Изучение индуцированного васкулогенеза в 3D культуре мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат биологических наук Горкун, Анастасия Алексеевна

• Горкун, Анастасия Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Горкун, Анастасия Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клеточные механизмы васкуло- и ангиогенеза.

1.2. Ранние и поздние эндотелиальные прогениторы.

1.3. Факторы роста и васкулогенез.

1.4. 2D- и ЗО-модели васкуло- и ангиогенеза in vitro.

1.5. Современные подходы к получению васкуляризованных тканевых конструктов.

1.6. Пупочный канатик как источник мультипотентных клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение и культивирование клеток из пупочного канатика.

2.2. ЗБ-культивирование HUVEC и ММСК пупочного канатика.

2.3. Индукция васкулогенной дифференцировки в 3D культуре ММСК ПК

2.4. Моделирование роста тубулоподобных структур в матригеле.

2.5. Слияние аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов.

2.6. Изучение поведения клеток сфероидов ММСК ПК в ткани печени крыс на модели хронической печеночной недостаточности.

2.7. Методы гистологии, иммуноцитохимии и молекулярной биологии.

2.8. Исследование строения сфероидов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Выделение и характеристика 2D культуры ММСК ПК.

3.2. Исследование образования и иммуноцитохимическая характеристика 3D сфероидов ММСК ПК.

3.3. Исследование строения сфероидов ММСК ПК.

3.4. Исследование васкулогенных характеристик сфероидов ММСК ПК.

3.5. Исследование ангиогенных характеристик васкулярных сфероидов ММСК ПК.

3.6. Слияние сфероидов и получение васкуляризованной микроткани.

3.7. Инъекция васкуляризованных сфероидов ММСК ПК в поврежденную печень крыс при моделировании хронической печеночной недостаточности

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Получение и характеристика стандартной 2D культуры ММСК ПК.

4.2. Исследование полученных 3D сфероидов ММСК ПК.

4.3. Выявление ранних и поздних ЭП в сфероидах ММСК ПК.

4.4. Исследование образования тубулоподобных структур в матригеле

4.5. Получение васкуляризованной микроткани.

4.6. Исследование эффектов инъекции васкуляризованных мезенхимосфероидов в ткань поврежденной печени крыс.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение индуцированного васкулогенеза в 3D культуре мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика»

Актуальность темы

Формирование единой сети кровеносных сосудов является одним из ранних и сложных процессов морфогенеза в эмбриональном развитии млекопитающих. Выделяют два механизма образования и роста сосудов: васкулогенез и ангиогенез. Васкулогенез - это сборка капилляров из отдельных разрозненных эндотелиальных прогениторов (ЭП), одновременно собирающихся в единую систему in vivo или in vitro. В отличие от васкулогенеза, при ангиогенезе эндотелиальные прогениторы направленно мигрируют из терминалей капилляров, формируя новый тяж (cord) вслед за ведущими клетками (tip cells). Эмбриональный васкулогенез включает в себя формирование кровеносных сосудов в двух независимых областях эмбриона -провизорных органах и самом зародыше. Новообразование ангиобластов происходит благодаря индукционным взаимодействиям мезодермы и энтодермы [116]. Ангиобласты зародыша мигрируют на большие расстояния, чтобы дать начало вторичным плексусам (пучкам) в новых участках органогенеза [69]. До конца XX века считалось, что, в отличие от эмбриональной, во взрослой ткани рост и образование сосудов осуществляется только за счет ангиогенеза. Однако в 1997 году было установлено, что в крови взрослого человека циркулирует 2-3 ЭП/мл [21]. Эти ЭП имели «маркерную» комбинацию из 3 молекул: CD34+, Flkl+ и CD 133 [21] и были способны к заселению (реэндотелизации) синтетических протезов сосудов [134, 148]. Asahara сумел выделить «раннюю» и «позднюю» фракцию ЭП по скорости прикрепления и формирования характерных 2D колоний. Две группы исследователей [21, 133] показали по спектру маркерных белков, что постнатальные ЭП не имеют ничего общего с эмбриональными ангиобластами. Изучение клеточных механизмов ангио- и васкулогенеза in vivo и in vitro позволило идентифицировать две субпопуляции ЭП: «ранние» ЭП (CD 13 3 +/CD34+/VEGF+ клетки) и «поздние» ЭП (CD31+/Flk-l+/vWF+ клетки). Поздние ЭП также маркируются CD34+/CD45- [144] и имеют 77% общих РНК-транскриптов с мононуклеарной фракцией крови [99]. Поскольку 2 субпопуляции ЭП являются, по-видимому, единственным источником новых эндотелиальных клеток in situ/in vitro, резко возрос интерес к изучению и моделированию васкулогенеза с целью ангио-регенерации и клеточной терапии ишемических состояний [111]. Было показано, что ранние ЭП лишь стимулируют пролиферацию других эндотелиальных клеток за счет паракринного механизма, тогда как поздние ЭП активно участвуют в васкулогенезе и ангиогенезе, в том числе при различных патологических состояниях [7, 148, 136, 81]. Введение поздних ЭП в ишемизированные ткани [19, 80], в сердечную мышцу при инфаркте миокарда [75, 37] и в ткань печени при хронической недостаточности [147] приводило к восстановлению кровоснабжения и усилению регенерации. Регенерация печени сопровождалась снижением фиброза. Однако клиническое применение ауто-ЭП лимитировано их малым количеством в циркулирующей крови. Поэтому за последнее десятилетие возрос интерес к лабораторному получению ЭП из доступных резервов взрослого организма - из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). Например, мононуклеарная фракция из аспирата костного мозга содержит множество предшественников эндотелиальных клеток различной степени дифференцировки [112]. Ранние CD133+ ЭП клетки, которые появляются в прикрепленном состоянии в первые 4-7 суток культивирования имеют общие признаки с циркулирующими в крови ЭП, описанными Asahara [136]. Недавние исследования показали повышенное содержание ЭП в экстраэмбриональных тканях. В отличие от взрослой периферической крови, кровь пуповинной вены содержит «поздние» ЭП с необычайно высоким пролиферативным потенциалом - хороший источник для банка ЭП и клинического применения [111]. Первичная культура ММСК, выделенная из Вартонова студня пупочного канатика (ПК), обогащена ранними ЭП в большей степени, чем аспират костного мозга взрослого организма [151,131]. Кроме того, было установлено, что воздействие VEGF приводит к образованию в 2D культуре ММСК ПК поздних С031+/у\\Ф+ ЭП, сопоставимому с дифференцировкой 2Т) культуры ММСК КМ [35,43].

