Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Волков, Владимир Алексеевич

• Волков, Владимир Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волков, Владимир Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Возможные механизмы митоза.

1.2 Микротрубочка - древний биологический мотор.

1.3 Механизм перемещения груза деполимеризующейся микротрубочкой.

1.4 Генерация сил выгибающимися протофиламентами.

1.5 Сопряжение объектов с разбирающейся микротрубочкой.

1.5.1 Кольцевые сопрягающие устройства.

1.5.2 Количественный флюоресцентный анализ комплексов Daml.

1.5.3 Неколъцевые сопрягатели.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.

2.1 Бактериальная экспрессия, очистка и мечение комплекса DamI.

2.2 микроскопические исследования взаимодействия флюоресцентных комплексов DamI с микротрубочками.

2.3 Работа с шариками, покрытыми DamI.

2.4 Шарики, покрытые компонентами комплекса KMN.

2.5 Получение изображений и сбор данных.

2.6 Электронная микроскопия.

2.7 Анализ данных.

2.8 Математический анализ кинетики выцветания точек.

2.8.1 Математический анализ кривых выцветания.

2.8.2 /Алгоритм аппроксимации Гауссовыми распределениями.

2.8.3 Алгоритм PDF.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ DAM1 С МИКРОТРУБОЧКОЙ.

3.1 Комплексы DamI, устойчиво двигающиеся с концом разбирающихся микротрубочек, не меняют свой размер.

3.2 Следующий за концом микротрубочки комплекс DamI является кольцом, но не большим комплексом.

3.3 Двигающийся комплекс DamI теряет субъединицы, когда наталкивается на крупный неподвижный комплекс.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ШАРИКОВ, ПОКРЫТЫХ DAM1, С МИКРОТРУБОЧКОЙ.

4.1 Связанный с концом микротрубочки шарик скользит вдоль ее поверхности в присутствие Dami в растворе.

4.2 Покрытые DamI шарики могут следовать за концами микротрубочек в отсутствие колец.

4.3 В отсутствие растворимого DamI шарики, покрытые DamI, катятся, а не скользят.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ. НЕКОЛЬЦЕВЫЕ И ФИБРИЛЛЯРНЫЕ СОПРЯГАТЕЛИ.

5.1 Некольцевые комплексы DamI имеют разный размер и быстро диффундируют.

5.2 Некольцевые комплексы DamI могут следовать за концом разбирающейся микротрубочки.

5.3 Фибриллярные сопрягатели.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6.1 Кинетические и сопрягающие свойства олигомеров DamI in vitro.

6.2 По поводу структуры комплексов DamI, функционирующих на кинетохорах почкующихся дрожжей.

6.3 Поведение покрытых DamI шариков в отсутствие растворимого DamI: сравнение наших результатов с опубликованными данными.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение»

Основная задача делящейся клетки - обеспечить равное разделение генетического материала между дочерними клетками (Алов 1972). Каждая из двух сестринских хроматид в хромосоме должна уйти в свою клетку. Это возможно с помощью полярных белковых полимеров - микротрубочек, которые во время митоза образуют веретено деления. Микротрубочки являются механическими элементами цитоскелета, и в то же время высоко динамичны. Своими минус-концами они прикрепляются к полюсам веретена деления, а плюс-концы постоянно удлиняются и укорачиваются, и способны присоединяться к хромосомам и двигать их. Хромосомы присоединяются к микротрубочкам с помощью белкового суперкомплекса, называемого кинетохором (Mcintosh et al. 2002, Maiato et al. 2004, Westermann et al. 2007). Каждая хроматида из пары, составляющей хромосому, прикрепляется к микротрубочкам, идущим от своего полюса. Кинетохоры крепко связываются с динамическими концами (плюс-концами) микротрубочек, однако субъединицы тубулина по-прежнему могут добавляться или отсоединяться от концов микротрубочек. Понимание механизма, который бы позволял этому закреплению быть одновременно стабильным (нестабильные закрепления приводят к потере хромосом и анеуплоидии) и в то же время динамичным (нарушение динамики микротрубочек останавливает митоз) - один из основных вопросов в области биологии, изучающей деление клетки. Сегодня известно более 100 белков, входящих в состав кинетохора, однако ясной картины механической машины, обеспечивающей его связь с микротрубочкой, до сих пор нет. Сложность связана как с разнообразием теоретических представлений о потенциальном принципе работы такого устройства, так и с тем, что экспериментальная проверка подобных гипотез зачастую была невозможна из-за отсутствия биохимических кандидатов на роль этих устройств.

