Изучение механизма лизиса эритроцитов под влиянием порообразующих гемолитиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат наук Бессонова, Светлана Валерьевна

• Бессонова, Светлана Валерьевна
• кандидат наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат наук Бессонова, Светлана Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1. Механизмы регуляции объема эритроцитов

1.2 Нарушение регуляции объема эритроцитов

порообразующими агентами и механизм гемолиза

1.3. Характеристика объектов исследования

1.3.1.Мелитти н

1.3.2. Амфотерицин В

1.3.3. Стафилотоксин

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Получение суспензии эритроцитов и определение гемолитической активности

порообразующих веществ

2.2.2. Кондуктометрический метод определения количества замкнутых мембранных структур

в суспензии эритроцитов

2.2.3. Определение осмотической стойкости эритроцитов

2.2.4. Определение размера эритроцитов и их теней

2.2.5.Регистрация гемолиза с помощью видеоцифровой микроскопии

2.2.6. Метод измерения спектров флуоресценции

2.2.7. Математическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Агрегатное состояние мелиттина при его действии

на эритроциты и размер мелиттиновой поры

3.1.1. Влияние анионов на гемолитическую активность мелиттина и его агрегатное состояние при

действии на эритроциты

3.1.2. Коллоидно-осмотический механизм гемолиза

и размер мелиттиновой поры

3.1.3. Обсуждение

3.2. Исследование пост-литических стадий коллоидно-осмотического лизиса эритроцитов

3.2.1. Лизис клеток путем гипотонического шока

3.2.2. Лизис клеток под действием детергента

3.2.3. Лизис клеток порообразующими гемолитиками

3.2.4. Визуальное наблюдение пост-литического формирования теней эритроцитов

3.2.5. Регистрация гемолиза с помощью

видео-цифровой микроскопии

3.2.6. Обсуждение

3.3. Чувствительность эритроцитов человека и различных видов животных к коллоидно-осмотическому лизису

3.3.1. Кинетика лизиса эритроцитов различных видов под действием амфотерицина В

3.3.2. Осмотическая стойкость различных типов эритроцитов

3.3.3. Роль системы Ыа-К-2С1 котранспорта в коллоидно-осмотическом лизисе эритроцитов

3.3.4. Обсуждение

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизма лизиса эритроцитов под влиянием порообразующих гемолитиков»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Живая клетка является высокоорганизованной системой, способной к саморегуляции в условиях меняющихся параметров окружающей ее среды. Сохранение целостности клетки тесно связано с ее способностью к активному поддержанию постоянства объема. Изучение механизмов регуляции объема живой клетки является одной из центральных проблем современной клеточной физиологии и биофизики. Этому вопросу посвящено большое количество исследований, что отражено в многочисленных обзорах на эту тему ( Strange et al., 1996; Nilius et al, 1996; Okada, 1997; Lang et al, 1998). Различные типы клеток по разному регулируют свой объем в условиях осмотического стресса, который является стимулом к активации хлор-и калий-селективных ионных каналов, системы Na/Н-обмена, сопряженного Na/K/2C1 и К/С1 котранспорта, хлор/бикарбонатного обмена и некоторых других.

Так как стабильный объем клетки достигается за счет поддержания ионной асимметрии клеточного состава и тонкой регуляции селективной мембранной проницаемости, то очевидно, что любая модификация ионной проницаемости плазматической мембраны клеток будет приводить к изменению ее объема, а в крайних случаях - к нарушению ее целостности и цитолизу. Это явление широко используется в природе, когда одни клетки в качестве орудия нападения секретируют в окружающую среду вещества, способные формировать ионные каналы в мембранах других клеток,

тем самым нарушая ионный и осмотический баланс клеток-мишеней. Результатом является цитолиз (гемолиз в случае эритроцитов) -широко распространенный в биологии феномен. Он используется бактериями и грибами как орудие в борьбе одних штаммов с другими: колицины (Stroud et al., 1998), грамицидины, полиеновые антибиотики (Егоров, 1986), а так же как орудие в выживании паразитов (патогенных и непатогенных) в макроорганизме- хозяине (бактериальные токсины - стафилотоксин, стрептолизин, тетанолизин др., см. Bhakdi et al., 1996. Ядовитые животные используют каналоформеры как орудие нападения на жертву - мелиттин из яда медоносной пчелы (Tosteson et al., 1985), кардиотоксин из яда кобры (Fletcher & Jiang, 1993), каналообразующие токсины из яда пауков (Usmanov et al,. 1985; Krasilnikov & Sabirov, 1992) и др. В свою очередь, человеческая иммунная система использует каналообразующие белки (компоненты комплимента, перфорины, секретируемые Т-киллерами) для обезвреживания патогенных микроорганизмов, а также для уничтожения клеток, инфицированных вирусами, а также раковых клеток (Ashcroft, 1999).

Несмотря на то, что гемолиз очень часто используется как тест цитолитической активности при описании тех или иных физиологически активных веществ, относительно небольшое число работ посвящено молекулярным и клеточным механизмам цитолиза вообще, и гемолиза в частности. Общие вопросы цитолиза как биологического феномена изучены крайне недостаточно и еще далеки от окончательного решения. Это в особенности относится к постлитической фазе цитолиза, которая в настоящее время остается

практически неизученной. Вышесказанное определило актуальность темы настоящего исследования.

Цель и задачи работы:

Целью настоящей работы было изучение механизма коллоидно-осмотического гемолиза под действием каналообразующих гемолитиков (мелиттина, амфотерицина В, стафилотоксина), исследование пост-литических стадий лизиса и выявление роли мембранных транспортных процессов в определении устойчивости клеток крови к коллоидно-осмотическому гемолизу.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. Изучить роль агрегатного состояния молекул каналообразующего гемолитика мелиттина в водной фазе и в мембране в процессе лизиса эритроцитов человека; оценить размер мелиттиновой поры и число молекул полипептида, необходимых для ее формирования.

2. Исследовать процесс лизиса эритроцитов при гипотоническом шоке и под действием каналообразующих веществ (полипептидов, антибиотиков и токсических белков) с использованием комбинации фотометрических, кондуктометрических методов и световой микроскопии; выявить и охарактеризовать мембранные формирования, образующиеся в постлитической стадии процесса.

3. Провести сравнительное исследование чувствительности эритроцитов земноводных, птиц и человека к осмотическому шоку, а также к коллоидно-осмотическому лизису в изотонических

условиях. Выявить роль системы Ыа/К/2С1 котранспорта в определении чувствительности эритроцитов различных видов к лизису в гипотонических и изотонических условиях.

Научная новизна работы.

В процессе исследования механизма мелиттин-индуцированного гемолиза установлено, что факторы, способствующие агрегации полипептида в растворе, подавляют его литическую активность, в то же время для формирования литической поры в эритроцитарной мембране необходима агрегация 6-9 молекул мелиттина.

Впервые показано, что коллоидно-осмотический гемолиз под действием порообразующих веществ не вызывает полное разрушение эритроцита с исчезновением тела клетки, а приводит к формированию замкнутых мембранных образований- теней эритроцитов, регистрируемых как визуально, так и кондуктометрическим методом. Впервые обнаружено явление постлитического сжимания теней эритроцитов, имеющего неосмотическую природу.

