Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Дорохов, Борис Дмитриевич

• Дорохов, Борис Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дорохов, Борис Дмитриевич

Содержание

Введение

Обзор литературы

Бактериофаг Pi

ПлазмидаР

Плазмида Ri

Плазмида RK2

Внутриклеточная локализация плазмид

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности.. -17 -Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага N15

Цели и задачи работы

Задачи работы:

Материалы и методы

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды

Плазмиды, используемые для экспрессии генов N15

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными

геном при анализе транскрипции sop оперона N15

Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension

анализа транскрипции sop оперона N15

Плазмиды, используемые в эксперименте по изучению регуляции

экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15

Плазмиды, используемые для определения скорости потери линейных

репликонов N15

Плазмиды, используемые для определения внутриклеточной локализации

линейных репликонов

Трансформация Е. coli

Выделение плазмиднойДНК

Электрофорез ДНК

Определение активности sop промотора

Анализ транскриптов с помощью ОТ-ПЦР

Определение активности Ptel промотора

Определение эффективности трансформации

Флуоресцентная микроскопия

Определение скорости потери линейных плазмид

Результаты

Регуляция экспрессии sop оперона N15

Структура sop оперона плазмиды N15

Связывание Sop белков N15 с sopPi промотором

ОТ-ПЦР анализ транскриптов sop оперона N15

Структурная организация промоторной области гена

протеломеразы

Регуляция экспрессии промотора протеломеразы

Роль протеломеразы в стабилизации концов линейной ДНК

Внутриклеточная локализация. Многокопийное состояние

Внутриклеточная локализация. Однокопийное состояние

Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне N15

Обсуждение

Регуляция экспрессии sop оперона

Внутриклеточная локализация плазмид

Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды N15

Список публикаций по теме диссертации

Цитированная литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15»

Введение

Стабильное наследование бактериальных хромосом и низкокопийных плазмид обеспечивается правильным распределением реплицированных молекул между дочерними клетками перед клеточным делением. Функционально этот процесс аналогичен митозу у эукариот. Как правило, стабильное наследование обеспечивается опероном из двух генов (sopA и sopB) и центромерным сайтом (sopC). Репликация плазмид сопровождается формированием сегрегационных комплексов (Sop белки, связанные с центромерами); реплицированные молекулы образуют пары за счет взаимодействия этих комплексов. После завершения репликации происходит разделение пар и активный транспорт плазмид к противоположным концам клетки. Механизм активной сегрегации бактериальных хромосом принципиально аналогичен. Эта модель является результатом исследования механизмов стабильного наследования кольцевых бактериальных репликонов (хромосом и плазмид), в первую очередь, плазмид F и Pi Escherichia coli. Однако, известны и прокариотические организмы, имеющие линейные плазмиды и хромосомы с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). К их числу относятся возбудитель боррелиоза (болезни Лайма) Borrelia burgdorferi, патоген растений Agrobacterium tumefaciens, линейные плазмиды phiK02, PY54 и N15. Механизмы стабильного наследования линейных бактериальных репликонов в настоящее время малоизучены. Мы исследуем явление стабильного наследования на примере бактериофага N15, особенностью которого является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому Escherichia coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами. Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F, но центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, как в плазмиде F, а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме, причем каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры (Ravin and Lane, 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001). В то время sop опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями; имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. Изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих правильное распределение линейных низкокопийных плазмид в бактериальных клетках, внесет важный вклад в понимание механизмов наследования генетического материала у прокариот.

Обзор литературы

Механизм распределения бактериальных плазмид и хромосом между будущими дочерними клетками при делении, наряду с работой аппарата репликации ДНК, является необходимым для стабильного наследования генетического материала. Высококопийные плазмиды не требуют наличия специальных механизмов сегрегационной стабильности для гарантированного распределения их реплицированных копий между дочерними клетками при делении. Случайного пассивного распределения вполне достаточно, чтобы, как минимум, одна копия оказалась в каждой из дочерних клеток. Низкокопийные плазмиды должны обладать специальным механизмом для обеспечения гарантированного наследования. Первые работы по изучению активного процесса сегрегации и связанных с этим явлением генов были проведены для низкокопийных плазмид Escherichia coli Pi и F. (Ogura and Hiraga, 1983; Austin and Abeles, 1983). В дальнейшем, в плазмидах разнообразных бактерий экспериментально, и/или компьютерным анализом последовательностей геномов были найдены аналогичные, обнаруженным у Pi и F сегрегационные модули, ответственные за стабильное наследование.

Обычно сегрегационный модуль состоит из двух генов, кодирующих транс-активные белки, способные образовывать комплекс на цис-активном центромерном сайте ДНК. Первый из двух генов в опероне кодирует белок, как правило, называемый РагА, второй ген кодирует белок, который является ДНК-связывающим фактором (РагВ). Существует значительная неоднородность в размерах и последовательности РагА белков, но одни из них обладают слабой АТФ-азной активностью и содержат Walker-type АТФ-азный мотив (РагА), другие же являются актиноподобными белками (РагМ) (Surtees and Funnell, 2003; Gerdes et al, 2004). В случае плазмиды Ri, кодирующей РагМ актиновый гомолог, АТФ-опосредованная двунаправленная полимеризация этого белка обеспечивает внутриклеточный транспорт прикрепленных плазмид к центрам будущих дочерних клеток (Moller-Jensen et al., 2002; van den Ent et al., 2002; Moller-Jensen et al., 2003; Garner et al., 2004). Известные на настоящий момент данные говорят о том, что и белок РагА также управляет распределением плазмид за счет активного процесса полимеризации (Ebersbach and Gerdes, 2004; Barilla et al., 2005; Lim et al., 2005; Adachi et al., 2006), однако

молекулярные механизмы, вовлеченные в процесс сегрегационной стабильности, все еще не достаточно изучены.

Начальной стадией процесса сегрегации является сборка нуклеопротеинового комплекса на центромере, так называемой сегросомы. Механизм наиболее хорошо изучен на примере бактериофагов Pi и Р7. Эти фаги являются родственными, содержат протяженные участки гомологии (см. Yun and Yanpnek, 1977), а в лизогенном состоянии не интегрируются в хромосому Е. со/г, а представляют собой кольцевые низкокопийные плазмиды. Все компоненеты системы сегрегационной стабильности локализованы в одном локусе, par (Austin and Abeles, 1983a, b; Ludtke et al., 1989). Этот локус включает авторегулируемый оперон, состоящий из двух генов, рагА и рагВ, а также cis-действующий сайт parS, следующий за геном рагВ. ParS включает два типа последовательностей, узнаваемых РагВ (Davis et al, 1990), расположенных по обеим сторонам сайта связывания бактериального белка IHF.

Рисунок 1. Организация сегрегационного модуля. Оперон состоит из двух генов, кодирующих Walker-type или актиноподобную АТФ-азу (показано серым цветом) и белок, способный связываться с центромерой (красный). Происходит сборка комплекса на центромере (белый квадрат), расположеной после или перед опероном. Фактор связывания с центромерой вовлекает АТФ-азу, которая, в свою очередь полимеризуется и направляет плазмиду к центру будущей дочерней клетки (Hayes and Barilla, 2006).

Основная последовательность, обеспечивающая связывание РагВ, - это гептамер (atttcac), называемый Бокс А. Имеются четыре копии Бокса А, два из которых образуют инвертированный повтор в правой половине parS, -минимальную последовательность, необходимую для связывания РагВ (Martin

-С

T/BS

et al, 1991). Второй последовательностью, участвующей в связывании РагВ, является гептамер (tcgcca), называемый Боксом В (Davis et al, 1990). Связывание IHF с parS вызывает изгиб ДНК, центр которого находится в сайте связывания IHF. Этот изгиб способствует специфическому свзыванию РагВ с parS (См. Рис. 2 b.) (Davis and Austin, 1988; Funnell, 1988b, 1991; Funnell and Gagnier, 1993, Radnedge et al, 1996).

N-концевой участок белка РагВ включает последовательность, обеспечивающую взаимодействие с РагА, в то время как С-конец содержит последовательность, существенную как для связывания с центромерой parS, так и для димеризации. РагВ образует семь a-helix районов (helix-turn-helix [НТН] домен), соединенных четырьмя подвижными аминокислотными линкерами с отдельным доменом, который содержит три антипараллельные (3 цепи и С-концевой a-helix (димерный домен). Димеризация РагВ происходит за счет упаковки Р цепей и С-конечного участка (Schumacher and Funnell, 2005).

Хотя сегрегационные модули плазмид, как правило, организованы в соответствии с описанной выше схемой, центромерные сайты могут иметь весьма разнообразную структуру. Обычно, центромера представляет собой набор из прямых повторов, но также может включать инвертированные повторы и/или прямые повторы с внутренней симметрией. Центромера parS бактериофага Pi представляет собой набор прямых повторов, расположенных после генов, отвечающих за сегрегационную стабильность. Однако, число повторов, их длина, расстояние между ними, нуклеотидная последовательность, - всё это может сильно различаться в структурной организации других известных центромер (Рис. 2 a.) (Hayes and Barilla, 2006).

а

F sopC PI parS RK2 0B3 TP288 par H pTAR parS pTAVlinc2 pRA2 parS

-OX-

lOObp

* i и

-сфсфс^с^

pB171 parCl -

R1 рагС -Ефк^ИСфвфжг^-C^EZyCZ^CZ^e^-

10bp

Рисунок 2. Разнообразие строения центромерных сайтов бактериальных плазмид.

a. Показаны наиболее изученные центромеры различных плазмид. Стрелками показаны повторы, длина и число которых различно у разных центромер. Для Pi parS повторы бокса А и бокса В показаны серым и красным сответственно. Сайт связывания IHF показан синим прямоугольником. Масштаб для центромеры sopC плазмиды F отличается от других центромер.

b. Схематическое изображение молекулярной организации сегросомы Pi, содержащей parS последовательность ДНК, с которой взаимодействует IHF (фиолетовый), образуя изгиб ДНК. РагВ (зеленый) взаимодействует с гептамерными и гексамерными последовательностями на обоих концах parS. РагА (красный) вовлекается в сегросому за счет взаимодействия с РагВ.

К примеру, кодируемый плазмидой F белок SopB, являющийся гомологом РагВ, распознает сайт связывания, представляющий собой двенадцать последовательно расположенных повторов длиной 43 нт (sopC). Для сравнения, белок КогВ плазмиды RK2 связывается с полиндромом длиной 13 нт (ОвЗ)- Последние исследования структуры ДНК-связывающего домена белка КогВ выявили консервативный НТН мотив, а также необычный механизм распознавания белком центромеры. Механизм основан на двустороннем взаимодействии белка с двумя парами нуклеотидов, смежными со средней парой тринадцати нуклеотидного сайта связывания (Khare et al, 2004). Более того, в отличии от РагВ фага Pi, процесс димеризации КогВ за счет взаимодействия С-концевых районов белка приводит к существенному увеличению способности связываться с ДНК. (Delbruck et al., 2004). КогВ-0 НТН мотив связывается с центромерой, изменяя вторичную структуру ДНК в месте контакта. N-концевой район КогВ взаимодействует с родственным аналогом РагА белка (IncC), который, в свою очередь, после связывания перекрывает часть последовательности центромерного сайта. Таким образом, РагВ и КогВ, являясь по сути белками, связывающимися с центромерой и

гомологами, используют различный механизм как для олигомеризации, так и для связывания с ДНК. Каждый из этих двух белков распознает свои центромеры, которые у Pi и RK2 различаются как организацией повторов, так и нуклеотидными последовательностями. В последнее время было идентифицировано множество ДНК-связывающих белков, осуществляющих функции, аналогичные РагВ, но структурно отличающихся от него, а также существенные различия в механизмах формирования ДНК-белкового комплекса. Несмотря на такое разнообразие в организации центромер, РагВ белки выполняют главную функцию - формируют ДНК-белковые комплексы и обеспечивают специфичное связывание родственных РагА белков с образованием сегрегационного комплекса. Стоит отметить, что в большинстве случаев системы сегрегационной стабильности плазмиды самостоятельно обеспечивают правильное распределение репл^цированных молекул перед делением. Скорее всего, этот процесс не связан с компактизацией ДНК, как в случае распределения бактериальных хромосом, и происходит независимо от сегрегации нуклеоидов (см. обзор Прозоров, 2005), так^мутантном штамме mukB плазмида F распределяется правильным образом (Hiraga, 1992).