Несмотря на то, что пупочный канатик является универсальным источником низкодифференцированных клеток различного фенотипа [119], в 20 культуре не удается моделировать развитие ранних и поздних ЭП. Условия ЗО культивирования лучше моделируют структуры нативной ткани и полноценный морфогенез. Однако до сих пор нет адекватных моделей васкуло- и ангиогенеза в ЗО культуре ММСК, механизмы этих процессов остаются неизученными, так как исследования в этой области проводились в основном на эмбриональных ангиобластах [71].

Цель и задачи исследования

Изучить ангиогенные и васкулогенные характеристики индуцированных УЕОБ мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика в ЗБ культуре.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать стандартное сырье - клонированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки пупочного канатика (ММСК ПК).

2. Разработать и стандартизовать методику серийного масштабирования жизнеспособных аваскулярных и васкуляризованных ЗО мезеносфероидов из стандартного 20 сырья.

3. Изучить ЗО динамику сфероидообразования ММСК ПК. Сравнить распределение экспрессии в 2Б и ЗБ культуре эпителиальных и мезенхимных маркеров, оценить пролиферативный потенциал клеток сфероида, исследовать структурные изменения на клеточном и ультраструктурном уровне.

4. Исследовать экспрессию маркеров ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток в аваскулярных и васкуляризованных сфероидах ММСК ПК.

5. Осуществить ЗБ скрининг УЕОБ-индуцированных сфероидов ММСК ПК к капиллярогенезу в ЗБ-матригеле.

6. Проверить возможность образования васкуляризованной микроткани при слиянии мезеносфероидов.

7. Исследовать поведение поздних ЭП из ЗБ культуры ММСК ПК при патологическом процессе на модели хронической печеночной недостаточности крыс.

Научная новизна

Работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые было осуществлено серийное масштабирование аваскулярных (неиндуцированных) и васкуляризованных (УЕОР-индуцированных) мезеносфероидов из стандартного 2Т) сырья -клонированной культуры ММСК ПК.

Были впервые исследованы пластичность и перераспределение экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров в клетках сфероидов ММСК ПК. Впервые были выявлены ранние ЭП в аваскулярных мезеносфероидах. Впервые показано, что УЕОБ индуцировал появление в ЗЭ культуре ММСК ПК поздних ЭП, способных к образованию люменов внутри сфероида и тубулоподобных структур в окружающем матриксе при помещении в матригель.

Предложена оригинальная методика получения васкуляризованной микроткани путем слияния индуцированных мезеносфероидов с образованием единой капиллярной сети. Впервые показано, что трансплантированные в составе сфероида поздние ЭП выживали в поврежденной ксеногенной печени без иммуносупрессии, встраивались в стенки сосудов реципиента и сохраняли экспрессию маркера ЭП.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан метод получения неограниченного числа аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов из стандартного источника - ММСК

