Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Ленц, Александр Александрович

• Ленц, Александр Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ленц, Александр Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура №+,К+-АТФазы.

1.2 Субстраты, последовательность реакций и цикл Альберса - Поста.

1.3. Структура и механизм работы Са2+-АТФазы.

1.3.1 Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене.

1.3.2 Упрощенная схема работы Са2+-АТФазы.

1.4. Центры связывания ионов в белке.

1.4.1. Центры связывания ионов в Na+,1С-АТФазе.

1.4.2 Перестройка трансмембранных спиралей при конформационном переходе Et - Е2.

1.5. Электрогенность Na+,K+ - АТФазы. Диэлектрические коэффициенты.

1.6. Модель электрогенного транспорта ионов Na+,K+- АТФазой.

1.7. Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого Na+,K+ - АТФазой.

1.8. Переходные токи в модельной системе БЛМ с адсорбированными фрагментами.

1.9. Изменения емкости, связанные с работой №+,К*-АТФазы.

1.10. рН зависимость электрогенного транспорта.

1.11. Реконструкция Na+,К^АТФазы.

ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ТРАНСПОРТА ИОНОВ НАТРИЯ В NA+,K+-AT0>A3E.

2.1. Физическая модель.

2.2. Энергетика и электростатика.

2.3. Кинетические уравнения.

2.4. Емкость и проводимость.

2.5. Внеклеточный и внутриклеточный каналы.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Составы растворов, выделение Ка+,К+-АТФазы и 19 - кД фрагмента.

3.2. Экспериментальная система: БЛМ + адсорбированные мембранные фрагменты.

3.3. Экспериментальная система: золотой электрод - тиол - адсорбированные фрагменты.

3.4 Метод поверхностного плазмонного резонанса.

3.5. Реконструкция №+,К+-АТФазы и 19-кД фрагментов в бислойную липидную мембрану по методу Шиндлера.

3.6. Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Кинетика изменения емкости проводимости, связанные с работой №+,К+-АТФазы при фотовысвобожзении caged- АТФ.

4.2. Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости.

4.2.1. Аппроксимация частотных зависимостей.

4.2.2. Частотные зависимости изменения емкости и проводимости при различных концентрациях ионов натрия.

4.3. Сравнение глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа.

4.4. Зависимость электрогенного транспорта ионов натрия №*К+-АТФазой от рН.

4.4.1. Измерение частотных зависимостей изменения емкости и проводимости при разных значениях рН.

4.5 Электростатическое поле в системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами с №+,К+-АТФазой.

4.5.1. Электростатические потенциалы, возникающие при адсорбции МФ на БЛМ.

4.5.2. Изменение электростатического поля вследствие переноса ионов натрия Na+K*-AТФазой.

4.6 Электрогенный транспорт в системе золотой электрод-тиол-адсорбированные фрагменты.

4.7. Реконструкция №+,К+-АТФазы и 19 - кД фрагментов в бислойную липидную мембрану.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране»

Na+,K+-ATOa3a является одним из важнейших мембранных белков эукариотических клеток, который участвует в поддержании асимметричного распределения ионов натрия и калия по обе стороны клеточной мембраны. Трансмембранные градиенты концентрации ионов натрия и калия, создаваемые ферментом, обеспечивают ключевые стадии жизни клетки: электрическую активность, работу систем вторично-активного транспорта, регуляцию клеточного цикла. Используя свободную энергию гидролиза одной молекулы АТФ, Ыа+,К+-АТФаза переносит из цитоплазмы три иона натрия во внеклеточную среду и два иона калия в противоположном направлении. Таким образом, процесс является электрогенным, что позволяет регистрировать работу Ыа+,К+-АТФазы и исследовать ее функциональные свойства с помощью измерения переходных и стационарных токов, связанных с транспортом ионов, при воздействии быстрого введения АТФ или электрического поля от внешнего источника (Lauger, 1991).