Бактериофаг Pi

В настоящий момент наиболее хорошо изучена организация сегрегационного модуля бактериофага Pi. Сайт parS представляет собой последовательность - 8о нт, расположенную следом за генами рагАВ. Центромерный сайт parS состоит из двух частей, разделенных сайтом связывания IHF. Каждая из частей содержит несимметрично расположенные гептамерные и гексамерные мотивы, с которыми может связываться РагВ (Hayes and Austin, 1994; Davis and Austin, 1988; Surtess and Funnell 2001). Белок IHF, связываясь с ДНК, вызывает изгиб в области parS, тем самым способствуя взаимодействию РагВ с сайтами связывания обоих частей центромеры (Funnell, 1991). Подобные конформационные изменения необходимы для образования сегросомы и правильного функционирования механизма сегрегационной стабильности Pi. Однако стоит отметить, что участие IHF или других структурных белков, кодируемых клеткой, в формировании нуклеопротеиновых комплексов на центромерах других бактериальных репликонов пока не было описано.

Белок РагА обладает АТФ-зной активностью и выполняет две функции: во-первых, он репрессирует промотор par оперона и, во-вторых, является компонентом собственно механизма сегрегационной стабильности (Davis et al, 1992 Friedman and Austin, 1988, Davis et al, 1996). РагА образуют димеры, связываясь с ATP или ADP, причем связывание с АТР приводит к изменению конфигурации РагА, делая возможным специфичное взаимодействие с SopB и включение в структуру сегросомы (Bouet and Funnell. 1999)- Описана точечная мутация в РагА, не влияющею на репрессию промотора par оперона, но нарушающая стабильность высококопийной плазмиды, содержащей parS (Youngren and Austin, 1997). Анализ свойств этого мутанта позволил выдвинуть гипотезу об образовании после репликации ориентированных пар плазмид, которые разделяются и транспортируются к противоположным концам делящейся клетки. Если контакт между плазмидами осуществляется в parS сайтах, а функция РагА состоит в разделении пар, то описанная мутация, нарушающая эту функцию, фактически приводит к снижению эффективного числа копий плазмиды вдвое, что и наблюдалось.

Второй важной функцией РагА является регуляция экспрессии par оперона, что обеспечивает контролируемую продукцию Par белков. Повышенный уровень их экспрессии нарушает работу механизма сегрегационной стабильности (Funnell, 1988а Hayes et al, 1994). РагА репрессирует транскрипцию, связываясь с районом, перекрывающим промотор оперона (Abeles et al, 1985), а именно, участком длиной около 140 нт, центром которого является АТ-богатый палиндром длиной 42 нт (Davis et al, 1992). Аналогичным образом соответствующий промотор репрессирует РагА белок фага Р7. РагА белки содержат ДНК-связывающий helix-turn-helix мотив в N-концевом участке (аминокислоты 43-62 в Pi и 44-63 в Р7), замена этого мотива в РагА Pi на эквивалентный мотив из РагА Р7 приводит к смене специфичности репрессии промотора (Hayes et al, 1994).

ПлазмидаF

F-фактор является низкокопийной конъюгативной плазмидой, кодирующей собственный механизм сегрегеционной стабильности, или sop-систему. Подобно parS сайту Pi, центромера sopC плазмиды F расположена после генов sopA и sopB, гомологичных рагАВ. Однако существуют различия в организации центромер: sopC представляет собой двенадцать

последовательных элементов (повторов) длиной 43 нт (Mori et al., 1986), каждый из которых способен сам по себе полностью стабилизировать плазмиду в присутствии SopAB (Biek and Shi, 1994). Индивидуальный элемент sopC содержит инвертированный повтор длиной 7+7 нуклеотидов, разделенных двумя нуклеотидами, и зеркальный повтор 9+9 нуклеотидов, разделенный одним нуклеотидом. Белок SopB является гомологом РагВ и может связываться с центромерным сайтом sopC, что приводит к снижению уровня отрицательной суперскрученности в этом районе ДНК. Также было показано явление двунаправленного распространения SopB белков по ДНК, начиная от области связывания с sopC, приводящее к сайленсингу близлежащих к центромере последовательностей (Lynch and Wang, 1995; Rodionov et al, 1999). Вероятно, это явление отражает конфигурацию нуклеопротеинового комплекса, окружающего последовательности вне сайта sopC, и может иметь некое вторичное, пока не установленное значение, для обеспечения сегрегационной стабильности (Rodionov and Yarmolinsky, 2004).

Избыточное количество SopA может дестабилизировать плазмиду, содержащую sopC; подобный эффект был выявлен и в случае чрезмерной продукции РагА для плазмид, несущих parS (Abels et al, 1985). SopA снижает уровень положительной суперскрученности плазмидной ДНК, вызываемой связыванием белка SopB с центромерным сайтом sopC и образованием сегрегационного комплекса. Для этого процесса требуется свободный сайт связывания АТР белка SopA, наличие которого свидетельствует, что связывание SopA с ДНК имеет существенное влияние на структуру и организацию сегросомы, образуемой на sopC (Lemonnier et al, 2000).

Как и РагА, SopA принимает участие, как в регуляции экспрессии оперона, так и в работе собственно механизма сегрегационной стабильности. SopA связывается с четырьмя последовательностями CTTTGC, перекрывающими промотор, и, тем самым, репрессирует его (Mori et al, 1989 ). Уровень репрессии возрастает в присутствие SopB и дополнительно возрастает в присутствие sopC (Yates et al, 1999). Однако, как и в случае с РагА, белок SopA не может напрямую взаимодействовать с центромерой sopC, и его роль в изменении организации сегросомы опосредована взаимодействием с SopB (Lemonnier et al, 2000).

Плазмида Ri

Par локус плазмиды Ri является аналогом, но не гомологом par/sop лоуксов F и Pi. В этом случае центромерный сайт рагС расположен не после оперона, состоящего из генов рагМ и parR, а перед ним (Dam and Gerdes, 1994, Gerdes and Molin 1986). Сайт рагС включает в себя два набора итеронов длиной 11 нт, повторяющихся тандемно пять раз. Между наборами располагается последовательность из 39 нт, содержащая промотор parMR, перекрывающийся двумя итеронами, с которыми связывается ParR. (Jensen R.B. et ah, 1998; Breuner et ah, 1996; Jensen et al., 1994). Связывание ParR с итеронами необходимо как для репрессии, так и собственно для работы механизма сегрегационной стабильности, причем для обеспечения этих функций требуется вся последовательность рагС. Актиноподобный белок РагМ, обладающий АТФазной активностью, является неотъемлемой частью par-системы плазмиды Ri (Jensen and Gerdes, 1997) и может взаимодействовать с комплексом ParR-рагС используя АТР-зависимый механизм. Таким образом, образование сегрегационного комплекса плазмиды Ri напоминает формирование сегросомы на parS у Pi и на центромерных сайтах других плазмид, вовлекающих в нуклеопротеиновый комплекс Walket-type АТР-азу (Moller-Jensen et al, 2003). В отличие от SopA/ParA, РагМ не принимает участие в регуляции активности par промотора. Было установлено, что образование сегрегационного комплекса у рагС приводит к образованию пар плазмид, контактирующих в районе этих сайтов.

Длина (т.п.н.) 1

2

3

1 2 3

I l I I

1 2

Рисунок з. Организация сегрегационных оперонов плазмид Pi, F и Ri. Заштрихованый прямоугольник - транскрипт; Черные прямоугольники, -элементарные единицы центромерных сайтов.

Плазмида RK2

Особый механизм, обеспечивающий сегрегацию ДНК в делящейся бактериальной клетке для имеющих широкий круг хозяев плазмид из группы несовместимости Р (IncP), требует отдельного рассмотрения. Эти плазмиды стабильно поддерживаются в различных грамотрицательных бактериях. Для понимания того, как IncP плазмиды могут существовать в различных видах бактерий, необходимо определить их стратегию стабильного наследования и изучить, как их системы взаимодействуют с хозяйской клеткой. По сравнению с описанными системами сегрегационной стабильности, локус плазмиды RK2, отвечающий за стабильное наследование, имеет много общего с ними, однако, существуют и важные отличия.

Процесс активной сегрегации для IncP плазмид был впервые описан Mayer and Hinds, 1982, которые обнаружили фактор несовместимости функции стабильного наследования в когА опероне RK2, кодирующем репрессор транскрипции КогА и КогВ. Ген incC, ответственный за несовместимость, перекрывается с геном когА по различным рамкам считывания и продолжается до гена когВ (Thomas and Smith, 1986) (См. Рис. 4)

КогА КогВ

| когА

тсС2

когВ korF ^ korG

incC

Рисунок 4. Организация когА сегрегационного оперона плазмиды RK2 Ген когА расположен с пределах incC, но кодируется с другой рамки считывания. incC2 кодирует белок 1псС2 с внутреннего сайта инициации. korFvi korG гены «основных» белков с неустановленными функциями. Р - промотор; Оа и Ов - сайты связывания КогА и КогВ соответственно. Стрелкой отмечен сайт начала транскрипции (Siddique and Figurski, 2001).

Ген incC экспрессирует два полипептида: длинный IncC и короткий 1псС2, инициируемые с внутреннего сайта трансляции. Оба белка являются АТР-азами, сходными с РагА плазмиды Pi (Gerdes et al, 2000). Изучение внутриклеточной локализации RK2 плазмид в Escherichia coli с помощью флуоресцентной микроскопии показало наличие системы активной сегрегации. Было установлено, что белок IncC может взаимодействовать с КогВ in vivo и in vitro, a IncC2, КогВ и сайт связывания КогВ (Ов) играют важнейшую роль в процессе сегрегации. РагВ гомолог КогВ связывается с 12 сайтами Ов, расположенными от области -35 промотора когА оперона до 198 нт после точки начала транскрипции, причем КогВ, связываясь с ними, может репрессировать транскрипцию промотора. Белок IncC, являясь гомологом РагА, способен усиливать репрессию, вызванную КогВ, при этом нет данных о том, что белок сам способен связываться с ДНК. Работы по изучению активности промоторов показали, что эффект репрессии связан с белком КогВ, при этом происходит изменение конформации ДНК в месте взаимодействия с белком. Такие конформационные изменения, по всей видимости, снижают активность промотра, а связывание IncC с КогВ приводит к усилению репрессии (Jagura-Berdzy et al., 1999). Таким образом, существует двойной контроль промотора

оперона когА, с помощью белка КогА и совместного действия белков KorB-IncC. Белок 1псС2 являясь АТР-азой способен связываться с комплексом КогВ-Ов и полимеризовываться, обеспечивая транспорт плазмид (Siddique and Figurski, 2001).