ПК. Было показано, что клонированная культура ММСК ПК способна к сфероидообразованию с включением в новообразующийся сфероид практически всех клеток в ЗБ системе. Предложенный метод позволяет получить максимально возможное количество идентичных мезеносфероидов с минимальными потерями исходного числа клеток. Было установлено, что сфероидообразование ММСК ПК всегда сопровождается ламинацией сфероида на две функциональные зоны, ультраструктурными изменениями и перераспределением паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров. Нестин+, цитокератин 19+ эпителиоподобные клетки располагались на поверхности сфероидов, тогда как коллаген 1У+ округлые клетки были сосредоточены в центральной части, но все клетки сфероида сохраняли экспрессию виментина, цитокератина 18 и ламинина. Были выявлены ранние и поздние ЭП в ЗБ культуре ММСК ПК. Продемонстрирована новая клеточная модель васкулогенеза и ангиогенеза из одного типа клеток. Появление поздних ЭП было связано с влиянием УЕОР и сопровождалось образованием люменов и тубулоподобных структур в матригеле. Установлено, что сфероиды ММСК ПК способны к неограниченному слиянию с увеличением плотности клеток в объединенном сфероиде. Слияние васкуляризованных сфероидов приводило к сегрегации СБ31+ клеток с образованием единой капиллярной сети. Интеграция с тканями реципиента и сохранение экспрессии специфического маркера свидетельствовали о способности поздних ЭП из сфероидов ММСК ПК к участию в регенерации сосудистой сети поврежденной печени крыс. Разработанный метод получения васкуляризованных мезеносфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Культивирование сфероидов ММСК ПК на агарозных планшетах позволяет с малыми трудозатратами получать из стандартного 2D сырья большие (достаточные для клинических трансплантаций) количества сфероидов.

2. ММСК ПК при сфероидообразовании разделяются на две популяции: нестин+/цитокератин19+ и нестин-/коллаген IV+ клетки. Популяции отличаются не только иммуноцитохимическими, но и ультраструктурными особенностями.

3. При 3D культивировании ММСК ПК происходит спонтанная дифференцировка в эндотелиальном направлении, сопровождающаяся новообразованием ранних ЭП. Добавление индукционного фактора VEGF стимулирует появление поздних ЭП, формирующих люмены внутри сфероида и тубулоподобные структуры в матригеле. При слиянии большого числа сфероидов, в новообразованной ткани развивается внутренняя сосудистая сеть.

4. Локальное введение васкуляризованных сфероидов в ткань поврежденной печени крыс приводит к интеграции поздних ЭП с тканями реципиента и их участию в регенерации сосудистой сети.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на:

• XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (2009г, Москва)

• VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (2009г, Москва)

• IX «High médical technologies in XXI century: The modem achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (20 Юг, Benidorm, Spain)

• X «High médical technologies in XXI century: The modem achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (2011 r, Benidorm, Spain)

• 8th Swiss experimental surgery symposium "Animal Models for Organogenesis" (2012r, Geneva, Switzerland)

• 5 Всероссийский симпозиум с международным участием «Актуальныевопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (2012г, Уфа)

• 47th Annual Congress of the European Society for Surgical Research (2012r, Lille, France)

• 4th Expert Meeting Mesenchymal Stem Cells in Solid Organ Transplantation MISOT (2012г. Barselona, Spain)

• The XI International Conference "Hight Medical Technologies XXI Century" (2012r. Benidorm, Spain)

Внедрение полученных результатов

Результаты диссертационного исследования используют для моделирования васкулогенеза и ангиогенеза in vitro, подготовки клеток к трансплантации в поврежденные ткани, получения васкуляризованной микроткани для тканеинженерных конструкций в лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИОПП РАМН и для исследования регенеративного и иммуномодулирующего воздействия мезеносфероидов на печень при развивающемся патологическом процессе в лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Горкун, Анастасия Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Клонированные 2D культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика обладают смешанным мезенхимным (CD 105+/CD90+/CD29+/CD 11 b-/CD45 -/CD3 4-, виментин+) и эпителиальным (цитокератин 18+, коллаген IV+, ламинин+) фенотипом, который стабильно воспроизводится в свыше 95% клеток при дальнейшем культивировании.

2. Временные и количественные закономерности сфероидообразования в системе единичных сфероидов «висячей капле» и при масштабном культивировании на агарозных планшетах 3D Petri Dish идентичны. Сфероидообразование происходит в течение 7 суток 3D культивирования и сопровождается ламинацией на поверхностную и центральную зоны сфероидов, состоящие из различных типов клеток. Эпителиоподобные (нестин+/цитокератин19+) поверхностные клетки связаны межклеточными контактами и несут микроворсинки. Центральную часть сфероидов составляют нестин-/коллаген IV+ клетки с ультраструктурными изменениями, выражающимися в накоплении секреторных гранул, образовании центрических крист митохондрий, гиперплазии аппарата Гольджи, повышенном количестве микровезикул. Экспрессия виментина, цитокератина18 и ламинина сохраняется во всех клетках сфероида.

3. На 7 сутки 3D культивирования в мезеносфероидах экспрессируются маркеры раннего эмбриогенеза (GATA6, РАХ6) и маркеры ранних эндотелиальных прогениторов (CD133+, CD34+, VEGF+) без морфологических признаков ангио-, васкулогенеза в сфероиде.