Ма+,К+-АТФаза была открыта в 1957 году Йенсом Христианом Скоу (Skou, 1957), позднее (в 1997 г.) получившим за это Нобелевскую премию. С тех пор исследованию молекулярных механизмов работы и структуры Ма+,К+-АТФазы было посвящено большое количество работ. Установлены гены, кодирующие данный белок, определена аминокислотная последовательность, охарактеризованы основные функциональные свойства, найдены специфические ингибиторы, действующие на различные стадии работы фермента, разработаны методы выделения и очистки. Однако до сих пор не удалось получить белок в кристаллической форме и расшифровать структуру Ыа+,К+-АТФазы с атомным разрешением. Поэтому пока не установлена трехмерная структура Ма+,К+-АТФазы, и многие вопросы, касающиеся механизма ее функционирования, остаются на данный момент открытыми.

Особый интерес представляет изучение электрогенного переноса ионов натрия, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой в среде, не содержащей ионов калия. В этих условиях можно изучать кинетику процесса, регистрируя нестационарные электрические токи после быстрого введения АТФ, либо скачкообразного изменения напряжения. Нестационарный электрический ток в Ыа+,К+-АТФазе после скачкообразного изменения напряжения изучают на изолированных клетках или фрагментах клеточной мембраны ("гигантский пэтч кламп"). Такие объекты обычно содержат не только АТФазу, но и другие мембранные белки, что затрудняет измерения (для получения "чистого" электрического сигнала АТФазы приходится использовать процедуры вычитания сигнала, записанного после ее ингибирования. Исследования электрогенного транспорта в очищенной от посторонних белков Ыа+,К+-АТФазе проводятся на модельной системе, в которой мембранные фрагменты (МФ), содержащие Ыа+,К+-АТФазу, адсорбированы на поверхности бислойной липидной мембраны (БЛМ). Такая система позволяет исследовать электрогенный транспорт ионов натрия, вызванный либо быстрым освобождением АТФ из связанной формы, либо приложением переменного напряжения. Разработанные к настоящему времени экспериментальные методы позволяют с помощью электрических измерений определить скорость отдельных стадий электрогенного транспорта и получить важную информацию о пути переноса ионов в белке, в частности, о так называемых "каналах доступа" ионов, через которые происходит обмен ионов натрия и калия между водным раствором и центрами связывания ионов внутри белка. Несмотря на интенсивные исследования электрогенного транспорта, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой, ряд вопросов относительно механизма ее функционирования остается открытым. В настоящее время достаточно хорошо изучен транспорт ионов во внеклеточном канале, в частности, показано, что он состоит из нескольких стадий, хотя до сих пор остается невыясненным происхождение этих стадий и нет их теоретического описания. Очень мало изучен транспорт во внутриклеточном канале, само существование которого ставилось под сомнение. Предметом настоящей работы является детальное исследование электрогенного транспорта в обоих каналах Na+,K+-ATOa3bi с помощью метода импедансной спектроскопии на модельной системе.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ленц, Александр Александрович

ВЫВОДЫ

1. Методом импедансной спектроскопии, реализованном в широком диапазоне концентраций ионов натрия, изучен активный транспорт этих ионов №,К-АТФазой во фрагментах мембран, адсорбированных на бислойной липидной мембране.

2. Измерения в области умеренных и высоких (50-1000 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерные частоты конформационной перестройки белка (от 30 с'1 при 50 мМ NaCl до 100 с"1 при 1 М NaCl) и транспорта ионов натрия через внеклеточный канал доступа (1600 с'1). Таким образом, частоты и относительные вклады стадий зависят от концентрации ионов натрия.

3. Разработана теория активного транспорта ионов натрия №+,К+-АТФазой, учитывающая конформационную перестройку белка и транспорт ионов через внеклеточный канал доступа. Она позволила количественно описать частотные зависимости емкости и проводимости, измеренные в области низких, умеренных и высоких концентраций ионов натрия.

4. Измерения в области низких (< 10 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерную частоту (800 с"1, 1 - 5 мМ NaCl) перемещения этих ионов во внутриклеточном канале доступа.