Впервые показано, что в ряду «земноводные - птицы -человек» изменение осмотической резистентности эритроцитов обратно изменению их устойчивости к коллоидно-осмотическому гемолизу, индуцированному полиеновым антибиотиком амфотерицином В. Впервые показано участие буметанид-чувствительной системы Ка/К/2С1 котранспорта в определении устойчивости эритроцитов человека к коллоидно-осмотическому лизису.

Научно-практическая ценность работы.

Выявленные в работе новые особенности коллоидно-осмотического лизиса клеток необходимы для построения общей теории взаимодействия порообразующих физиологически активных веществ с живыми клетками. В практическом отношении результаты работы будут представлять интерес для разработки путей предотвращения патологического действия каналообразующих факторов патогенности микроорганизмов, а также в практической фармакологии для уменьшения нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов-гемолитиков.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на международной конференции "Проблемы экологической физиологии", Фергана - 1997, на симпозиуме "Cellular and Molecular Physiology of Ion Channels and Trans porters"( Ташкент- 1999), на семинарах лаборатории молекулярной физиологии Института физиологии и биофизики АН РУз.

Публикации результатов исследования Основные положения диссертации изложены в 4 печатных работах.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР. 1.1. Механизмы регуляции объема эритроцитов.

Эритроциты являются наиболее доступными клетками и в течении ряда лет служили классическим объектом мембранологии и клеточной физиологии. Известно, что в средах с различной осмотичностью эритроциты ведут себя как неидеальные осмометры. Это означает, что они меняют свой объем соответственно осмотическому давлению среды, однако в меньшей степени, чем это можно было бы ожидать для идеального осмометра. Обычно это объясняется наличием осмотически неактивного объема внутри клеток, который приписывается белкам цитоплазмы (Solomon et al., 1986). Следует однако отметить, что осмотическое набухание или сжимание клеток наблюдается лишь в начальный период (несколько секунд) после изменения осмотичности среды. Вслед за этим эритроциты (так же как и большинство других клеток) начинают активно изменять свой объем, приспосабливаясь к новым условиям (Cala, 1977; Ellory & Hall, 1988). Способность регулировать объем является фундаментальным свойством клеток крови. При попадании в гипотоническую среду (с низкой осмотичностью) клетки сначала набухают, что является пассивным ответом, а затем начинают сжиматься и восстанавливают свой изначальный объем. Этот процесс носит название регуляторного уменьшения объема (RVD - regulatory volume decrease). В случае гипертонической среды (с повышенной осмотичностью) клетки сначала сжимаются (пассивный ответ в течении нескольких секунд), а

затем медленно восстанавливают свой объем. Этот процесс называется регуляторным увеличением объема (RVI - regulatory volume increase).

Следует подчеркнуть, что даже в изотонической среде клетка не находится в термодинамическом равновесии с окружающей средой. Это связано с наличием ионных градиентов через плазматическую мембрану, который активно поддерживается с помощью АТФ-зависимого активного транспорта и пассивной ионной проницаемости плазмалеммы. Теоретические принципы и мембранные механизмы гомеостаза клеточного объема были проанализированы в классических работах Tosteson & Hoffman, 1960; Freedman & Hoffman, 1979; Milgram & Solomon,1977; Jakobson, 1980; Solomon et al., 1986. При этом за основу принимается модель «насос-утечка», в которую включается как активная составляющая, описывающая активный транспорт, так и пассивная Гольдмановская утечка.

В условиях гипотонического или гипертонического стресса наблюдаемая регуляция объема является результатом активации большого числа мембранных транспортных процессов, деятельность которых направлена на выравнивание возникшего осмотического дисбаланса. Так, когда клетка оказывается в среде с низкой осмотичностью, она вынуждена "освободиться" от излишка внутриклеточных осмолитов. Наиболее часто используемыми осмолитами для выброса наружу являются ионы К+ и Cl" (Dickman & Goldstein, 1990) В случае клеток крови показано, что гипоосмотический стресс приводит к активации системы выброса ионов калия и хлора в эритроцитах лягушки (Agalakova et al., 1997;

Gusev et al., 1995, 1997, 1999), саламандры Amphiuma (Cala et al., 1992), форели (Bourne & Cossins, 1984), кролика (al Rohil & Jennings, 1989), овцы (Bize & Dunham, 1994), собаки (Fujise et al., 1997), мыши (Armsby et al., 1995) и человека (Ellory & Hall, 1988). Хлористый калий может выбрасываться через две альтернативные системы. С одной стороны, это сопряженный К-С1 котранспорт, чувтсвительный к фуросемиду, как это чаще всего наблюдается в эритроцитах (см. например Fujise et al., 1997). С другой стороны, независимая активация ионных каналов, селективных для калия и хлора (обзор см. Okada, 1997, 1998) также приводит к выбросу хлористого калия, однако это более характерно для неэритроидных клеток.

Наряду с ионами калия и хлора, из клеток в ответ на гипотонический стимул могут также выбрасываться и другие осмотически-активные вещества. Практически все типы клеток, включая эритроциты, содержат нейтральную аминокислоту таурин. Эта аминокислота не входит в состав белков. Относительно недавно было установлено, что таурин выбрасывается из клеток крови в условиях гипотонического стресса. Данные в основном были получены на эритроцитах рыб (Fincham et al., 1987; Garcia-Romeu et al., 1991, 1996), хотя аналогичные явления наблюдались и при исследовании эритроцитов лошади (Gibson et al., 1993). Предполагается, что белок полосы 3 мембраны эритроцитов, являющийся хлор бикарбонатным обменником, ответственен за объем зависимый выброс таурина из эритроцитов (Perlman, 1996).

При попадании в среду с высокой осмотичностью клетки должны увеличить осмотичность внутриклеточного содержимого для

того, чтобы выжить. Поскольку основным внеклеточным ионом является натрий, то это достигается путем активации сопряженных систем транспорта натрия. Так, было показано, что гипертонический стресс вызывает активацию амилорид-чувствительного Na/H обмена в эритроцитах саламандры (Cala, 1983), форели (Bourne. & Cossins, 1984) и лягушки (Gusev, 1997). Поскольку протоны в цитоплазме находятся в основном в связанной форме, обмен их на натрий приводит к общему повышению внутриклеточного осмотического давления и росту клеточного объема.

Нетто-перенос осмотически-активных ионов натрия, калия и хлора может также осуществляться системой Na/K/2C1 котранспорта. Эта система опосредует однонаправленный электронейтральный поток катионов натрия и калия вместе с двумя ионами хлора. Особенностью этой системы является то, что в норме градиенты калия и натрия имеют противоположную направленность и гораздо больше по абсолютной величине, чем градиент ионов хлора. Следовательно, общее направление потока осмолитов зависит от того, какой из градиентов (Na или К) превалирует. Так как в норме градиент ионов калия (140-160 мМ в цитозоле против 2-5 мМ в плазме и интерстициальной жидкости) несколько выше, чем градиент ионов натрия (10-15 мМ в цитозоле против 140-150 мМ в плазме и интерстициальной жидкости), активация Na/K/2C1 унипорта в норме будет приводить к сжиманию клеток. Действительно, в работах Ferrari et al. (1992), Fernandes & Dewey (1994) и Armsby et al. (1996), было показано, что объем эритроцитов из гипертензивных линий мышей, которые обладают повышенной активностью Na/K/2C1

системы, существенно меньше, чем объем клеток из нормальных животных. Можно было бы ожидать, что при гипотоническом стрессе будет происходить активация этой системы, однако опыты, проведенные на эритроцитах лягушки (Gusev et al., 1997) и лошади (Gibson et al., 1993) показали, что выброс ионов калия и хлора нечувствителен к буметаниду - специфическому блокатору Na/K/2C1 ко- транспортной системы. В то же время, в работе Mairbaurl & Herth (1996) было показано, что эритроциты хорька обладают сильно выраженной активностью системы Na/K/2C1 унипорта, которая становится еще более активной в условиях гипертонического стресса. Этот результат указывает на то, что в определенных условиях Na/K/2C1 котранспортная система также может быть вовлечена в регуляторное уменьшение объема эритроцитов в ответ на гипотонический стресс.