Внутриклеточная локализация плазмид

Использование флуоресцентных зондов для изучения внутриклеточной локализации плазмид в последние годы существенно облегчило анализ механизмов сегрегационной стабильности плазмид и хромосом. Было установлено, что перемещение новой реплицированной ДНК является не пассивным процессом, связанным с увеличением клеточной стенки, а активным и достаточно быстрым (относительно периода клеточного цикла) процессом (Sharpe and Errington, 1999; Jensen and Shapiro, 1999). Изучение внутриклеточной локализации плазмид позволяет лучше понять, как функционируют механизмы сегрегационной стабильности и какие процессы происходят в клетке перед делением. В работах по изучению par систем плазмид Pi (in vivo) и Ri (in vitro) было установлено (Edgar et al, 2001; Jensen et al, 1998), что центромеры реплицированных плазмид «спариваются», причем взаимодействие двух плазмид происходит в центре клетки за счет взаимодействия комплексов, образованных на центромерных сайтах ДНК-связывающими сегрегационными белками (Li et al, 2004). Образование такого комплекса в центре клетки недостаточно для успешной сегрегации плазмид, только включение в нуклеопротеиновый комплекс белка АТР-азы приводит к правильной работе сегрегационного аппарата и, как предполагается, является первой стадией процесса сегрегации (Funnell, 2005). В случае плазмиды Ri для спаривания копий достаточно взаимодействия центромеры рагС с белком ParR, однако РагМ может способствовать этому процессу (Jensen et al, 1998). Возникает вопрос, почему именно центр клетки является местом для спаривания дочерних плазмид после репликации? Возможно, репликация плазмид в клеточном центре обеспечивает правильное пространственное расположение сегрегационных комплексов за счет взаимодействия с клеточными факторами, влияние которых на процесс сегрегационной стабильности требует дополнительного изучения.

Усовершенствованые в последнее время методы внутриклеточной локализации макромолекулярных комплексов позволили установить, что

положения внутри клетки белков ParA/SopA, ParB/SopB и сайтов parS/sopC взаимосвязаны (Erdmann et al, 1999; Li et al, 2004; Niki and Hiraga, 1997). Внутриклеточная локализация плазмид F и Pi в живых клетках была исследована с помощью флуоресцентного белка GFP. Для этого в геном плазмид был интегрирован /ас-оператор, с которым связывался гибридный белок GFP-lacI, экспрессируемый в той же клетке (Gordon et al, 1997» Jensen and Gerdes, 1999). Аналогичные паттерны внутриклеточной локализации плазмид были выявлены в экспериментах с использованием fluorescent in situ hybridisation (FISH) (Niki and Hiraga, 1997). Правильная внутриклеточная локализация плазмиды F зависит от функционирования sop - системы (Niki and Hiraga, 1997). В клетках, содержащих одну F или Pi плазмиду, флуоресцентный сигнал локализуется в районе центра клетки, в то время как в клетках, содержащих две плазмиды (результат репликации), они расположены в положениях V4 и 3А по длине клетки. Таким образом, можно предположить, что плазмиды реплицируются в центре клетки, а затем транспортируются в положения положениях Ул и т.е. в центры будущих дочерних клеток, где они и находятся до завершения клеточного деления. Отсутствие флуоресцентных фокусов в других положениях свидетельствует о том, что этот перенос протекает достаточно быстро по сравнению с длительностью клеточного цикла, что предполагает активный транспорт плазмид.

-ч н

Н i 1 л i 4 и ц • а

' к /Ч V

■ 7

Рисунок 5. Внутриклеточная локализация плазмид Pi. Флуоресцентная микроскопия в реальном времени. На первом этапе фокусы объединены и локализуются в центре клетки незадолго до клеточного деления. Далее происходит быстрое разделение пар и двунаправленный транспорт плазмид. Дальнейшее образование клеточной стенки разделяет плазмиды, оставляя каждую из них в новой дочерней клетке (Li and Austin, 2002).

Также была исследована внутриклеточная локализация SopB и РагВ (Erdmann et al 1999, Kim and Wang, 1998). Гибридный белок SopB-GFP локализуется в положениях Ул и что позволяет предположить, что именно он обуславливает аналогичную внутриклеточную локализацию sopC-содержащей плазмиды. Аналогичным образом было установлено, что РагВ локализуется в положениях V4 и %, образование точечного фокуса зависело от присутствия parS, в то время как его правильное положение зависело также и от ParA (Erdmann et al 1999). В работе Li et al, 2004 было показано, что для правильной локализации плазмид с сайтом parS требуется наличие как РагА, так и РагВ белка. РагВ требуется для позиционирования плазмид в центре клетки, а РагА требуется для последующего их транспорта к противоположным полюсам перед клеточным делением. Мутации, снижающие АТР-азную активность РагА, приводили к возникновению аберраций в положении плазмид. Аналогичные результаты были получены при изучении механизмов сегрегации плазмиды RK2, кодирующей РагА и РагВ гомологи 1псС2 и КогВ (Bignell et al, 1999).

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности

Полученные в последние годы результаты (Niki and Hiraga, 1997, 1999; Jensen et al, 1998; Jensen and Gerdes 1997) свидетельствуют в пользу следующей модели функционирования механизма сегрегационной стабильности (Рис. 6, Moller-Jensen et al, 2000), принципиально аналогичной митозу у эукариот. Репликация плазмид, локализованных в районе центра клетки, сопровождается формированием сегрегационных комплексов; реплицированные молекулы плазмид образуют пары за счет взаимодействия сегрегационных комплексов, связанных с их центромерами. После завершения репликации происходит разделение пар (в случае плазмиды F эту функцию, выполняет SopA) и активный транспорт плазмид. Образование пар плазмидами Ri in vitro зависит от белков ParR и ParM (Jensen et al, 1998). Следовательно, сборка сегрегационного комплекса является необходимым предварительным условием для последующей работы гипотетического митотического аппарата. Колокализация плазмид и белков, связывающихся с центромерами (РагВ, SopB и ParM Ri), предполагает, что эти белки связывают транспортируемые плазмиды со специфическими клеточными структурами, сохраняя их в определенной позиции до завершения клеточного деления, хотя существует

гипотеза^ о том, что сегрегация Ri не зависит от клеточных факторов и локализация сегрегационного комплекса в центре клетки связана лишь с репликацией (Moller-Jensen et al, 2003).

Сегрегация хромосом является более сложным процессом. Флуоресцентная детекция хромосомной ДНК показала, что реплицированные ori-сайты быстро разделяются за счет движения к противоположным полюсам клетки. Это согласуется с тем, что хромосомные аналоги sop/par семейства специфически связываются с последовательностями, расположенными вблизи оп-сайтов. Будучи клонированными в плазмидах, хромосомные и плазмидные sop/par системы работают одинаково эффективно. Поэтому вероятно, что плазмидные и хромосомные sop/par системы могут функционировать сходным образом, т.е. может происходить образование спаренных опС-районов, которые затем разделяются и транспортируются к противоположным полюсам.

Moller-Jensen и соавторы (2000) предложили следующую модель сегрегации бактериальных хромосом. В только что образовавшейся клетке, oriC перемещается к центру клетки, где происходит сборка реплисомы. Позднее, одновременно с репликацией, oriC активно транспортируется к полюсам клетки, к которым затем прикрепляются. Эта модель является некоторым упрощением реальной ситуации, поскольку она не принимает во внимание наличие нескольких репликационных вилок в быстро растущей бактериальной культуре. Более того, факты отсутствия par/sop гомологов в некоторых бактериальных геномах (например, Е. со/г) требуют дальнейшего изучения. Последующие исследования показали, что важнейшую роль в активном транспорте плазмид играет ParA/SopA и их гомологи. Сборка сегросомы подразумевает взаимодействие ParB/SopB с центромерным сайтом. Сам нуклеопротеиновый комплекс при этом локализуется в центре клетки. Включение в комплекс ParA/SopA обеспечивает разделение пар и полимеризацию белков с включением в реакцию АТР, тем самым, создавая структуру, расталкивающую плазмиды двунаправлено. Белки ParB/SopB могут включаться в создаваемую структуру, способствуя её правильной сборке (Barilla et al, 2005). После завершения клеточного деления, по всей видимости, образованная ParA/SopA структура деполимеризуеется.

Рисунок 6. Предполагаемая модель сегрегации плазмид, содержащих par/sop оперон.

Вслед за репликацией, копии плазмиды образуют пары в центре клетки засчет взаимодействия сегрегационных SopB белков (желтый), связанных с центромерой (красный), (l) SopA белок (синий) включается в сегрегационный комплекс (2) и, связывая АТР, двунаправлено полимеризуется между двумя центромерами, тем самым, расталкивая плазмиды к противоположным полюсам клетки (3). SopB белки могут корректировать образование филаментов (4). После окончания клеточного деления плазмиды оказываются правильно распределены в дочерние клетки. Образованные SopA полимерные цепочки разрушаются (5). (Hayes and Barilla, 2006).

Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага N15

Бактериофаг N15 был выделен и описан В.К. Равиным в 1964 г (Голуб и Равин, 1967). Фаг N15 имеет линейную двунитевую ДНК молекулярной массой 30 МД, частота лизогенизации около 50%, урожай фага около юо, латентный период 45 мин (Равин, 1971). Бактериофаги N15 и лямбда имеют схожую структуру вириона, около 50% ДНК N15 гибридизуется с ДНК фага лямбда (Ravin and Shulga, 1970). На основании этого N15 был отнесен к семейству лямбдоидных фагов. Как было показано В.К. Равиным и сотрудниками в 196770 гг, особенностью N15 является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся плазмиду (Ravin and Shulga, 1970).

Следующий важный шаг в изучении генетики фага N15 был сделан проф. В.Н. Рыбчиным и сотрудниками, которые показали, что профаг N15 представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). Вывод о линейности профага N15 был сделан на основе физического картирования ДНК фага и профага, которое показало, что (l) обе молекулы ДНК линейны и имеют длину 46.3 тпн и (2) рестрикционная карта профага является результатом циклической пермутации карты фага (Сварчевский и Рыбчин, 1984b).