5. Существование электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном канале было качественно подтверждено с помощью импедансной спектроскопии на другой модельной системе, в которой мембранные фрагменты с №+,К+-АТФазой адсорбированы на твердой подложке золото - тиолы.

6. На основании сравнения диэлектрических коэффициентов перемещений первого иона натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа показано, что место связывания этого иона в №+,К+-АТФазе расположено асимметрично на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от ее цитоплазматической стороны.

7. Обнаружен электрогенный транспорт второго и третьего ионов натрия во внутриклеточном канале доступа при высоких рН. При низких рН этот транспорт сводится к электронейтральному Na+/H+ обмену.

8. Проведена реконструкция 19-кД фрагментов Na+,K+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера. Показано, что эти фрагменты обладают ионофорными свойствами и образуют ионные каналы с проводимостью около 2,5 пС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрена теоретическая модель активного транспорта ионов натрия, осуществляемого №+,К+-АТФазой, учитывающая 3 стадии: медленный конформационный переход белка и транспорт ионов во внеклеточном и внутриклеточном каналах доступа. В экспериментальной части работы исследовался нестационарный транспорт ионов натрия на модельной системе, включающей БЛМ с адсорбированными на ней фрагментами мембран, содержащими белок. В эксперименте регистрировались малые изменения емкости и проводимости, вызванные фотоиндуцированным освобождением АТФ. Исследования проведены в широком диапазоне частот (2-1000 Гц), концентраций ионов натрия (1 - 1000 мМ) и рН среды. Экспериментальные данные были сопоставлены с разработанной теорией, которая позволила объяснить измеренные частотные зависимости приращений емкости и проводимости, а также влияние на них концентрации ионов натрия. В результате были определены кинетические параметры отдельных стадий переноса ионов натрия. Наилучшее совпадение теории и эксперимента наблюдается при 150 мМ NaCl. Как было предсказано теорией и подтверждено в эксперименте, частотные зависимости приращений емкости и проводимости описываются суммой трех функций Лоренца с амплитудами Со, Q и Сг и характерными частотами Шо, cc>i и со2. Каждый из этих лоренцианов отвечает определенной стадии транспорта. Значения амплитуд и характерных частот зависели от состава раствора.

Частотная зависимость при концентрации ионов натрия выше 50 мМ удовлетворительно описывается суммой двух лоренцианов с постоянной составляющей. Характерная частота первого лоренциана позволила оценить скорость конформационной перестройки белка (от 30 с"1 при 50 мМ NaCl до 100 с'1 при 1 М NaCl). Второй лоренциан связан с перемещением одного из трех ионов натрия во внеклеточном канале №+,К+-АТФазы. Характерная частота второго лоренциана составляла ~1600 с"1, а его относительная амплитуда уменьшалась при понижении концентрации ионов натрия в растворе и исчезала при концентрации менее 10 мМ.

При более низкой концентрации ионов натрия появлялись приращения емкости и проводимости отрицательного знака. Они объясняются электрогенным транспортом ионов натрия во внутриклеточном канале, который существует в нефосфорилированном белке и прекращается после введения АТФ. Показано, что отрицательные приращения емкости и проводимости зависят от частоты. Эта зависимость описывается лоренцианом с отрицательной амплитудой. Его характерная частота составляла 800 с"1 (1 - 5 мМ NaCl), а относительный вклад возрастал при уменьшении концентрации ионов натрия, достигая максимального значения при концентрации около 3 мМ, соответствующей константе связывания третьего иона натрия во внутриклеточном канале.

На основании сравнения диэлектрических коэффициентов перемещений первого иона натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа был сделан вывод, что место связывания этого иона расположено асимметрично на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от цитоплазматической стороны белка.

Транспорт ионов натрия во внеклеточном и внутриклеточном каналах доступа был исследован также при различных значения рН. При низкой концентрации ионов натрия, увеличение рН приводило к появлению отрицательных приращений емкости и проводимости большой величины, что свидетельствует о появлении новой электрогенной стадии транспорта, прекращающейся после фосфорилирования белка при введении АТФ. Данная стадия связана с транспортом двух ионов натрия с внутриклеточной стороны белка, который является электрогенным при высоких значениях рН, и превращается в электронейтральный Na+/H+ обмен при низких рН.