4. Добавление васкулогенного индуктора VEGF в культуральную среду вызывает на 7 сутки 3D культивирования образование поздних эндотелиальных прогениторов (CD31+, Flk-1+, vWF+ клеток), образующих внутри сфероида кольцевые структуры - люмены.

5. Помещение мезеносфероидов с поздними эндотелиальными прогениторами в матригель индуцирует активный рост тубулоподобных структур в окружающий матрикс, завершающийся к 9 суткам культивирования формированием первичной капиллярной сети.

6. Слияние аваскулярных и васкуляризованных (содержащих люмены и тубулоподобные структуры) мезеносфероидов завершается образованием единой структуры - васкуляризованной микроткани.

7. Поздние эндотелиальные прогениторы из васку ляризованных мезеносфероидов способны дифференцироваться в эндотелиоциты и участвовать в регенерации сосудистой сети при патологическом процессе in vivo.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Горкун, Анастасия Алексеевна, 2012 год

1. Белоусов JI.B. Основы общей эмбриологии. M.: Изд-во Моск. Ун-та:1. Наука, 2005.-368с.

2. Гилберт С. Биология развития. Перевод 7-го издания. -СПб.:Библиотечное дело, 2003. - 838с.

3. Горкун A.A., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Пулин A.A., Комиссарова C.B., Репин B.C., Иванов Д.В. Индукция васкулогенеза в сфероидах из стромальных клеток пупочного канатика // Вестник новых медицинских технологий, 2012.-№2. - С. 313-315.

4. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену: пер. с англ. — М.: Мир, 1983. — Т. 2. —390с.

5. Мелихова В. С., Исаев А. А. Клеточные популяции, выделяемые из пуповинно-плацентарного комплекса и перспективы их научно-практического использования // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007.-№ 4. - С. 31-38.

6. Репин B.C. Стволовые клетки сердечно-сосудистой системы и атеросклероз // Патогенез. 2004. - №1. - С. 9-20.

7. Репин B.C., Сабурина И.Н. Клеточная биология развития/М.: И.С.К.Ч., 2010.-200с.

8. Репин B.C., Сабурина И.Н. Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении ткани // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. -Т.5, №3. - С.64-72.

9. П.Сабурина И.Н., Репин B.C. ЗО-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (к вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности) // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. - Т.5,№2. - С.75-86.

10. Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам гомеостаза / Д.С. Саркисов. М: «Медицина», 1977. - 35с.

11. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство/М.: Изд-во Бином. Лаборатория знаний, 2010. 691с.

12. Alvarez-Perez J., Ballesteros P., Cerdan S. Microscopic images of intraspheroidal pH by 1H magnetic resonance chemical shift imaging of pH sensitive indicators //MAGMA. 2005. - Vol.6, №18. - P.293-301.

13. Amarapurkar A.D., Amarapurkar D.N., Vibhav S., Patel N.D. Angiogenesis in chronic liver disease // Ann. Hepatol. 2007. - Vol.3, №6. - P.170-3.

14. Annabi В., Lee Y.T., Turcotte S., Naud E., Desrosiers R.R., Champagne M., Eliopoulos N., Galipeau J., Beliveau R. Hypoxia promotes murine bone-marrow-derived stromal cell migration and tube formation // Stem Cells.2003. Vol.21, №3. - P.337-47.

15. Asahara T. Endothelial progenitor cells for vascular medicine // Yakugaku Zasshi. 2007. - Vol.127, №5. - P.841-5.

16. Asahara T., Kawamoto A. Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2004. - Vol.287, №3. -P.572-9.

17. Asahara T., Murohara T., Sullivan A., Silver M., van der Zee R., Li T., Witzenbichler B., Schatteman G., and Isner J.M. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis // Science. 1997. - №275. -P.964-967.

18. Baal N., Widmer-Teske R., McKinnon T., Preissner K.T., Zygmunt M.T. In vitro spheroid model of placental vasculogenesis: does it work? // Lab. Invest. 2009. - Vol.89, №2. - P. 152-63.

19. Baksh D., Yao R., Tuan R.S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow // Stem Cells. 2007. - Vol.25, №6. -P.1384-92.

20. Banerjee S., Dhara S.K., Bacanamwo M. Endoglin is a novel endothelial cell specification gene // Stem Cell Res. 2012. - Vol.8, №1. - P.85-96.

21. Bhang S., Cho S., La W., Lee T., Yang H., Sun A., Baek S., Rhie J., Kim B. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells //B iomaterials. 2011. - Vol.32, №11. -P.2734-47.

22. Bourne G.H., Danielli J.F. and Jeon K.W. International Review of Cytology: A Survey of Cell Cytology / Academic Press, USA, 1983. Vol.83. - P.l-304.

23. Burt R.K., Loh Y., Pearce W., Beohar N., Barr W.G., Craig R., Wen Y., Rapp J.A., Kessler J. Clinical applications of blood-derived and marrow-derived stem cells for nonmalignant diseases // JAMA. 2008. - Vol.299, №8. -P.925-36.