Система Na/K/2C1 котранспорта экспрессирована в различной мере также в эритроцитах человека (O'Neill, 1989) и птиц (Ueberschar & Bakker-Grimwald, 1983; Palfrey & Leung, 1993; Pewitt et al., 1990), однако ее роль в регуляции клеточного объема в норме и при воздействии осмотического стресса на эти типы клеток остается невыясненной.

Электрофизиологические исследования неэритроидных клеток (таких как кишечный эпителий, эндотелий, кардиомиоциты, и др.) выявили важную роль ионных каналов в регуляции клеточного объема (см. Strange et al., 1996; Nilius et al., 1996; Okada, 1997). Так, было показано, в ответ на гипотонический стресс, в первую очередь активируются неселективные механо- чувствительные каналы,

которые, наряду с ионами натрия, пропускают также ионы кальция внутрь клетки. Кальций, в свою очередь, активирует Са-зависимые калиевые каналы, увеличивая тем самым калиевую проницаемость плазмалеммы. Независимо от кальция активируются объем-зависимые хлорные каналы, что повышает хлорную проницаемость мембраны. В результате, хлористый калий выбрасывается из клеток, что приводит к регуляторному уменьшению объема. Высокая деформируемость и малые размеры эритроцитов были причиной того, что этот тип клеток в электрофизиологическом плане наименее изучен. Поэтому роль ионных каналов в регуляции объема эритроцитов остается не до конца выясненной. Имеется ряд работ, в которых показано, что эритроциты также экспрессируют все типы каналов, участвующих в регуляции объема других типов клеток. Так, в работах Bennekou (1993) и Christophersen & Bennekou (1991) потенциалзависимые неселективные катионные каналы были обнаружены на эритроцитах человека, а в работе Egee et al. (1998) аналогичные каналы зарегистрированы на эритроцитах форели. Кальций-зависимые калиевые каналы были выявлены и на человеческих эритроцитах (Christophersen, 1991; Leinders et al., 1992; Dunn, 1998; Pellegrino et al., 1998). В работе Egee et al. (1997) была показана активация DIDS-чувствительного хлорного тока на мембране эритроцитов форели в ответ на гипотонический стресс. Следует отметить, что это практически единственная работа, в которой на уровне макроскопического тока надежно показано наличие в эритроцитах объем-зависимого хлорного тока.

Основываясь на этих наблюдениях, можно полагать, что, кроме системы электронейтрального котранспорта ионов калия и хлора

(описанного выше) в эритроцитах в гипотонических условиях также может активироваться система электрогенного транспорта через калий- и хлорселективные ионные каналы. Относительный вклад этих двух независимых систем выброса КС1 в настоящее время остается неясным.

1.2 Нарушение регуляции объема эритроцитов порообразующими

агентами и механизм гемолиза

Из сказанного в предыдущей главе ясно, что стабильный объем клетки достигается за счет поддержания ионной асимметрии клеточного состава и тонкой регуляции селективной мембранной проницаемости. Очевидно, что любая модификация ионной проницаемости плазматической мембраны клеток будет приводить к изменению ее объема, а в крайних случаях - к нарушению ее целостности и цитолизу. Как уже отмечалось во введении, явление широко используется в природе, когда одни клетки в качестве орудия нападения секретируют в окружающую среду вещества, способные формировать ионные каналы в мембранах других клеток, тем самым нарушая ионный и осмотический баланс клеток-мишеней. Результатом является цитолиз (гемолиз в случае эритроцитов) -широко распространенный в биологии феномен.

Каналоформеры составляют класс физиологически активных соединений, способных повышать ионную проницаемость искусственных и природных мембран путем образования ионных каналов. К их числу относятся как животные токсины (Fletcher &

Jiang, 1993; Krasilnikov & Sabirov, 1992; Tosteson & Hoffman, 1985; Usmanov et al., 1985) и токсические белки, продуцируемые патогенными микроорганизмами (Bhakdi et al., 1996; Stroud et al., 1998; Tomita & Kamio, 1997), так и некоторые пептидные и полиеновые антибиотики, широко применяемые в практике (Егоров, 1986). Взаимодействие этих веществ с клетками приводит к глубоким изменениям в их физиологическом состоянии. Гемолиз, индуцированный бактериальными токсинами лежит в основе анемии, наблюдаемой при тяжелых бактериальных инфекциях (стафилококковой и стрептококковой инфекции, геморрагической диарее). При применении канал ообразующих препаратов (амфотерицин, нистатин, грамицидины и др.) анемия является часто наблюдаемым побочным эффектом, ограничивающим возможности лекарственной терапии с использованием этого класса веществ.

Несмотря на то, что гемолиз очень часто используется как тест цитолитической активности при описании тех или иных физиологически активных веществ, относительно небольшое число работ посвящено молекулярным и клеточным механизмам цитолиза вообще, и гемолиза в частности. Механизм нистатин-индуцированного гемолиза человеческих эритроцитов был подробно проанализирован в работе Pooler (1985). Ключевым моментом предложенного автором механизма является увеличение катионной проницаемости плазматической мембраны эритроцита и последующее нарушение осмотического баланса клетки. Хотя полученные теоретические уравнения в рамках такого механизма хорошо описывали экспериментально наблюдаемую кинетику лизиса, однако

тот факт, что такой хорошо исследованный каналоформер, как грамицидин А, не является гемолитиком, хотя и эффективно повышает неселективную катионную проницаемость эритроцитарной мембраны, заставляет полагать, что модель Пулера не учитывает некоторых важных особенностей гемолитического процесса.

Многие авторы подчеркивают (хотя и в основном на описательном уровне), что гемолиз под действием каналообразующих веществ является не чисто осмотическим, а коллоидно-осмотическим, указывая на важность внутриклеточных белков (гемоглобина в случае эритроцитов), которые создают онкотическое давление в цитозоле. Это подтверждается наблюдением, что инертные вещества, которые не взаимодействуют существенно ни с эритроцитами, ни с каналоформерами, способны подавлять индуцированный этими веществами гемолиз. Так, в работах ВИаксН et а1. (1984, 1986) было показано, что гемолиз, вызванный альфа-стафилотоксином и гемолизином Е. соП может быть эффективно подавлен добавкой в среду 30 мМ декстрана с мол. массой 4000. Стафилотоксин-индуцированный гемолиз подавлялся инертными

полиэтиленгликолями с молекулярной массой больше 2000 в работах КгазПшкоу е1 а1. (1988) и Сабиров и др. (1990). В работе К^и е1 а1. (1988) гемолиз под действием мелиттина и грамицидина С подавлялся декстранами и полиэтиленгликолями, хотя эффективная молекулярная масса полимера в этом случае зависела от концентрации гемолитиков и времени инкубации. Тотка е1 а1. (1998) показали, что гемолиз, индуцированный фламмутоксином также подавляется полиэтиленгликолями с эффективным диаметром больше 5 пт.