Концы профага N15 (теломеры), назвываемые telL и telR, представляют собой шпилечные структуры, т.е. две нити ДНК ковалентно связаны однонитевыми участками. Шпилечная структура теломер профага N15 была установлена в работе (Сварчевский и Рыбчин, 1984b). В работах (Малинин и др., 1992а, 1992b) были определены нуклеотидные последовательности концевых районов профага и соответствующего неразрезанного сайта в фаговой ДНК, telRL, представляющего собой палиндром длиной 56 н. Схема образования плазмидной ДНК из фаговой, впервые предложенная в работе (Малинин и др., 1992а), показана на рисунке 7. После проникновения фаговой ДНК в клетку она замыкается в кольцо по когезивным концам, однонитевые разрывы зашиваются ДНК-лигазой. Затем гипотетический фаговый фермент, впоследствии названный протеломеразой (прокариотическая теломераза), вносит ступенчатый разрыв в фаговой ДНК в области telRL.

tosRJ tosLI

cosL

cosR

циркупяризация

.- telRL ■

фаговая ДНК

ИА5ТССТСТ1ГТ^1ЯСТЦТХТЙСДЖСАТАТТАГГтеАТЦГДГДГМГТИ

telRL

telL

о

разрезание telRL саота прогепомеразой и образование коеалентно замкнутых тепомер

ДНК линеиного профага

telL

• CTWTmGGACTftTTGTGTGCreATA

< шшшсСгммсАслтаспи

О

telR

telR

—raTCAGCMCaATTGOCCATTMUCGC - ATKTOGTGTGTTAACGGSTMTATGCG J

В

образование шпилечных теломер протеломеразой

telR

= э =э

telR

Рисунок 7. А — преобразование фаговой ДНК в линейную плазмиду после инфекции. cosL, cosR — однонитевые когезивные концы; cosRL, cos — сайт после замыкания и лигирования; telRL — сайт действия протеломеразы; telL и telR — левая и правая шпилечные теломеры профага, образуемые при помощи протеломеразы; tosLl, tosL2, tosL3, tosRl, tosR2 и tosR3 — предполагаемые сайты связывания протеломеразы;

В — модель репликации линейного плазмидного профага.

Отжиг концевых однонитевых участков, имеющих внутреннюю комплементарносгь и последующее соединение фосфодиэфирных связей приводит к образованию ковалентно замкнутых теломер.

telL

О

о

Некоторые свойства плазмиды N15 были охарактеризованы в работе (Сварчевский и Рыбчин, 1984а). Так .было установлено, что плазмида N15 является низкокопийной и стабильно наследуемой, - частота ее спонтанной потери не превышает ю*4 на генерацию. N15 совместим с плазмидами, представляющими различные группы несовместимости: Pi, PBR322, F-фактором.

В предыдущих частях обзора литературы были рассмотрены принципы функционирования механизмов сегрегационной стабильности, применимые к кольцевым низкокопийным плазмидам и, в ряде случаев, к бактериальным хромосомам. В то же время, механизмы, обеспечивающие стабильное наследование линейных прокариотических репликонов, практически не изучены.

Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F как в области структурных генов (sopA, sopB), так и в районе длиной около 150 нт, предщесгвующем sopA, и содержащем промотор sop оперона, Psop. (Ravin and Lane, 1999). В случае плазмиды F белок SopA обладает АТР-азной активностью, а также может репрессировать Psop, взаимодействуя с сайтами связывания, перекрывающимися с промоторным районом. Функция белка SopB заключается в связывании с центромерным сайтом и образовании сегрегационного комплекса. В то же время исследование механизма сегрегационной стабильности N15 выявило существенные отличия от принятой для кольцевых плазмид модели. Так, центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме N15 (Рис. 8). Каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры (Ravin and Lane, 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001). Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. В то же время sop опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями. Наконец, анализ нуклеотидной последовательности, предшествующей N15 sopA, позволил выявить несколько потенциальных промоторов, помимо Psop, что является предметом отдельного исследования. Детальное изучение механизмов

функционирования и регуляции sop системы сегрегационной стабильности N15 является целью настоящей работы.

Р1

RK2

pTAVI

ТР228

pRA2 pTAR рВ171

Rl

parH

inc2

parCl

parC2

parC

500 bp

sopA

N15

sopB

I // I // I//

IR4 IRS IR2

repA

IR1

Рисунок 8. А. Организация сегрегационных модулей. Гены, кодирующие РагА, изображены синими стрелками, РагВ - желтыми стрелками, ParG -зелеными стрелками. Аналоги ParG показаны оранжевыми и темно-синими стрелками. Сегрегационный модуль Ri имеет аналогичное строение, но содержит ген РагМ, кодирующий гомолог актина, - показано зеленым, и ген ParR, кодирующий ДНК-связывающий белок, - показано белым. Центромерные сайты отмечены красным.

Б. Организация sop системы бактериофага N15. Распределенные в геноме четыре центромеры (IR) N15 показаны красным. Белок SopA может репрессировать промотор sop оперона. Белок SopB взаимодействует с центромерами и образует сегрегационный комплекс.

Цели и задачи работы

Целью работы является изучение особенностей структурной и функциональной организации локусов, обеспечивающих сегрегационную стабильность линейных бактериальных репликонов на примере профага N15, и установление возможных взаимосвязей между процессами сегрегационной стабильности, репликации ДНК, образованием теломер и контролем экспрессии генов на разных стадиях жизненного цикла фага N15.

Задачи работы:

1) Идентифицировать промоторы sop оперона фага N15 и установить механизмы регуляции их активности.

2) Установить факторы, регулирующие экспрессию sop оперона N15 в лизогенном состоянии и на различных стадиях литического развития.

3) Исследовать возможную роль Sop генов N15 в регуляции репликации и числа копий профага.

4) Методом флуоресцентной микроскопии in vivo исследовать внутриклеточную локализацию профага N15 и влияние на нее Sop белков.

5) Установить значимость и функциональную роль наличия 4-х центромерных сайтов, расположенных в различных районах генома N15 для стабильного наследования линейной плазмиды.

Материалы и методы

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды

Бактерии выращивали в LB бульоне или чашках с LB агаром при 37 °С или 30°С. В случае необходимости в среды добавляли антибиотики: ампициллин (юо мкгр/мл), хлорамфеникола (20мкг/мл), канамицин (50 мкгр/мл), тетрациклина (20 мкг/мл) или спектиномицин (юо мкгр/мл) Pfu ДНК-полимеразае (Promega), щелочная фосфатаза Е. coli, Т4 DNA лигаза, фрагмент Кленова ДНК полимеразы, Т4 полинуклеотидкиназа (New England Biolabs), бактериальная щелочная фосфатаза (Promega) и эндонуклеазы рестрикции (Promega, New England Biolabs, Сибэнзим) были использованы в соответствии с рекомендациями производителя. Отбор рекомбинантов по цветному тесту на чашках с X-gal и ИПТГ осуществляли по методу (Sambrook et al, 1989).

Были использованы следующие синтетические олигнонуклеотиды:

PRi (5' GATGTTAACCTTAACTTTGCGTTTTC);

PR3 (5' rTGAATTCCAACGTAAGTAATACCGTTG);

PR6 (5' TGATTGTCCAGTGTTGTAAAAAGCGA);

PR23 (5' CCGGATCCTGACCGCGATTGATAC);

PR23N (5' TCCTGACCGCGATTGATACA);

PR34 (5' GCGAATTCGTGTGCTGATATGTTCCG);

PR46 (5' CGGGATCCAGCTTCATCTAAGCGCAACG);

PR48 (5' CGGGATCCTCTATCTCTTCCGTCTCTA);

PR27L (5' CATCATCCAGCTCTCCAACG);

PR39R (5' TGTTATGCCCTTCCTTACCC);

PR37S1 (5' GGAATTCCCGGGTAGATGATACAATAAC);

PR37S2 (5' CATGCCATGGTAACCTTACAAGAATTCTAC);

PR37L3 (5' GCTCTAGACCCGGGTTATATCGCCACGGCT);

PR28L (5' AACGGAAAGTACAACCGGGT);

PR28R (5' GCTGAAAGACTGTATCAATC);

Km-Pac (5' GTTAATTAACGTTGTGTCTCAAAATC);

Km-Not (5' CGCGGCCGCCGTCCCGTCAAGT);

telRL-3 (5' CGGAATTCGTGTGCTGATAAGGAGAAC);

telRL-i (5' GGGGATCCGTTTCTAAGTCTCTGGAT);

IR2-R (5'CCTTAATTAArrAGGAAGTCAGGCGTA);

PR43mutiN (5' CAGTAGCGCCATTCCGTTGCTGTTC);

PR43mut2N (5' TCGTGGCCCAGCCGGAAGAAGAACGT);

IRspi (5' CGCGATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAAT);

IRsp2 (5' CCGGATTCCGTGCGACCATGGTCGCAGCATAT);

PR IR3-SexAI (5' CCTGGATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAAT);

PR IR3-BstBI (5' CGATTCCGTGCGACCATGGTCGCACGATAT);

PRIR3_FLi (5' CTGCATATCGTGCGACCATGGTCGCACGGAATC);

PR IR3_FL3 (5' CTTGGATTCCGTGCGACCATGGTCGCACGATATGCAGGCA);

PR077 (5' GGTGGGACAGAGGTATCGCC).

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды

Штамм МС1061 (Casadaban and Cohen, 1980) был использован для размножения фагов лямбда и N15, штамм DH10B (Grant et al, 1990), - в остальных случаях. Для повышения эффективности трансформации при получении линейных плазмид на основе репликона N15 использовали лизогенный по N15 штамм. Нумерация нуклеотидов в геноме N15 приводится в соответствии с последовательностью фага N15, представленной в GenBank (AF064539; Ravin etal, 2000).

Бактериофаг NisKm был получен в результате клонирования гена устойчивости к канамицину (ПЦР фрагмент, полученный с помощью праймеров Кт-Рас и Km-Not на матрице pKRPi2 (Reece and Phillips, 1995)) между уникальными сайтами РасI и Notl профага N15. В результате sop гены N15 были замещены геном устойчивости к канамицину, вследствие чего профаг NisKm не является стабильно наследуемым, а в остальном (частота лизогенизации, урожай, морфология бляшек, число копий и т.п.) эквивалентен исходному N15.

Плазмиды. используемые для экспрессии генов N15

Плазмиды PDAG408 и PDAG242 были использованы для конститутивной экспрессии sopA и sopA одновременно с sopB, соответственно (Ravin et al, 2003). Плазмида pJDioi (Deneke et al, 2000) использовалась для экспрессии протеломеразы N15 (TelN), PDAG242 и pJDioi основаны на разных репликонах и поэтому совместимы. Плазмиды pCAis и pCAi2 использовались для экспрессии СВ репрессора и AntA антирепрессора N15, соответственно.

Плазмида pNC07 использовалась для контролируемой экспрессии гена репликации герА. Для создания этой плазмиды был получен ПЦР фрагмент, содержащий последовательность гена герА N15 с использованием олигонуклеотидов 73S2 и 73L3. Полученный фрагмент был вставлен в экспрессионный вектор PBAD24 (Guzman et al, 1995) между сайтами рестрикции Ncol и Xbal. Экспрессия AntA и RepA индуцировалась путем добавлением арабинозы в растущую культуру клеток до конечной концентрации 0,01%

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными геном при анализе транскрипции sop оперона N15

Фрагменты ДНК N15, содержащие промотор sop оперона, были клонированы между ЕсоШ. и ВатШ сайтами репортерного вектора PRS551 (Simons et al, 1987) на 5' конце гена lacZ. Плазмида pNSPoi содержит фрагмент ДНК N15 sop? (от -470 до +47 относительно «А» в ATG кодоне гена sopA), полученный при помощи ПЦР с использованием праймеров PR34 и PR23. Плазмида pNSPo6 содержит фрагмент sopP2 (от -470 до -148; праймеры PR34 и PR46). Плазмида pNSP04 содержит фрагмент sopPi (от -183 до +47; праймеры PR3 и PR23). Репротерные конструкции sop-lacZ были перенесены в хромосому Е. coli при помощи рекомбинации in vivo и лизогенизации штамма МС1061 рекомбинантным фагом XRS88 (Simons et al, 1987), в результате чего были получены штаммы pNSPoichr, pNSP04chr и pNSPo6chr.