В связи с этим актуальны исследованиия сопрягающих свойств наиболее вероятных кандидатов на роль посредника между микротрубочкой и кинетохором. Такими кандидатами в настоящее время считаются комплекс а Daml/DASH, а также компоненты супер-комплекса KMN (KNL-1, Misl2, Ndc80). Комплекс Daml/DASH может существовать в виде колец и спиралей, также предполагается существование олигомеров меньшего размера. Компоненты суперкомплекса KMN Ndc80 и KNL1 имеют форму фибрилл. В качестве необходимого этапа такие исследования должны включать сравнение полученных данных с математическими моделями передвижения груза разбирающейся микротрубочкой посредством кольца (Efremov et al., 2007) или фибрилл (Mcintosh et al., 2008).

Цель работы: Экспериментальное исследование движения белковых комплексов Daml, Ndc80, Misl2 и белка KNL1 за деполимеризующимися микротрубочками.

Задачи исследования:

1. Исследовать свойства кольцевых и иных комплексов Daml, взаимодействующих с деполимеризующимися микротрубочками. Выяснить возможный механизм сопряжения движения груза с деполимеризацией микротрубочки при помощи кольцевых комплексов Daml.

2. Выяснить экспериментальную возможность работы такого сопрягателя на основе фибриллярных белковых комплексов.

Научная новизна.

В работе впервые установлено, что комплекс Daml образует на динамических микротрубочках как кольца, так и комплексы меньшего размера. Показано, что максимальный размер олигомера, который способен двигаться под действием деполимеризации микротрубочки, не превышает одиночного кольца. Установлено, что кольца замедляют разборку микротрубочки, причем размер и скорость двигающегося комплекса не изменяются во время движения. При этом, если олигомеры большего размера образуются спонтанно или в результате столкновения двух колец, то разборка микротрубочки приостанавливается до тех пор, пока кольцо, находящееся ближе к плюс-концу микротрубочки, не разрушится. Показано, что существует два различных механизма движения груза (стеклянного шарика) за концом микротрубочки с участием комплексов Daml. В случае, когда шарик прикреплен к микротрубочке через кольцо, шарик двигается медленно, не меняя своей ориентации относительно микротрубочки. Если же шарик, покрытый Бат1, прикреплен без участия кольца, то он двигается быстро и катится по поверхности микротрубочки. На основании совокупности полученных данных сделан вывод, что движение хромосом в клетке почкующихся дрожжей происходит с участием колец. Методами флюоресцентной и электронной микроскопии установлено, что комплексы Ват1, которые не образуют колец, весьма разнообразны по своему размеру и форме. Показано, что такие комплексы также способны двигаться с концом разбирающейся микротрубочки. Установлено, что фибриллярные белки, которые не могут образовывать колец в принципе, также способны преобразовывать усилие, развиваемое при деполимеризации микротрубочки, в движение груза. Этот результат подтверждает опубликованные данные о разной роли компонентов супер-комплекса КМИ в связывании кинетохора с микротрубочкой.

Научно-практическое значение.

Фундаментальным Результатом данной работы является вклад в понимание механизмов присоединения кинетохоров к микротрубочкам во время деления клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Описаны два принципиально отличающихся механизма взаимодействия комплекса Ваш1 с микротрубочкой: кольца (19 ± 3 гетеродекамеров), и более мелкие олигомеры (9 ± 1 гетеродекамеров). Более крупные олигомеры не двигаются по микротрубочке.

