Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат биологических наук Богачева, Наталия Николаевна

• Богачева, Наталия Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Богачева, Наталия Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование молекулярных маркерных систем в селекционной практике сельскохозяйственных растений

1.2. Методы молекулярного маркирования в генетико-селекционных исследованиях сахарной свеклы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы исследований

2.2. Методика проведения исследований

3. ПОЛИМОРФИЗМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН IIS ГЛОБУЛИНОВ В ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

3.1. Изучение генетической структуры исходных линий сахарной свеклы

3.2. Кластерный анализ в исследовании исходного селекционного материала сахарной свеклы

3.3. Применение белковых молекулярных маркеров при подборе пар для скрещиваний

4. RAPD-MAPKEPbl В ИССЛЕДОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ИСХОДНЫХ ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

4.1. Генотипирование исходного материала сахарной свеклы на основе полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей генома

4.2. Изучение взаимосвязи генетической структуры пробных гибридов по RAPD-маркерам с продуктивностью

4.3. Определение генетической отдаленности исходного селекционного материала сахарной свеклы

5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СКРЫТОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИ

ПРОВЕДЕНИИ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

5.1. Оценка геномного состава межвидовых гибридов В.vulgaris L. х B.corolliflora Zoss. по белковым маркерам

5.2. Детекция интрогрессии элементов генома Beta corolliflora Zoss. в межвидовых гибридах с использованием видоспецифических маркеров

6.3АКЛЮЧЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

8 .РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

9. ЛИТЕРАТУРА

10. ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Важнейшей задачей современной селекции сахарной свеклы является получение новых исходных форм и ускоренное создание гибридов с повышенной продуктивностью и другими хозяйственно-полезными признаками и свойствами.

Независимо от средств и методов селекции самой сложной частью работы является выявление генетической изменчивости в исходном селекционном материале и отбор желаемых генотипов (Жученко, 2001). Запасы такой изменчивости составляют генетический потенциал формообразования вида и популяции, но в силу сложности обнаружения селекционеру они малодоступны, а некоторые из них обычными методами генетического анализа совсем не раскрываются.

Методы молекулярного маркирования открывают широкие возможности для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы, что позволяет решать проблему недостатка морфологических маркеров (Конарев, 2000). С использованием изоферментных маркеров изучен генетический полиморфизм материалов сахарной свеклы, установлено наследование изоферментных локусов, проведено тестирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Левитес, 1984; Jung, Zoplien, 1986; Smed, Van Geyt, Oleo, 1989; Федуло-ва, 2005). Методом белковых маркеров идентифицированы формы кормовой, столовой и сахарной свеклы (Лесневич 1989; Буренин, Гаврилюк, 1994; Ми-тин, 2004). Методами ДНК-генотипирования (RELP, SSR, RAPD) проведены работы по созданию генетической карты генома сахарной свеклы (Barzen et al.,1995; Shondelmaier, Steinrucken, Jung, 1996), исследованию полиморфизма видов рода Beta (Шаюк, 2003), идентификации гиногенетических линий (Свирщевская, Милько, Кильчевский, 2011).

Однако до настоящего времени остаются неясными основные механизмы становления такого полигенного количественного признака, как продуктивность (Титок, 2008). Одним из возможных путей в решении этой проблемы

является анализ связей между молекулярно-генетическими особенностями и

4

хозяйственно-полезными свойствами, основанными на применении молекулярных и биохимических маркерных признаков.

На современном этапе актуальным является изучение возможности применения совокупности молекулярно - генетических маркеров на основе RAPD-, ISSR-, и белкового анализов, которые позволяют группировать изучаемый материал по степени генетического родства (Yong-Il Cho et. al., 1996), выявлять генетические различия между контрастными по качественным и количественным признакам растений (Xiao, Li, et al., 1996 и др.).

Представляется перспективным применение ДНК - технологий и других методов молекулярного маркирования, с помощью которых станет возможным решение таких задач современной селекции, как контроль за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях (Велишаева, Шилов, Хавкин, 2006).

В связи с этим исследование возможности применения методов молеку-лярно-генетического маркирования (RAPD, ISSR, белковых) для идентификации селекционных материалов, при разработке программ скрещивания, отборе интрогрессивных форм сахарной свеклы является актуальным направлением исследований.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в выявлении генетической структуры селекционных материалов и интрогрессивных форм сахарной свеклы на основе молекулярно-генетического анализа для повышения эффективности селекционного процесса.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

1) Выявить электрофоретический состав запасных белков семян (11S глобулинов) и определить генетические дистанции скрещиваемых исходных форм сахарной свеклы при получении пробных гибридов.

2) Оценить генетическое разнообразие селекционных материалов сахарной свеклы с использованием одиночных произвольных (RAPD) праймеров для осуществления молекулярно-генетической идентификации.

3) Изучить генетическую структуру межвидовых гибридов F1 Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. с использованием белковых маркеров.

4) Выявить интрогрессивные формы при проведении межвидовой гибридизации сахарной свеклы с использованием видоспецифических ДНК-маркеров.

Научная новизна исследований. Впервые установлено, что генетические дистанции по типам белковых спектров 11S глобулинов с максимальной частотой встречаемости (35-76 %) являются основой для определения геноти-пических различий между исходными формами сахарной свеклы и подбора пар при гибридизации. Получены новые данные, свидетельствующие о возрастании уровня истинного гетерозиса по урожайности гибридов сахарной свеклы по мере увеличения генетической удаленности родительских компонентов (D>2,24). Обнаружены оригинальные типы белковых спектров для межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora. Электрофоретические фрагменты с относительной подвижностью Rf = 0,05; 0,07; 0,47; 0,85; 0,90 характерные для дикой свеклы, позволяют выявлять элементы генома В. corolliflora в межвидовых гибридах.

Впервые на основе RAPD-профилей геномной ДНК, полученных с одиночными праймерами PAWS 5, PAWS 6, PAWS 16, PAWS 17, составлены генетические формулы позволившие осуществить молекулярно-генетическую идентификацию селекционных материалов сахарной свеклы. Наибольший полиморфизм установлен для праймеров к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК PAWS 5 и PAWS 17 для выявления различий между генотипами. С использованием произвольных одиночных праймеров определены генетические дистанции и проведена кластеризация для 33 комбинаций скрещиваний, что дает возможность наиболее обоснованно подбирать родительские компоненты гибридов сахарной свеклы. Максимальные генетические расстояния между мужскостерильными линиями и сростноплодными опылителями составляют D=3,74-3,87.

В геноме межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora различной пло-идности установлено присутствие сателлитной последовательности НаеШ (161 п.н.), являющейся видоспецифическим признаком дикого вида В. corolliflora. Праймеры к данному сателлиту позволяют эффективно осуществлять отбор интрогрессивных форм свеклы. Данные исследования расширяют и углубляют теоретические представления о структурно-функциональной организации генома сахарной свеклы и интрогрессивных форм, что открывает большие перспективы для внедрения молекулярно-генетических методов в селекционный процесс.

Практическая ценность работы. Разработанный метод подбора родительских пар на основе установленных генетических расстояний по белковым маркерам может служить принципиальной основой создания новых высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы. Выявленные электрофоретические компоненты белковых спектров дикой свеклы В. corolliflora могут использоваться для тестирования интрогрессивных форм в потомстве от межвидовых скрещиваний.

Выявленная генетическая структура исходных родительских форм и гибридов сахарной свеклы на основе RAPD-анализа геномной ДНК позволяет осуществлять их генотипирование. Разработаный метод идентификации селекционных материалов по ДНК-маркерам рекомендуется использовать при регистрации гибридов, а так же для защиты авторских прав селекционеров.

Метод ИТ IP с использованием видоспецифических праймеров к сателлитной ДНК НаеШ позволяет эффективно и быстро осуществлять отбор форм с интрогрессией В. corolliflora, ускоряя селекционный процесс. Разработанные в процессе исследований методические подходы могут найти широкое применение в селекции сахарной свеклы, а также использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование запасных белков семян IIS глобулинов позволяет осуществлять подбор родительских пар для гибридизации сахарной свеклы с учетом их генетической удаленности.

2. RAPD - анализ геномной ДНК с использованием одиночных произвольных праймеров дает возможность идентифицировать и выявлять генетический полиморфизм селекционных материалов сахарной свеклы.

3. Электрофоретические фрагменты запасного белка IIS глобулина и ви-доспецифическая ДНК НаеШ позволяют выявлять скрытую генетическую изменчивость интрогрессивных форм при межвидовой гибридизации В. vulgaris х В. corolliflora.

Организация исследований и вклад автора. Работа выполнена в 2004-2011 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свеклы им. A.JI. Мазлумова и на кафедре физиологии и биохимии клетки Воронежского государственного университета. Исследования проводились в соответствии с тематическими планами НИР института по заданиям 04.03.02.01: «Изучить проявление молекулярно-генетических признаков геномов В. vulgaris и В. corolliflora у межвидовых гибридов» и 04.03.02.02: «Молекулярно-генетическое изучение родительских форм при создании высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы на стерильной основе».

Автору принадлежит постановка проблемы, разработка программы и методики исследований, проведение эспериментальных исследований, статистическая обработка и интерпретация полученных данных, формулировка выводов и предложений. Доля личного участия диссертанта в получении и обобщении результатов исследований составляет 80 %.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены: на

межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых

«Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки» (Воронеж,

2005); на II Вавиловской международной конференции «Генетические ресур-

8

сы культурных растений в XXI веке» (г. Санкт-Петербург, 2007); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Москва, 2008); на IX молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2009); на IV Международной научной конференции молодых ученых «Новейшие направления аграрной науки в работах молодых ученых» (г. Новосибирск, 2010); на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2010); на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011); на XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2011), на заседаниях Ученого совета ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им. A. JI. Мазлумова РАСХН» (в настоящее время ГНУ ВНИИ сахарной свеклы им. A. JI. Мазлумова РАСХН) в 2005-2011 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, рекомендаций для селекционной практики, выводов, приложений; включает 13 таблиц, 30 рисунков, 2 приложений.

Список использованной литературы включает 189 источников, в том числе 64 иностранных.

1. Обзор литературы 1.1. Использование молекулярных маркерных систем в селекционной практике сельскохозяйственных растений

Важнейшей проблемой современной селекции является ускоренное создание нового исходного материала и гибридов сельскохозяйственных растений с высоким потенциалом продуктивности и устойчивостью к биотическим и

абиотическим стрессам.

Традиционные методы селекции, основанные на использовании морфологических признаков, являются трудоемкими для решения этих задач. Поэтому технологии молекулярного маркирования в настоящее время являются важнейшим направлением науки и призваны улучшить и ускорить селекционный процесс. За последние 30 лет были выявлены и использовались несколько таких маркеров - от электрофоретических вариантов белков, отражающих полиморфизм соответствующих структурных генов, до высокополиморфных последовательностей ДНК, позволяющих исследовать генетическую изменчивость не на уровне продуктов экспрессии гена, а на уровне генома (Созинова и др., 2008; Мухина, Дубина, 2011).

Белковые и ДНК-маркеры широко используются в решении прикладных и теоретических проблем генетических ресурсов растений, селекции, сортоиспытания, семеноводства и семенного контроля (Конарев, 2000). Методы молекулярного маркирования применяют в работе с генетическими ресурсами растений для идентификации и паспортизации генетического разнообразия (образцов коллекции, сортов и т. д.); для выделения генотипов с ценными свойствами; для поиска нового генетического разнообразия (образцов) и привлечения его в мировые коллекции; в анализе генетической структуры коллекций (выяснение степени генетической дифференциации генофондов видов, популяционные исследования); для выявления дублетных образцов в мировых коллекциях; для выяснения степени генетической целостности сохраняемых и периодически пересеваемых образцов коллекции; для охраны

авторских прав при использовании образцов в качестве источников или до-

10

норов в селекции и т.д. (Конарев, 2001), в осуществлении маркирования селекционно-ценных признаков (Messeguer et al. 1991, Barzen et al., 1997), a также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) (Van der Knaap et al., 2002).

Полиморфизм белков и ДНК используется для анализа внутривидовых связей, родства видов и геномов. Молекулярные маркеры применимы для контроля за стабильностью генотипов растений, представляющих генетические линии (Конарев, 1998).

Молекулярное маркирование основано на полиморфизме, найденном в белках и нуклеиновых кислотах. Перед тем, как маркер может использоваться для решения каких-либо конкретных задач, корректность его использования должна быть аргументирована с генетических и биохимических позиций (Конарев, 1998).

Белковые маркеры ближе других субстанций стоят к носителям наследственной информации, ДНК-маркеры - сами ими являются. Белковые и ДНК-спектры используются для маркирования генотипов по принципу отпечатков пальцев - «fingerprinting technique», важным является то, что они не зависят от условий выращивания растений. Использование электрофоретиче-ских маркеров основывается на физико-химических свойствах белка, это, прежде всего, - заряд, масса и форма молекулы. Белковыми признаками здесь служат соответственно электрофоретическая подвижность, изоэлектрическая точка, число и разновидность субъединиц белка и их позиции в электрофоре-тическом спектре. Принципиально важно, что семя - фиксированная фаза онтогенеза. Запасные белки семян остаются неизменными часто в течение многих лет. Метод электрофоретического фракционирования белков характеризуется надежностью, воспроизводимостью результатов и простотой в использовании.