Сахароза эффективно ингибировала гемолиз в случае амфотерицина В (Эл-Суфи и др., 1991).

Таким образом, наиболее вероятная модель гемолитического процесса, индуцированного порообразующими веществами, может быть описана следующим образом. Каналоформеры, встраиваясь в эритроцитарную мембрану, увеличивают ее ионную проницаемость. Это приводит к тому, что осмотически активные ионы (катионы и анионы в цитозоле и во внеклеточной среде) теряют свою осмотическую активность. Осмотически активными при этом остаются только те вещества, которые не могут проходить через сформированные поры (например, те, которые имеют диаметр больше 0,8 пт в случае амфотерицина В, или больше 2,5-3 пт в случае альфа-стафилотоксина). Внутриклеточный гемоглобин имеет существенно больший размер, чем большинство пор, формируемых каналоформерами-гемолитиками. Следовательно, единственным осмотическим градиентом, который остается после массового формирования каналов, является онкотический градиент гемоглобина, который и обуславливает движение воды внутрь клетки, и ее последующий лизис. Понятно, что, внося во внеклеточную среду инертные вещества, непроникающие через вновь сформированные поры, можно выровнять онкотический градиент и, тем самым, предотвратить лизис клетки.

Следует отметить, что пост-литические стадии гемолиза остаются практически неизученными и являются предметом настоящего исследования.

1.3.Характеристика объектов исследования.

1.3.1.Мелиттин.

Мелиттин- один из основных цитотоксических компонентов яда медоносной пчелы Apis mellifera. Молекула мелиттина - полипептид, содержащий 26 аминокислотных остатков, последовательность расположения которых в белковой цепи установлена в 1967 году (Haberman, Jentsch, 1967):

NH-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val- 1 5 Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser- 10 Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-GLn-CONH

Молекулярная масса мелиттина равна 2840 Да. Молекула мелиттина обладает амфифильными свойствами. Из 20 аминокислотных остатков с N-конца молекулы около 75% гидрофобные, а гексапептид на С-конце состоит исключительно из гидрофильных аминокислот, большинство из которых обладают положительным зарядом (Arg, Lis). Такая структурная организация предполагает высокую поверхностную активность мелиттина, которая была установлена прямыми измерениями (Haberman, Reiz, 1965; Haberman, 1972; Ксенжек, Гевод, 1985). Мелиттин хорошо растворим в воде и водно-солевых растворах. Установлено, что при малой концентрации пептида и в растворах с низкой ионной силой мелиттин является мономером, находящимся преимущественно в конформации беспорядочного клубка. К образованию мелиттином ди- и тетрамерных агрегатов

приводит повышение концентрации пептида и электролита (Schubert et al.,1985). В таком агрегатном состоянии молекулы мелиттина имеют, в основном, высокоупорядоченную альфа-спиральную конформацию (Bazzo et al, 1988). В образовании тетрамера в растворе не участвуют водородные связи, а структура стабилизируется исключительно гидрофобными связями. Четыре молекулы мелиттина взаимодействуют своими гидрофобными сторонами альфа-спиралей так, что они оказываются полностью изолированными от окружающего водного раствора, а положительно заряженные С-концевые гидрофильные кластеры максимально разнесены друг от друга, уменьшая энергию их электростатического отталкивания (Terwilliger et.al., 1982). Несмотря на выраженную гидрофобность входящих в нее альфа-спиральных молекул, тетрамерная структура мелиттина остается хорошо водорастворимой. То есть, основными силами, обеспечивающими существование наблюдаемой тетрамерной структуры, являются силы гидрофобного взаимодействия и электростатического отталкивания. Соотношение между ними будет определять и состояние равновесия мономер - тетрамер. Мелиттин лизирует все форменные элементы крови, а также другие ткани и клетки, попадающие в поле действия токсина. Предлагают два пути действия мелиттина на клеточном уровне. Первый путь заключается в способности мелиттина лизировать различные типы клеток и внутриклеточных органелл. Мелиттин является поверхностно-активным веществом, мишенью его действия является липидный бислой. Вторым путем влияния мелиттина на клетки является его синергизм с действием как присутствующей в пчелином яде

фосфолипазы А, так и эндогенного мембраносвязанного фермента (Yunes et al.,1977). Оба пути влияния мелиттина на биомембраны являются следствием его взаимодействия с липидным бислоем. Для объяснения литического действия мелиттина предложены различные механизмы. Так, De Grado et al.,1982 предполагают, что в мембранах эритроцитов под влиянием мелиттина образуются поры, размеры которых позволяют проходить молекулам гемоглобина. С другой стороны, Tosteson et al. (1985) постулировали, что мелиттин формирует небольшие водонаполненные поры, через которые проходят только ионы и неэлектролиты небольших молекулярных масс, но не гемоглобин, а лизис клеток проходит по коллоидно-осмотическому механизму ( см. также Katsu et al., 1988) .

1.3.2. Амфотерицин В.

Полиеновые антибиотики (ПА) - широкий класс соединений, продуцируемый актиномицетами ( Герольд, 1966; Егоров, 1986). Для более чем 40 ПА полностью или частично установлена их структура (Bolard, 1986). На сегодня известно несколько сотен ПА, которые различаются по числу и положению двойных связей в молекуле, размеру макролидного кольца, а также по химической природе боковых заместителей, среди которых следует отметить аминосахар и карбоксильную группу, придающие антибиотикам амфотерные свойства, а также, в отдельных случаях, ароматическую группировку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бессонова, Светлана Валерьевна, 2000 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Герольд М., Бондарчек М., Нечасек Я., Доскачил И. Антибиотики.- М. : Медицина.- 1966.- с. 406 .

2. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках - М: Высшая шк. - 1986. - с. 448.

3. Езепчук Ю.В. Классификация токсинов. // Биомолекулярные основы патогенности бактерий.- М.: Наука.- 1977.- с. 91-96.

4. Касумов Х.М., Каракозов С.Д. Эффект амфокерицина В, вводимого с одной стороны мембраны. // Биофизика.- 1985.-т.ЗО. вып. 2.-с. 281-284.

5. Кинский С. Полиеновые антибиотики. // В кн.: Механизм действия антибиотиков. / Ред. Г.Ф. Гаузе /- М.- Мир.- 1969.- с. 125-145.

6. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования.-1975.

7. Ксежек О.С., Гевод B.C. Мелиттин. Поверхностная активность и возможный механизм литического действия. // Биол. мембраны.- 1985. -т.2.- N. 4.- с. 395-404.

8. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. Изд.Мир. 1977.-Т.1.-С. 226-229.

9. Руденко С.В. Нипот Е.Е. Модуляция мелиттин-индуцированного гемолиза эритроцитов. // Биохимия.- 1996.-т.61.-№ 12.- с.2116-2124.