2. Охарактеризованы два механизма, с помощью которых Баш1 трансформирует энергию деполимеризации микротрубочки в движение груза. Первый механизм существует в отсутствие колец, и шарик в этом случае быстро катится по микротрубочке. Второй механизм представляет собой медленное скольжение шарика, связанного с кольцом на микротрубочке.

Фибриллярные комплексы, входящие в состав супер-комплекса КМ1Ч, охарактеризованы в отношении их сопрягающих свойств. Наилучшими сопрягателями из них являются белок КМЧ и комплекс N<1080, которые обеспечивают непрерывное движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Ваш1 (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Волков, Владимир Алексеевич

выводы.

1. Исследован характер взаимодействия кинетохорного комлпекса Daml с динамическими микротрубочками in vitro. Обнаружено, что они существуют в виде двух классов олигомеров: одиночных колец, состоящих из 19 ± 3 гетеродекамеров, и более мелких некольцевых олигомеров, содержащих от 2 до 16 гетеродекамеров.

2. Исследованы свойства этих классов олигомеров Daml в отношении передвижения грузов с концом микротрубочки, обнаружено два различных механизма движения шариков. В отсутствие растворимого Daml шарики катятся по микротрубочке со скоростью 30 ± 1 мкм/мин, а при добавлении Daml в раствор шарики скользят вместе с кольцами со скоростью 8 ± 1 мкм/мин.

3. KNL1 и Nd80, фибриллярные компоненты супер-комплекса KMN, обеспечивают движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Daml (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Волков, Владимир Алексеевич, 2011 год

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. 1972. «Медицина». Москва.

2. Молодцов М. И. Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил: дис. канд. биол. наук: 03.00.02 Москва, 2007 91 с. РГБ ОД, 61:07-3/544

3. Asbury, С. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D. and Davis, Т. N. (2006). The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 9873-9878.

4. Block SM, SvobodaK(1995) Analysis of high resolution recordings of motor movement. Biophys J 68:230S-239S.

5. Brouhard GJ, Stear JH, Noetzel TL, Al-Bassam J, Kinoshita K, Harrison SC, Howard J, Hyman AA. (2008) XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell 132:79-88.

6. Cheeseman I, Niessen S, Anderson S: Hyndman F, Yates JR, Oegema K, Desai A (2004) A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension. Genes Dev, 18:2255-2268.

7. Cheeseman, I. M., Chappie, J. S., Wilson-Kubalek, E. M. and Desai, A. (2006). The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore. Cell 127, 983-997.

8. Chen Y, Riley DJ, Chen PL, Lee WH (1997) Нес, a novel nuclear protein rich in leucine heptad repeats specifically involved in mitosis. Mol Cell Biol 17:6049-6056.

9. Chretien, D., Fuller, S. D. and Karsenti, E. (1995). Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol. 129, 1311-1328.

10. Cottingham, F. R., Gheber, L„ Miller, D. L. and Hoyt, M. A. (1999). Novel roles for saccharomyces cerevisiae mitotic spindle motors. J. Cell Biol. 147, 335-350.

11. Coue, M., Lombillo, V. A. and Mcintosh, J. R. (1991). Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J. Cell Biol. 112, 1165-1175.

12. DeLuca JG, Dong Y, Hergert P, Strauss J, Hickey JM, Salmon ED, McEwen BF (2004) Heel and Nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Mol Biol Cell 16(2):519-31.

13. Desai A, Rybina S, Muller-Reichert T, Shevchenko A, Hyman A, Oegema K (2003) KNL-1 directs assembly of the microtubule-binding interface of the kinetochore in C. elegans. Genes Dev, 17:2421-2435.

14. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R. and Ataullakhanov, F. I. (2007). In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 1901719022.

15. Elie-Caille, C., Severin, F., Helenius, J., Howard, J., Muller, D. J. and Hyman, A. A. (2007). Straight GDP-tubulin protofilaments form in the presence of taxol. Curr. Biol. 17, 1765-1770.

16. Franco, A., Meadows, J. C. and Millar, J. B. (2007). The Daml/DASH complex is required for the retrieval of unclustered kinetochores in fission yeast. J. Cell Sci. 120, 3345-3351.