В настоящее время считается твердо установленным, что аллельные варианты запасных белков служат информационными маркерами различных признаков и свойств (Конарев, 2001). В случае белковых маркеров идентифика-

11

ция генотипа осуществляется по сложной двумерной структуре спектра (сотни «белковых пятен»). Эффективные белковые маркерные системы для сельскохозяйственных растений отобраны из множества белков в результате работы многих коллективов исследователей (Конарев, 1993).

Для сортовой идентификации и решения проблем, связанных с изменчивостью внутри вида, необходимы генетически полиморфные белковые системы. Полиморфизм таких систем обусловлен аллельной изменчивостью и раскрывается при помощи электрофореза. Это дает возможность по спектру компонентов полиморфного белка различать генотипы и идентифицировать сорта, биотипы и линии (Сиволап, Календарь,1995).

Недостатком белковых маркеров является то, что они применимы для маркирования только экспрессирующихся генов, в то время как большая часть генома представлена некодирующими последовательностями.

С использованием запасных белков семян в качестве маркеров связаны реальные практические достижения в идентификации и регистрации сортов важнейших сельскохозяйственных культур, в семеноводстве и семенном контроле, в идентификации чужеродного генетического материала в геноме потомств, геномах и отдельных хромосомах сортов и линий - контроль за генотипами растений с транслокациями, изменением числа и состава хромосом (Зарубайло, Губарева, Таврин, 1973; Конарев, Гаврилюк, Губарева, 1970, 1977; Чугункова и др., 1992; Шаюк и др., 2003 и др.). Метод электрофореза запасных белков с успехом используется для определения сортовой чистоты сельскохозяйственных растений (Конарев, 1998).

Прямое генотипирование селекционных материалов по полиморфизму нуклеотидных последовательностей стало возможным благодаря появлению методов, основанных на применении ДНК-маркеров, что открывает принципиально новые возможности для идентификации и оценки селекционных материалов.

Селекция на основе ДНК-маркеров позволяет проводить быструю идентификацию и отбор генотипов, минуя фенотипическую оценку, основываясь

12

лишь на данных анализа ДНК. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма, что является преимуществом по сравнению с другими типами маркеров. Поэтому в настоящее время большой интерес для селекции представляет разработка технологий генотипирования на основе ДНК-полиморфизма, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль (Сатина, 2010).

В последние годы ДНК-маркеры становятся неотъемлемым элементом селекционного процесса для быстрого и эффективного отбора нужных генотипов растений. Они находят свое применение как на этапе подбора исходных источников для гибридизации, так и при последующем анализе гибридного материала. Неотъемлемой частью работ по созданию маркеров, в том числе, связанных с хозяйственно-ценными признаками у сельскохозяйственных растений, является определение спектра полиморфных последовательностей геномной ДНК (Азарин, 2011).

Многие методы ДНК-маркирования основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР - PCR). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплете-ние двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное дополнение обеих.

Для осуществления полимеразной цепной реакции в пробирке используют две генетические пробы (праймеры), которые и служат в качестве затравки для синтеза данного участка ДНК. Необходимым условием проведения реакции является знание нуклеотидной последовательности синтезируемого

участка, т.к. праймеры - это искусственно синтезированные олигонуклео-

13

тидные последовательности (15-30 нуклеотидных оснований), комплементарные Ъ1- концам амплифицируемых участков нитей ДНК. В результате амплификации количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии, и в течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле или с помощью других методик (Глик, 2002).

Основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) и состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавторами в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК, как результат реакции. В 1983 году Kary Mullís предложил метод, ставший в дальнейшем известным, как полимеразная цепная реакция. Многократное копирование (амплификация) в пробирке определенных участков ДНК происходит в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества фрагментов ДНК. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов (Глик, 2002).

Широкое применение нашли варианты амплификации ДНК с произвольными и специфическими праймерами, с помощью которых можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному растений (Гостимский, Кокаева, Коновалов, 2005).

Одним из наиболее распространенных методов выявления генетического полиморфизма у растений является RAPD-метод (Random Amplified Polimorphic DNA), или произвольно амплифицируемая полиморфная ДНК (Williams et al, 1990; Welsh et al., 1991). Это вариант полимеразной цепной реакции с единичным коротким произвольным праймером.

RAPD-методом исследованы различные сорта, линии и мутанты сельскохозяйственных культур, обнаружены полиморфные фрагменты, характерные для определенных генотипов, которые могут быть использованы для их идентификации, изучено наследование некоторых полиморфных RAPD-фрагментов (Сиволап и др., 2000; Van den Berg et al., 2002; Ковеза и др., 2005).

Так же, RAPD-анализом исследован межвидовой, внутривидовой и межродовой полиморфизм ядерного генома у представителей Lemnaceae (Мартиросян и др., 2008), выявлена генетическая изменчивость и определены филогенетические связи полиплоидных видов эгилопса, имеющих в составе своего аллоплоидного генома геном D, и диплоидного вида Aegilops tauschii, являющегося потенциальным донором D-генома мягких пшениц (Ковеза и др., 2005).

Исследован генетический полиморфизм ячменя методом ПЦР с произвольными праймерами , осуществлена идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD и SSR анализа (Сиволап, 2000).

Перспективы селекции неразрывно связаны с познанием механизмов контроля рекомбинационных процессов при гибридизации, приводящих к повышению продуктивности и другим полезным изменениям. Одним из возможных путей в решении этой проблемы является анализ связей между мо-лекулярно-генетическими особенностями гибридов и хозяйственно - полезными признаками, основанными на применении молекулярных и биохимических методов исследований.

Геномы высших растений характеризуются большим размером и сложной

организацией. Выявление внутривидовых различий на уровне ДНК-маркеров

15

имеет важное практическое значение для характеристики разных линий и создания гетерозисных форм растений (Гостимский и др., 2005).

Решению проблем при создании и отборе форм растений способствует разностороннее изучение, как родительских компонентов, так и получаемых гибридов. В настоящее время ведутся обширные исследования, направленные на поиск маркеров, сцепленных с гетерозисом. Важную роль в проявлении гетерозиса играет наличие генетической дивергенции между исходными формами. Широко применяются методы молекулярного маркирования (RELP, RAPD, AFLP, SSR, белковые), которые позволяют сгруппировать изучаемый материал по степени генетического родства (Yong-Il Cho et al., 1996). Исследования, проведенные с помощью изоферментного анализа линий, сортов и гибридов томатов, кукурузы и других культур (Юренкова, 2001) выявили увеличение числа изоформ и количества ферментного белка у гибридных форм, что в конечном итоге приводит к реализации гетерозисно-го преимущества (благодаря расширению условий протекания метаболических реакций по сравнению с родительскими формами и т. д.).

Для селекции растений особое значение имеет использование молекулярных маркеров не только для различения и идентификации сортов культурных растений, но и для контроля за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях (Велишаева, Шилов, Хавкин, 2006).

В организме существует структурная и функциональная сопряженность всех генетических и морфогенетических процессов. Это одна из главных предпосылок в разработке методов маркирования генетических систем всех уровней (Конарев, 1993). Введение молекулярных маркеров в практику биологических исследований дает возможность эффективной оценки степени генетических различий между культурными и дикими формами различных сельскохозяйственных растений (Jung, 1993), а также их гибридами, решения конкретных вопросов межвидовой гибридизации (Галаев, Бабаянц, Сиволап,

2004; Буренин, Гаврилюк, 1994; Вахитов, Куликов, Чемерис, 1988; Зарубай-ло, Губарева, Таврин, 1973 и др.).

Для большинства культур каждому сорту, дикорастущему образцу и составляющим их биотипам (генотипам) соответствуют характерные только для них электрофоретические спектры белков.

Применение методов молекулярного маркирования позволяет выполнять отбор генотипов, которые невозможно отобрать методами традиционной селекции. Белковые и ДНК-маркеры на протяжении последних десятилетий с успехом используются в селекционных программах для решения многих вопросов, в том числе для определения гибридности семян, получаемых при отдаленных скрещиваниях.

Исследована возможность применения белковых маркеров в оценке генетической конституции тритикале на всех его основных формах - первичных октоплоидных и гексаплоидных, вторичных гексаплоидных и ржано-пшеничных тетраплоидных амфидиплоидах ( Конарев, 1993).

Н. А. Козуб (2004) изучал эффект интрогрессии участка хромосомы ID от Aegilops cylindrica на проявление признаков продуктивности у растений F2 озимой мягкой пшеницы с помощью локусов запасных белков как генетических маркеров. Маркером интрогрессии служил аллель глиадинкодирующего локуса GH-D1, было выявлено, что интрогрессия, маркированная локусом GH-D1, влияла на уровень проявления признаков продуктивности (продуктивное кущение, масса и число зерен с растения) через взаимодействие с другими маркерными локусами (локусы запасных белков Glu-Bl, Glu-Dl, GH-B2).

Анализ спектров белков сортов мягкой пшеницы с транслокациями и замещениями пшеничной хромосомы на ржаную (1B/1R), показал возможность выявления таких генотипов по наличию глиадиновых маркеров хромосомы 1R ржи (Конарев, 1986).

В настоящее время широко используется микросателлитный метод для исследования межвидовых различий растений, выявления интрогрессивных форм растений.

Сателлитные ДНК являются характерным компонентом генома всех эука-риот. В настоящее время под этим термином подразумевается характерный компонент эукариотического генома, состоящий из тандемно организованных повторов; сателлитная ДНК не кодирует белки и локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом. При этом в родственных геномах часто обнаруживается наличие общих или родственных типов сателлитных ДНК. Типичные сателлиты с характерным сайтом для одной (или многих) эндо-нуклеаз рестрикции были названы «рестрикционными сателлитными ДНК». В специфических случаях, когда определение морфологических различий затруднено или почти невозможно, видоспецифические сателлитные ДНК позволяют быстро и достоверно идентифицировать тот или иной организм (Хе-млебен и др., 2003).

Следует различать термины сателлитные ДНК и мини, а также микроса-теллитные ДНК. Основное различие между ними заключается в том, что мини- и микросателлиты в отличие от сателлитных ДНК обнаруживаются в эу-хроматине. Число копий повторов в мини и микросателлитах намного меньше по сравнению с сателлитными ДНК. Общим для всех трех компонентов является наличие тандемно расположенных повторов, а префиксы мини- и микро- отражают различия в длине повторяющихся единиц. Длина повторяющейся единицы минисателлитных ДНК составляет 10-100 п.н., а микроса-теллитных - менее 10 п.н. Длина повторов сателлитных ДНК не имеет каких либо ограничений. Она варьирует от 2 п.н. до нескольких сотен (Хемлебен и ДР., 2003).

Повторяющиеся единицы сателлитных ДНК различны по своей специфичности. Некоторые повторы встречаются в большом количестве во всех видах определенного рода, в то время как другие могут присутствовать в одном или нескольких видах. Обнаружены существенные отличия в степени амплификации повторов между дикими видами и культурными видами высших растений (Schweizer et al., 1993). Выявлена дивергенция последовательности повторяющихся единиц сателлитных ДНК порядка 5-15% даже у от-

18

дельных индивидумов в пределах вида (King, Jobst, 1995). Сателлитные ДНК с видо-специфичностью являются ценными пробами для анализа межвидовых гибридных геномов (Kamm et al., 1995; Harrison, Heslop-Harrison, 1995; Gao et al., 2000). Геномо-специфичная сателлитная ДНК успешно использовалась для отбора линий с моносомными добавлениями с помощью методов быстрого отбора, как, например, сквош-дот или дот-блот гибридизация (Schmidt el al., 1990).

A.B. Галаев с соавторами (2004) использовал ISSR- и SSR-анализы для выявления участков генома донора в пшенице, скрещенной с Aegilops cylindrica и которой придана устойчивость к грибным заболеваниям, выявлено 19 ISSR-локусов, отнесенных к интрогрессивным фрагментам генома Aegilops cylindrica в Triticum aestivum. Показано, что ISSR- и SSR-методы эффективны для детекции изменчивости, вызванной интрогрессией чужеродного генетического материала в геном мягкой пшеницы.

B.А. Бирюкова с коллегами (2006) изучала процесс интрогресии генетического материала дикорастущих видов Solanum в геном культурных сортов картофеля с помощью анализа полиморфизма умеренных повторов. Выявленные автором фрагменты ДНК, которые переходят из генома дикорастущих видов в культурный картофель, рассматриваются, как потенциальные видоспецифические маркеры.