10. Самедова A.A. Взаимосвязь структуры и функции полиеновых антибиотиков: Автореф. дисс. канд. биол. наук.- Тбилиси. -1991.-22 с.

11. Сабиров Р.З. Индуцированные ионные каналы в искусственных и природных мембранах: структура и функции. // Диссер. на соискание ученой степени доктора биол. Наук.-Ташкент-1993.

12. Сабиров Р.З., КрасильниковО.В. и др. Три типа пор образуемых в эритроцитарных мембранах СТ-токсином Staphilococus aureus. //Биологические мембраны.-1991.- т.8. 13.

13. Сабиров Р.З., Захидова J1.T., Красильников О.В., Ташмухамедов Б. А. Избирательность цитолитической активности стафилотоксина и структура водных пор их форма вмембранах эритроцитов. // Докл. Акад. Наук. СССР. - 1990.-т.315.- с. 1479-1481.

14. Захидова JI.T. Влияние грамицидина S, мелиттина и стафилотоксина на барьерную функцию мембран эритроцитов. // Диссер. на соискание ученой степени кандидата биол. Наук.-Ташкент- 1998.

15. Эл Суфи С.А.Ф., Сабиров Р.З., Красильников О.В. Размер амфотерициновых каналов в мембране эритроцитов. Докл. АН СССР. 1991.-t.21.-c.18

16. Abu-Salah К.М. Amphotericin В: an update.// British Journal of Biomedical Science .-1996.-V.- 53.-P.- 122-133.

17. Adlam C., Ward P.P, Tarner W. Effekt of immunization with higtly purified alpha- and beta- toxins on staphiloccocal mastits in rabbits. // Infect. Immun. -1977.- V.- 17.- P.- 250 - 256.

18. Agget P.J., Fenwick P.K., Kirk H. The effect of amphotericyn B. on pemeability of lipid blayers to divalent trace metals. // Biochim. Biophys. Acta.- 1982.- V.- 684.- P.- 291-294.

19. Agalakova, N. I., Lapin A.V., and Gusev G.P.. Temperature

effects on ion transport across the erythrocyte membrane of the frog Rana temporaria.// Comp Biochem.Physiol A Physiol.-1997.-V.-117.-P.-411-418.

20. al Rohil, N. and Jennings M.L. Volume-dependent K+ transport in rabbit red blood cells comparison with oxygenated human SS cells. //Am.J.Physiol. 1989.-V.- 257.-P.114-121.

21. Armsby C. C., Brugnara C., and Alper S.L. Cation transport in mouse erythrocytes: role of K(+)-Cl- cotransport in regulatory volume decrease. // Am.J.Physiol. 1995.-V.-268.- P. 894- 902.

22. Armsby, C. C., Stuart-Tilley A.K., Alper S.L., and Brugnara C. Resistance to osmotic lysis in BXD-31 mouse erythrocytes: association with upregulated K-Cl cotransport.W Am.J.Physiol 1996.-V.-270.-P. 866- 877.

21. Ashcroft, F. M. Ion Channels and Desease. Channelopathies. Academic Press. 1999.

22. Barro R., Tappin M.J., Pastore A., Harvey T., Carves J. And Campbell D. The structure of melittin AH- NMK study in methanol. //Eur.J. Biochem.- 1988.-V.- 173.-P. 139-146.

23. Blomgvist L., Bergman T., Thelestam M., Jornvall H. Characterization of domain borders and of naturally occuring major fragment of staphylococcal a-toxin // FEBS Lett. -1987.-V.-21 l.-N 2.-P.127-132.

24. Brajtburg J, Elberg S., Kobayashi G.S., Medoff G. Effects of ascorbic acid on the antifungal action of amphotericin B. // Antimicrob. Chemother. -1989.- V.- 24.- P. 333-337.

25. Brajtburg J., Medoff G., Kobayashi G.S., Elberg S., Finegold C. // Antimicrob. Agent. Chemother.- 1980- V.- 18. - P. 586-592 ( Hht. no Bolard, 1986)

26. Brajtburg J., Powderly W.G., Kobayashi G.S. and Medoff G. Amphotericin B: Current understending of mechanisms of action. // Antimicrob. Agents Chemother.- 1990.- V.-34.- N 2- P- 183188.

27. Brajtburg J., Elberg S., Schwartz D.R., Vertut-Groquin A., Schlessinger D., Kobayash G.S., Medoff G. Involvement of oxidative damage in erytrocyty lysis induced by amphotericyn B // Antimicrob. Agents. Chemother.- 1985.-V.-27. -P. 172-176.

28. Bolard J. How do the polyene macrobide antibiotics affect the cellular membrane properties? // Biochim. Biophys. Acta. -1986.-V.-864.-P.257-304.

29. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus. // Microbiol. Reviews.- 1991.- V.- 55.- N4.- P.733-751.

30. Bernheimer A. W. Interaction between membranes and cytolytic bacterial toxins. // Biochim. Biophis. Acta. -1974.-V.- 344.- N 1.-P. 27-50.

31. Bradley Pewitt, Ramanujan S. Hegde, and H. Clive Palfrey. [ H] Bumetanide binding to avian erythrocyte membranes. // J. Biological Chemistry .1990.- V.-265. N 24. -P. 14364- 14370.

32. Bennekou, P. The voltage-gated non-selective cation channel from uman red cells is sensitive to acetylcholine.// Biochim.Biophys.Acta 1993.-V.-147.-P. 165-167.

33. Bhakdi, S., M. Muhly, and R. Fussle. Correlation between toxin inding and hemolytic activity in membrane damage by taphylococcal alpha-toxin. //Infect.Immun.1984.-V.- 46.-P.318-323.

34. Bhakdi, S., N. Mackman, J. M. Nicaud, and I. B. Holland, scherichia coli hemolysin may damage target cell membranes by

enerating transmembrane pores.// Infect.Immun. 1986.-V.-52.-P. 63-69.

35. Bhakdi, S., H. Bayley, A. Valeva, I. Walev, B. Walker, M. Kehoe, nd M. Palmer. Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and scherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial ytolysins.// Arch.Microbiol. 1996. -V.-165.-P. 73-79.

36. Bize, I. and Dunham P.B. Staurosporine, a protein kinase inhibitor, activates K-Cl cotransport in LK sheep erythrocytes. //Am.J.Physiol. 1994.-V.-266.-P.759-770.

37. Bourne, P. K. and Cossins A.R. Sodium and potassium transport in trout (Salmo gairdneri) erythrocytes. // J.Physiol (Lond) 1984.-V.-347.-P. 361-375.

38. Cass A., Finkelstein A., and Krespi V. The ion permeability idused in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B // J. Gen. Physiol.- 1970.- V.- 56.- P. 100-124.

39. Cassidy P., Harshman S. Iodination of a tyeosyl residulin staphylococcul a-toxin // Biochemistry.- 1976a.- V.- 15.-P.2342-2348.

40. Cassidy P., Harshman S. Studies of binding of staphylococcal 5125 01- labeled a-toxin to rabbit erytrocytes. // Biochemis. 1976b.-V.- 15.-P. 2348-2355.

41. Cala, P. M. Volume regulation by flounder red blood cells in nisotonic media. // J.Gen.Physiol.l977.-V.- 69.-P. 537-552.