Возможной альтернативной причиной появления отрицательных приращений емкости может быть электрострикция - изменение емкости

БЛМ при ее сжатии в электростатическом поле, которое может изменяться в результате функционирования Na+K+-ATOa3bi. Для оценки электрострикции проведены исследования электростатического поля, возникающего в МФ при его адсорбции на БЛМ. Показано, что при введении суспензии МФ в раствор с одной стороны БЛМ происходит адсорбция на поверхности мембраны как самих МФ, так и содержащейся в препарате примеси SDS, что приводит к возникновению электростатического потенциала в области контакта мембранных фрагментов с бислоем. Были проведены оценки потенциалов, возникающих при адсорбции мембранных фрагментов и SDS. Опыты со скачками напряжения показали, что изменение потенциала в щели между МФ и БЛМ вследствие функционирования Ка+К+-АТФазы мало и не может объяснить изменение емкости эффектом электрострикции. Кроме того, существование электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном канале было качественно подтверждено с помощью импедансной спектроскопии на другой модельной системе, в которой мембранные фрагменты с Ка+,К+-АТФазой адсорбированы на твердой подложке золотой электрод - тиолы. На этой системе было также зарегистрировано зависящее от частоты отрицательное приращение емкости и проводимости. Полученные результаты служат дополнительным доказательством того, что изменения емкости и проводимости вызваны транспортом ионов натрия Na+K+-АТФазой, поскольку данная система не содержит липидных бислоев с деканом, дающих основной вклад в электрострикцию.

В работе было осуществлено встраивание Ка+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера. На данный момент удалось зарегистрировать токи короткого замыкания в ответ на введение АТФ, которые оказались небольшими по величине, что не позволило провести дальнейшее исследование Ка+,К+-АТФазы в этой системе при помощи импедансной спектроскопии. Более удачной оказалась реконструкция 19-кД фрагментов Na+,K+-АТФазы. Показаны ионофорные свойства этих фрагментов, которые образуют ионные каналы с проводимостью около 2,5 пС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ленц, Александр Александрович, 2005 год

1. Айтьян С.Х., Белая M.JL, и Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие заряженных бислойных липидных мембран // ДАН СССР - 1981. - Т. 256.- С. 990-994.

2. Айтьян С.Х., Белая МЛ., и Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие мембран, несущих постоянный поверхностный заряд // Биофизика 1981. - Т. 26. -С. 467-473.

3. Albers R.W. Biochemical aspects of active transport // Annu. Rev. Biochem.- 1967.-V. 36.-P. 727-756.

4. Anner B.M. and Moosmayer M. Preparation of Na,K-ATPase-containing liposomes with predictable transport properties by a procedure relating the Na,K-transport capacity to the ATPase activity // J Biochem. Biophys Methods 1982. - V. 5. - P. 299-306.

5. Apell H.J. Toward an understanding of ion transport through the Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P. 133-140.

6. Apell H.J. and Diller A. Do H+ ions obscure electrogenic Na+ and K+ binding in the El state of the Na,K-ATPase? // FEBS Lett. 2002. - V. 532. -P. 198-202.

7. Apell H.J. and Karlish S.J. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques // J. Membrane Biol. 2001. - V. 180. - P. 1-9.

8. Apell H.-J., Borlinghaus R., and Lauger P. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: II. Microscopic Analysis of Transient Currents // J. Membrane Biol. 1987. - V. 97. - P. 179-191.

9. Artigas P. and Gadsby D.C. Ion occlusion/deocclusion partial reactions in individual palytoxin-modified Na/K pumps // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003a. -V.986.-P. 116-126.

10. Artigas P. and Gadsby D.C. Na+/K+-pump ligands modulate gating of palytoxin-induced ion channels // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003b. - V. 100.-P. 501-505.

