Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Лябин, Дмитрий Николаевич

• Лябин, Дмитрий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лябин, Дмитрий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1).

1. История открытия и номенклатура семейства Y-бокс-связывающих белков.

2. Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков.

2.1. Общие свойства Y-бокс-связывающих белков.

2.2. Свойства Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1).

2.2.1. Взаимодействие YB-1 с белками.

2.2.2. Особенности взаимодействия YB-1 с ДНК и РНК.

3. Функции YB-1 в ядре.

3.1. Участие YB-1 в транскрипции.

3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК.

3.3. Участие YB-1 в сплайсинге мРНК.

4. Функции YB-1 в цитоплазме.

5. Перераспределение YB-1 между ядром и цитоплазмой.

6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии.

7. YB-1 и раковая трансформация клеток.

8. Структура гена YB-1 и регуляция его экспрессии.

И. Роль 3' НТО мРНК в регуляции трансляции.

1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3' НТО.

2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3' НТО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Использованные в работе плазмиды. Получение конструкций, содержащих ген YB-1 с мутациями в регуляторной последовательности.

2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК.

3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli.

4. Обработка плазмиды рестриктазой.

5. Лигирование Т4-ДНК-лигазой.

6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

8. Выделение рекомбинаитного РАВР.

9. Выделение рексшбинантного YB-1.

10. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика.

11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы.

13. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины.

14. Метод замедления подвижности РНК-белковых комплексов в геле (Gel-shift assay).

15. РНК-белковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения.

16. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы.

17. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика.

18. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда).

19. Детекция мРНК YB-1 при помощи радиоактивного зонда (Northern-dot анализ)

20. Дефосфрилирование фрагмента РНК.

21. Мечение фрагмента РНК по 5' концу.

22. Картирование сайтов связывания белков с фрагментом РНК.

23. Биотинилирование РНК.

24. Выделение белков лизата ретикулоцитов кролика с использованием биотинилированной РНК.

25. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса.

2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса.

3. Локализация сайтов связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1 методом футпринтинга.

4. Подтверждение специфичности взаимодействия YB-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, идентифицированными методом футпринтинга.

5. РАВР и YB-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК YB-1.

6. Влияние мутаций в YB-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК YB-1 на её трансляцию.

7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1.

8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB-1.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и её место в общей регуляции белкового синтеза.

2. Возможные механизмы влияния YB-1 и РАВР на трансляцию мРНК YB-1.

3. Специфическое взаимодействие YB-1 с РНК.

4. Негативный эффект полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляцию как новый способ регуляции синтеза YB-1.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1»

Мультифункдиональный ядерно-цитоплазматический Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в обширную группу белков, содержащих домен холодового шока. Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 обладает онкогенной и антионкогенной активностью, повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации и является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости.

Участие YB-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его почти уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками. В ядре он участвует в регуляции транскрипции многих генов, вовлечен в процессы репликации и репарации ДНК, а также сплайсинга пре-мРНК. В цитоплазме YB-1 упаковывает мРНК в мРНП, стабилизирует мРНК и регулирует их трансляцию.

Характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит от его содержания в клетке и от его распределения между ядром и цитоплазмой. YB-1 может переходить в клеточное ядро под действием ксенобиотиков, повреждающих ДНК, и ультрафиолетового облучения, а также в определённый период митотического цикла или при активации некоторых сигнальных путей клетки. Содержание YB-1 в клетке зависит от скорости его синтеза и распада, а скорость синтеза определяется как эффективностью транскрипции гена YB-1, так и эффективностью трансляции его мРНК.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что регуляция синтеза YB-1 осуществляется при участии ~ 80-нуклеотидной регуляторной последовательности, находящейся в 3' нетранслируемой области (3' НТО) мРНК YB-1. С этой последовательностью специфически взаимодействуют два мажорных белка цитоплазматических мРНП - сам YB-1 и поли(А)-связывающий белок (poly(A)-binding protein, РАВР). Было выяснено, что РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 даже в отсутствие З'-концевой поли(А)-последовательности у мРНК (Skabkina et al, 2003), a YB-1 её избирательно ингибирует при относительно низких концентрациях, которые оптимальны для трансляции других клеточных мРНК (Скабкина и др., 2004).

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению молекулярных механизмов, регулирующих трансляцию мРНК YB-1. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить стадию трансляции, на которой YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует синтез YB-1; 2) локализовать сайты специфического связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1; 3) установить, конкурируют или не конкурируют белки YB-1 и РАВР за места своего специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1\ 4) исследовать влияние 3'-концевого полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляционную активность в бесклеточной системе белкового синтеза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Лябин, Дмитрий Николаевич

выводы

1. Установлено, что YB-1 избирательно ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, на этапе присоединения к мРНК 43 S преинициаторного комплекса или на более раннем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции.