42. Cala, P. M. Cell volume regulation by Amphiuma red blood cells, he role of Ca+2 as a modulator of alkali metal/H+ exchange. //.Gen.Physiol 1983.-V.-82.-P. 761-784.

43. Cala, P. M., Maldonado H., and Anderson S.E. Cell volume and H regulation by the Amphiuma red blood cell: a model for hypoxia-

induced cell injury. //Comp Biochem.Physiol Comp Physiol 1992.-V.-102.-P. 603-608.

44. Christophersen, P. and P. Bennekou. Evidence for a voltage-gated, non-selective cation channel in the human red cell membrane. // Biochim.Biophys.Acta 1991.-V.-1065.-P. 103-106.

45. Christophersen, P. Ca2(+)-activated K+ channel from human erythrocyte membranes: single channel rectification and selectivity. //J.Membr.Biol. 1991.-V.-119.-P. 75-83.

48. Cybulska B., Mazerski J., Borowski E., Gary-Bobo C.M. Hemolytic activity of aromatic heptaenes. // Bioshem. Pharmacol.-1984.- V.33.- P.41-46.

49. De Grado W. F., Musso G. F., Lieber M., Kaiser E.T., Keszdy

J. Kinetics and mechanism of hemolysis induced by melittin and syntethyc melittin analogue. // Biophys. J. 1982.- V- 37.-P.329-338.

50. Dickman, K. G. and L. Goldstein. Cell volume regulation by skate erythrocytes: role of potassium. // Am. J. Physiol 1990.-V.-258.-P.1217-1223.

51. Dunn, P. M. The action of blocking agents applied to the inner face of Ca(2+)- activated K+ channels from human erythrocytes.

// J.Membr.Biol. 1998.-V.-165.-P. 133-143.

51. Egee S., Harvey B.J., and Thomas S. Volume-activated DIDS-sensitive whole-cell chloride currents in trout red blood cells. // J.Physiol (Lond) 1997.-V.-504 ( Pt 1).-P. 57-63.

52. Egee S., Mignen O., Harvey B.J. and Thomas S. Chloride and non-selective cation channels in unstimulated trout red blood cells. //J.Physiol (Lond) 1998.V.-511 ( Pt 1).-P. 213-224.

53. Ellory, J. C. and Hall A.C.. Human red cell volume egulation in potonic media. // Comp Biochem.Physiol 1988.-V.-90.-P.533-537.

54. Ermishkin L.N., Khasumov K., Potseluev V. Proporties of amphotericin B channels in a lipid bilayers. // Biochim. Biophys. Acta . 1977. V. -470.- P. 357-367.

55. Fernandes, P. R. and Dewey M.J. Genetic control of erythrocyte volume regulation: effect of a single gene (rol) on cation metabolism. //Am.J.Physiol. 1994.-V.- 267.-P. 211-219.

56. Ferrari, P., L. Torielli, Salardi S., Rizzo A., and Bianchi G.. Na+/K+/2C1- cotransport in resealed ghosts from erythrocytes of the ilan hypertensive rats. // Biochim.Biophys.Acta 1992.-V.-llll.-P. 111-119.

58. Fincham, D. A., Wolowyk M.W. and Young J.D. Volume-ensitive taurine transport in fish erythrocytes. // J.Membr.Biol.. 1987.-V.- 96.-P. 5-56.

59. Fletcher, J. E. and Jiang M.S. Possible mechanisms of action of cobra snake venom cardiotoxins and bee venom melittin.// Toxicon 1993.-V.-31.-P. 669-695.

60. Freedman, J. C. and Hoffman J.F.. Ionic and osmotic equilibria of human red blood cells treated with nystatin.// J.Gen.Physiol 1979.-P. 157-185.

61. Fujise H., Abe K., Kamimura M., and Ochiai H.. K(+)-Cl-cotransport and volume regulation in the light and the dense fraction of high-K+ dog red blood cells.// Am.J.Physiol 1997.-V.-273.-P.991-998.

62. Freer J.H., Arbuthnott J.P. Toxins of staphilococcus aureus. // Pharmacol. Bacterial. Toxins / Dorner and Drews (eds) Oxsford; ergamon press, 1986.-P, 581-633.

63. Gaikowska B, Gadamski R., Frontozak - Baniewicz M. Effects of staphilococcal alpha-toxin on the ultrastructure of the rat hypothalamo system. // Acta Neurobiol. Exp. Warsz. - 1994. - V.-54.-N.3.-P. 219-225.

64. Garcia-Romeu, F., Cossins A.R., and Motais R. Cell volume regulation by trout erythrocytes: characteristics of the transport systems activated by hypotonic swelling. //J.Physiol (Lond) 1991.-V.- 440.-P. 547-567.

65. Garcia-Romeu, F., Borgese F., Guizouarn H., Fie vet B., and Motais R.. A role for the anion exchanger AE1 (band 3 protein) in cell volume regulation.// Cell Mol.Biol.(Noisy.-le-grand)1996.-V.-42.-P. 985-994.

66. Gibson, J. S., Ellory J.C., Culliford S.J., and Fincham D.A.. Volume-sensitive KC1 co-transport and taurine fluxes in horse red blood cells. //Exp.Physiol 1993.-V.-78.-P. 685-695.

67. Glomski, C. A. and Tamburlin J. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte. I. Hemoglobin: the universal respiratory pigment. //Histol.Histopathol. 1989.-V.-4.-P. 509-514.

68. Glomski, C. A. and Tamburlin J. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte. II. The early or invertebrate prototypes. //Histol.Histopathol. 1990.-V.- 5.-P. 513-525.

69. Glomski, C. A., Tamburlin J., and Chainani M. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte. III. Fish, the lower vertebrate experience.//Histol.Histopathol. 1992.-V.- 7.-P. 501-528.

70. Glomski, C. A., Tamburlin J., Hard R., and Chainani M. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte. IV. The amphibians. // Histol.Histopathol. 1997.-V.-12.-P. 147-170.

71. Gouaux, E. Channel-forming toxins: tales of transformation.

// Curr.Opin.Struct.Biol.1997.-V.- 7.P. 566-573.

72. Gouaux, E. alpha-Hemolysin from Staphylococcus aureus: an archetype of beta- barrel, channel-forming toxins. // J. Struct. Biol. 1998.-V.-121.-P. 110-122.

73. Godart H., Ellory J.C. KC1 cotransport by high hydrostatic pressure. //J. Physiol (Lond) 1996. V.-491 (Pt2).- P. 423-34.

74. Guizouarn H. and Motais R.. Swelling activation of transport athways in erythrocytes: effects of C1-, ionic strength, and volume hanges.//Am.J.Physiol 1999.-V.-276.-P. 210-220.

75. Gusev, G. P., Agalakova N.I., and Lapin A.V. Potassium transport

in red blood cells of frog Rana temporaria: demonstration of a K-Cl cotransport.//J.Comp Physiol [B] 1995.-V.-165.-P.230-237.

76. Gusev, G. P., Lapin A.V., and Agulakova N.I. Volume regulation in red blood cells of the frog Rana temporaria after osmotic shrinkage and swelling.// Membr.Cell Biol. 1997.-V.-11.-P. 305-317.