Для получения линейной репортерной плазмиды сперва была получена линейная плазмида PG59 на основе N15 путем лигирования Smal фрагмента из плазмиды pKRPn (Reece and Philips, 1995), содержащего ген устойчивости к канамицину, с фрагментом ДНК N15 (с координатами 22733-35000), полученным ПЦР с использованием олигонуклеотидов PR27L и PR39R. PG59 содержит гены, необходимые для репликации и контроля лизогении (гены 2838), включая telN, герА и сВ. Удалив из PG59500 нт Bglll фрагмент, содержащий sopA и sopB гены, получили плазмиду PG591. Вставив lacZYA гены из pNSPoi (Pad - ХтаШ фрагмент) между РасI и Notl сайтами в pG59, получили pNSP03 - линейную плазмиду, несущую lac оперон под контролем промотора sop оперона N15.

Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension анализа транскрипции sop оперона N15

Для анализа транскрипции sop оперона N15 использовали плазмиды pNSPoi, pNSP02. Для снижения негативного влияния высокого уровня (3-галактозидазы на рост штаммов с плазмидой pNSPoi из этой плазмиды был удален BamHI-BsrGI фрагмент, содержащий основную часть lac оперона, и получена плазмида pNSP02.9Ta плазмида использовалась как источник РНК для primer extension анализа. Ti терминатор оперона sop N15 поместили между промоторным фрагментом и LacZ. SopAB-Ti фрагмент был амплифицирован на ДНК N15 с праймерами PRi и PR6 и затем вставлен в сайт Smal в вектор pUC9. Полученную плазмиду обрабатывали BamHI и Nrul для удаления большей части вставки, за исключением юонт фрагмента с терминатором, обработали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, а затем лигировали для получения pUC-Ti. Эта плазмида была обработана Sau$A, полученный фрагмент Ti длиной 237 нт вставлен в ВатШ сайт pNSPoi и PNSP04. Таким образом, терминатор Ti был размещен в естественной ориентации после промотора sop оперона. Размер sop-специфичных РНК, которые могли быть получены на этих плазмидах, ожидался от 140 нт (относительно «А» в стартовом кодоне sopA до первой «Т», следующей за инвертированным повтором терминатора Ti) до 601нт (от левого конца sopP до Ti).

Плазмиды. используемые в эксперименте по изучению регуляции экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15

Плазмида pJDioi (Denke et al, 2000) была использована для конститутивной экспрессии протеломеразы, а соответствующий «пустой» вектор PMS119EH - в качестве отрицательного контроля. В параллельном эксперименте с той же целью использовали линейную плазмиду pNPoi и соответствующий вектор PZC176 (Ravin et al, 2001). Вектор PZC176 основан на репликоне плазмиды Pi и содержит гены, необходимые для репликации и стабильного наследования Pi (мини-Pi). pNPoi была получена в результате клонирования фрагмента ДНК N15, содержащего telRL сайт и telN ген, в PZC176, что приводило к ее линеаризации и дальнейшему поддержанию в линейной форме (Ravin et al, 2001).

Линейная плазмида PG591 основана на репликоне N15 и содержит все гены, необходимые для репликации и контроля числа плазмиды N15, включая ген

протеломеразы (см. выше). Кольцевая плазмида pG59ic получена из PG591 путем делегирования теломер и telN гена (рестрикция Styl + ВатШ, обработка концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы и лигирование с геном устойчивости к тетрациклину, вырезанному из плазмиды pKRPi2 с помощью Smal). Плазмида pNF04 содержит репликон F-фактора Е. coli, а также теломеры и ген протеломеразы N15 и реплицируется в линейной форме (Ravin et al, 2001).

Фрагмент ДНК N15, содержащий предполагаемый промотор гена протеломеразы Ptel (от -175 до -ю нт относительно «А» в ATG кодоне гена telN) был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров telRL-i и telRL-3. Этот фрагмент был клонирован между ЕсоШ. и BamHl сайтами репортерного вектора PRS551 (Simons et al, 1987) на 5' конце гена lacZ (плазмида pRSssiPtel). Поскольку вектор PRS551 основан на репликоне PBR322 и, следовательно, несовместим с плазмидами pJDioi и pMSngEH, имеющими тот же репликон, мы сконструировали производное pRSssiPtel, содержащее совместимый с PBR322 репликон pSCioi. С этой целью Ncol - Seal фрагмент плазмиды pRSssiPtel, содержащий PBR322 ori, заменили JVcol - ECI136II фрагментом плазмиды pZS2i* (Lutz and Bujard, 1997) содержащем репликон плазмиды pSCioi. В результате была получена плазмида pZS-Ptel, совместимая со всеми векторами, использованными для экспрессии генов N15. Для изучения влияние профага N15 на уровень активности Ptel промотора в pZS-Ptel был получен лизогенный штамм DHioB(Ni5)/pZS-Ptel.

Плазмиды. используемые для определения скорости потери линейных репликонов N15

Для изучения влияния количества центромер на процесс стабильного наследования было необходимо создать серию плазмид, содержащих разное число центромер, и определить, какое значение имеет их распределение в геноме N15. За основу была взята линейная плазмида PG591 с одной центромерой внутри гена репликации герА. Для получения не содержащей центромеру плазмиды PG595 было необходимо инактивировать центромеру, при этом не нарушив процесс репликации, что было выполнено с помощью сайт-направленного мутагенеза. ДНК N15 обрабатывали Rsal и, выделенный фрагмент длиной 1200 нт, циркуляризовали путем лигирования с помощью Т4

DNA лигазы. ПЦР фрагмент с использованием олигонуклеотидов PR43mutiN и PR43mut2N содержащих замены в области инвертированного повтора был получен на лигированной ДНК. Полученный в результате ПЦР продукт лигировали для получения кольцевой молекулы и использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами PR077 и 37S1. Получившийся фрагмент обрабатывали EcoRI и вставляли в PG591 (замещая эквивалентный ЕсоШ фрагмент, не содержащий мутации). Плазмиды PG593, PG598 и PG599 содержащие дополнительные одну или две центромеры, получали вставкой в Pacl сайт плазмид PG591 или PG595 фрагмента, содержащего один или два инвертированных повтора (IR), разделенных последовательностью длиной примерно 2 тпн, предварительно клонированного в векторе pGEM-T. Последовательность, содержащую инвертированный повтор, получали ПЦР на матрице ДНК N15 с праймерами PR3 и IR2-R и вставляли в pGEM-T по сайтам Pstl и Sphl для получения PG593 и PG598. pGEM-IR использовали для создания последовательности, содержащей две инвертированных повтора, разделенных небольшим участком, для этого в вектор по сайту ЕсоШ был помещен Seal фрагмент ДНК фага X длиной 2000 нт. Второй центромерный сайт получали отжигом олигонуклеотидов IRspi и IRsp2 между собой и вставляли по сайтам AgeI и BssHII. Плазмиды PG750, PG751 и PG752 получали на основе PG595, поместив полученный отжигом праймеров PRIR3-SexAI и PRIR3-BstBI инвертированный повтор в сайты SexAI и BstBI. Для изучения влияния длины линейной плазмиды на ее стабильность были получены производные всех использованных плазмид за исключением PG595, содержащие вставку ДНК фага X длиной 22 тпн в сайт Bglll. В качестве контроля использовали кольцевую плазмиду pNCio на основе репликона N15 с одной центромерой в герА.

Плазмиды. используемые для определения внутриклеточной локализации линейных репликонов

Для изучения внутриклеточной локализации использовалась система с двумя гибридными флуоресцентными белками синего (Cfp::CI (cyan fluorescent protein fused to lambda repressor)) и желтого цвета (Yfp::TetR (yellow fluorescent protein fused to Tet repressor)), способными специфично взаимодействовать с сайтами связывания операторов лямбда (L-О) и Tet (Tet-O) соответственно (Lau et al, 2003). При этом в живой бактериальной клетке образуются фокусы флуоресцентного свечения, соответствующие положению сайтов-мишеней в

клетке. Линейная плазмида-мишень основана на репликоне N15 и содержится в клетке в количестве 4-6 копий на хромосому, содержит два центромерных сайта, достаточно удаленных друг от друга, а также набор из 64 CI -операторов лямбда (L-0 23 нт последовательности оператора, разделенные 5 нт вставками) вблизи одной центромеры и набор из 48 Tet операторов (Tet-0 19 нт последовательности, разделенные случайными ю нт вставками) вблизи другой. Такая система позволяет не только определить положение плазмиды в клетке, но и изучить возможное взаимодействия центромерных сайтов между собой в различных условиях. Плазмида-мишень PDAG711 несет точечную замену (мутация ts52, Ravin et al, 2003), приводящую к нарушению нормального процесса репликации при 37°С и позволяющая достигнуть при повышении температуры от 30 до 37°С такого состояния, когда в клетке будет находится одна копия плазмиды. Для получения PDAG711 была проведена серия экспериментов по клонированию. В плазмиду PDAG294 в сайты BsfAPI и Styl был вставлен инвертированный повтор, полученный отжигом двух праймеров PR IR3_FLi и PR IR3_FL3. Из PDAG498 был вырезан фрагмент HindUl-Clcil, содержащий Tet-O, и вставлен по соответствующим сайтам в плазмиду pRFBii2, содержавшую L-О, таким образом, получена PDAG704. Фрагмент Seal с сайтами связывания флуоресцентных гибридных белков из PDAG704 клонировали в Hindll сайт PDAG703. PDAG703 обработали Рей, затем фрагментом Кленова и Apal и вставляли фрагмент Ech^6ll-Apal из PDAG705 длиной 5233 нт. получив PDAG706.

yfp::tetR cfp::CI

/ \

IR ' A DNA 22kb 41 IR

О' inintrr^ii— n^inin Q

repA tetO array LO array

yfp::tetR - hybrid yellow fluorescent protein cfp::CI - hybrid cyan fluorescent protein

IR - центромерный сайт

Рисунок 9. Линейная плазмида-мишень на основе репликона N15 для экспериментов по изучению внутриклеточной локализации с помощью гибридных флуоресцентных белков. герА - ген репликации; IR -центромерный сайт; tetO array - набор Tet операторов; LO - набор лямбда операторов; X DNA 22kb - вставка ДНК фага лямбда для увеличения дистанции между центромерными сайтами. yfp::tetR - жетлый гибридный флуоресцентный белок; cfp::CI - синий гибридный флуоресцентный белок.

Фрагмент ДНК фага X был клонирован в сайт Bglll, получена плазмида PDAG707, из которой Notl фрагмент длиной 27937 нт вставили в соответствующий сайт pG595ts52 и получили линейную плазмиду мишень PDAG711.

Для экспрессии Sop белков N15 использовали плазмиды PDAG242 (экспрессия SopA одновременно с SopB) и PDAG713 (экспрессия SopB), полученная из PDAG242 путем удаления последовательности гена sopA по сайтам NsiI и Pacl, обработкой концов фрагментом Кленова ДНК полимеразы с последующим лигированием.