24. Campard D., Lysy P.A., Najimi M., Sokal E.M. Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells // Gastroenterology. 2008. - Vol.134, №3. - P.833-48.

25. Can A., Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells // Stem Cells. 2007. -Vol.25, №11. -P.2886-95.

26. Caswell P.T., Vadrevu S., Norman J.C. Integrins: masters and slaves of endocytic transport // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2009. - Vol.10, №12. -P.843-53.

27. Chappell J.C., Bautch V.L. Vascular development: genetic mechanisms and links to vascular disease // Curr. Top. Dev. Biol. 2010. - №90. - P.43-72

28. Chen M.Y., Lie P.C., Li Z.L., Wei X. Endothelial differentiation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells // Exp. Hematol. 2009. - Vol.37, №5. -P.629-40.

29. Cheung A.L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Электронный ресурс.: научный журн. Curr. Protoc. Microbiol. - 2007. - №2. -URL: http://onlinelibrary.wiley.com. (23.02.2010).

30. Chong JJ. Cell therapy for left ventricular dysfunction: an overview for cardiac clinicians // Heart Lung Circ. 2012. - Vol.21, №9. - P.532-42.

31. Chung A.S., Ferrara N. Developmental and pathological angiogenesis // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2011. - Vol. 10, №27. - P.563-84.

32. Cochain C., Channon K.M., Silvestre J.S. Angiogenesis in the Infarcted Myocardium Электронный ресурс.: научный журн. Antioxid. Redox Signal. - 2012. - URL: http://online.liebertpub.com. (05.09.2012)

33. Cole R. W., Liu F., Herron B. J. Imaging of angiogenesis: past, present and future // Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. -2010. Vol.2, №4. - P.885-896.

34. Crawford S., Diamond D., Brustolon L., Penarreta R. Effect of increased extracellular ca on microvesicle production and tumor spheroid formation // Cancer Microenviron. 2010. - Vol.4, №1. - P.93-103.

35. Doetschman T.C., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium // J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. - №87. - P.27-45.

36. Drake C.J. Embryonic and adult vasculogenesis // Birth. Defects Res. C. Embryo Today. 2003. Vol.69, №1. - P.73-82.

37. Ellinson V., Yurovskaya M., Lyamin A., Ovchinnikova N., Naumkin A. New Antimicrobial Materials Based on Polymers With Nanostructured Surface Modified by Organic Fullerene 60. Derivatives // Plasma Process. Polym. -2009. №6. - P.85-S91.

38. Ema M., Rossant J. Cell fate decisions in early blood vessel formation // Trends Cardiovasc. Med. 2003. - №13. - P.254-59.

39. Felschow D.M., McVeigh M.L., Hoehn G.T., Civin C.I., Fackler M.J. The adapter protein CrkL associates with CD34 // Blood. 2001. - Vol.97, №12. -P.3768-75.

40. Fernández M., Semela D., Bruix J., Colle I., Pinzani M., Bosch J. Angiogenesis in liver disease // J. Hepatol. 2009. - Vol.50, №3. - P.604-20.

41. Fleming P.A., Argraves W.S., Gentile C., Neagu A., Forgacs G., Drake C.J. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels // Dev. Dyn. 2010. - Vol.239, №2. - P.398-406.

42. Folkman J,. Haudenschild C. Angiogenesis in vitro // Nature. 1980. - Vol. 288, № 5791.-P.551-6.

43. Folkman J., Haudenschild C., Zetter B.R. Long-term culture of capillary endothelial cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol.76, №1. -P.5217-21.

44. Genis L., Galvez B.G., Gonzalo P., Arroyo A.G. MT1-MMP: universal or particular player in angiogenesis? // Cancer Metastasis Rev. 2006. - Vol.25, №1. - P.77-86.

45. Gentile K., Fleming P.A., Mironov V., Argraves K.M., Argraves W.S., Drake C.J. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids // Dev. Dyn. 2008. - №237. - P.2918-25.

46. Gilbert S., Loranger A., Daigle N., Marceau N. Simple epithelium keratins 8 and 18 provide resistance to Fas-mediated apoptosis. The protection occurs through a receptor-targeting modulation // J. Cell. Biol. 2001. - №154. -P.763-73.

47. Gonza'lez-Aguilar F. What do the synaptic vesicles contain? // Neuroscience. 1993,-Vol.56, №1.-P.247-261.

48. Goto H., Yasui Y., Kawajiri A., Nigg E.A., Terada Y., Tatsuka M., Nagata K., Inagaki M. Aurora-B regulates the cleavage furrow-specific vimentin phosphorylation in the cytokinetic process // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, №10. - P.8526-30.

49. Hadjipanayi E., Cheema U., Hopfner U., Bauer A., Machens H.G., Schilling A.F. Injectable system for spatio-temporally controlled delivery of hypoxia-induced angiogenic signaling // J. Control. Release. 2012. - Vol.161, №3. -P.852-60.

50. Hajdu Z., Mironov V., Mehesz A.N., Norris R.A., Markwald R.R., Visconti R.P. Tissue spheroid fusion-based in vitro screening assays for analysis of tissue maturation // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2010. - Vol.4, №8. - P.659-64.