77. Gusev, G. P., Agalakova N.I. and Lapin A.V. Kinetics of K-Cl Cotransport in Frog Erythrocyte Membrane: Effect of External Sodium. //J.Membr.Biol.-1999.-V. 172.-P. 203-213.

78. Haberman E., Reiz K.G. Zur biochemie der bienengiftpeptide melittin und apamin // Biochemische Zeitschrift.- 1965.- V. 343.- P. 1192-1203.

79. Harshman S., Sugg N. Effect of calcium ions of staphylococcal alpha-toxin - induced hemolysis of rabbit erytrocytes // Infect. Imrnun.- 1985.- V. 47.- N 1.- P. 37-40.

80. Hider R.C., Khader F., Tatham A. Lytic activity of monomeric and oligomeric melittin. // Biochem. et biophys. Acta. - 1983.- V. 728.-P. 206-215.

81. Henry-Toulme N., Bolard J. Cynergistic incorporation of daunorubicin in erythricytes in the presence of polyen antibiotics. // Biochim. Biophys. Acta. Role of the membrane potential.-1986. - V. 854. - P. 84-92.

82. Henry-Toulme N., Sema M. and Bolard J. Interaction of amphotericine B and its N-fructosil derivative with murine thymocytes : A comparative stidy using fluorescent membrane. // Biochim. Biophys. Acta, probes. - 1989. - V. 982. - N. 2 - P. 245252.

83. Ikigai H., Nakae T. Interaction of the alpha-toxin of staphilococcus aureus with the liposome membrane. // J. Biol. Chem.- 1987a - V. 262. N 5.- P. 2150-2155.

84. Ikigai H.,Nakae T. Assembley of the alpha-toxin - hexamer of staphilococcus aureus in the liposome membrane. // J. Biochem.-1987 b - V. 262. N 5. - P.2156-2160.

85. Ikigai H., Nakae T. Conformational alteration in alpha-toxin from staphilococcus aureus concomitant with the transformation of the water - soluble monomer to membrane oligomer. // Bichim. Biophis. Res. ommons. - 1985. - V. 130.-N 1.- P. 175-185.

86. Jeljaszewics J. Toxins (hemolysins). // The Staphylococci. Ed. Cohen J.O.-New-York: Wiley International.- 1972.-P.249-280.

87. Jakobsson E. Interactions of cell volume, membrane potential, and

membrane transport parameters.// Am.J.Physiol .-1980.-V. 238.-P. 196-206.

88. Katsu T., Ninomiya C., Kuroko M., Kobayashi H., Hirota T. and Fujita Y. Action mechanism of amphipathic peptides gramicidin S and melittin on erythrocyte membrane.// Biochim.Biophys.Acta.-1988.-V.- 939.-P.57-63.

89. Krasilnikov O. V., Sabirov R.Z., Ternovsky V.I., Merzliak P.G., and Tashmukhamedov B.A. The structure of Staphylococcus aureus alpha-toxin-induced ionic channel. // Gen.Physiol Biophys. -1988.-V. 467-473.

90. Krasilnikov O. V. and Sabirov R.Z.. Comparative analysis of latrotoxin channels of different conductance in planar lipid bilayers. Evidence for cluster organization. // Biochim.Biophys.Acta.-1992.-V.- 1112.-P. 124-128.

91. Kim H.D. and Mcmanus T.S. Studies on the energy metabolism of pig red cells. 1. the limiting role of membrane permeability in glycolysys. // Biochim. et Biophys. Acta. -1977- V. 230 - P. 1-11.

92. Ling N.R., Spicer E., James K. and Williamson N. // Dr.J. Haemol. - 1965. - V. 11. - P. 421-431. (mrr. no Wandstrum 1983.).

93. Lang F., Busch G.L. and Volkl H. The diversity of volume regulatory mechanisms.- Cell Physiol Biochem. -1998.-V.8.-P. 145.

94. Leinders T., van Kleef R.G., and Vijverberg H.P. Single Ca(2+)-activated K+ channels in human erythrocytes: Ca2+ dependence of opening frequency but not of open lifetimes.// Biochim. Biophys. Acta.-1992.-V. 1112.-P. 67-74.

95. Mazerski J., Grzybowska J., Borowski E. Influence of net charge on the agregation and solubility behaviour of amphotericin B and its derivatives in aqueous media. // Eur. Biophys. J.- 1990.-V. 18 - N 3 - P. 159-164.

96. Mairbaurl, H. and Herth C. Na(+)-K(+)-2Cl- cotransport, Na+/H+ exchange, and cell volume in ferret erythrocytes. .//Am.J.Physiol.-1996.-V. 271.-P.1603-1611.

97. Midez J.A. , Hopfer R.L., Lopez-Berestein G., Mehtar T. Effect of free and Liposomal Amphotericin B and Gramicidin S Alon and in Combinanion on Potassium Leakage From Human Erytrocytes and Candina albicans. // Antimicrob. Agents Chemot.-1989.-V33.-N 2.-P.152-155.

98. Menestrina G. Ionic channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin: voltage- dependent inhibition by divalent and trivalent cations. //J.Membr.Biol. -1986.-V.90.-P. 177-190.

99. MedoffG., Kobayashi G.S., Kwan C.N., Schlessinger D., Venkov P. Potentiantion of rifampicin and 5-fluorocytosine as antifungal antibiotics by amphotericin B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1972.- V. 69.- P.196-199.

100. Milgram J. H. and Solomon A.K. Membrane permeability equations and their solutions for red cells. //J.Membr.Biol.-1977.-V. 34.-P. 103-144.

101.Nilius, B., J. Eggermont, T. Voets, and Droogmans G.. Volume-activated CI- channels.// Gen.Pharmacol.-1996.-V. 27.-P. 1131-1140.

102. Ostedgaard L.S., Shasby D.M., Welsh M.J. Staphilococcus aureus alpha-toxin permeabilizes the basolateral membrane of a CI 5- - secreting epithelium. // Am. J. Phisiol.- 1992. - V. 263. N. 1-P. 104-112.

103. O'Neill W. C. Volume-sensitive, Cl-dependent K transport in resealed human erythrocyte ghosts. //Am.J.Physiol.-1989.-V. 256.-P. 81-88.

104. Okada Y. Volume expansion-sensing outward-rectifier Cl-channel: fresh start to the molecular identity and volume sensor. //Am.J.Physiol.-1997.-V. 273.-P. 755-789.

105. Okada Y. Cell volume-sensitive chloride channels. // Contrib. Nephrol.-1998.-V. 123.-P. 21-33.

106. Palfrey H. C. and Leung S. Inhibition of Na-K-2C1 cotransport and bumetanide binding by ethacrynic acid, its analogues, and adducts. //Am. J. Physiol.-1993.-V. 264.-P. 1270-1277.

107. Pellegrino M. and Pellegrini M. Modulation of Ca2+-activated K+ channels of human erythrocytes by endogenous c AMP-dependent protein kinase. // Pflugers Arch.-1998.-V. 436.-P. 749756.

108. Perlman D. F., Musch M.W. and Goldstein L. Band 3 in cell volume regulation in fish erythrocytes. // Cell Mol.Biol.(Noisy.-le-grand). - 1996.-V.42.-P. 975-984.