11. Artigas P. and Gadsby D.C. Large diameter of palytoxin-induced Na/K pump channels and modulation of palytoxin interaction by Na/K pump ligands // J. Gen. Physiol 2004. - V. 123. - P. 357-376.

12. Ермаков Ю.А. и Юсипович А.И. Граничный потенциал и натяжение плоских БЛМ в присутствии гадолиния. Регистрация в условиях непрерывной перфузии ячейки. // Биологические мембраны 2002. - Т. 19.-С. 541-548.

13. Babes A. and Fendler К. Na+ Transport, and the EiP-E2P Conformational Transition of the Na+/K+-ATPase // Biophys. J. 2000. - V. 79. - P. 25572571.

14. Bamberg E., Butt H.-J., Eisenrauch A., and Fendler K. Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes // Quart. Rev. Biophys. 1993. - V. 26. -P. 1-25.

15. Borlinghaus R., Apell H.-J., and Lauger P. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: I. Current and Voltage Transients after Photochemical Release of ATP // J. Membrane Biol. 1987. -V. 97.-P. 161-178.

16. Buhler R., Sturmer W., Apell H.-J., and Lauger P. Charge translocation by the Na,K-pump: I. Kinetics of local field changes studied by time-resolved fluorescence measurements // J. Membrane Biol. 1991. - V. 121. - P. 141161.

17. Butscher C., Roudna M., and Apell H. Electrogenic partial reactions of the SR-Ca-ATPase investigated by a fluorescence method // J Membr. Biol. -1999.-V. 168.-P. 169-181.

18. Cornelius F. Incorporation of C^Eg-solubilized Na+,K+-ATPase into liposomes determination of sidedness and orientation // Meth. Enzymol. -1988.-V. 156.-P. 156-167.

19. Cornelius F., Mahmmoud Y.A., and Christensen H.R. Modulation of Na,K-ATPase by associated small transmembrane regulatory proteins and by lipids //J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 415-423.

20. Cornelius F. and Skou J.C. Reconstitution of (Na++K+)-ATPase into phospholipid vesicles with full recovery of its specific activity // Biochim. Biophys. Acta 1984. - V. 772. - P. 357-373.

21. De Weer P., Gadsby D.C., and Rakowski R.F. Voltage Dependence of the Na-K Pump // Ann. Rev. Physiol. 1988. - V. 50. - P. 225-241.

22. Deguchi N., Jorgensen P.L., and Maunsbach A.B. Ultrastructure of the sodium pump. Comparison of thin sectioning, negative staining and freeze-fracture of purified membrane-bound (Na+,K+)-ATPase // J. Cell Biol. -1977.-V. 75.-P. 619-634.

23. Domaszewicz W. and Apell H. Binding of the third Na+ ion to the cytoplasmic side of the Na,K-ATPase is electrogenic // FEBS Lett. 1999. -V. 458.-P. 241-246.

24. Drachev L.A., Jasaitis A.A., Mikelsaar H., Nemecek I.B., Semenov A.Y., Semenova E.G., Severina I.I., and Skulachev V.P. Reconstitution ofbiological molecular generators of electric current // J. Biol. Chem. 1976. -V.251.-P. 7077-7082.

25. Eisenrauch A., Grell E., and Bamberg E. Voltage Dependence of the Na,K-ATPase incorporated into Planar Lipid Membranes // 1991. P. 317-326.

26. Fendler K., Grell E., Haubs M., and Bamberg E. Pump Currents Generated by the Na+,K+-ATPase from kidney on Black Lipid Membranes // EMBO J. -1985.-V. 4.-P. 3079-3085.

27. Fendler K., Jarushewski S., Hobbs A.S., Albers W., and Froehlich J.P. Pre-Steady-State Charge Translocation in Na,K-ATPase from Eel Electric Organ //J. Gen. Physiol. 1993. - V. 102. - P. 631-666.