51. Hallmann R., Horn N., Selg M, Wendler O, Pausch F., Sorokin L.M. Expression and function of laminins in the embryonic and mature vasculature // Physiol. Rev. 2005. - Vol.85, №3. - P.979-1000.

52. Hans F., Dimitrov S. Histone H3 phosphorylation and cell division // Oncogene. 2001. - Vol.20, №24. - P.3021-7.

53. Harris J.R., Fisher R., Jorgensen M., Kaushal S., Scott E.W. CD 133 progenitor cells from the bone marrow contribute to retinal pigment epithelium repair // Stem Cells. 2009. - Vol.27, №2. - P.457-66.

54. Herbert S.P., Stainier D.Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2011. -Vol.12, №9.-P.551-64.

55. Jakobsson L., Kreuger J., Claesson-Welsh L. Building blood vessels stem cell models in vascular biology // J. Cell. Biol. - 2007. - Vol.177, №5. -P.751-5.

56. Janovski M., Lukomska В., Domanska Janik K. Migratory capabilities of human umbilical cord neural stem cells in vitro // Acta. Neurobiol. Exp. -2011. №71. - P.24-35.

57. Jászai J., Fargeas C.A., Florek M., Huttner W.B., Corbeil D. Focus on molecules: prominin-1 (CD133) // Exp. Eye. Res. 2007. - Vol.85, №5. -P.585-6.

58. Jujo К., Ii M., Losordo D.W. Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium // J. Mol. Cell. Cardiol. 2008. -Vol.45, №4. -P.530-44.

59. Kadner A., Zund G., Maurus C., Breymann C., Yakarisik S., Kadner G., Turina M., Hoerstrup S.P. Human umbilical cord cells for cardiovascular tissue engineering: a comparative study // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2004. -Vol.25, №4.-P.635-41.

60. Kaully Т., Kaufman-Francis K., Lesman A., Levenberg S. Vascularization— the conduit to viable engineered tissues // Tissue Eng. Part. B. Rev. 2009. -Vol.15, №2.-P. 159-69.

61. Khoshnoodi J., Pedchenko V., Hudson B.G. Mammalian collagen IV // Microsc. Res. Tech. 2008. - Vol.71, №5. - P.357-70.

62. Kim S.H., Turnbull J., Guimond S. Extracellular matrix and cell signalling: the dynamic cooperation of integrin, proteoglycan and growth factor receptor // J. Endocrinol. 2011. - Vol.209, №2. - P. 139-51.

63. Kim S.W., Kim H., Yoon Y.S. Advances in bone marrow-derived cell therapy: CD31 -expressing cells as next generation cardiovascular cell therapy // Regen. Med. 2011. - Vol.6, №3. - P.335-49.

64. Kunz-Schughart L.A., Freyer J.P., Hofstaedter F., Ebner R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model // J. Biomol. Screen. 2004. - Vol.9, №4. - P.273-85.

65. Levy A.P. A cellular paradigm for the failure to increase vascular endothelial growth factor in chronically hypoxic states // Coron. Artery Dis. 1999. -Vol.10, №6.-P. 427-30.

66. Li J., Stuhlmann H. In vitro imaging of angiogenesis using embryonic stem cell-derived endothelial cells // Stem Cells Dev. 2012. - Vol.21, №2. -P.331-42.

67. Lin R.Z., Chang H.Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research // Biotechnol. J. 2008. - Vol.3, №10.-P.l 172-84.

68. Livoti C.M., Morgan J.R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units // Tissue Eng. Part. A. 2010. - Vol.16, №6. -P.2051-61.

69. Lokmic Z., Musyoka J., Hewitson T.D., Darby I.A. Hypoxia and hypoxia signaling in tissue repair and fibrosis // Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 2012. -№296. -P.139-85.

70. Lutolf M.P., Gilbert P.M., Blau H.M. Designing materials to direct stem-cell fate // Nature. 2009. - Vol.462, №7272. - P.433-41.

71. Maillard E., Sencier M.C., Langlois A., Bietiger W., Krafft M., Pinget M., Sigrist S. Extracellular matrix proteins involved in pseudoislets formation // Islets. -2009. Vol.1, №3. - P.232-41.

72. Mauro A., Buscemi M., Gerbino A. Immunohistochemical and transcriptional expression of matrix metalloproteinases in full-term human umbilical cord and human umbilical vein endothelial cells // J. Mol. Histol. 2010. - Vol.41, №6. - P.367-77.

73. Medina R.J., O'Neill C.L., Humphreys M.W., Gardiner T.A., Stitt A.W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2010. - Vol.51, №11. -P. 5906-13.

74. Merks R.M., Perryn E.D., Shirinifard A., Glazier J.A. Contact-inhibited Chemotaxis in de novo and sprouting blood-vessel growth Электронный ресурс.: научный журн. PLoS Comput. Biol. - 2008. - Vol.4, №9. - URL: http://www.plosone.org. (16.12.2011).