17. Fygenson DK, Braun E, Libchaber A (1994) Phase diagram of microtubules. Phys Rev E 50:1579-1588.

18. Gachet, Y., Reyes, C., Courtheoux, T., Goldstone, S., Gay, G., Serrurier, C. and Tournier, S. (2008). Sister kinetochore recapture in fission yeast occurs by two distinct mechanisms, both requiring Daml and Klp2. Mol. Biol. Cell 19, 1646-1662.

19. Garcia, M. A., Koonrugsa, N. and Toda, T. (2002). Spindle-kinetochore attachment requires the combined action of Kin I-like Klp5/6 and Alpl4/Disl-MAPs in fission yeast. EMBO J. 21, 6015-6024.

20. Gelfand, V. I. Cytoplasmic microtubular motors. (1989) Curr Opin Cell Biol. 1989 Feb;l(l):63-6.

21. Grishchuk EL and Ataullakhanov FI. (2010) In vitro assays to study the tracking of shortening microtubule ends and to measure associated forces. Methods Cell Biol. 95:657-76.

22. Grishchuk, E. L. and Mcintosh, J. R. (2006). Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. EMBO J. 25, 48884896.

23. Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Molodtsov, M. and Ataullakhanov, F. I. (2010). Force generation by dynamic microtubule polymers. In Biophysics, Vol. 7 (ed. Y. E. Goldman and E. M. Ostap). Elsevier (in press).

24. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. and Mcintosh, J. R. (2005). Force production by disassembling microtubules. Nature 438, 384388.

25. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S. and Mcintosh, J. R. (2007). Mitotic chromosome biorientation in fission yeast is enhanced by dynein and a minus-end-directed, kinesin-like protein. Mol. Biol. Cell 18, 2216-2225.

26. Hill, T. L. (1985). Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4404-4408.

27. Inoue, S. and Salmon, E. D. (1995). Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol. Biol. Cell 6, 1619-1640.

28. Ishikawa, M., Yogi, O., Ye, J. Y., Yasuda, T., and Maruyama, Y., (1998) Anal. Chem., 70, 5198.

29. Joglekar AP, Bouck DC, Molk JN, Bloom KS, Salmon ED (2006) Molecular architecture of a kinetochore-microtubule attachment site. Nat Cell Biol 8:581-585.

30. Joglekar, A. P. and Hunt, A. J. (2002). A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys. J. 83, 42-58.

31. Jordan, M. A., Toso, R. J., Thrower, D. and Wilson, L. (1993). Mechanism of mitotic block and inhibition of cell proliferation by taxol at low concentrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9552-9556.

32. Kerres, A., Jakopec, V., Fleig U. (2006) The conserved Spc7 protein is required for spindle integrity and links kitetochore proteins in fission yeast. Mol Biol Cell, 18: 2441-2454.

33. Kim, Y„ Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. (2008) CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. J Cell Biol 181(3):411-9.

34. Kirschner, M. W., Honig, L. S. and Williams, R. C. (1975). Quantitative electron microscopy of microtubule assembly in vitro. J. Mol. Biol. 99, 263276.

35. Koshland, D. E., Mitchison, T. J. and Kirschner, M. W. (1988). Poleward chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature 331, 499-504.

36. Maiato H, DeLuca J, Salmon ED, Earnshaw WC. (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci. 117(Pt 23):5461-77.

37. Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. and Milligan, R. A. (1991). Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo- electron microscopy study. J. Cell Biol. 114, 977-991.

38. Mao, Y., Varma, D. and Vallee, R. 2010. Emerging functions of forceproducing kinetochore motors. Cell Cycle 9, 715-719.

39. Mcintosh JR, Grishchuk EL, West RR. (2002) Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol. 18: 193-219.

40. Meraldi P, Draviam VM, Sorger PK (2004) Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell, 7:45-60.

41. Miranda, J. J., De Wulf, P., Sorger, P. K. and Harrison, S. C. (2005). The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 138-143.