Таким образом, молекулярно-генетические маркеры успешно используются для решения многих задач селекции, обеспечивая использование в селекционном процессе как природного, так и созданного человеком генетического разнообразия растений.

1.2. Методы молекулярного маркирования в генетико-селекционных исследованиях сахарной свеклы

Генетическое изучение сахарной свеклы и ее диких родственников осуществляется с помощью различных методов, прежде всего, традиционным методом гибридизации линий, сортов, видов с анализом признаков у потомства. Однако морфологических и физиологических признаков для изучения генетического разнообразия свеклы недостаточно, поэтому прорыв в этом отношении обеспечен с появлением молекулярных методов - белковых и ДНК (Корниенко, Буторина, 2012).

Наибольшее распространение в качестве маркеров у сахарной свеклы получили выявленные JI.A. Лесневич с коллегами (1987), белки-маркеры геномов свеклы - кислые субъединицы IIS глобулинов семян, доказана стабильность их состава в разных условиях произрастания растений, проверена их изменчивость в общей пробе и в индивидуальных генотипах. В результате электрофоретического изучения 11S глобулина показано, что белковые маркеры могут быть использованы для идентификации геномов на видовом и линейном уровне, прогнозирования генетической совместимости и контроля гибридности семян сахарной свеклы при межвидовой гибридизации (Лесневич, 1988).

Генетическое обоснование использованию запасных белков семян сахарной свеклы (IIS глобулинов) как генетических маркеров было дано в работах В. Г. Конарева (1970-2001). Электрофоретический состав запасных белков семян IIS глобулинов сахарной свеклы - эффективная маркерная система для изучения генетической структуры сахарной свеклы и ее диких сородичей, а так же для выявления скрытой генетической изменчивости (Конарев, 2000; Лесневич 1989).

Изучение по электрофоретическим спектрам IIS глобулинов селекционных материалов сахарной свеклы позволило выявить в них наличие различных биотипов, различающихся по структуре (Лесневич, 1993). Идентифицированы сорта (формы) кормовой свеклы (Буренин, 1996), выявлены различия

20

среди образцов раздельноплодной столовой свеклы (Буренин, Гаврилюк, 1994).

С.Н. Митиным (2004) исследованы генетические взаимоотношения между сортами и гибридами сахарной свеклы, определены генетические дистанции между ними с использованием кластерного анализа, исследована генетическая структура некоторых родительских компонентов сахарной свеклы, определены их различия по критерию идентичности.

С использованием изоферментного анализа изучен генетический полиморфизм селекционных материалов сахарной свеклы, определен генетический контроль более десяти ферментов, к настоящему моменту у сахарной свеклы в пяти из девяти известных групп сцепления имеется по 2-3 маркерных гена (Левитес, 1984, Федулова, 2005). Изоферментный состав у растений сахарной свеклы сортоспецифичен и не зависит от условий выращивания (Федулова, 1995).

Смед с соавторами выявил спепление локуса Idh-1 с локусом красной окраски гипокотиля (Smed, Van Geyt, Oleo, 1989). Определено сцепленное наследование структурного локуса алкогольдегидрогеназы, гена несовместимости и летального гена у сахарной свеклы (Малецкий, Коновалов, 1985). Изоферментные маркеры внесли большой вклад в изучение филогении в роде Beta (Wagner, Gimbel, Wrickle, 1989). С использованием изоферментных маркеров проведено тестирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Jung, Wehling, Zoplien, 1986)

Обзор литературных источников позволяет сделать вывод о целесообразности широкого использования белковых маркеров в селекционных исследованиях.

Существенно расширить возможности традиционной селекции, увеличить генетическое разнообразие сахарной свеклы позволяют методы ДНК - маркирования.

Литературные данные свидетельствуют о RFLP, RAPD, AFLP, SSR исследованиях сахарной свеклы. Методы ДНК-генотипирования и селекции

21

при помощи молекулярных маркеров (marker-assisted selection-MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно-ценных генов и локусов количественных признаков (quantitative trait loci - QTLs) в процессе селекции и обеспечить создание новых гибридов с целым комплексом заданных свойств. С использованием ДНК-маркирования возможно генотипирование исходных линий, сортов и гибридов сахарной свеклы, а так же ее диких сородичей, создание карт сцепления и физических карт генома с их помощью, клонирование генов на основе этих карт (mapbased gene cloning), конструирование новых генотипов растений методами генетической инженерии (Федулова, 2005).

Изучено генетическое разнообразие у диких, культурных и сорняковых форм Beta vulgaris с использованием шести кодоминантных микросателлитов (Desplanque et al., 1999; Viard et al., 2002). Ричарде с соавторами (Richards et al., 2004) охарактеризовали восемь новых полиморфных микросателлитных маркеров, пять из которых базировались на тринуклеотидных повторениях. Создано шесть микросателлитных маркеров (Cureton et al., 2002), чтобы исследовать генетическую изменчивость у приморской свеклы (Beta vulgaris ssp. maritima).

Анализ литературных источников показал, что у сахарной свеклы для идентификации нормальной и стерильной цитоплазмы используются мито-хондриальные фрагменты ДНК. Стерильные и фертильные растения отличаются друг от друга низкомолекулярными суперспирализованными молекулами мтДНК, что было показано многими исследователями (Комарницкий и др., 1988; Хворостов и др., 1998).

С использованием анализа RFLP оценена степень генетической изменчивости рода Beta, подтверждена современная таксономия секции Beta vulgaris (Raybould, Mogg, Clarke, 1996). JI.В. Шаюк с коллегами (2003) исследовала полиморфизма рода Beta с помощью ПП-ПЦР-анализа.

С использованием ДНК-маркеров проведены работы по созданию генетической карты генома сахарной свеклы (получены данные по сцеплению 248

ПДРФ - маркеров и 50 маркеров RAPD (Barzen et al., 1995; Shondelmaier,

22

Steinrucken, Jung, 1996). Исследования в этой области продолжаются и в настоящее время.

Большое практическое значение имеют работы английских и итальянских исследователей по созданию и картированию молекулярных (RFLP и RAPD) маркеров, сцепленных с устойчивостью к ризомании (Redtearr, Asher,1997).

Польскими учеными исследован полиморфизм и осуществлено генотипи-рование селекционных материалов свеклы на основе RAPD-анализа (Baranski е.а., 1995). Полученные данные подтвердили высокий уровень информативности RAPD-анализа, в частности, при проведении тестирования отдельных сортов и линий. По данным международного института исследований сахарной свеклы (URB, Бельгия) на основе современных компьютерных технологий с использованием ДНК-маркеров создан информационный банк данных по генетическим ресурсам сахарной свеклы (Germeier, Frese, 2001).

Зарубежными исследователями в рамках международных программ широко проводятся исследования направленные на расширение генного пула сахарной свеклы за счет диких сородичей, исследуется генетическая структура межвидовых гибридов.

H. Zhu, Y.D. Bi, L.J. Yu, D.D. Guo, B.C. Wang в 2009 году была выделена линия М14 с одной добавочной хромосомой Beta corolliflora и апомиктичным фенотипом. С помощью двухмерного гель-электрофореза была изучена генетическая структура данной линии, а так же сахарной свеклы и Beta corolliflora, в результате исследований были идентифицировали белки, которые были по-разному выражены у Ml4 (2п = 2х = 18 +1) и Beta vulgaris. Данные белки участвуют в важных биологических процессах, таких как деление клеток. Авторы считают что, результат исследований может быть полезным для того, чтобы лучше понять генетический механизм апомиксиса.

D. Gao, Т. Schmidt, С. Jung в 2000 году выделена последовательнось рВС 216, расположенная на хромосоме IV В. corolliflora. Эта последовательность может быть использована в качестве зонда для идентификации чужеродного

генетического материала и маркера переноса генов от дикой свеклы в геном культурной.

Выделена специфичная для сахарной свеклы сателлитная ДНК pBVl, принадлежащая к семейству последовательностей Ват Ш, которое распространяется на большие области вплоть до 3000 kb в центромере всех хромосом сахарной свеклы (Schmidt et al., 1991; Kubis et al., 1998).

Тем неменее применение генетического маркирования в селекционной практике сахарной свеклы еще недостаточно и широко изучено. Необходимо дальнейшее использование молекулярного маркирования в создании нового исходного материала, подборе пар для скрещиваний с целью получения гете-розисных гибридов, идентификации селекционных материалов для защиты

авторских прав и т. д.

Обзор литературных источников позволил сделать вывод об актуальности и необходимости всестороннего молекулярно-генетическое изучения исходного материала сахарной свеклы для применения в усилении эффективности, а также в ускорении практической селекции, что определило направление наших исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы исследований

В качестве материалов для молекулярно-генетических исследований были использованы растения сахарной свеклы: исходные родительские формы (мужскостерильные линии (МС) №№ 08112, 08131, 08077, 1117, 1137, 1113, 1141, 1134, 1131, И-08015, И-08001, И-08016; сростноплодные опылители (ОП) №№ 08008, 08016, 08197, 1165, 1172, 1180, 1187, 1195, 1203, 15202) и гибридные комбинации №№ - 08002, 08003, 08005, 08010, 08011, 08013, 08180, 08181, 08183, И-08015 х ОИ 15202, И-08001 х ОП 15202, И-08016 х ОП 15202, МС 94 Ар х ОП 15202 лабораторий ЦМС и исходного материала ВНИИСС), а так же полученные нами межвидовые гибриды: МС И-08015 х В. corolliflora, МС И-08001 х В. corolliflora, гамма-МС-70 х В. corolliflora, № 32 х В. corolliflora, № 31 х В. corolliflora, № 172 х. В. corolliflora.

В качестве материнских исходных форм при межвидовой гибридизации Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. использовались мужскостерильные растения культурной сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): гамма-МС-70, растения МС-линий № И-08001, № И-08015, № 32, № 31, № 172. Отцовской формой в скрещивании служила дикая свекла Beta corolliflora Zoss. Для исследований использовали растения и семена, полученные при отдаленной гибридизации.

2.2.Методика проведения исследований

Электрофоретическое фракционирование глобулинов. Белковые спектры получали методом DDS-электрофореза в ПААГ (Конарев, 2000). В работе применяли базовую методику проведения Ds-Na-электрофореза запасного белка семян 11S глобулина сахарной свеклы в 10% ПААГ, с последующим окрашиванием Кумасси. В работе использовались белки-метчики молекулярных масс: лизоцим (тМ 14,ЗкД), БСА (тМ 69кД), яичный альбумин (тМ 45кД). Молекулярные массы, полученных на электрофореграммах белков,

25

определяли по калибровочной кривой логарифмической зависимости молекулярной массы от электрофоретической подвижности белков (Гааль и др. Д982).

Селекционные материалы сахарной свеклы, а также Beta corolliflora изучались в выборке 100 штук семян, межвидовые гибриды в выборке 50 шт. Анализ проводился по каждому семени индивидуально. Спектры с частотой встречаемости менее 2% не учитывались.

ПЦР-анализ. Геномную ДНК выделяли из 0,2 г. зеленых листьев с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода с использованием СТАВ (Chomczynski, 1987). Качество выделенной ДНК определяли электрофорезом в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия (Маниатис, 1984). Полученную ДНК растворяли в ЮмМ трис- HCl-буфера, pH 8.0, содержащем ОДмМ ЭДТА и использовали для ПЦР-анализа.

ПЦР-анализ проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация при 95оС в течение 10 минут, затем 30 циклов: 95°С - 40с, 60°С - 40с, 72°С - 40с и начальный этап элонгации цепи 72°С- 5мин.

Для детекции интрогрессии генетического материала в геноме гибридных растений использовали праймеры, подобранные нами на основе нуклеотид-ной последовательности сателлитной ДНК НаеШ, многократно повторяющейся во многих хромосомах В. corolliflora:

/1 ggccaatttt tgccttttcg cgtccctttc gtacttatcg agtcatttaa ccccaaatta 61 ttttgaaca tgattatatg aggtataatg taactattgt gtagattttt aggcttgtat 121 atgttttgg ttgaatttcg ggaacgaaaa ggtcatttta g //.

Специфичность сателлитной ДНК Hae III показана Gindallis F, C.Desel, I. Galasso, T. Schmidt (2001).

В качестве праймеров использовали следующие нуклеотидные последовательности: прямой — 5'-ССAATTTTTGCCTTTTCG-3'; обратный - 5'-AAAATGACCTTTTCGTTCC-3'. Для создания специфических праймеров

применяли программу Primer3. Олигонуклеотиды синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия).

Для анализа полиморфизма рассеянных повторяющихся последовательностей генома в работе использованы следующие произвольные праймеры, синтезированные в ЗАО «Синтол» (г. Москва): PA WS 5 (5'- AAC-GAG-GGG-TTC-GAG-GCC-3'), PAWS 6 (5'- GAGTGTCАААСССAACGA-3'), PAWS 16 (5'- ACC-TCT-GCG-CTT-GGA-GGC-3'), PAW S 17 (5'- CTA-CAC-GGA-CTG-GGT-CCG-3'). Результаты электрофореза визуализировали с помощью системы фото-видео документирования DNA-analysis (ДНК-технология, Россия).