75. Miki Т., Lehmann Т., Cai H., Stolz D.B., Strom S.C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells // Stem Cells. 2005. -Vol.23, №10. - P.1549-59.

76. Milde F., Bergdorf M., Koumoutsakis P. A hybrid model of 3D simulation of sprouting angiogenesis // Biophys. J. 2008. - № 95. -P.3146-60.

77. Mitchell K.E., Weiss M.L., Mitchell B.M., Martin P., Davis D., Morales L., Helwig В., Beerenstrauch M., Abou-Easa К., Hildreth Т., Troyer

78. D., Medicetty S. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia // Stem Cells. 2003. - Vol.21, №1. - P.50-60.

79. Moll R. Cytokeratins as markers of differentiation. Expression profiles in epithelia and epithelial tumors // Veroff. Pathol. 1993. - №142. - P.l-197.

80. Murohara T. Cord blood-derived early outgrowth endothelial progenitor cells // Microvasc. Res. 2010. - Vol.79, №3. - P. 174-7.

81. Nekanti U., Dastidar S., Venugopal P., Totey S., Та M. Increased proliferation and analysis of differential gene expression in human Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells under hypoxia // Int. J. Biol. Sci. -2010. Vol.6, №5. - P.499-512.

82. Nekrasova O.E., Mendez M.G., Chernoivanenko I.S., Tyurin-Kuzmin P.A., Kuczmarski E.R., Gelfand V.I., Goldman R.D., Minin A.A. Vimentin intermediate filaments modulate the motility of mitochondria // Mol. Biol. Cell. 2011. - Vol.22, №13. - P.2282-9.

83. Nielsen J.S., McNagny K.M. Novel functions of the CD34 family // J. Cell. Sci. -2008. -№121. -P.3683-3692.

84. Norotte C., Marga F.S., Niklason L.E., Forgacs G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting // Biomaterials. 2009. -Vol.30, №30.-P.5910-7.

85. Oshima-Sudo N., Li Q., Hoshinol Y., Nakahama K., Kubota Т., Morita I. Optimized method for culturing outgrowth endothelial progenitor cells // Inflammation and Regeneration. 2011. - Vol .31, №2. - P.219-227.

86. Oswald J., Boxberger S., Jergensen В., Feldmann S., Ehninger G., Bornhauser M., Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro // Stem Cells. 2004. - Vol.22, №3. - P.377-84.

87. Pacini S., Cornicelli V., Trombi L., Montali M, Fazzi R, Lazzarini E, Giannotti S, Petrini M. Constitutive expression of pluripotency associated genes in mesodermal progenitor cells Электронный ресурс.: научный

88. KypH. PLoS One. - 2010. - Vol.5, №3. - URL: http://www.plosone.org. (06.12.2011).

89. Palpaut N.J., Metzger J.M. Aestatic cardiology: adipose-derived cells for myocardial repair // Curr. Stem Res. Ther. 2010. - №5. - P. 145-52.

90. Park D., Xiang A.P., Mao F.F., Zhang L., Di C.G., Liu X.M., Shao Y., Ma B.F., Lee J.H., Ha K.S., Walton N., Lahn B.T. Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells // Stem Cells. 2010. - Vol.28, №12. -P.2162-71.

91. Patan S. Vasculogenesis and angiogenesis as mechanisms of vascular network formation, growth and remodeling // J. Neurooncol. 2000. -Vol.50, №2.-P.l-15.

92. Paternostro C., David E., Novo E., Parola M. Hypoxia, angiogenesis and liver fibrogenesis in the progression of chronic liver diseases // World J. Gastroenterol. -2010. Vol.16, №3. -P.281-8.

93. Paumard P., Vaillier J., Coulary B., Schaeffer J., Soubannier V., Mueller D.M., Brethes D., di Rago J., Velours J. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology // EMBO J. 2002.- Vol.21, №3.-P.221-230.

94. Pelosi E., Castelli G., Testa U. Human umbilical cord is a unique and safe source of various types of stem cells suitable for treatment of hematological diseases and for regenerative medicine //.Blood Cells Mol. Dis.- 2012. Vol.49, №1. - P.20-8.

95. Phelps E.A., Garcia A.J. Engineering more than a cell: vascularization strategies in tissue engineering // Curr. Opin. Biotechnol. 2010. - Vol.21, №5. - P.704-9.

96. Proulx-Bonneau S., Annabi B. The primary cilium as a biomarker in the hypoxic adaptation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: a role for the secreted frizzled-related proteins // Biomark. Insights. 2011. -№6. - P.107-18.

97. Rentala S., Mangamoori L.N. Oct-4 expression maintained stem cell properties in prostate cancer-derived CD133+MDR1+cells // Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2009. - Vol. 8, №1. - P.3-9.

98. Risau W., Sariola H., Zerwes H.G., Sasse J., Ekblom P., Kemler R., Doetschman T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies // Development. 1988. - Vol.102, №3. - P.471-8.