28. Glynn I.M. The Na+,K+-transporting adenosine triphosphatase // 1985. V. 2. -P. 35-114.

29. Goldshlegger R., Karlish S.J.D., Rephaeli A., and Stein W.D. The Effect of Membrane-Potential on the Mammalian Sodium- Potassium Pump Reconstituted into Phospholipid-Vesicles // J. Physiol. -London 1987. - V. 387.-P. 331-355.

30. Hayman E.S. J. Membrane Biol. 1977. - V. 37. - P. 263-263.

31. Heyse S., Wuddel I., Apell H.-J., and Sturmer W. Partial reactions of the Na,K-ATPase: determination of rate constants // J. Gen. Physiol. 1994. - V. 104.-P. 197-240.

32. Hilgemann D.W. Channel-Like Function of the Na,K Pump Probed at Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches // Science 1994. - V. 263. - P. 1429-1432.

33. Hirsch Т., Kettenberger H., Wolfbeis O.S., and Mirsky V.M. A simple strategy for preparation of sensor arrays: molecularly structured monolayers as recognition elements // Chem. Commun. (Camb. ) 2003. - P. 432-433.

34. Hladky S.B. Ion transport and displacement currents with membrane bound carriers: The theory for voltage - clamp currents, charge - pulse transients and admittance for symmetrical systems // J. Membrane Biol. - 1979. - V. 49. - P. 213-237.

35. Hokin L.E. and Dixon J.F. Reconstitution of the Na,K-pump by freeze thaw sonication estimation of coupling ratio and electrogenicity // Meth. Enzymol. - 1988.-V. 156.-P. 141-155.

36. Holmgren M. and Rakowski R.F. Pre-Steady-State Transient Currents Mediated by the Na/K Pump in Internaly Perfused Xenopus Oocytes // Biophys. J. 1994. - V. 66. - P. 912-922.

37. Holmgren M., Wagg J., Bezanilla F., Rakowski R.F., De Weer P., and Gadsby D.C. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions // Nature 2000. - V. 403. - P. 898-901.

38. Павлов K.B. и Соколов B.C. Электрогенный транспорт ионов Na/K-АТРазой // Биологические мембраны 1999. - Т. 16. - С. 604-638.

39. Маркин B.C. и Чизмаджев Ю.А. Индуцированный ионный транспорт // 1974.

40. Jain М.К., White F.P., Strickholm A., Williams Е., and Cordes E.H. Studies concerning the possible reconstitution of an active cation pump across an artificial membrane // J. Membrane Biol. 1972. - V. 8. - P. 363-380.

41. Jogansson A., Smith G.A., and Metcalfe J.C. The effect of bilayer thickness on activity of (Na-K)-ATPase // Biochim. Biophys. Acta 1981. - V. 641. - P. 416-421.

42. Jorgensen P.L. Isolation of the Na,K-ATPase // Meth. Enzymol. 1974. - V. 32. - P. 277-290.

43. Jorgensen P.L., Hakansson K.O., and Karlish S.J. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions // Annu. Rev. Physiol -2003. V. 65.-P. 817-849.

44. Karlish S.J. Organization of the membrane domain of the Na/K-pump. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. - V. 834. - P. 30-44.

45. Karlish S.J.D., Goldshleger R., and Stein W.D. A 19-kDa C-Terminal Tryptic Fragment of the Alpha-Chain of Na/K- ATPase Is Essential for Occlusion and Transport of Cations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990. - V. 87. - P. 45664570.

46. Kimelberg H.K. and Papahadjopoulos D. Phospholipid requirements for (Na-K)-ATPase activity: head group specificity and fatty acid fluidity // Biochim. Biophys. Acta 1972. - V. 282. - P. 277-292.

47. Lauger P. Electrogenic Ion Pumps // 1991. P. 1-313.

48. Li C., Capendeguy O., Geering K., and Horisberger J.D. A third Na+-binding site in the sodium pump // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. - V. 102. - P. 12706-12711.

49. Lu C.-C., Kabakov A., Markin V.S., Mager S., Frazier S., Frazier G.A., and Hilgemann D.W. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -1995.-V. 1995.-P. 11220-11224.