Создание межвидовых форм сахарной свеклы. Для скрещиваний использовали мужскостерильные растения сахарной свеклы и В. corolltflora Zoss., применяя метод принудительного опыления.

Общая схема получения форм сахарной свеклы с интрогрессией В. corolliflora состояла из этапов.

1. Скрещивание родительских форм.

2. Выделение незрелых гибридных зародышей вместе с тканями семяпочек и выращивание их в культуре in vitro.

3 .Микроразмножение жизнеспособных регенерантов, полученных в результате межвидовой гибридизации.

4. Определение плоидности регенерантов.

5. Детекция интрогрессии генетического материала венчикоцветной свеклы в геноме растений, являющихся потомством от скрещивания Beta vulgaris х Beta corolliflora.

Пыльцу дикой свеклы собирали в период массового цветения растений В. corolliflora и проводили принудительное опыление предварительно отобранных и изолированных мужскостерильных диплоидных растений сахарной свеклы. Незрелые зародыши на 8 и 12 день после опыления эксплантировали на агаризованные питательные среды Гамборга (В 5) с добавлением гормо-

нов (гиббереллин, кинетин, БАП - 0,1мг/л (Подвигина, 2004). Зародыши экс-плантировали вместе с семяпочками. В исследованиях использовалась методика стерилизации, техника приготовления питательных сред и культивирования по Р.Г. Бутенко (1975). В качестве стерилизующего агента использовали хлорамин (10%) при экспозиции 40 минут с последующей четырехкратной промывкой материала дистиллированной автоклавированной водой.

Через месяц растения-регенеранты, полученные в результате межвидовой гибридизации с использованием эмбриокультуры, пересаживали на питательную среду по Гамборгу (В 5) с добавлением гормонов (гиббереллин, кинетин, БАП - 0,2мг/л) для микроклонального размножения в условиях in vitro.

Для индукции корнеобразования в культуре in vitro использовали питательные среды Гамборга (В5) с добавлением 0,2 мг/л НУК.

Незрелые зародыши и микроклоны культивировали при интенсивности света 5 тыс. люкс (фотопериод 16 часов), температуре 20-22°С днем и 16-19°С ночью, при влажности 65-75%.

Дальнейшее выращивание межвидовых гибридов и исходных родительских форм проводили в условиях закрытого грунта.

Подсчет хромосом полученных растений осуществляли под микроскопом в метафазных пластинках делящихся соматических клеток вегетативных органов свеклы по стандартной методике окрашиванием ацетокармином (Яр-молюк, Ширяева, 1987), а так же по содержанию ядерной ДНК в клетках растения с использованием проточного цитометра Partee* РА (Германия).

Микрофотосъемки проводились с помощью цифрового фотоаппарата Olympus С180.

Математическая обработка экспериментальных результатов исследований. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли по стандартной методике (Доспехов, 1973). Кластерный анализ осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Повторность каждого опыта Зх - кратная биологическая.

3. ПОЛИМОРФИЗМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН IIS ГЛОБУЛИНОВ В ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

3.1. Изучение генетической структуры исходных линий

сахарной свеклы

В последние годы молекулярные маркеры (белковые и ДНК) становятся неотъемлемым элементом селекционного процесса для быстрого и эффективного отбора нужных генотипов растений.

Перспективными маркерами для сахарной свеклы являются запасные белки семян IIS глобулины, генетическое обоснование использования которых как молекулярно-генетических маркеров дал В.Г. Конарев (1970-2001). С использованием белковых маркеров идентифицированы формы кормовой, столовой и сахарной свеклы (Лесневич 1989; Буренин, Гаврилюк, 1994). С. Н. Митиным (2004) изучен генетический полиморфизм, оценена степень генетической дивергенции сортов и гибридов сахарной свеклы.

В связи с этим представляет интерес осуществление идентификации родительских компонентов сахарной свеклы по белковым маркерам, а так же выявление генетических взаимоотношений в генофонде Beta vulgaris для использования этих данных в селекционном процессе при создании новых гибридов.

В процессе наших исследований 17 исходных линий сахарной свеклы, использующихся для получения пробных гибридов на основе ЦМС обнаружено 69 типов спектров, с частотой встречаемости от 2 до 76 % для индивидуальных селекционных материалов (табл. 1-2). Для большинства исходных материнских линий выявлен небольшой полиморфизм - 2-5 типов электрофоре-тических спектров. Для MC - линии 94 Ар выявлено 7 типов спектров с частотой встречаемости от 5 до 35 %. Однако две пары характерных для данной линии типов спектров: № 22 и № 23 с частотой встречаемости соответственно 12 % и 10 %, а так же № 24 и № 25 с частотой встречаемости 9 % и

13 % различаются лишь интенсивностью проявления полипептидов. У МС-линии И-08001 выявлено 5 типов спектров, из них схожими по компонентному составу оказались типы спектров с частотой встречаемости 64%, 13%, 5% (6, 7, 8) и типы спектров 9-10 (различаются лишь интенсивностью проявления белковых полос). Подобные результаты получены для других мужско-стерильных линий. Для линий МС 1134, МС 1137, МС 1117 (табл.2) выявлено от 2 до 3, характерных для них типов спектров, различающихся лишь интенсивностью проявления. Таким образом, если обработке подвергать лишь компонентный состав белковых спектров (а интенсивностью проявления полипептидов пренебречь), то можно считать, что исходные материнские линии характеризуются 1-3 типами белковых формул.

Выявленный полиморфизм 11S глобулинов свидетельствует о генетической однородности и выровненности материнских компонентов пробных гибридов.

Для сростноплодных опылителей в зависимости от генотипа выявлено наличие 4-8 типов спектров. Интересно, что сростноплодный опылитель ОП 15202 характеризуется наличием наибольшего числа составляющих его биотипов, что отражается присутствием в его структуре по 11S глобулинам восьми типов спектров (табл.1), с частотой встречаемости от 2 до 48 %. Следует отметить, что четыре из характерных для данного селекционного материала типов белковых формул являются минорными (частота встречаемости от 2 до 3%), а типы спектра 16 и 17 - различаются лишь интенсивностью полос.

Таблица 1 - Электрофоре™ческие формулы 1 ^-глобулинов семян селекционных материалов сахарной свеклы

№ типа спектра Белковая с эормула №1 №2 №3 №4 №5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1 2 1 0 0 3 1 0 0 2 1 0 0 1 0 0 0 1 1 70%

2 2 1 0 0 3 1 0 0 2 1 0 0 1 0 0 0 1 0 15%

3 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 5%

4 2 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 4%

5 2 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 1 1 3%

6 2 0 2 1 2 2 2 3 2 0 0 0 0 0 2 0 0 1 64%

7 1 0 1 1 1 1 1 3 1 0 0 0 0 0 2 0 0 2 13%

8 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 2 0 0 2 5%

9 2 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 2 5%

10 2 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 2 10%

11 3 0 1 1 2 2 1 1 3 3 1 0 1 0 1 0 1 1 48%

12 3 2 1 1 9 2 1 1 3 3 1 1 1 0 1 0 1 1 18%

13 0 0 1 1 1 2 2 2 3 2 1 0 1 0 1 0 1 1 19%

14 0 0 1 1 1 2 2 2 3 2 1 0 1 0 1 0 1 1 2%

15 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 1 0 1 1 1 0 1 1 2%

16 2 0 2 2 2 3 2 2 3 3 1 0 1 1 1 1 1 1 2%

17 2 0 2 2 2 2 2 2 3 3 1 0 1 1 1 1 1 1 9%

18 2 0 2 2 2 2 2 2 3 3 1 0 1 0 1 1 1 1 3%

Продолжение таблицы 1.

№ типа спектра зелковая формула №1 №2 №3 №4 №5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 1 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 1 1 0 0 1 35%

20 0 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 0 0 2 2 1 14%

21 0 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 1 1 0 0 1 5%

22 1 2 3 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 1 1 0 0 1 12%

23 1 2 3 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 1 1 0 0 1 10%

24 1 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 0 0 2 2 9%

25 1 0 0 0 0 0 1 1 3 3 1 0 0 0" 0 г 2 1 13%

26 3 3 2 3 0 0 0 0 3 3 1 0 0 0 0 0 3 2 55%

27 3 3 2 3 0 0 0 0 3 3 1 0 0 0 0 0 2 2 34%

28 3 3 3 3 0 0 0 0 3 3 1 0 0 0 0 0 1 2 18%

29 3 3 2 3 0 0 0 0 3 3 1 0 0 0 0 0 0 2 2%

Обозначения:, №1 -МС И-08015, №2 - МС И-08001; №3 - ОП 15202, №4 - МС 94 Ар; № 5 - МС И-08016. Примечание: В белковой формуле интенсивность проявления каждой полосы (полипептида) обозначены в баллах: очень интенсивный полипептид - 3 балла, интенсивный полипептид - 2 балла, слабый - 1 балл. В процентах указана частота встречаемости типов спектров у родительских форм сахарной свеклы.

Таблица 2 - Электрофоретические формулы 118-глобулинов семян селекционных материалов сахарной свеклы

№ типа спектр Белковая с рормула мс 1131 мс 1134 мс 1141 мс 1113 мс 1137 МС-ШУ ОП 1203 он 1195 оп 1197 ОП 1181 ОП 1172 ОП 1165

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

30 2 2 2 1 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 1 1 75%

31 2 2 2 2 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 1 1 23%

32 1 2 3 1 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 1 1 2%

33 0 1 1 0 1 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 59%

34 0 2 2 0 2 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 21%

35 0 2 1 0 1 0 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 20%

36 3 2 0 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 72%

37 3 3 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 28%

38 0 1 1 1 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 2 64%

39 0 1 1 1 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 23%

40 0 1 1 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 13%

41 2 з 2 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 76%

42 2 2 2 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 1 : - 24%

43 1 2 1 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 55%

44 1 1 1 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 28%

45 2 2 3 0 0 0 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0 1 17%

46 0 2 2 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 2 0 0 0 1 67%

47 0 3 2 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 2 0 0 0 1 9 %

48 0 3 3 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 2 0 0 0 1 4%

49 0 2 2 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 0 1 20%

50 0 2 2 3 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 52%

51 0 2 3 2 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 2 16%

52 0 0 2 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 3 8%

53 0 2 2 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 23%

54 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 75%

55 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 0 0 2 10%°/

56 0 0 1 1 0 0 0 0 1 2 0 0 2 0 0 0 0 2 5%

57 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 10%

58 0 0 1 1 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 2 2 61%

59 0 0 2 2 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 2 2 14%

60 0 0 2 2 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 1 6%

61 0 0 2 2 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 2 1 17%

62 0 3 3 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 0 1 61%

63 0 3 1 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 1 20%

64 0 3 1 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 3 9%

65 0 2 2 0 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 2 9%

66 0 0 1 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 42%

67 0 0 2 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10%°/

68 0 0 1 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 27%

69 0 0 1 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 19%

Примечание: В белковой формуле интенсивность проявления каждой полосы (полипептида) обозначены в баллах: очень интенсивный полипептид - 3 балла, интенсивный полипептид - 2 балла, слабый - 1 балл. В процентах указана частота встречаемости типов спектров у родительских форм сахарной свеклы.

Таким образом, в результате электрофоретического фракционирования запасных белков семян сахарной свеклы (Ш-глобулинов) исходных родительских компонентов сахарной свеклы выявлена их генетическая структура, характеризующаяся наличием и отсутствием полипептидов с различной электрофоретической подвижностью, а так же интенсивностью их проявления, что позволило составить генетические формулы.

3.2. Кластерный анализ в исследовании исходного селекционного материала сахарной свеклы

Анализ генетического разнообразия полезен при планировании скрещиваний с целью вовлечения в гибридизацию генетически дивергентных линий (Конарев, 1998).

Эффективность селекции сахарной свеклы во многом определяется информацией о генетическом разнообразии родительских форм в сочетании с данными о выраженности хозяйственных признаков у родителей (Федулова, 2005).

Метод белковых маркеров является достаточно простым, удобным и дешевым, поэтому нами изучены генетические различия исходных родительских форм сахарной свеклы кластерным анализом матрицы белковых генетических профилей.

Объединение или метод древовидной кластеризации используется для выявления групп или кластеров несходства, а так же расстояния между объектами. Евклидово расстояние - это наиболее общий тип расстояния. Оно является геометрическим расстоянием в многомерном пространстве и вычисляется следующим образом (Пасеков, 1983):

Расстояние (х,у) = {(х1 - уГ)2 } 1/2

Евклидово расстояние вычисляется по исходным, а не по стандартизованным данным. Это обычный способ его вычисления, который имеет определенные преимущества (например, расстояние между двумя объектами не изменяется при введении в анализ нового объекта, который может оказаться

35

выбросом). Кластерный анализ определяет "наиболее возможно значимое решение".