Плазмида PDAG709, использованная для экспрессии обоих гибридных флуоресцентных белков, была получена вставкой NheI - Stul фрагмента длиной 1527 нт из pRFGii5 в сайт Hindlll с предварительно обработанными фрагментом Кленова ДНК полимеразы концами. Полученная конструкция содержит оперон, включающий в себя гены tetR::Yfp и cI::eCfp под контролем арабинозо-индуцибельного промотора агаРвдо. Производные плазмиды PG711 с одним (PG720) или без центромерных сайтов (PG721) были получены аналогичным образом, за исключением стадии вставки инвертированного повтора в PG294.

Трансформация Е. coli

Для трансформации использовали стандартную методику (Sambrook et al, 1989) со следующей модификацией: вместо буфера TFB использовали буфер следующего состава: [СаС12 50 mM, КС1 ЮО тМ, МпС12 ю тМ, HEPES ю тМ, рН 6.3].

Выделение плазмиднойДНК

Для выделения плазмидной ДНК использовали стандартные методики, основанные на щелочном лизисе (Sambrook et al, 1989). Дополнительную очистку плазидной ДНК, в случае необходимости, проводили при помощи наборов Wizard Miniprep (Promega) или Qiagen (Diagen Gmbh.) следуя указаниям производителя.

Электрофорез ДНК

Электрофорез ДНК проводили в lxTAE - буфере с использованием агарозы производства фирм Chemapol и Sigma. В качестве маркеров для определения молекулярных масс фрагментов ДНК использовали Hindlll

рестрикционные фрагменты ДНК фага лямбда или GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas).

Определение активности sop промотора

Эксперименты проводили, используя штаммы pNSPoichr, pNSP04chr, pNSPo6chr и MCio6i/pNSPo3, или тот же штамм, содержащий плазмиды, экспрессирующие различные ре1уляторные факторы. Бактерии выращивали в LB-бульоне при 37 °С до OD600 = 0.2-0.4, активность (3-галактозидазы определяли методом Миллера (Miller, 1972).

Получение радиоактивно-меченых ПЦР фрагментов

Фрагмент ДНК N15 длиной 200 нт., содержащий промотор sop оперона, был получен с помощью ПЦР с использованием праймеров PR3 и PR24. Контрольный ПЦР фрагмент длиной 143 нт, не содержащий N15 Psop, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров PR24 и F18, и ДНК плазмиды pNR-SOE3 (Ravin et al, 2003) в качестве матрицы. Оба фрагмента были очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.

Для получения радиоактивно-меченых зондов i пмоль ПЦР фрагментов обрабатывали Т4-полинуклеотидкиназой в присутствии 50MK Ci у-з2Р АТР, следуя указаниям производителя. Очистку ПЦР-фрагментов от невключившегося изотопа осуществляли посредством двухкратного переосаждения этанолом.

Анализ транскриптов методом Northern blot и primer extension анализ

Выделение РНК, Northern blot, primer extension анализ, приготовление радиоактивно-меченых з2Р олигонуклеотидов и гибридизация проводились по методике, описанной ранее (Ravin et al, 1999)- Меченые згр пробы специфичные для sopPi и sopP2 фрагментов были получены с помощью Prime-a-Gene Labelling kit (Promega). Праймер PR48 использовался в синтезе радиоактивных меченых проб для primer extension анализа.

Анализ транскриптов с помощью ОТ-ПЦР

Выделение РНК для ОТ-ПЦР анализа производилось как описано в работе Ravin et al., 1999> за исключением того, что образцы РНК были

дополнительно обработаны RNAse free DNAse (Promega) и очищены с помощью набора QIAGEN RNA Easy Mini kit по прилагаемому стандартному протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: один микрограмм РНК инкубировали в 50мкл MMLV буфера с 400 единицами MMLV reverse transcriptase (Promega), 4мкг случайных хексадиоксирибонуклеотидов и 0,2 мМ dNTPs в присутствии 2 единиц RNAsin (Promega) в течении одного часа при 37°С. Затем добавляли десять единиц Т4 DNA ligase и инкубировали 20 минут. Реакцию останавливали нагреванием до 65°С и хранили при -20°С. Разведения полученной кДНК использовались в качестве матрицы для ПЦР с использованием двух пар праймеров: PR28L+PR1 для амплификации кДНК транскриптов, начинающихся только с Р2 (фрагмент 452 нт, FRi), и PR28L+PR28R для амплификации кДНК, полученной как с Pi, так и с Р2 транскриптов (фрагмент 316НТ, FR2). Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и окрашивались этидиум бромидом. Фрагменты не были получены в контрольном эксперименте, когда обратная транскрипция не проводилась. Это служит доказательством того, что полученные продукты ПЦР не являются результатом загрязнения препарата ДНК N15.

Для изучения активности промоторов sop оперона при литическом развитии использовали тот же набор праймеров и условия реакции. Использовали лизогенный по N15 штамм DHl0B(Ni5)/pBAD24_3i, индукция гена 31 с помощью 0,1% арабинозы приводила к инактивации главного репрессора и началу литического развития профага. Образцы РНК выделяли из культуры, отобранной на различных стадиях лизиса (точки: о мин.; ю мин.; 50 мин.; 6о мин. с момента индукции).

Изучение влияния Sop белков на число копий плазмид.

Штамм DH10B содержал линейные плазмиды на основе репликона N15, не содержащие sop оперон: PG591 с центромерным сайтом в пределах гена герА или PG595 с инактивированным центромерным сайтом. Влияние Sop белков N15 на число копий изучали, экспрессируя их конститутивно; pZS2i - «пустой» вектор в качестве контроля, PDAG242 - SopAB, PDAG713 - SopB и PDAG408 -SopA. Препараты ДНК выделяли из ночной культуры, кольцевые плазмиды линеаризовывали с помощью NotI, не имеющего сайта в линейных плазмидах, и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Об изменении

числа копий судили, сравнивая интенсивности полос, соответствующих изучаемым плазмидам, с интенсивностью полос, соответствующих референсным плазмидам (pZS2i, PDAG242, PDAG713, PDAG408).

Получение белковых экстрактов

Культуры DHioB/pUC9 и DH10B/PNR213 (pUC9 с клонированными N15 sopA и sopB генами) выращивали при 37°С на качалке до OD6oo=o.3,вносили ИПТГ до 1мМ и продолжали выращивание в течение следующих 3 часов. Клетки в количестве, соответствующем юмл раствора СЮбоо=2.о, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 450 мкл раствора юмМ Трис рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, юо мМ NaCl, 20% сахарозы. Белковый состав бактериальных культур анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (Sambrook et al, 1989; Watson, 1972).

Для получения препарата белков клетки лизировали, путем внесения лизоцима (0.4 мгр/мл, 15 мин инкубации при +4°С) с последующей обработкой ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли посредством двухкратного центрифугирования при i4000g в течение 15 мин при +4°С.

Концентрацию белков в супернатанте определяли при помощи BioRad Protein Assay Kit (Biorad), следуя указаниям производителя. Полученные препараты белков разводили до концентрации 400 мкгр/мл в реакционном буфере, содержащем somM HEPES-KOH (pH=7.s), 50mM NaCl, ютМ MgCl2, 10% глицерина, юо мгкр/мл бычьего сывороточного альбумина, юо мкгр/мл ДНК спермы лосося, и 1 мМ дитиотритола.

Взаимодействие фрагментов ДНК с белковыми экстрактами

Реакции связывания in vitro проводили, смешивая по o.oi пмоль опытного и контрольного фрагмента ДНК с 0.125 мкгр, о.25мкгр, 0.5 мкгр, i мкгр, или 2 мкгр. белкового препарата, полученного из DHioB/pUC9 (пробы 15) или DH10B/PNR213 (пробы 6-ю) в ю мкл буфера, содержащего 50мМ HEPES-KOH (рН=7.5), 50mM NaCl, ютМ MgCl2, 10% глицерина, юо мкгр/мл бычьего сывороточного альбумина, юо мкгр/мл ДНК спермы лосося, и 1 мМ дитиотритола. В контрольных экспериментах смешивали 2 мкгр белкового препарата DH10B/PNR213 с Psop фрагментом (проба и) или контрольным фрагментом ДНК N15 (проба 12). Реакционные смеси инкубировали при +зо°С в течение 15 минут и анализировали с помощью электрофореза в 5%

полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в ТВЕ-буфере, по окончании электрофореза гель переносили на лист ватмана DE8i, высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Определение активности Ptel промотора

Эксперименты проводили, используя штамм DHioB/pZS-Ptel или тот же штамм, содержащий плазмиды, экспрессирующие TelN. Активность Ptel промотора также измеряли в лизогенном по N15 штамме, DHioB(Nis)/pZS-Ptel. Бактерии выращивали в LB-бульоне при 37°С в течение 12-16 часов до достижения ими стационарной фазы (СЮбоо = 1.0 - 2.0), активность (3-галактозидазы определяли методом Миллера (Miller, 1972).

Определение эффективности трансформации

Эксперименты по определению эффективности трансформации проводили на штаммах МС1061 QisdR araDi39 А (агаАВС-1еи)7б79 A (lac)X74 galU galK rpsL thi) и DH10B (araDi39 A (ara, 1еи)7б97 A lac)X74 galU galK rpsL deoR <j>8o lacZ AMIS endAi nupG recAl mcrA A mrr hsdRMS mcr ВС)) . Компетентные клетки готовили согласно (Sambrook et al, 1989) с использованием буфера (50 шМ СаС12, юо mM КС1, 10 тМ HEPES, l тМ МпС12). Стандартные трансформационные пробы включали 200 ц1 компетентных клеток и 0.1 jag, 0.01 }xg или o.ooi jag плазмидной ДНК.

Флуоресцентная микроскопия

Для получения четких фокусов флуоресцентного свечения в клетках ночную культуру выращивали при зо°С, разводили 1:100, выращивали до оптической плотности СЮбоо = 0.2. Индукцию экспрессии гибридных флуоресцентных белков проводили путем добавления в среду от 0,005% Д° 0,0005% арабинозы и последующего инкубирования в течении 30 минут. Экспрессию останавливали добавлением в среду равного количества глюкозы (0,005 - 0,0005%), затем культуры выращивали еще в течении двух часов. Для получения одной копии линейной плазмиды в клетке ночную культуру выращивали при 30°С, разводили в юо раз и выращивали при 37°С без канамицина в течении 4 часов. Индукцию экспрессии гибридных флуоресцентных белков проводили аналогичным образом. Культуру клеток

объемом io мл концентрировали центрифугированием и ресуспендировали в 1,5 мл. Отбирали з мкл для нанесения на предметное стекло со слоем агарозы (i% агарозы, 10% LB) или на предметное стекло Polysine™ (Polysine Microscope Slides), фиксировали покровным стеклом. Цифровые изображения получали с помощью микроскопа Olympus IX 81 с хюо объективом, соединенного с фотокамерой Roper Coolsnap HQ (Olympus Corp.). Фотографии получали и анализировали с помощью пакета обработки изображений MetaMorph® Imaging System V6.3. Для внутриклеточной локализации флуоресцентных фокусов совмещали желтый и синий цветовые каналы с изображением мембраны клетки, сделанным в белом свете. Расположение фокусов в клетке рассчитывали, измеряя расстояние от полюса, принимая значение одного пикселя цифрового изображения равным 0,064 мкм- Контроль специфичности образования фокусов проводили в культуре клеток, не содержащих плазмиды-мишени с сайтами связывания флуоресцентных белков. Влияние Sop белков N15 на положение фокусов в клетке изучали, введя плазмиды экспрессирующие SopA+SopB (PDAG242) и SopB (PDAG713).