50. Ma H., Lewis D., Xu C., Inesi G., and Toyoshima C. Functional and structural roles of critical amino acids within the"N", "P", and "A" domains of the Ca2+ ATPase (SERCA) headpiece // Biochemistry 2005. - V. 44. - P. 8090-8100.

51. Marcus M.M., Apell H.-J., Lauger P., Roudna M., Schwendener R.A., and Weder H.G. (Na+ K+)-ATPase in Artificial Lipid Vesicles - Influence of1.pid Structure on Pumping Rate // Biochim. Biophys. Acta 1986. - V. 854. -P. 270-278.

52. McLaughlin S. Electrostatic Potentials at Membrane-Solution Interfaces // 1977.-P. 71-144.

53. Mironova G.D., Bocharnikova N.I., Mirsalikhova N.M., and Mironov G.P. Ion transporting properties and ATPase activity of (Na+-K+)- ATPase large subunit incorporated into bilayer lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta -1986.- V. 861.-P. 224-236.

54. Montal M. and Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1972. - V. 69. - P. 3561-3566.

55. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., and Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1963. - V. 67. - P. 534-535.

56. Nagel G., Bamberg E., Fendler K., and Grell E. Na+ Currents Generated by the Purified (Na+ K+)-ATPase on Planar Lipid-Membranes // Biochim. Biophys. Acta - 1987. - V. 901. - P. 239-249.

57. Nakao M. and Gadsby D.C. Voltage Dependence of Na Translocation by the Na/K Pump // Nature 1986. - V. 323. - P. 628-630.

58. Соколов B.C. и Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока // Биофизика 1980. - Т. 25. - С. 170-172.

59. Соколов B.C., Павлов К.В., Джанджугазян К.Н., и Бамберг Е. Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании №,К-АТФазы // Биологические мембраны 1992. - Т. 9. - С. 961-969.

60. Соколов B.C., Стуколов С.М., Дармостук А.С., и Апель Х.-Ю. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATPазой методом измерения емкости // Биологические мембраны 1997. - Т. 14. - С. 529-548.

61. Соколов B.C., Черный В.В., Симонова М.В., и Маркин B.C. Распределение потенциала на границе мембрана-раствор при адсорбции амфифильных ионов // Биологические мембраны 1990. - Т. 7. - С. 872884.

62. Сорокина З.А. Ионофорные свойства пептидных фрагментов церебральной Na,К-АТФазы // Укр. Биохим. Ж. СССР 1984. - Т. 56. - С. 413-417.

63. Norby J.G. Na,K-ATPase Structure and Kinetics - Comparison with Other Ion- Transport Systems // Chemica Scripta - 1987. - V. 27B. - P. 119-129.

64. Ogawa H. and Toyoshima C. Homology modeling of the cation binding sites of Na+K+-ATPase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002. - V. 99. - P. 15977-15982.

65. Or E., Goldshleger R., and Karlish S.J.D. An Effect of Voltage on Binding of Na+ at the Cytoplasmic Surface of the Na+ K+ Pump // J. Biol. Chem. 1996. -V.271.-P. 2470-2477.

66. Peinelt C. and Apell H.J. Time-resolved partial reactions of the SR Ca-ATPase investigated with a fluorescent styryl dye // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2003.-V. 986.-P. 325-326.

67. Peinelt C. and Apell H.J. Kinetics of Ca2+ Binding to the SR Ca-ATPase in the El State // Biophys. J. 2005. - V. 89. - P. 2427-2433.

68. Peluffo R.D. and Berlin J.R. Electrogenic K+ transport by the Na+,K+ pump in rat cardiac ventricular myocytes // Journal Of Physiology London 1997. - V. 501.-P. 33-40.

69. Pintschovius J. and Fendler K. Charge translocation by the Na+/K+-ATPase investigated on solid supported membranes: Rapid solution exchange with a new technique // Biophys. J. 1999. - V. 76. - P. 814-826.