В наших исследованиях, при проведении кластерного анализа, математической обработке подвергали только данные электрофоретического состава с максимальной частотой встречаемости типов спектров, характерных для индивидуальных линий, представленных в виде двоичной матрицы присутствия/отсутствия компонентов спектра (рис. 1). Интенсивность проявления полос в сравнительном анализе генетической структуры селекционных материалов методом кластеризации не учитывали.

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Богачева, Наталия Николаевна

выводы

1. Установлена генетическая структура исходных селекционных материалов сахарной свеклы на основе полиморфизма запасных белков семян IIS глобулинов, позволившая составить молекулярно-генетические формулы для идентификации и паспортизации. Для исследованных материалов выявлено 69 оригинальных типов электрофоретических спектров с частотой встречаемости от 2 % до 76 %. Типы спектров мужскостерильных линий характеризовались в основном различиями в интенсивности проявления полипептидов.

2. Использование кластерного анализа на основе компонентного состава основных белковых спектров IIS глобулинов позволяет сгруппировать исходные линии сахарной свеклы по степени генетического родства. Показано, что с увеличением генетической удаленности родительских компонентов (D > 2,24) возрастает уровень истинного гетерозиса гибридов сахарной свеклы.

3. Разработан метод подбора родительских пар по белковым маркерам, включающий: подсчет частоты встречаемости основных типов спектров у родительских компонентов, определение родства на основе генетических расстояний с учетом наибольшей их удаленности друг от друга, что позволяет наиболее обоснованно подбирать компоненты для скрещиваний для повышения эффективности селекционного процесса.

4.Установлено, что при межвидовой гибридизации наблюдаются генетические изменения, выявляемые методом электрофоретического фракционирования запасных белков семян. Выделены электрофоретические компоненты спектров IIS глобулинов дикой свеклы В. corolliflora (с относительной подвижностью Rf = 0,05; 0,07; 0,47; 0,85; 0,90) которые могут быть использованы для обнаружения чужеродного генетического материала в межвидовых гибридах.

5. Наиболее полиморфными и перспективными для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы являются праймеры к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК семейства R 173: PAWS 5 и PAWS 17. Исследованные селекционные материалы сахарной свеклы характеризовались варьированием числа выявляемых ДНК- ампликонов в зависимости от генотипа и локуса от 1 до 8 и диапазоном длин получаемых RAPD- фрагментов от 250 до 2000 п.н.

6. На основе данных RAPD-анализа определены генетические дистанции между 11 исходными родительскими линиями сахарной свеклы (для 33 возможных комбинаций скрещивания). Наибольшие значения генетических расстояний выявлены для родительских пар МС И-08001 X ОП 08197 (D=3,87), МС И-08001 X ОП 08001 (D= 3,74), МС И-08016 X ОП 08008 (D=3,46), МС И-08015 X ОП 08008 (D= 3,74), МС 94 Ар X ОП 08008 (D= 3,46), МС И-08016 X ОП 08016 (D= 3,74) и др. Данные родительские пары рекомендованы для проведения скрещиваний.

7. Разработаны метод идентификации селекционных материалов по RAPD-маркерам и метод подбора родительских пар на основе анализа геномной ДНК, основанные на присутствии / отсутствии фрагментов ДНК, с учетом евклидовых расстояний.

8. Установлено присутствие сателлитной ДНК HaelII в геноме триплоидных и диплоидных форм межвидовых гибридов Beta vulgaris х Beta corolliflora. ISSR-ПЦР-анализ с видоспецифическими праймерами, сконструированными к данной последовательности ДНК, является точным методом детекции и позволяет быстро отбирать растения, несущие в своем геноме генетический материал дикой свеклы В.corolliflora, что позволяет значительно упростить и ускорить селекционный процесс.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Для повышения эффективности селекции сахарной свеклы при создании гибридов с повышенной продуктивностью рекомендуется использовать метод, основанный на выявлении генетических дистанций исходных линий сахарной свеклы, рассчитанных на основе компонентного состава основных типов белковых спектров.

2. Для проведения молекулярно-генетической идентификации предлагается применять RAPD-анализ с использованием одиночных произвольных праймеров при регистрации гибридов, а так же для защиты авторских прав селекционеров.

3. При проведении межвидовой гибридизации сахарной свеклы с диким видом Beta corolliflora Zoss. предлагается использовать метод ISSR-ПЦР с видоспецифическими праймерами к сателлитной ДНК НаеШ, позволяющий отбирать интрогрессивные формы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Селекция сахарной свеклы длительное время достаточно успешно осуществлялась с использованием морфологических признаков, позволившим создать целый ряд высокопродуктивных сортов и гибридов (Мазлумов, 1966; Корниенко, 2010; Богомолов, 2010; Ошевнев, Грибанова, 2010 и др.). В настоящее время практически во все сферы селекционного процесса включаются методы молекулярного маркирования, что обеспечивает переход селекции на новый уровень, когда возможен массовый скрининг образцов с использованием высоких технологий.

Как показали наши исследования, генотипирование селекционных материалов сахарной свеклы с использованием электрофоретического анализа запасных белков семян свеклы IIS глобулинов и RAPD-анализа позволило объединить изученные формы по степени генетического родства, рассчитать генетические дистанции и разработать методы подбора родительских пар при создании гибридов.

Выявлены генетические изменения методами белкового и ISSR-ПЦР анализов в межвидовых гибридах В. vulgaris х В. corolliflora. Установлено присутствие видоспецифической ДНК НаеШ в геноме триплоидных и диплоидных интрогрессивных форм.

Проведенные исследования свидетельствуют о возможности и необходимости привлечения методов молекулярного маркирования (белковых и ДНК) для решения следующих проблем практической селекции сахарной свеклы (рис. 9):

• Генотипирование, идентификация и паспортизация селекционных материалов свеклы.

• Выявление степени генетической дивергенции исходного селекционного материала и увеличение эффективности подбора пар для гибридизации в гетерозисной селекции.

• Детекция иитрогрессии чужеродного генетического материала в геноме растений сахарной свеклы и быстрый их отбор на этапе микроклонального размножения.

• Исследование генетической структуры межвидовых гибридов, выявление скрытой генетической изменчивости.

Принципы и методы белковых маркеров позволяют успешно решать проблемы селекции и семеноводства от поиска исходного материала до семенного контроля созданных гибридов. Тем не менее, имеются ограничения в применении белкового анализа, которые заключаются в использовании семенного биологического материала и времени его сбора, преимуществом является относительная экономия материальных средств, обеспечивающих проведение анализа.

Преимущества ДНК - анализа заключаются в длительности хранения образцов выделенной ДНК, возможности работать с любыми тканями, на любых стадиях развития растения. Метод ПЦР позволяет быстро и с небольшими затратами получить более 10 миллионов копий определенной последовательности ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. RAPD-анализ позволяет осуществлять ДНК -фингерпринт (геномную дактилоскопиию) растений, исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ).

При проведении более масштабных исследований всего генофонда Beta vulgaris L. и для получения более достоверных данных количество ДНК -маркеров следует увеличить, что будет способствовать более полному выявлению генетической изменчивости. Использование молекулярных маркеров в решении различных задач селекции может обеспечить экономию материальных ресурсов и ускорить селекционный процесс.

Генотипирование селекционных материалов сахарной свеклы с использованием молекулярных маркеров тг

Элсктрофорегический анализ запасных белков семян свеклы 118 глобулинов

Исследование генетической структуры межвидовых гибридов сахарной свеклы

--- гттт III '■■Г * Г —- V

- -

Идентификация и паспортизация исходных родительских линий сахарной свеклы

1000000033000020002

1А250°АЗ00°А4001А500.

Кластеризация селекционных материалов и подбор пар в гетерозисной селекции

Быстрый отбор интрогрессивных форм сахарной свеклы

Рис. 30. Использование молекулярного маркирования в селекционном процессе сахарной свеклы

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Богачева, Наталия Николаевна, 2012 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Азарин К. В. Оценка комбинационной способности линий подсолнечника и подбор SSR-маркеров, ассоциированных с эффектом гетерозиса/ К. В. Азарин // Инновационные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур: VI международная конференция молодых ученых и специалистов. - Краснодар, 2011.- С. 5-9.

2. Банникова В. П. Повышение эффективности отдаленной гибридизации злаков методом эмбриокультуры / В. П. Банникова, П.Д. Майстров, Е.А. Барабанова и др. // Цитология и генетика. - 1990. - Т. 24, № 5.- С. 25-28.

3. Бирюкова В. А. ДНК-дактилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей / В. А. Бирюкова, Н. С. Велишаева, В. С. Зайцев, Э. Е. Хавкин, Л. М. Хромова, И. А. Шилов // Вопросы картофелеводства. Материалы «Школы молодых ученых». - М., 2004. - С. 114-123.

4. Богачева H.H. Индуцирование генетической изменчивости при проведении межвидовой гибридизации (Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss.) / H.H. Богачева II Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки: Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых. - Воронеж, 4.2. - 2005. - С.95-97.

5. Богачева Н. Н. Электрофоретический анализ белков семян, полученных при межвидовой гибридизации (Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss.) / H. H. Богачева, P. В. Усачева // Юбилейный сборник научных трудов.-Воронеж, ВГАУ, 4.2. - 2007. - С.34-35.

6. Богачева H.H. Детекция интрогрессии элементов генома Beta corolliflora Zoss. в геноме сахарной свеклы Beta vulgaris L. / Н. Н. Богачева, Р.В. Усачева, А.Т. Епринцев, Д.Н. Федорин, Т.П. Федулова // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: Материалы II Вавиловской международной конференции. - С.-Пб, 2007. - С. 244-245.

7. Богачева H.H. Создание и молекулярно-генетическое изучение межвидовых гибридов свеклы Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. / H.H. Богачева,Т.П. Жужжалова, A.T. Епринцев, Д.Н. Федорин // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: Материалы IX международной конференции. - М., 2008. - С.50-51.

8. Богачева Н. Н. Идентификация генетического материала дикой свеклы в геноме межвидовых гибридов / Н. Н. Богачева, Р. В. Усачева, Т.П. Жужжалова, Т. П. Федулова, А. Т. Епринцев, Д. Н. Федорин // Вестник РАСХН. - 2009. - №. 3. - С. 59-61.

9. Богачева H.H. Применение культивирования in vitro и молекулярного маркирования для осуществления и контроля межвидовой гибридизации Beta vulgaris х Beta corolliflora / H.H. Богачева, P.B. Усачева II Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы IX молодёжной научной конференции. - М., 2009. - С. 8 - 9.

10. Богачева H.H. Получение новых форм сахарной свеклы путем отдаленной гибридизации Beta vulgaris L. xBeta corolliflora Zoss. / H.H. Богачева // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: Труды IV международной конференции молодых ученых. - Новосибирск, 2010. - С. 226-229.

11.Богачева Н. Н. Получение интрогрессивных форм свеклы при проведении межвидовой гибридизации / Н. Н. Богачева, Д. Н. Федорин, Т.П. Федулова // Сахарная свекла. - 2010. - №4. - С. 10-12.

12.Богачева H.H. Молекулярно-генетическое исследование гибридов сахарной свеклы с разным уровнем продуктивности / H.H. Богачева, Т.П. Федулова, Д.Н. Федорин // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы XI молодежной научной конференции. - М., 2011. - С.13-14.

13.Богомолов М. А. Индукция и генетико-селекционное изучение гамма-линий сахарной свеклы: Автореф. дис. ... канд.с.-х. наук./ М. А. Богомолов - Рамонь, 2000. - 28 с.

14.Богомолов М.А. Создание исходного материала сахарной свеклы на основе индуцированного апомиксиса / М.А. Богомолов, Т. П. Федуло-ва.- Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2007. - 136 с.

15. Богомолов М.А. Индуцированный апомиксис и использование его в селекции сахарной свеклы / М. А. Богомолов // Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свеклы: Сб. науч. Тр. - Новосибирск: Издательство сова.- 2010.- С. 504-513.

16.Брежнев Д.Д. Дикие сородичи культурных растений флоры СССР / Д. Д. Брежнев, О. Н. Коровина // JL: Колос, 1981.- С.3-5.

17.Бузанов И.Ф. Роль физиологии и биохимии в селекции сахарной свеклы / И.Ф. Бузанов, А.Ф. Маринчик // Селекция сахарной свеклы с использованием полиплоидии и ЦМС. - Киев, 1971. - С. 81-93.

18. Буренин В. И. Применение белковых маркеров для идентификации генетических ресурсов свеклы / В. И. Буренин, И. П. Гаврилюк // Докл. Росс. акад. с.-х. наук. - 1994 . - № 3. - С.14-16.

19.Буренин В.И. Диагностика образцов по запасным белкам семян / В. И. Буренин //Сахарная свекла.- 1996,- № 2.- С. 17.

20. Буренин В.И. Свекла / В.И.Буренин, В.Ф. Пивоваров // С-Пб, 1998. -212с.

21.Буренин В.И. Дикорастущие виды свеклы и современная селекция /В. И. Буренин // Сахарная свекла. - 1999.- № 6. - С. 21-22.