Определение скорости потери линейных плазмид

Стабильность наследования линейных плазмид, основанных на репликоне N15, изучали, определяя скорость их потери в процентах на генерацию. Оценивали долю клеток, сохранивших устойчивость к антибиотику при выращивании в среде без селективного фактора, используя стандартный метод реплик на чашках (Ravin and Lane, 1999). Эксперимент начинали с колоний трансформантов, содержащих исследуемые плазмиды. Ночные культуры, выращенные с антибиотиком, разводили в юз, ю6 раз в LB бульоне без антибиотика, далее выращивали до стационарной фазы и определяли фракцию клеток, содержащих плазмиду. Для этого культуры рассевали на LB агаре, не содержащем антибиотик, и делали реплики на чашки антибиотиком. Разведения и выращивание повторяли для того, чтобы получить культуру клеток от ю до юо генераций. В эксперименте по изучению стабильного наследования в присутствии Sop белков использовали плазмиду pDAG2i6 (Cm+), во всех случаях сохраняя для нее селективный фактор (хлорамфеникол). Скорость потери линейной плазмиды на одну генерацию (L) определяли по формуле % L = 1 - (Ff / Fi)Vn х юо где - Fi фракция клеток, содержащих

плазмиду первоначально, a Ff, - фракция клеток, содержащих плазмиду после роста на протяжении N генераций в неселективных условиях.

Для демонстрации того, что sop оперон N15 обеспечивает именно сегрегационную стабильность, а не увеличение числа копий плазмиды вследствие активации репликации, число копий исследуемых линейных репликонов определяли количественно, сравнивая интенсивности полос линейной и контрольной плазмиды в агарозном геле. Выделенные препараты плазмидной ДНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Относительные интенсивности полос на цифровых фотографиях определяли с помощью программы TINA-PCBas или TotalLab v.2,01 и определяли отношения интенсивности полосы, соответствующей тестируемой линейной плазмиде, к полосе, соответствующей стабильной корезидентной плазмиде PBR322, принимая во внимание длины плазмид и долю бесплазмидных клеток. В результате определяли относительное число копий тестируемой плазмиды относительно PBR322, число копий которой постоянно и не зависит от экспрессии Sop белков.

Результаты

Регуляция экспрессии sop оперона N15

Структура sop оперона плазмиды N15

Sop локус N15 расположен в районе правого конца линейной плазмиды (Рис.11). Оперон включает два гена, sopA и sopB, имеющих 75% и 49% гомологию по аминокислотным последовательностям с соответствующими генами плазмиды F. Участок длиной около 150 нт, предшествующий sopA, также гомологичен соответствующему району плазмиды F и содержит промотор sop оперона, Pisop, (Ravin and Lane, 1999). Этот район содержит 5 копий последовательности CTTTGC, разделенных А/Т богатыми участками, причем эти повторы перекрывают последовательности -35 и -10 sop промотора (Рис.п). Соответствующий фрагмент плазмиды F содержит 4 копии последовательности CTTTGC, расположенных аналогично четырем из пяти соответствующих последовательностей N15. В отличие от F Psop, промотор sop оперона N15 содержит сайт связывания бактериального белка IHF (integration host factor). Для плазмиды F было показано, что SopA репрессирует Psop, причем величина репрессии многократно увеличивается в присутствии SopB. Более того, Sop белки N15 способны репрессировать F Psop, хотя и в меньшей степени, чем собственные белки плазмиды F (Ravin and Lane, 1999).

Последовательность длиной 448 нт от правого конца линейного профага N15 до начала гена sopA содержит уже известный промотор Pisop (Ravin and Lane, 1999). Транскрипция, инициируемая с этого промотора, регулируется белком SopA. Последовательность длиной 380 нт перед этим районом не имеет гомологии с последовательностью F, причем компьютерным анализом было предсказано возможное наличие пяти потенциальных промоторов (Ravin et al, 2000; Grigoriev and Lobocka, 2001), однако существование ни одного из них не было доказано экспериментальным образом.

AAAAGCCCCACATACGTGGGGCTTTT

В

О

Ptel

Р telN

pNSP03

telR

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дорохов, Борис Дмитриевич, 2007 год

Цитированная литература

1. Голуб Е.И., Равин В.К. (1967) Новая система фаговой конверсии. Доклады АН СССР, 174,4б5-4б7

2. Малинин А.Ю., Васильев А.Л., Холодий Г.А., ВостровАА, Рыбчин В.Н., Сварчевский А.Н. (1992b) Структура области в геноме бактериофага N15, необходимая для образования шпилек на концах линейного плазмидного профага, Мол.Генет.Микроб. Вирусол., 5-6, 22-25

3. Малинин А.Ю., Востров А.А., Рыбчин В.Н., СварчевскийА.Н. (1992а) Структура концов линейной плазмиды N15. Мол. Генет. Микроб. Вирусол., 5-6,19-22

4. Прозоров А.А., (2005) Клеточный цикл бактерий: репликация ДНК, распределение нуклеоидов, деление. Микробиология, б, 74-4,437-4515. Равин В.К. (1971) Лизогения. Издательство «Наука», Москва, 1971.

6. Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. (1984b) Физическое картирование ДНК фазмиды N15. Мол.Генет.Микробиол.Вирусол., ю, 16-22

7. Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. (1984а) Характеристика плазмидных свойств бактериофага N15. Мол.Генет.Микроб.Вирусол., ю, 34-39

8. Abeles A.L., S.A. Friedman and S.J. Austin (1985) Partition of unit-copy miniplasmids to daughter cells. III. The DNA sequence and functional organization of the Pi partition region. J. Mol Biol 185, 261-272

9. Adachi, S., Hon, K. and Hiraga, S. (2006). Subcellular Positioning of F Plasmid Mediated by Dynamic Localization of SopA and SopB. J. Mol Biol 356: 850-863.

10. Austin S. and A. Abeles (1983) Partition of unit-copy miniplasmids to daughter cells. II. The partition region of miniplasmid Pi encodes an essential protein and a centromere-like site at which it acts. J. Mol Biol 169,373-387.

11. Austin, S. and A. Wierzbecki. (1983). Two mini-F-encoded proteins are essential for equipartition. Plasmid, 10:73-81

12. Barilla D, Rosenberg MF, Nobbmann U, Hayes F. (2005) Bacterial DNA segregation dynamics mediated by the polymerizing protein ParF. EMBO J. 2005,24(7): 1453-64

13. Biek, D.P. and J. Shi. (1994). A single 43-bp sopC repeat of plasmid mini-F is sufficient to allow assembly of a functional nucleoprotein partition complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8027-8031

14. Bignell, C. R., Haines, A. S., Khare, D. & Thomas, С. M. (1999) Effect of growth rate and incC mutation onsymmetric plasmid distribution by the IncP-i partitioning apparatus. Mol. Microbiol. 34,205-216.

15. Bouet J.Y., J.A. Surtees and B.E. Funnell (2000) Stoichiometry of Pi plasmid partition complexes. J. Biol. Chem. 275,8213-8219.

16. Bouet, J.Y. and Funnell, B.E. (1999) Pi ParA interacts with the Pi partition complex at parS and an ATP-ADP switch controls ParA activities. EMBO J, 18, 1415-1424

17. Bzymek, M, and Lovett, S.T. (2001) Evidence for Two Mechanisms of Palindrome-Stimulated Deletion in Escherichia coli: Single-Strand Annealing and Replication Slipped Mispairing. Genetics, 158: 527-540.

18. Casadaban, M.J. and S.N. Cohen. (1980). Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 138:179-207

19. Connelly, J.C., Kirkham,L.A., Leach,D.R. (1998) The SbcCD nuclease of Escherichia coli is a structural maintenance of chromosomes (SMC) family protein that cleaves hairpin DNA. Proc.NatlAcad.Sci.USA, 95: 7969-7964

20.Cromie GA, Millar CB, Schmidt KH, Leach DR (2000) Palindromes as substrates for multiple pathways of recombination in Escherichia coli. Genetics.154:513-22.

21. Davis M.A. and S.J. Austin (1998) Recognition of the Pi plasmid centromere analog involves binding of the ParB protein and is modified by a specific host factor. EMBO J. 7,1881-1888.

22. Davis M.A., K.A. Martin and S.J. Austin (1992), Biochemical activities of the ParA partition protein of the Pi plasmid. Mol. Microbiol. 6, 1141-1147

23. Davis M.A., K.A. Martin and S.J. Austin (1992), Biochemical activities of the ParA partition protein of the Pi plasmid. Mol. Microbiol. 6, 1141-1147

24. Davis M.A., K.A. Martin and S.J. Austin (1990) Specificity switch of the Pi plasmid centromere-like site. EMBO J. 9, 991-998

25- Davis M.A., L. Radnedge, K.A. Martin, F. Hayes, B. Youngren and S.J. Austin (1996) The Pi ParA protein and its ATPase activity play a direct role in the segregation of plasmid copies to daughter cells. Mol. Microbiol. 21, 10291036

26. Delbruck H, Ziegelin G, Lanka E, Heinemann U. (2002) An Src homology 3-like domain is responsible for dimerization of the repressor protein KorB encoded by the promiscuous IncP plasmid RP4. J Biol Chem. 2002,277(6): 4191-8

27. Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E. (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U SA 97(14), 7721-7726.

28.Dorokhov, B.D., Lane, D., Ravin, N.V. (2003) Partition operon expression in the linear plasmid prophage N15 is controlled by both Sop proteins and protelomerase. Mol. Microbiol., 50,713-721.

29.Ebersbach G, Gerdes K. (2004) Bacterial mitosis: partitioning protein ParA oscillates in spiral-shaped structures and positions plasmids at mid-cell. Mol Microbiol. 2004,52(2): 385-98.

30. Edgar, R., Chattoraj, D.K. and Yarmolinsky, M. (2001) Pairing of Pi plasmid partition sites by ParB. Mol Microbiol, 42,1363-1370.

31. Erdmann N, Petroff T, Funnell BE. (1999) Intracellular localization of Pi ParB protein depends on ParA and ParS. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (1999), 14905-14910.

32. Friedman S.A and S.J. Austin (1988) The Pi plasmid-partition system synthesizes two essential proteins from an autoregulated operon. Plasmid 19, 103-112

33. Funnell В E (1988b) Participation of Escherichia coli integration host factor in the Pi plasmid partition system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6657-6661

34. Funnell B.E, (1991) The Pi plasmid partition complex at parS: the influence of Escherichia coli integration host factor and of substrate topology. J. Biol.

Chem. 266 (1991), 14328-1433735. Funnell B.E. (1988a) Mini-Pi plasmid partitioning: excess ParB protein destabilizes plasmids containing the centromere parS. J. Bacteriol. 170, 954960

36.Funnell B.E. and L. Gagnier (1994) Pi plasmid partition: binding of Pi ParB protein and Escherichia coli integration host factor to alter parS sites. Biochemie, 76,924-932.

37. Funnell, В. E. (2005) Partition-mediated plasmid pairing. Plasmid, 53,119125.

38.Garner E.C, Campbell C.S, Mullins R.D. (2004) Dynamic instability in a DNA-segregating prokaryotic actin homolog. Science, 306,1021-1025.

39.Gerdes K, Moller-Jensen J, Ebersbach G, Kruse T, Nordstrom K. (2004) Bacterial mitotic machineries. Cell, 116,359-366.