70. Rakowski R.F. Charge Movement by the Na/K Pump in Xenopus Oocytes // J. Gen. Physiol. 1993.-V. 101.-P. 117-144.

71. Reinhardt R., Lindemann В., and Anner B.M. Leakage channel conductance of single (Na-K)-ATPase molecules incorporated into planar bilayer by fusion of liposomes // Biochim. Biophys. Acta - 1984. - V. 774. - P. 147-150.

72. Rettinger J., Vasilets L.A., and Schwarz W. Analysis the Na+/K+-pump in Outside-out Giant Membrane Patches of Xenopus Oocytes // 1994. P. 553556.

73. Rice W.J., Young H.S., Martin D.W., Sachs J.R., and Stokes D.L. Structure of Nal,Kl-ATPase at 11-Е Resolution: Comparison with Ca21-ATPase in El and E2 States // Biophys. J. 2001. - V. 80. - P. 2187-2197.

74. Sagar A. and Rakowski R.F. Access Channel Model for the Voltage Dependence of the Forward- running Na+/K+ Pump // J. Gen. Physiol. 1994. -V. 103.-P. 869-894.

75. Schneeberger A. and Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement // J. Membr. Biol. 1999. - V. 168. - P. 221228.

76. Schneeberger A. and Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: II. Competition of various cations // J. Membr. Biol. 2001. - V. 179. - P. 263-273.

77. Schwappach В., Sturmer W., Apell H.-J., and Karlish S.J.D. Binding of sodium ions and cardiotonic steroids to native and selectively trypsinized Na,K pump, detected by charge movements // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. -P. 21620-21626.

78. Seifert K., Fendler K., and Bamberg E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes // Biophys. J. 1993. - V. 64.-P. 384-391.

79. Shull G.E., Schwarz A., and Lingrel J.B. Amino-acid sequence of the catalitic subunit of the Na,K pump deduced from complementary DNA // Nature -1985.-V. 316.-P. 691-695.

80. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta 1957. - V. 23. - P. 394-401.

81. Sokolov V.S., Ayuyan A.G., and Apell H.-J. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements // European Biophysics Journal 2001. - V. 30. - P. 515-527.

82. Sokolov V.S. and Mirsky V.M. Electrostatic potentials of bilayer lipid membranes: basic research and analytical applications // 2004. P. 255-291.

83. Sokolov V.S., Pavlov K.V., and Dzhandzhugazyan K.N. Change of Membrane Capacitance Coupled with Electrogenic Transport by Na,K-ATPase // 1994. P. 529-533.

84. Stengelin M., Eisenrauch A., Fendler K., Nagel G., van der Hijden H.T., de Pont J.J., Grell E., and Bamberg E. Charge translocation of H,K-ATPase and Na,K-ATPase //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992. - V. 671. - P. 170-188.

85. Sweadner K.J. and Donnet K. Structural similarities of Na,K,ATPase andл I

86. SERCA, the Ca -ATPase of the sarcoplasmic reticulum // Biochem. J. -2001.-V. 356.-P. 685-704.

87. Therien A.G., Pu H.X., Karlish S.J., and Blostein R. Molecular and functional studies of the gamma subunit of the sodium pump // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 407-414.

88. Toyoshima C. and Mizutani T. Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue // Nature 2004. - V. 430. - P. 529-535.

89. Toyoshima C., Nakasako M., Nomura H., and Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution // Nature -2000.-V. 405.-P. 647-655.

90. Toyoshima C. and Nomura H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium // Nature 2002. - V. 418. - P. 605611.

91. Toyoshima C., Nomura H., and Tsuda T. Lumenal gating mechanism revealed in calcium pump crystal structures with phosphate analogues // Nature 2004. - V. 432. - P. 361-368.

92. Vasilets L.A. and Schwarz W. Structure Function Relationship of Cation Binding in the Na+/K+ - ATPase // Biochim. Biophys. Acta - 1993. - V. 1154. -P. 201-222.

93. Wuddel I. and Apell H.-J. Electrogenity of the Sodium Transport Pathway in the Na,K-ATPase Probed by Charge-Pulse Experiments // Biophys. J. 1995. -V. 69.-P. 909-921.