109. Pewitt, E. B., Hegde R.S., Haas M., and Palfrey H.C. The regulation of Na/K/2C1 cotransport and bumetanide binding in avian erythrocytes by protein phosphorylation and

dephosphorylation. Effects of kinase inhibitors and okadaic acid. //J.Biol.Chem.-1990.-V. 265.-P. 20747-20756.

110. PodoF., Strom R., Cribo C., Zulauf M. Dependence of melittin structure on its interaction with multivalent anions and with model membrane systems. // Int. J. Peptid. Protein. Res. 1982.-V. 19.-P. 514-527.

111. Pooler, J. P. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. I. nystatin-induced lysis. // Biochim. Biophys. Acta.-1985.-V. 812.-P. 193198.

112. Rogolsky M. Nonenteric toxins of Staphylococcus aureus // Microbiol. Rev.- 1979.- V. 43.- N 3.- P.320-360.

113. Rostovtseva T. K., Bashford C.L., Lev A.A. and Pasternak C.A. Triton channels are sensitive to divalent cations and protons. //

J.Membr.Biol.- 1994. -V. 141.-P. 83-90

114. Sabirov R. Z., Krasilnikov O.V., Ternovsky V.I. and Merzliak P.G. Relation between ionic channel conductance and conductivity of media containing different nonelectrolytes. A novel method of pore size determination.// Gen.Physiol Biophys.-1993.-V. 12.P. 95111.

115. Sabirov R. Z., Manjosova M.A., Tadjibaeva E.T. and Krasilnikov O.V. The interaction of amphotericin B with cell membrane of rat thymocytes. // Gen.Physiol Biophys.-1993.-V. 12.P. 249-257.

116. Solomon A. K., Toon M.R. and Dix J.A. Osmotic properties of human red cells. // J.Membr.Biol.-1986.-V. 91 .-P. 259-273.

117. Song L., Hobaugh M.R., ShustakC., Cheley S., BayleyH.. and Gouaux J. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore [see comments], // Science.-1996.-V.274.-P. 1859-1866.

118. Strange K., F. and Jackson P.C. Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels. // Am.J.Physiol.-1996.-V. 270.-P.711-730.

119. Stroud, R. M., Reiling K., Wiener M., and Freymann D. Ion-channel-forming colicins. // Curr. Opin. Struct. Biol.-1998.-V. 8.-P. 525-533.

120. Schubert D., Pappert G., Boss K. Das dimeris melittin occur in aqueous solution? // Biophys. J.- 1985.- V. 48.- N 2.- P. 327-329.

121. Sokol-Anderson M., Brajtburg J., Medoff G. Amphotericin B-induced oxidative damage and killing of Candida albicans. // J. Infect. Diss. - 1986 - V.154.-P. 76-83.

122. Stein S.H., Little J.R., Little K.D. Parallel inheritance tissue

catalase activity and immunostimulatory action of amphotericin B in inbred mouse strains. // Cell. Immunol.- 1987.-V.-105. -P. 99-109.

123. Shell R.E., Tran N.V., Bamhal J.S. AB-induced changes in renal membrane permation : A-model of nephrotoxicity. // Biochem. Biophys. Res. Commons.- 1989.-V. 159-N3.-P. 1165-1170.

124. Thelestam M. Modes of membrane damaging action of staphylococcal toxins. // In: Staphylococci and staphylococcal infections. (Easmon and Adlam Eds.).// Academic Press.- 1983. -V. 2. -P.705-744.

125. Teerlink T., De Kruijff B. and Demeo R.A. The action of pimaricin, et ruscomycin and amphotericin B on liposomes with waryng sterol contant. // Biochem. et Biophis. Acta. - 1980. - V. 599. - P. 484-492.

126. Thelestam M. Blomqueist L. Staphilococcal alpha-toxin -Recent advances. // Toxicon. - 1988. - V. 26.- N 1. - P. 51-65.

127. Thelestam M., Jolivett-Renaut C., Allof J.E. Fotolabeling of staphilococcal alpha-toxin from within rabbit erythrocytes membranes. // Biochem. Biophys. Res. Commons. - 1983. - V.l 11 , N2. - P. 444-449.

128. Terwilliger T.C., Eisenberg D. The structure of melittin. I. Structure determination and partial refeinament. // J. Biol. Chem.-1982.-V. 257.-P. 6010-6015.

129. Tomita T. and Kamio Y. Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus. // Biosci. Biotechnol. Biochem.-1997.-V. 61.-P. 565-572.

130. Tomita T., Ishikawa D., Noguchi T., Katayama E. and Hashimoto Y. Assembly of flammutoxin, a cytolytic protein from

the edible mushroom Flammulina velutipes, into a pore-forming ring-shaped oligomer on the target cell. // Biochem.J.-1998.-V. 333 (Pt 1).-P. 129-137.

131. Tosteson D. C. and Hoffman, J. F. Regulation of cell volume by active transport in high and low potassium sheep red cells. // J.Gen.Physiol.-1985.-V. 44.-P. 169-194.

132. Tosteson M. T., Holmes S.J., Razin M. and Tosteson D.C. Melittin lysis of red cells. //J.Membr.Biol.-1985.-V. 87.-P. 35-44.

133. Ueberschar S. and Bakker-Grunwald T. Bumetanide-sensitive potassium transport and volume regulation in turkey erythrocytes. //Biochim. Biophys. Acta.-1983.-V. 731.-P. 243-250.

134. Usmanov P. B., Kazakov I., Kalikulov H., Atakuziev B.U., Yukelson L.Y., and Tashmukhamedov B.A. The channel-forming component of the Theridiidae spider venom neurotoxins.// Gen.Physiol Biophys.-1985.-V. 4.-P. 185-193.

135. Vertut-Doi A., Hannaert P. and Bolard J. The polyene antibiotic amphotericine B inhibits the Na 5+ 0/K 5+ Opomp of human erythrocytes. //Biochem. Biophys. Res. Com. - 1988. - V. 157.-N2.-P. 692-697.

136. Weigershausen B. On the Pharmacolology of staphylococcal toxin ( Wood 46 ) The effect of staphylococcal toxin on the isolated heart, auricles and vessels of various species . // Acta. Biol. Med. Ger.- 1962.- V. 9.- P. 517.

137. Wadstrom T. Biological effects of cell damaging toxins. // Staphylococci and staphylococcal infections. Eds. Easmon C.S., Adlam C.: V. 4. - London: Acad. Press., 1983. - P. 671-704.

138. WalevL, Palmer M., Martin E., Jonas D., Weller V., Hohn-Bentz H., Husman M., Bhakdi S. Recovering of human

fibroblasts from attac by the pore - forming alpha-toxin of staphylococcus aureus. // Microb. Patog.- 1994. - V. 17. N 3. P. 187-201.

139. Walev I., Reske K., Palmer M., Valeva A., Bhakdi S. Potassium-inhibited processing of IL-1 beta in human monocytes. //EMBOJ. - 1995 .-V. 14.-N8-P. 1607-1614.

140. Yunes R., Goldhammer A.R., Garner W.K., Cordes E.H. Phospholipases melittin facilitation of been venom phospholipase A2 - catalysed hydrolysis of usonicated lecithin liposomes. // Arch. Biochem. Biophys.-1977.-V. 183.-N 1.-P.105-112.