22. Буренин В.И. Генетические ресурсы рода Beta L. (Свекла) / В. И. Буренин//С.Пб., 2007. - 274 с.

23.Бутенко Р.Г. Дифференциация и морфогенез в культуре тканей, клеток и протопластов/ Р.Г. Бутенко // Биология развития растений. - М.: Наука, 1975. - С. 48-65.

24.Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений/ Р.Г. Бутенко // Гормональная регуляция онтогенеза растений. - М., 1984. -С. 42-54.

25.Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе / Р.Г. Бу-

тенко // Л., 1986.-216 с.

26. Бутенко Р.Г. Состояние и перспективы изучения морфогенеза растений /Р.Г. Бутенко // Всесоюз. об-во физиологов раст. - 1990, Вып. 8. -С. 5-8.

27. Вавилов Н. И. Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости / Н. И. Вавилов // Докл. на III Всеросс. сельск. съезде.- Саратов, 1920.- 16с.

28. Вавилов Н. И. Ботанико-географические основы селекции (учение об исходном материале) / Н. И. Вавилов // Избр. произв. Д.: Наука, 1967.Т. 1. - С.345-405.

29.Вайшля О. Б. Факторный анализ показателей фотосинтеза, дыхания

и продуктивности у гетерозисных гибридов и родительских линий Pisum sativum L. / О.Б. Вайшля // Электронный журнал «Исследовано в России». - 2004. - С. 144-163.

30.Вахитов В.А. Сравнительное изучение повторяющихся нуклеотидных последовательностей ДНК у аллоплоидов пшеницы // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. - 1976. - Т. 58, вып. 1. - С. 57- 68.

31.Вахитов В. А. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов рДНК пшениц и эгилопса // В. А. Вахитов, А. М. Куликов, А. В. Чеме-рис // Генетика. - 1988. - Т.24, № 11. - С. 1995-2007.

32. Велишаева Н. С. Использование технологии микросателлитного анализа для различения сортов картофеля и его дикорастущих сородичей. / Н. С. Велишаева, И. А. Шилов, Э. Е. Хавкин // Вопросы картофелеводства. Актуальные проблемы науки и техники. -М., 2006.- С. 228235.

33.Высоцкий В.А. Морфогенез и клональное микроразмножение растений / В.А. Высоцкий // Культура клеток растений и биотехнология. - М., 1986.-С. 91-102.

34.Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э.Гааль, Г. Медьеши, JL Верецкеи // М.: Мир, 1982. - 446с.

35. Галаев А. В. Детекция интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrica Host, в геном Triticum aestivum L. с помощью IS SR- и SSR-анализа / А. В. Галаев, Л. Т. Бабаянц, Ю. М. Сиволап // Генетика. -2004.-Т. 40, № 12. - С.1654-1661.

36. Герасимова Т.И. «Транспозиционные взрывы» при дестабилизации генома у Drosofila melanogaster / Т.И. Герасимова // Молекулярные механизмы генетических процессов.- М.: Наука, 1985. - С.13-20.

37.Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Д. Пастернак //Москва: Мир, 2002. -589с.

38.Гостимский С. А., Кокаева 3. Г., Боброва В. К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. - 1999. - Т. 35.-С. 1538-1549.

39. Гостимский, С. А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С. А. Гостимский, 3. Г. Кокаева, Ф. А. Коновалов // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 4 . - С. 480-492.

40.Гуляев Г.В. Селекция и семеноводство полевых культур с основами генетики / Г. В. Гуляев, А.П. Дубинин // М.: Колос, 1980. - 375с.

41. Гуляев Г.В. Словарь терминов по генетике, цитологии, селекции, семеноводству и семеноведению / Г. В. Гуляев, В. В. Мальченко // М.: Россельхозиздат, 1983. - 240с.

42. В. Г.Гуляев Генетика / М.: Колос.- 1984. - 352с.

43.Дорофеев В. Ф. Спонтанные пшенично - ржаные амфидиплоиды Закавказья / В. Ф. Дорофеев // Докл. ВАСХНИЛ. - 1964. - № 2. - С.21-23.

44. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // М.: Колос, 1973.-366с.

45.Епринцев А.Т. Молекулярно-биохимические особенности межвидовой

гибридизации Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. / А.Т. Епринцев,

Д.Н. Федорин, H.H. Богачева, Т.П. Жужжалова, Т.П. Федулова // Орга-

102

низация и регуляция физиолого-биохимичееких процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Выпуск 10. - ВГУ. - Воронеж, 2008. - С. 89-96.

46.Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи / П.М. Жуковский // Л.: Колос, 1971. - 752с.

47.Жученко А. А. Адаптивная система селекции растений (эколого-генетические основы) / А. А. Жученко // М.: РУДН, 2001 .-Т. 2.- 708с. .

48. Зарубайло Т. Я. Геномный анализ амфидиплоидов пшеницы по белкам зерна / Т. Я. Зарубайло, Н. К. Губарева, Э. В. Таврин // Тр. по прикл. бот., ген. и сел., 1973.- Т. 52, вып.1. - С.214-221.

49. Здруйковская-Рихтер А. И. Культура изолированных зародышей, семяпочек и семян различных плодовых деревьев и аспекты ее применения в прикладных целях / А. И. Здруйковская-Рихтер / Сельскохозяйственная биология. - 1985. - № 3. - С.57-60.

50. Календарь Р.Н. Полимеразная цепная реакция с произвольными прай-мерами / Р. Н. Календарь Р.Н., Ю. М. Сиволап / Биополимеры и клетка. - 1995. - № 3-4. - С.55-65.

51.Картель H.A. Взаимодействие экзогенного генетического материала с геномом растений / H.A. Картель, К. И. Забенькова, О. В. Квитко, С. Е. Аблов, С.С. Савченко // Генетические методы ускорения селекционного процесса. - Кишинев: Штиинца, 1986. - С. 96-105.

52.Катаева Н.В. Клональное размножение растений в культуре ткани / Н.

B. Катаева, В.А. Аветисов // Культура клеток растений. - М. - 1981. -

C.137-149.

53. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений/ Е.И. Кацы // Генетика. - 1997. - Т. 33, № 5. - С. 565-576.

54.Кирикович С.С. Эпигенетическая изменчивость ферментных локусов у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при многофакторных воздействиях: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / С.С. Кирикович - Томск, 2005. - 17 с.

55.Коваленко O.B. Генетические аспекты морфогенеза растений / О.В. Коваленко // Успехи соврем, биологии. - 1993, Т. 113, Вып. 3. - С. 269285.

56.Ковеза О. В. Выявление и картирование полиморфных RAPD -маркеров генома гороха / О. В. Ковеза, 3. Г. Кокаева, Ф. А. Коновалов, С. А. Гостимский // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 3. - С. 341-348.

57.Кожухова Н. Э. Прогнозирующий потенциал ДНК-маркеров в гетеро-зисной селекции кукурузы / Н. Э. Кожухова, Б. Ф. Вареник, Ю. М. Сиволап // Цитология и генетика. - 2005. - № 1. - С. 14-20.

58. Козуб H.A. Эффект интрогрессии от Aegilops cylindrica Host, в проявлении признаков продуктивности растений F2 озимой мягкой пшеницы / H.A. Козуб, И.А. Созинов, A.A. Созинов // Генетика. - 2004. - Т. 40, № 12 . - С. 1662-1667.

59. Комарницкий И.К. Методические рекомендации по применению мо-лекулярно-биологического анализа в селекции сахарной свеклы / И. К. Комарницкий, A.M. Самойлов, В. И. Перетятько, Ю.Ю. Глеба. - Киев, 1988.-28с.

60.Конарев А. В. Гетерогенность геномноспецифичных белков - серологических маркеров геномов В1-вверху и D пшениц и эгилопсов / А. В. Конарев, В.М. Чмелев // Докл. ВАСХНИЛ. - 1986. - № 5. - С. 7-9.

61. Конарев А. В. О компонентном составе геномноспецифичных белков -серологических маркеров геномов В1-вверху и D пшеницевых / А. В. Конарев, В.М. Чмелев // С. - х. биология. - 1990. - № 5. - С.46-51.

62.Конарев A.B. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / A.B. Конарев // Аграрная Россия. - 2002. - № 3. - С. 4-11.

63.Конарев В.Г. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких сородичей / В.Г. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н.К. Губарева // Вестник с.-х. науки. -1970 а.- № 8.-С.110-114.

64. Конарев В.Г. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких сородичей / В.Г. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н.К. Губарева // Вестник с.-х. науки. - 1970 б. - № 9. - С.91-103.

65. Конарев В.Г. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции / В.Г. Конарев. - 1973. - № 3.

66.Конарев В.Г. Белковые маркеры в анализе тритикале / В. Г. Конарев, Т. И. Пенева // Вестник с.-х. науки. - 1977. - №10. - С. 60-68.

67.Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В. Г. Конарев. -М.: Колос, 1983.-320 с.

68.Конарев В.Г. Электрофорез зеина как метод идентификации, регистрации и анализа сортов, линий и гибридов кукурузы / В. Г. Конарев, В.В. Сидорова, Г.И. Тимофеева // С. - х. биология. - 1990. -№ 3. - С. 167177.

69. Конарев В.Г. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции / В. Г. Конарев. - М.: Колос, 1993. -

447 с.

70.Конарев В.Г. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений / В.Г. Конарев // Сельскохозяйственная биология. - 1998. - № 5. - С. 3-25.

71.Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно-генетический анализ растений. -С. -Пб., 1998.-375с.

72.Конарев В.Г. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / В. Г. Конарев. - С.- Пб., 2000.-186 с.

73. Конарев В.Г. Использование белковых маркеров для идентификации генетических ресурсов растений, решения проблем семеноводства и семенного контроля / В.Г. Конарев, А. В. Конарев, И.П. Гаврилюк, Н. К. Губарева, Т. И. Пенева, Н. В. Алпатьева // Генетические ресурсы культурных растений: Мат. междунар. практич. конф. 13-16 ноября. -С.-Пб, 2001 -С.309-311.

74.Корниенко A.B. Современное состояние по генетике и селекции сахарной свеклы за рубежом (обзор иностранной литературы) / А. В. Корниенко, И. В. Апасов, А.К. Буторина, Т. П. Жужжалова // Сельскохозяйственная биология. - 2011, № 1. - С. 3-11.

75.Корниенко A.B. Основы мутационной селекции свеклы / А. В. Корниенко // Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свеклы: Сб. науч. Тр. - Новосибирск: Издательство сова, 2010.- С. 489-503.

76. Корниенко A.B. Генетика и селекция сахарной свеклы В. Vulgaris L. (прошлое, настоящее, будущее) // А. В. Корниенко, А.К. Буторина / Воронеж, Воронежский ЦНТИ, 2012. - 391с.

77. Красочкин В. Т. Свекла / В. Т. Красочкин // М., 1960. - 438 с.

78.Левитес Е.В. Генетика изоферментов у сахарной свеклы / Е.В. Левитес // Генетика сахарной свеклы. - Новосибирск: Наука СО, 1984. - С. 4560.

79.Лесневич Л.А. Оценка и изучение генофонда свеклы по белкам-маркерам / Л. А. Лесневич, З.А. Болелова // Сельскохозяйственная биология. - 1987. - № 4. - С.58-63.

80. Лесневич Л.А. Значение белков как генетических маркеров при идентификации геномов свеклы / Л. А. Лесневич // Цитогенетические и цитологические исследования в селекции сахарной свеклы. - Киев, 1988. -С.89-97.

81.Лесневич Л.А. Полиморфизм 11 S-глобулинов в изучении генома сахарной свеклы / Л. А. Лесневич // Частная генетика растений: Тез. Докл. Конф. 23-25 мая 1989 г. - Киев.- Т.1. - С. 131-132.

82.Лесневич Л. А. Полипептиды IIS -глобулина в анализе подлинности сортов сахарной свеклы / Л. А. Лесневич // Физиология и биохимия культурных растений. - 1993. - Т.25, №2. - С.175-191.

83. Лесневич Л.А. Электрофоретическое и иммунохимическое изучение белков семян свеклы / Л.А. Лесневич // Физиология и биохимия культурных растений. - Т.29, №3. - 1997. - С. 200-207.

84. Мазлумов A.JI. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов: Сборник трудов ВНИИСС. - Воронеж, 1966. - Вып. 3. - С. 3 - 53.

85.Малецкий С. И. Наследование алкогольдегидрогеназы у сахарной свеклы. Сообщение I. Анализ отклонения от моногенного расщепления / С. И. Малецкий, А. А. Коновалов // Генетика. - 1985. - Т.21, №9. - С 1527- 1540.

86.Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук И М.: Мир, 1984.- 399 с.

87. Маринчик А.Ф. Получение вегетативных гибридов свеклы путем прививки разновозрастных компонентов и поведений их потомства / А. Ф. Маринчик // Вопросы физиологии, биохимии и анатомии сахарной свеклы (труды Т. XXXV). - Киев, 1957.- С.117-140.