42. Miranda, J. J., King, D. S. and Harrison, S. C. (2007). Protein arms in the kinetochore-microtubule interface of the yeast DASH complex. Mol. Biol. Cell 18, 2503-2510.

43. Mitchison, T. J. and Kirschner, M. W. (1985). Properties of the kinetochore in vitro. I. Microtubule nucleation and tubulin binding. J. Cell Biol. 101, 755765.

44. Molodtsov, M. I., Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., Mcintosh, J. R. and Ataullakhanov, F. I. (2005a). Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 4353-4358.

45. Nicklas, R. B. (1997). How cells get the right chromosomes. Science 275, 632-637.

46. Park M, Kim H-H, Kim D, SongNW(2005) Counting the number of fluorophores labeled in biomolecules by observing the fluorescence-intensity transient of a single molecule. Bull Chem Soc Jpn 78:1612-1618.

47. Pearson CG, Yeh E, Gardner M, Odde D, Salmon ED, Bloom K. (2004) Stable kinetochore-microtubule attachment constrains centromere positioning in metaphase. CurrBiol 14:1962-1967.

48. Putkey, F.R., Cramer, T., Morphew, M.K., Silk, A.D., Johnson, R.S., Mcintosh, J.R., and Cleveland D.W. (2002) Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Dev. Cell 3 : 351 -365 .

49. Rieder, C. L., and Salmon, E. D. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol. 1998 Aug;8(8):310-8.

50. Schmidt, T., Schutz, G. J., Gruber, H. J. and Schindler, H. (1996). Anal. Chem., 68,4397

51. Shang C, Hazbun TR, Cheeseman IM, Aranda J, Fields S, Drubin DG, Barnes G. (2003) Kinetochore protein interactions and their regulation by the Aurora kinase Ipllp. Mol Biol Cell 14:3342-3355.

52. Sharp, D. J., Rogers, G. C. and Scholey, J. M. (2000). Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat. Cell Biol. 2, 922-930.

53. Tan D, Asenjo AB, Mennella V, Sharp DJ, Sosa H. (2006) Kinesin-13s form rings around microtubules. J Cell Biol. 175(1):25-31.

54. Tanaka, K., Kitamura, E., Kitamura, Y. and Tanaka, T. U. (2007). Molecular mechanisms of microtubule-dependent kinetochore transport toward spindle poles. J. Cell Biol. 178, 269-281.

55. Wang, HW, and Nogales, E. (2005) Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly. Nature. 435(7044):911-5.

56. Welburn, J. P., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., 3rd and Cheeseman, I. M. (2009). The human kinetochore Skal complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell 16, 374-385.

57. Westermann S, Drubin DG, Barnes G. (2007) Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu Rev Biochem. 76: 563-91.

58. Westermann, S., Avila-Sakar, A., Wang, H. W., Niederstrasser, H., Wong, J., Drubin, D. G., Nogales, E. and Barnes, G. (2005). Formation of a dynamic kinetochore-microtubule interface through assembly of the Daml ring complex. Mol. Cell 17, 277-290.

59. Westermann, S., Wang, H. W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E. and Barnes, G. (2006). The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature 440, 565-569.

60. Wigge PA, Kilmartin JV (2001) The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol, 152:349-360.

61. Wood, K.W., Sakowicz, R., Goldstein, L.S., and Cleveland D .W. (1997) CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 : 357 366 .

62. Wordeman, L., Wagenbach, M. and von Dassow, G. (2007). MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J. Cell Biol. 179, 869-879.

63. Yang, Z„ Tulu, U. S., Wadsworth, P. and Rieder, C. L. (2007). Kinetochore dynein is required for chromosome motion and congression independent of the spindle checkpoint. Curr. Biol. 17, 973-980.

64. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K.F., and Cleveland D.W. (2000) CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nat. Cell Biol. 2 : 484 491 .

65. Zheng L, Chen Y, Lee WH (1999) Heclp, an evolutionarily conserved coiled-coil protein, modulates chromosome segregation through interaction with SMC proteins. Mol Cell Biol, 19:5417-5428.