40.Gerdes, K., J. Moller-Jensen, and R. B. Jensen. (2000) Plasmid and chromosome partitioning: surprises from phylogeny. Mol. Microbiol. 37:455466.

41. Goosen N., van de Putte P. (1995). The regulation of transcription initiation by integration host factor. Mol Microbiol. 16,1-7.

42. Gordon, G.S., D. Sitnikov, C.D. Webb, A. Teleman, A. Straight, R. Losick, A.W. Murray and A. Wright (1997). Chromosome and low copy plasmid segregation in E.coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell 90:1113-1121

43. Grant, S.G., J. Jessee, F.R. Bloom and D. Hanahan. (1990). Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci USA 87:4645-4649

44.Grigoriev P.S., Lobocka M.B. (2001). Determinants of segregational stability of the linear plasmid-prophage N15 of Escherichia coli. Mol Microbiol. 42,355368.

45. Guzman, L-M., Belin, D., Carson, M.J. and Beckwith, J. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing arabinose Pbad promoter. J Bacteriol 177,4121-4130.

46. Hayes F, Barilla D. (2006) The bacterial segrosome: a dynamic nucleoprotein machine for DNA trafficking and segregation. Nat Rev Microbiol. 4(2):i33-43.

47. Hayes F., L. Radnedge, M.A. Davis and S.J. Austin (1994) The homologous operons for Pi and P7 plasmid partition are autoregulated from dissimilar operator sites. Mol. Microbiol. 11, 249-260

48. Hayes, F, and Barilla, D. (2006) Assembling the bacterial segrosome. Trends Biochem Sci. 2006,3i(5):247-50.

49. Hiraga S., (1992) Chromosome and plasmid partition in Escherichia coli. Annu. Rev. Biochem. 61, 283-306

50. Jacob, S. Brenner and F. Cuzin, (1963), On the regulation of DNA replication in bacteria. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28 329-348.

51. Jagura-Burdzy G, Kostelidou K, Pole J, Khare D, Jones A, Williams DR, Thomas CM. (1999) IncC of broad-host-range plasmid RK2 modulates KorB transcriptional repressor activity In vivo and operator binding in vitro. J Bacteriol. i8i(9):2807-15.

52. Jensen R.B. and K. Gerdes, (1999) Mechanism of DNA segregation in prokaiyotes: ParM partitioning protein of plasmid Ri co-localizes with its replicon during the cell cycle. EMBO J. 18, 4076-4084

53. Jensen R.B. and L. Shapiro, (1999) Chromosome segregation during the prokaryotic cell division cycle. Curr. Opin. Cell Biol. 11,726-731

54. Jensen RB, Lurz R, Gerdes К (1998) Mechanism of DNA segregation in prokaryotes: replicon pairing by ParC of plasmid Ri. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 95.8550-8555.

55. K. Gerdes, T. Thisted and J. Marinussen, Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid Ri: sok antisense RNA regulates formation of hok mRNA species correlated with killing of plasmid-free cells. Mol. Microbiol. 4 (1990), pp. 1807-1818

56. K. Gerdes, T. Thisted and J. Marinussen, Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid Ri: sok antisense RNA regulates formation of hok mRNA species correlated with killing of plasmid-free cells. Mol. Microbiol. 4 (1990), pp. 1807-1818

57. Khare D, Ziegelin G, Lanka E, Heinemann U. (2004) Sequence-specific DNA binding determined by contacts outside the helix-turn-helix motif of the ParB homolog KorB. Nat Struct Mol Biol, 11(7): 656-63

58. Kim S.K. and J.C. Wang, (1998) Localization of F plasmid SopB protein to positions near the poles of Escherichia coli cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

, 1523-1527

59. Kim, H. J., Calcutt, M. J., Schmidt, F. J., and Chater, K. F. (2000) Partitioning of the linear chromosome during sporulation of Streptomyces coelicolor Аз(г) involves an oriC-linked parAB locus. J Bacteriol 182:1313-1320

60.Lau, I.F., Filipe, S.R., Soballe, В., Okstad, O.A., Barre, F.X., and Sherratt, D.J. (2003). Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol 49:731-743.

61. Leach,D.R. (1994) Long DNA palindromes, cruciform structures, genetic instability and secondary structure repair. Bioessays. 16: 893-900

62.Lemonnier, M., Bouet, J.Y., Libante, V. and Lane, D. (2000) Disruption of the F plasmid partition complex in vivo by partition protein SopA. Mol Microbiol, 38,493-505

63. Li, Y., Dabrazhynetskaya, A., Youngren, B. & Austin, S. (2004) The role of Par proteins in the active segregation of the Pi plasmid. Mol Microbiol 53,93102.

64. Lim GE, Derman Al, Pogliano J. (2005) Bacterial DNA segregation by dynamic SopA polymers. Proc Natl Acad Sci USA., 102(49): 17658-63

65. Lobocka M, A. Svarchevsky, V. Rybchin and M. Yarmolinsky, (1996) Characterization of the primary immunity region of the Escherichia coli linear plasmid prophage N15. J. Bacteriol. 178,2902-2910

66.Ludtke N., B.G. Eichorn and S.J. Austin (1989) Plasmid-partition functions of the P7 prophage. J. Mol Biol 209, 393-406

67. Lutz, R. and H. Bujard. (1997). Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Ii-L regulatory elements. Nucleic Acids Res. 25:1203-1210.

68. Lynch, A.S. and Wang, J.C. (1995) SopB protein-mediated silencing of genes linked to the sopC locus of Escherichia coli F plasmid. Proc Natl Acad Sci U S A, 92,1896-1900.

69. Martin K.A., M.A. Davis and S. Austin (1991), Fine-structure analysis of the Pi-plasmid partition site. J. Bacteriol 173, 3630-3634

70. Meyer, R., and M. Hinds. (1982) Multiple mechanisms for expression of incompatibility by broad-host-range plasmid RK2. J. Bacteriol 152:10781090.

71. Miller, J.H. (1972). Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour,N.Y.

72. Moller-Jensen J, Borch J, Dam M, Jensen RB, Roepstorff P, Gerdes K. (2003) Bacterial mitosis: ParM of plasmid Ri moves plasmid DNA by an actin-like insertional polymerization mechanism. Mol Cell, 12,1477-1487.

73. Moller-Jensen J, Jensen RB, Lowe J, Gerdes K. (2002) Prokaryotic DNA segregation by an actin-like filament. EMBO J., 21,3119-3127.

74- Mori H., A. Kondo, A. Ohshima, T. Ogura and S. Hiraga (1986) Structure and function of the F plasmid genes essential for partitioning. J. Mol Biol. 174, 115

75. Niki H and S. Hiraga, (1999) Subcellular localization of plasmids containing the oriC region of the Escherichia coli chromosome, with or without the sopABC partitioning system. Mol. Microbiol. 34, 498-503

76. Niki H. and S. Hiraga, (1997) Subcellular distribution of actively partitioning F plasmid during the cell division cycle in E. coli. Cell 90, 951-957.

77. Ogura, T. and Hiraga, S. Partition mechanism of F plasmid: two plasmid gene-encoded products and a cis-acting region are involved in partition. Cell 32 (1983), pp. 351-360.

78. Radnedge L, Davis M.A, Austin S. J., (1996) Pi and P7 plasmid partition: ParB protein bound to its partition site makes a separate discriminator contact with the DNA that determines species specificity. EMBO J. 15,1155-1162

79. Ravin N.V, Rech J., Lane D. (2003). Mapping of functional domains in F plasmid partition proteins reveals a bipartite SopB-recognition domain in SopA. J. Mol. Biol., 329,875-889.

80.Ravin V., Ravin N., Casjens S., Ford M., Hatfull G., Hendrix R. (2000). Genomic sequence and analysis of the atypical bacteriophage N15. J. Mol. Biol, 299,53-73

81. Ravin, N., & Lane D. (1999) Partition of the linear plasmid, N15: functional interactions with the sop locus of the F plasmid. J. Bacteriol, 181,6898-6906.

82. Ravin, N.V. (2003) Mechanisms of replication and telomere resolution of the linear plasmid prophage N15. FEMS Microbiol Lett. 221:1-6.

83. Ravin, N.V., Strakhova, T.S., Kuprianov, V.V. (2001) The protelomerase of the phage-plasmid N15 is responsible for its maintenance in linear form. J. Mol Biol, 312,899-906

84. Ravin, V.K. and Shulga, M.G. (1970) Evidence for extrachromosomal location of prophage N15. Virology, 40,800-807.

85. Reece, K.S. and Phillips, G.J. (1995) New plasmids carrying antibiotic-resistance cassettes. Gene, 165,141-142.

86.Rodionov, 0. & Yarmolinsky, M. (2004) Plasmid partitioning and the spreading of Pi partition protein ParB. Mol Microbiol 52,1215-1223.

87. Rodionov, О., Lobocka, M. and Yarmolinsky, M. (1999) Silencing of genes flanking the Pi plasmid centromere. Science, 283,546-549.

88.Rybchin, V.N. and Svarchevsky, A.N., (1999) The plasmid prophage N15: a linear DNA with covalently closed ends. Mol Microbiol 33,895-903.

89.Sambrook, E.J. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edit, ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

90. Schumacher, M.A, and Funnell, B.E. (2005) Structures of ParB bound to DNA reveal mechanism of partition complex formation. Nature. 2005,438(7067): 516-9

91. Sharpe M.E. and J. Errington, (1999) Upheaval in the bacterial nucleoid. An active chromosome segregation mechanism. Trends Genet. 15, 70-74

92. Siddique, A., and Figurski, D.H., (2001) The active partition gene incC of IncP plasmids is required for stable maintenance in a broad range of hosts. J Bacteriol. i84(6):i788-93.

93. Simons, R.W., F. Houman and N. Kleckner. (1987). Improved single and multicopy lac-based cloning vector for protein and operon fusions. Gene 53:

85-96.

94.Surtees, J.A. and Funnell, B.E. (2001) The DNA binding domains of Pi ParB and the architecture of the Pi plasmid partition complex. J Biol Chem, 276, 12385-12394.

95. Surtees, J.A. and Funnell, B.E. (2003) Plasmid and chromosome traffic control: how ParA and ParB drive partition. Curr. Top. Dev. Biol 56,145-180.

96. Thomas, С. M., and C. A. Smith. (1986) The trfB region of broad host range plasmid RK2: the nucleotide sequence reveals incC and key regulatory gene trfB/korA/korD as overlapping genes. Nucleic Acids Res. 14:4453-4469.

97. van den Ent F, Moller-Jensen J, Amos LA, Gerdes K, Lowe J. (2002) F-actin-like filaments formed by plasmid segregation protein РагМ. EMBO J., 21, 6935-6943

98. Watson J. (1972) Origin of concatemeric T7 DNA. Nature New Biol, 239,197201.

99. Yates P., D. Lane and D.P. Biek (1999) The F plasmid centromere, sopC, is required for full repression of the sopAB operon. J. Mol Biol 290, 627-638

юо. Youngren В. and S. Austin (1997) Altered ParA partition proteins of plasmid Pi act via the partition site to block plasmid propagation. Mol Microbiol 25,1023-1030. 101. Yun, Т., Yanpnek, D., (1977). Electron microscope analysis of bacteriophage Pi, PiCm and P7. Determination of genomic size, sequence homology, and location of antibiotic-resistance determinants. Virology. 77,

376-385.