88. Марченко А.О. Реализация морфогенетического потенциала растительных организмов / А.О. Марченко // Успехи соврем, биологии. -1996, Т. 116.-№3.-С. 306-319.

89. Мейстер Г. К. Современные задачи изучения межвидовых гибридов / Г. К. Мейстер // Тр. Всесоюз. съезда по генетике, селекции, семеноводству, 1930.-Т.2.-С.27-43.

90. Мережко А.Ф. Проблема доноров в селекции растений / А.Ф. Мережко // С. Пб.: ВИР, 1994а. - 126с.

91.Митин С.П. Биоморфологическое и молекулярно - генетическое изучение селекционного материала сахарной свеклы: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / П. Митин. - Рамонь, 2004. - 22 с.

92.Моисеева H.A. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений / H.A. Моисеева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. - С. 166-185.

93. Муромцев Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Г.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев // М. - ВО Агропромиздат, 1990. - 320с.

94. Мухина Ж. М. Молекулярные маркеры и их использование в селекционно-генетических исследованиях / Ж. М. Мухина, Е.В Дубина // Научный журнал КубГАУ. - 2011, №66.- С. 97-107.

95. Науменко Т. С. Генетический анализ эффекта гетерозиса по некоторым количественным признакам у гибридов Fi томата: Автореф. дис. .. .канд. с. - х. н. / Т. С. Науменко // Москва, 2000. - 23с.

96. Омаров Д. С. К методике учета и оценки гетерозиса у растений / Д. С. Омаров // С.-х. биолог. - 1975. - Т.10. - № 1. - С. 123-127.

97.Орловский Н.И. Рост сахарной свеклы / Н.И. Орловский // Биология и селекция сахарной свеклы. - М.: Колос, 1968. - С. 207 - 226.

98. Ошевнев В. П. Селекция самосовместимых опылителей О-типа у сахарной свеклы / В. П. Ошевнев, Н. П. Грибанова // Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свеклы: Сб. науч. Тр. - Новосибирск: Издательство сова, 2010. - С. 542-554.

99.Пасеков В. П. Генетические расстояния / В. П. Пасеков // Итоги науки и техники. Общая генетика. ВИНИТИ-1983.- Т.8. - С. 4-75.

100. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. / З.П. Паушева // М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.

101. Пиралов Г. Р. Влияние биологических особенностей исходного материала и состава питательных сред на каллусогенез и регенерацию в культуре незрелых зародышей кукурузы / Г. Р.Пиралов, O.E. Абраи-мова // Физиология и биохимия культ, растений.- 1997, Т. 29. - №1. -С.44-50.

102. Подвигина O.A. Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. ... д.с.-х. н. / О. А. Подвигина - Воронеж, 2003. -44с.

103. Родин С.Н. Закон гомологических рядов Н. И. Вавилова в свете некоторых данных теории эволюции / С.Н. Родин // Вавиловское наследие в современной биологии.- М.: Наука, 1989. - С.38-71.

104. Русина JI. В. Использование метода культуры изолированных зародышей для получения межвидовых гибридов шалфея / Л. В. Русина, A.M. Бугара, Л. А. Бугаенко // Физиология и биохимия культ, растений.

- 1997, Т. 29. - № 2. - С. 121-128.

105. Сатина Т. Г. Технология генотипирования на основе микросател-литного анализа в селекции рапса (Brassica napus L.): Автореф. дис. ... канд. биол. наук / Т. Г. Сатина - Москва, 2010. - 21с.

106. Свирщевская А. М. Анализ RAPD-спектров сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и оценка возможности применения метода для идентификации ее форм /А. М. Свирщевская, Л. В. Милько, А. В. Кильчев-ский / Молекулярная и прикладная генетика: сборник научных трудов.

- Минск: Право и экономика, 2011.- Т. 12. -С. 28-40.

107. Сиволап Ю.М. Генетический полиморфизм ячменя, выявленный ПЦР с произвольными праймерами / Ю. М. Сиволап, Р. Н. Календарь // Генетика. - 1995, Т. 31, № 10,- 1358-1364.

108. Сиволап Ю. М. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD и SSR анализа / Ю. М. Сиволап // Генетика. -2000, Т. 36, № 1.-С. 44-51.

109. Созинов A.A. Генетические маркеры у растений / А. А. Созинов // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27, № 5. - С. 3-14.

110. Созинова Л.Ф. Генетическая дифференциация растений-регенерантов мягкой пшеницы с помощью IRAP-маркеров / Л. Ф. Созинова, И. Л. Цветков, А. И. Сейтбатталова, А. Б. Комаров, В. И. Глаз-ко, Е. М. Раманкулов, А. К. Саданов // Сельскохозяйственная биология. -2008, №5.-С. 18-21.

111. Струнников В. А. Новая гипотеза гетерозиса: ее научное и практическое значение / В. А. Струнников // Вестник с.-х. науки. - 1983. -№1.- С. 34-40.

112. Суриков И. М. К вопросу о преодолении и использовании межвидовой несовместимости сельскохозяйственных растений с помощью

109

методов in vitro / И. M. Суриков И. М., Гавриленко Т. А., Дунаева С. Е. // С. - х. биология. - 1986. - № 4. - С. 3-9.

ИЗ. Титок В. В. Биоэнергетическая концепция гетерозиса / В. В. Ти-ток // Молекулярная и прикладная генетика. - 2008.- Т.8. - С. 81-93.

114. Федулова Т. П. Теоретические и практические аспекты молеку-лярно-генетического маркирования в селекции сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)\ Автореф. дис., д.б.н. / Т. П. Федулова - Рамонь, 2005. -43с.

115. Федулова Т.П. Молекулярно-генетическое изучение родительских форм и гибридов сахарной свеклы/Т. П. Федулова, Н. Н. Богачева, Д.Н. Федорин, М. А. Богомолов, В.П. Ошевнев // Сахарная свекла.-

2010. - №8. - С. 8-10.

116. Федулова Т.П. Подбор родительских пар для гибридизации с использованием ДНК-маркеров / Т.П. Федулова, М.А. Богомолов, H.H. Богачева, Т.П. Жужжалова, Д.Н. Федорин, В.П. Ошевнев, А.С Хуссейн // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы VI Московского международного конгресса. - М., 2011. - ч. I. - С. 234-235.

117. Хемлебен В. Сателлитные ДНК / В. Хемлебен, Т. Г. Беридзе, JI. Бахман, Я. Коварик, Р. Торрес // Успехи биологической химии. - 2003, Т. 43.-С. 267-306.

118. Хок М. Ш. Фракционирование и электрофоретический анализ запасных белков аллоплазматических гибридов пшеницы / М. Ш. Хок, Г.Г. Белкина, Н.П. Юрина, О.Г. Семенов, М. С. Одинцова // Доклады Российской академии наук. - 1993. - №3. - С. 11-15.

119. Чугункова Т. В. Изучение электрофоретических спектров глобулинов семян для контроля гомозиготности линий сахарной свеклы / Т. В. Чугункова, О. В. Дубровная, В.Н. Хризман, И.А. Шевцов // Цитология и генетика. - 1992. - Т. 26, №6. - С. 3-5.

120. Чугункова Т. В. Современное состояние и проблемы клеточных технологий у свеклы / Т. В. Чугункова // Цитология и генетика. - 1995. -Т. 29, №3.-С. 81-89.

121. Шайхаев Г.О. Набор реагентов для выделения ДНК из различного биологического материала / Г. О. Шайхаев // М., 2001. - 6 с.

122. Шаюк JI. В. Исследование генетического полиморфизма рода Beta с помощью ПП-ПЦР / JI.B. Шаюк, Н.В. Роик, Ю.М. Сиволап // Геном растений: Сб. тезисов IV Междунар. Конф. 10-13 июня 2003 г., Одесса, 2003.-С. 43.

123. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная битехнология / В. С. Ше-велуха, Е.А. Калашникова, С. В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, М. И. Прокофьев, Н.Н. Новиков, В. М. Ковалев, Д.В. Калашников // М., 1998. - 416 с.

124. Юрцев В.Н. Методическое руководство к лабораторно-практическим занятиям по цитологической и эмбриологической микротехнике. / В.Н. Юрцев., В. А. Пухальский // 1968. - 113 с.

125. Ярмолюк Т.И. Цитологические и цитогенетические исследования в селекции сахарной свеклы // Т.И. Ярмолюк, Э.И. Ширяева // Методические рекомендации. - Киев.: Наукова думка, 1982.- 56с.

126. Baenziger P.S. Improving lives: 50 years of crop breeding, genetics, and cytology (C-l) / P.S. Baenziger, W.K. Russell, G.L. Graef, B.T. Campbell // Crop Sci. - 2006. - № 46. - P. 2230-2244.

127. Barocka К. H. Die Sektion Corollinae der Gattung Beta (Tournef.) / К. H. Barocka // L.Z. Pflanzenzuchtung. -1966. - 56. - P. 376-388.

128. Barzen E. An extended map of the sugar beet genome containing RFLP and RAPD loci / E. Barzen, W.Mechellce, E.Pitter, E.Schulte-Kappert, F.Salamini // Theor. and Appl. genet. - 1995. - 90. - P. 189-193.

129. Barzen E. Development of coupling-repulsion-phase SCAR markers diagnostic for the sugar beet Rrl allele conferring resistance to rhizomania /

E. Barzen, R. Stahl, E. Fuchs, D.C. Borchardt, F. Salamini // Molecular Breeding. - 1997. -№ 3.-P. 231-238.

130. Brummer E. C. Analysis of annual Medicago species using RAPD markers / E. C. Brummer, J. H. Bouton, G. Kochert // Genome. - 1995. -№38.-P. 362-367.

131. Chomczynski P. Single-Step Metod of RNA Isolation by Acid Guani-dinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987.-V. 162.-P. 156-159.

132. Coons G. H. Interspecific hybrids between Beta vulgaris L. and the wild species of Beta. / G. H. Coons // J. Amer. Soc. Sugar Beet Technol. -1975. -№ 18. - P. 281-306.

133. Cureton A.N. Development of simple sequence repeat (SSR) markers for the assessment of gene flow between sea beet (Beta vulgaris ssp. maritima) populations / A.N. Cureton, M. J. Burns, B.V. Ford-Lloyd, H. J. Newbury // Mol. Ecol. Notes. - 2002. - 2. - P. 402-403.

134. Desel C. Painting of Parental Chromatin in Beta Hybrids by Multicolor Fluorescent in situ Hibridization / C. Desel, R. Jansen, G. Dedong, T. Schmidt // Annals of Botany. - 2002. - V.89. - P. 171-181.

135. Desplanque B. Genetic diversity and gene flow between wild, cultivated and weedy forms of Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae), assessed by RFLP and microsatellite markers / B. Desplanque, P. Boudry, K. Broom-berg, P. Saumitou-Laprade, J. Cuguen, H. Van Dijk // Theor. Appl. Genet. -1999.-№98.-P. 1194-1201.

136. Fang X. Construction of a binary BAC library for an apomictic mono-somic addition line of Beta corolliflora in sugar beet and identification of the clones derived from the alien chromosome /X. Fang , S. Gu , Z. Xu , F. Chen , D. Guo , H.B. Zhang, N. Wu // Theor. Appl. Genet. - 2004. - № 8. -P. 420- 425.

137. Ford-Lloyd B. V. The Use of RAPD for the Identification of Sugar Beet Varieties / B. V. Ford-Lloyd, M. Munthali, H.G. Newbury //Journal of Sugar Beet Research/ - 1993.-V.96, № 4.- P.291-298.

138. Frese L. 2001. Potential of genetic resources and breeding strategies for base-broadening in Beta. L. / Frese, H. D. Cooper, C. Spillane, T. Hodgkin // Broadening the genetic base of crop production. - Rome, 2001. - P. 295-309.

139. Gärtner T. Improved Heterosis Prediction by Combining Information on DNA- and Metabolic Markers / Tanja Gärtner, Matthias Steinfath, Sandra Andorf, Jan Lisec, Rhonda C. Meyer, Thomas Altmann, Lothar Will-mitzer, Joachim Selbig //PLoS One. - 4 (4). -2009.

140. Gamburg O.L. Culture methods and defection of glucanases in cultures of wheat and barley / O. L. Gamburg, D. E. Eveleigh // Canad. J. Bio-chem. - 1968. - V. 46, № 5. - P. 417-421.

141. Gao D. Molecular characterization and chromosomal distribution of species-specific repetitive DNA sequences from Beta corolliflora, a wild relative of sugar beet/ D. Gao , T . Schmidt, C . Jung // Genome. - 2000. -№43(6).-P. 1073-1080.

142. Gao D. Monosomie addition lines of Beta corolliflora Zoss. in sugar beet: cytological and molecular-marker analysis / D. Gao, D. Guo and C. Jung // TAG Theoretical and Applied Genetics. - 2001. - V.103, № 2-3. -P. 240-247.