2. Методом футпринтинга локализованы сайты специфического связывания белков YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК YB-1. Обнаружено, что сайты специфического связывания этих двух белков перекрываются, и что YB-1 и РАВР конкурируют между собой за связывание с регуляторной последовательностью.

3. Методами точечного и делеционного мутагенеза показано, что специфическое ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и её стимулирование под действием РАВР обусловлены присутствием специфических сайтов связывания этих двух белков в регуляторной последовательности мРНК YB-1.

4. Показано, что в бесклеточной системе белкового синтеза РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1. Предложена модель координации синтеза двух мажорных белков цитоплазматических мРНП - YB-1 и РАВР.

5. Обнаружено, что полиаденилирование мРНК YB-1 оказывает ингибирующее действие на её трансляцию, в то время как трансляция большинства других мРНК, наоборот, активируется при полиаденилировании.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лябин, Дмитрий Николаевич, 2008 год

1. Скабкин М.А., Скабкина О.В. и Овчинников Л.П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. химии, 44, 3-52.

2. Скабкина О.В., Скабкин М.А., Лябин Д.Н., Овчинников Л.П. (2004). Мажорный белок цитоплазматических мРНП р50/УВ-1 регулирует свой синтез. Докл. АН395, 548-550.

3. Abaza I., Coll О., Patalano S. and Gebauer F. (2006) Drosophila UNR is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation. Genes Dev, 20, 380-389.

4. Ansari S.A., Safak M., Gallia G.L., Sawaya B.E., Amini S. and Khalili K. (1999) Interaction of YB-1 with human immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity. J Gen Virol, 80 ( Pt 10), 2629-2638.

5. Aoki M., Blazek E. and Vogt P.K. (2001) A role of the kinase mTOR in cellular transformation induced by the oncoproteins P3k and Akt. Proc Natl Acad Sci U SA, 98, 136-141.

6. Bader A.G., Felts K.A., Jiang N., Chang H.W. and Vogt P.K. (2003) Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 1238412389.

7. Bader A.G. and Vogt P.K. (2005) Inhibition of protein synthesis by Y box-binding protein 1 blocks oncogenic cell transformation. Mol Cell Biol, 25, 20952106.

8. Baer B.W. and Kornberg R.D. (1980) Repeating structure of cytoplasmic poly(A)-ribonucleoprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 1890-1892.

9. Bagga S., Bracht J., Hunter S., Massirer K., Holtz J., Eachus R. and Pasquinelli A.E. (2005) Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell, 122, 553-563.

10. Barends S., Bink H.H., van den Worm S.H., Pleij C.W. and Kraal B. (2003) Entrapping ribosomes for viral translation: tRNA mimicry as a molecular Trojan horse. Cell, 112, 123-129.

11. Barnard D.C., Cao Q. and Richter J.D. (2005) Differential phosphorylation controls Maskin association with eukaryotic translation initiation factor 4E and localization on the mitotic apparatus. Mol Cell Biol, 25, 7605-7615.

12. Barnard D.C., Ryan K., Manley J.L. and Richter J.D. (2004) Symplekin and xGLD-2 are required for CPEB-mediated cytoplasmic polyadenylation. Cell, 119, 641-651.

13. Behm-Ansmant I., Rehwinkel J., Doerks Т., Stark A., Bork P. and Izaurralde E. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1-.DCP2 decapping complexes. Genes Dev, 20, 1885-1898.

14. Blobel G. (1972) Protein tightly bound to globin mRNA. Biochem Biophys Res Commim, 47, 88-95.

15. Bouvet P., Matsumoto K. and Wolffe A.P. (1995) Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain. J Biol Chem, 270, 28297-28303.

16. Capowski E.E., Esnault S„ Bhattacharya S. and Malter J.S. (2001) Y box-binding factor promotes eosinophil survival by stabilizing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA. J Immunol, 167, 5970-5976.

17. Castagnetti S. and Ephrussi A. (2003) Orb and a long poly(A) tail are required for efficient oskar translation at the posterior pole of the Drosophila oocyte. Development, 130, 835-843.

18. Chansky II.A., Ни M., Hickstein D.D. and Yang L. (2001) Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein. Cancer Res, 61, 3586-3590.

19. Chen C.Y., Gherzi R., Andersen J.S., Gaietta G., Jurchott K., Royer H.D., Mann M. and Karin M. (2000) Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation. Genes Dev, 14, 12361248.

20. Colegrove-Otero L.J., Minshall N. and Standart N. (2005) RNA-binding proteins in early development. Crit Rev Biochem Mol Biol, 40, 21-73.