99. Salmenpera P., Kankuri E., Bizik J., Siren V., Virtanen I., Takahashi S., Leiss M., Fassler R., Vaheri A. Formation and activation of fibroblast spheroids depend on fibronectin-integrin interaction // Exp. Cell. Res. 2008. - Vol.314, №19. - P.3444-52.

100. Semenov O.V., Brayman C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's Jelly and their potential for cardio-vascular tissue engineering // The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal. 2011. -№4. - P.64-71.

101. Shantsila E., Watson T., Tse H.F., Lip G.Y. New Insights on Endothelial Progenitor Cell Subpopulations and Their Angiogenic Properties // J. Am. Coll. Cardiol. 2008. - Vol.51, №6. - P.669-71.

102. Shi Q., Rafii S., Wu M.H., Wijelath E.S., Yu C., Ishida A, Fujita Y., Kothari S., Mohle R., Sauvage L.R., Moore M.A., Storb R.F., Hammond W.P. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells // Blood. 1998. - Vol.92, №2. - P.362-7.

103. Shi Q., Wu M.H., Hayashida N., Wechezak A.R., Clowes A.W., Sauvage L.R. Proof of fallout endothelialization of impervious Dacron grafts in the aorta and inferior vena cava of the dog // J. Vase. Surg. 1994. - №20. -P.546-556.

104. Siemerink M.J., Klaassen I., Vogels I.M., Griffioen A.W., Van Noorden C.J., Schlingemann R.O. CD34 marks angiogenic tip cells in human vascular endothelial cell cultures // Angiogenesis. 2012. - Vol.15, №1. -P.151-63.

105. Sieveking D.P., Buckle A., Celermajer D.S., Ng M.K. Strikingly different angiogenic properties of endothelial progenitor cell subpopulations: insights from a novel human angiogenesis assay // J. Am. Coll. Cardiol. -2008. Vol.51, №6. - P.660-8.

106. Siow R.C. Culture of human endothelial cells from umbilical veins // Methods Mol. Biol. 2012. - Vol.806. - P.265-74.

107. Sobolewski K., Galewska Z., Wolan'ska M., Jaworski S. The activity of collagen-degrading enzymes of Wharton's jelly in EPH gestosis (preeclampsia) // Biol. Neonate. 2001. - Vol.80, №3. - P.202-209.

108. Tang H.L., Lung H.L., Wu K.C., Le A.H., Tang H.M., Fung M.C. Vimentin supports mitochondrial morphology and organization // Biochem. J. -2008.-Vol.410, №l.-P.141-6.

109. Tetta C., Bruno S., Fonsato V., Deregibus M.C., Camussi G. The role of microvesicles in tissue repair // Organogenesis. 2011. - Vol.7, №2. -P.105-15.

110. Timmermans F., Plum J., Yoder M.C., Ingram D.A., Vandekerckhove В., Case J. Endothelial progenitor cells: identity defined? // J. Cell. Mol. Med. 2009. - Vol.13, №1. - P.87-102.

111. Trkov S., Eng G., Di Liddo R., Parnigotto P.P., Vunjak-Novakovic G. Micropatterned three-dimensional hydrogel system to study humanendothelial-mesenchymal stem cell interactions // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2010. - Vol.4, №3. -P.205-15.

112. Uemura N., Griffin J.D. The adapter protein Crkl links Cbl to C3G after integrin ligation and enhances cell migration // J. Biol. Chem. 1999 -Vol.274, №53. P.37525-32.

113. Ueno Т., Nakamura Т., Torimura Т., Sata M. Angiogenic cell therapy for hepatic fibrosis // Med. Mol. Morphol. 2006. - Vol.39, №1. - P. 16-21.

114. Urbich C., Dimmeler S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology // Circ. Res. 2004. - Vol.95, №4. - P.343-53.

115. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry // Circ. Res. 2003. -Vol.92, №8.-P.827-39.

116. Walls J.R., Coultas L., Rossant J., Henkelman R.M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo Электронный ресурс.: научный журн. PLoS One. - 2008. - Vol.3, №8. - URL: http://www.plosone.org. (18.05.2012).

117. Yamada K.M., Cukierman E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D // Cell. -2007. Vol.130, №4. -P.601-10.

118. Youssef J., Nurse A.K., Freund L.B., Morgan J.R. Quantification of the forces driving self-assembly of three-dimensional microtissues // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2011. - Vol.108, №17. - P.6993-8.

119. Zaibak F., Bello P., Kozlovski J., Crombie D., Ang H., Dottori M., Williamson R. Unrestricted somatic stem cells from human umbilical cord blood grow in serum-free medium as spheres // BMC Biotechnol. 2009. -№9. - P.l01.

120. Выражаю глубокую признательность за помшць и поддержку в проведении исследования и подготовке работы к публикации

121. Кубатиеву Аслану Амирхановичу Скуратовской Ларисе Николаевне Репину Вадиму Сергеевичу Сабуриной Ирине Николаевне