143. Gao, D. Monosomie addition lines of Beta corolliflora in sugar beet: plant morphology and leaf spot resistance. / D. Gao, C. Jung // Plant Breeding.-2002. - 121.-P. 81-86.

144. Ge Y. GISH and BAC-FISH study of apomictic Beta M14 / Y. Ge, G. He, Z. Wang, D. Guo, R. Qin , R. Li // Sei. China C. Life. Sei. - 2007.- № 50 (2). - P. 242-250.

145. Germeier C.U. The international Database of Beta - an expert system

for Beta genetic resources / C.U. Germeier, L. Frese // Proceedings of the 64

113

th Congress, Institut International de Recherches Betteravieres, June 2001. -Bruges, 2001.-P. 123 - 132.

146. Gindullis F. The Large-Scale Organization of the Centromeric Region in Beta Species / F. Gindullis, C. Desel, I. Galasso, T. Schmidt 11 Genom Research. -2001.-V. 11.-P. 253-265.

147. Harrison, G.E. Centromeric repetitive DNA sequences in the genus Brassica / G.E. Harrison, J.S. Heslop-Harrison // Theor. Appl. Genet. -1995.-90.-P. 157-165.

148. Jassem B. Embryology and genetics of apomixis in the section Corol-linae of the genus Beta / B. Jassem // Acta. Biol. Cracovensia. Ser. Botanica.

- 1976.-V.19.-P. 151-172.

149. Jung Electrophoretic investigalions on nematode resistant sugar beets / Jung, Wehling, Zoplien // Plant Breed. (8 riicher Z. Pflanzenzucht). - 1986.

- 97, № l.-P. 39-45.

150. Jung C. Phylogenetic relationships between cultivated and wild species in the genus Beta revealed by DNA 'fingerprinting 7 C. Jung, K. Pillen, L. Frese, S. Fahr, A. E. Melchinger // Theor. Appl. Genet. - 1993. - 86. - P. 449-457.

151. Kamm A. Analysis of a repetitive DNA family from Arabidopsis arenosa and relationships between Arabidopsis species / A. Kamm, I. Galasso, T. Schmidt, J.S. Heslop-Harrison//Plant Mol. Biol. - 1995.-№ 27. -P. 853-862.

152. King K. Differential homogenization and amplification of two satellite DNAs in the genus Cucurbita / K. King, J. Jobst, V. Hemleben // J. Mol. Evol. -1995. - 41. - P. 996-1005.

153. Kubis S. Repetitive DNA as a major component of plant genomes / S. Kubis, T. Schmidt, J.S. Heslop-Harrison // Annals of Botany (Suppl.). -1998.- 82.-P. 45-55.

154. Liu L. Idiogram analysis of Beta vulgaris L. and Beta corolliflora Zoss. and the offspring of hybrid. / L. Liu, D. Gao, Y. Li, S. Jia, D.Guo // Sugar Crops of China. - 1996. - № 3. - P. 1-5.

155. Martin, C. The use of RAPD markers to facilitate the identification of Oryza species within a germplasm collection / C. Martin, A. Juliano, H. J. Newbury, B. - R. Lu, M. T. Jackson, B. V. Ford-Lloyd // Genet. Res. Crop. Evol. - 1997. - 44. - P. 175-183.

156. Messeguer R. High resolution RFLP map around the root knot nematode resistance gene (Mi) in tomat / R. Messeguer, M. Ganal, M.C. de Vicente, N.D. Young, H. Bolkan, S. D. Tanksley // Theor Appl Genet. - 1991 -№82.-P. 529-536.

157. Millan T. Using RAPDs to study phylogenetic relationships in Rosa / T. Millan, F. Osuna, S. Cobos, A. M. Torres //Theor. Appl. Genet. - 1996. - 92.-P. 273-277.

158. Moose S. P. Molecular Plant Breeding as the Foundation for 21st Century Crop Improvement / S. P. Moose R., H. Mumm // Plant Physiol. -2008. -V. 147. - P. 969-977.

159. Morchen M. Abundance and length polymorphism of microsatellite repeats in Beta vulgaris L. / M. Morchen, J. Cuguen, G. Michaelis, C. Hanni, P. Saumitou-Laprade // Theor. Appl. Genet. - 1996. - 92. - P. 326-333.

160. Pochlman J.M. Inhorilanco of carlinness in crosses between Eariy Premium and Kawvale verieties of common wheat / J.M. Pochlman // Mis-suri Agric. Exp. Sta. Columbia. Res. Buii. - 1949. - № 430. - 24 p.

161. Raybold A.F. The genetic structure of Beta vulgaris ssp. maritima (sea beet) populations: RFLPs and isozyimes show diiferent patterns of gene flow / A.F.Raybold, RJ, Mogg, R.T. Clarke // Heredity. - 1996. -V. 77, part. 3.-P. 245 -250.

162. Reamon-Buttner, S. M. Interspecific relationship and genetic diversity in wild beets in section Corollinae genus Beta: isozyme and RAPD analyses

/ S. M. Reamon-Buttner, G. Wricke, L. Frese // Genet. Res. Crop. Evol. -1996.-43.-P. 261-274.

163. Redtearr M. Instint. rech. bettera viems / M. Redtearr, M. J. Asher // Bruxelles, 1997. - P. 545.

164. Richards C.M. Polymorphic microsatellite markers for inferring diversity in wild and domesticated sugar beet (Beta vulgaris) / C. M. Richards, M. Brownson, S. E. Mitchell, S. Kresovich, L. Panella //Mol. Ecol. Notes.

- 2004. - № 4. - P. 243-245.

165. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biologi. - 1985. - V. 5. - P. 69-67.

166. Rogowsky P. M. The R173 family of rye-specific repetitive DNA sequences: a structural analysis // P. M. Rogowsky, S. Manning, J.- Y. Liu e. a. // Genome. - 1991. - № 34. - P. 88-95.

167. Schmidt T. Distribution and evolution of two satellite DNAs in the genus Beta / T. Schmidt, C. Jung, M. Metzlaff // Theor. Appl. Genet. -1991.

- 82.-793-799.

168. Schmidt T. Variability and evolution of highly repeated DNA sequences in the genus Beta / T. Schmidt, J. S. Heslop-Harrison // Genome. -1993.-36.-P. 1074-1079.

169. Schondelmaier J. Integration of APLP markers in to a linkage map of sugar beet (Beta vulgaris L.) / J. Schondehnaier, G. Steinrucken, C. Jung // Plant Breed. - 1996.- 115.-P. 231-237.

170. Schulte D. A complete physical map of a wild beet (Beta procum-bens) translocation in sugar beet / D. Schulte, D. Cai, M. Kleine, L. Fan, S.Wang, C. Jung // Mol. Genet Genomics. - 275 (5). - 2006. - P. 504-511.

171. Schweizer G. Molecular analysis of highly repeated genome fractions in Solarium and their use as markers for the characterization of species and cultivars/ G. Schweizer, N. Borisjuk, L. Borisjuk, M. Stadler, T. Stelzer, L. Schilde, V. Hemleben //Theor. Appl. Genet. - 1993. - 85. - P. 801 - 808.

172. Shen Y. Ford-Lloyd The taxonomic characterisation of annual Beta germplasm in a genetic resources collection using molecular markers / Y. Shen, H. J. Newbury, B. V. Euphytica. - 1996. -№ 91. - P. 205-212.

173. Skoog F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / F. Skoog, C.O. Miller //Sympos. Soc. Exp. Biol. - 1957.-V. 11, №2.-P. 118.

174. Smed E. Genetical controland lineage relationships of isozyme markers in sugar beet (Beta vulgaris L.) / E. Smed, J. P. C. Van Geyt, M. Oleo // Isozitratedehydrogenase adenilate kinase, phospoglucomutase, glucose phosphate isomerase and cathodal peroxidase // Theor. and Appl. Genet. -1989.-V. 78, № l.-P. 97-104.

175. Uphoff H. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in sugar beet (Beta vulgaris L.): mapping the genes for nematode resistance and hypocotyls colour / H. Uphoff, G. Wricke / Plant Breed. -1992. -Vol. 109. -P.168-171.

176. Van der Knaap E. Extremely elongated tomato fruit controlled by four quantitative trait loci with epistatic interactions/ E. Van der Knaap, Z.B. Lippman, S.D. Tanksley // Theor. and Appl. Genet. -2002. - 104. - P. 241247.

177. Van Geyt G. P.C. Natural variation within the genus Beta and its possible use for breeding sugar beet: a review / G. P.C. Van Geyt, W. Lange, M. Oleo, Th. S. De Bock // Euphytica. - 1990. - № 49. - P. 57-76.

178. Viard F. Crop-weed interactions in the Beta vulgaris complex at a local scale: allelic diversity and gene flow within sugar beet fields / F. Viard, J. Bernard, B. Desplanque // Theor. and Appl. Genet. - 2002. - 104. - P. 688-697.

179. Virk P. S. Use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections / P. S. Virk, B. V. Ford-Lloyd, M. T. Jackson, H. J. Newbury // Heredity. - 1995. - № 74. - P. 170-179.

180. Wet J.M.J. De Counterfeit Hybrids between Tripsacum and Zea (Gramineae) / J. M. J. de Wet, C. A. Newell and D. E. Brink //American Journal of Botany. - 1984. -V. 71, № 2. - P. 245-251.

181. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.7213-7218.

182. Williams J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.L. Livak, J.A. Rafalscki, S.V. Tingly // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18 - P. 65136535.

183. Xiao J. Genetic diversity and its relationship to hybrid performance and heterosis in rice as revealed by PCR-based markers / Xiao J., Li J., Yuan L. et. all // Theoretical and Applied Genetics. - 1996. - V. 92, №6. -P. 637- 643.

184. Yong-Il Cho Key DNA Markers for Predicting Heterosis in Fi Hibrids of japonica Rise / Yong-Il Cho, Chan-Woong Park, Soon-Wook Kwon, Joong-Hyun Chin, Hyeon-So Ji, Ki-Jin Park, Susan McCouch, Hee-Jong Koh // Breeding Scince. - 1996. - V. 54, № 4. - P. 389-397.

185. Yulong Shen Genetic relationships within the genus Beta etermined using both PCR-based marker and DNA sequencing techniques / Yulong Shen, Brian V Ford-lloyd, and H JohnNewbury // Heredity. - 1998. - 80. -P. 624-632.

186. Zhou C. The effect of crossbreeding crops / C. Zhou, Z. Gong, Wang / Acta genet, sinika. - 1979. - V.6, № 4. - P. 405-413.

187. Zhou C. Induced of haploid rice plantlets by ovary culture / C.Zhou, H. Y. JangH. //Plant Sci.-1981, V. 20.-P. 231-237.

188. Zhu H. Comparative proteomic analysis of apomictic monosomic addition line of Beta corolliflora and Beta vulgaris L. in sugar beet / H. Zhu , Y.D. Bi , L.J. Yu , D.D. Guo , B.C. Wang //Mol. Biol. Rep. - 2009.- № 36 (8). - P. 2093-2098.

189. Zhy Z.C. Development of embryoids from unpollinated Nicotiana ovaries cultured in vitro / Z.C. Zhy, Z.Y. Liu, H.S. Wu // Acta Botanica Sinica. - 1981, V. 23. - P. 499-501.

У

/А и

Российская академия сельскохозяйственных наук

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ САХАРНОЙ СВЁКЛЫ ИМ. А. Л. МАЗЛУМОВА

396030, ВНИИСС Воронежской области, тел./факс [phone] Электронная почта: [e-mail]

№ 6 $ от «20» марта 2012 года

СПРАВКА

Выдана Богачевой Наталии Николаевне в том, что при выполнении диссертационной работы по теме «Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров» ею впервые разработаны методы подбора родительских пар для скрещиваний по белковым маркерам и на основе анализа геномной ДНК, а так же метод идентификации селекционных материалов сахарной свёклы по КАРБ-маркерам. Создан биохимический паспорт 21 селекционного материала сахарной свёклы на основе КАРБ-анализа.

Директор ГНУ Ц

Заведующий лгрораториеи селекц сахарной свеклщца ЦМС оспо.ве| доктор с.-х. нау:

Апасов И.В.

Ошевнев В. П.

Российской Федерации !

Министерство сельского хозяйства федеральное государственное бюджетное ооразовательное учреждение высшего профессионального образования _ «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I» (ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ) 394087 г. Воронеж, ул. Мичурина, 1

№

Справка

ФГБОУ ВПО Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I подтверждает, что материалы разработок исследований, изложенных в кандидатской диссертации Богачевой H.H. на тему «Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свеклы с использованием молекулярных маркеров», используются при проведении лекций и лабораторно-практических занятий со студентами по курсам «Генетика», «Селекция сельскохозяйственных культур», «Биология», «Сельскохозяйственная биотехнология».

Проректор по научной

профессор, доктор с.-х. Ш§Ш справок ШШЮ (У A.B. Дедов

Х- '-тУ®* * »VB * Й'