Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Попова, Анастасия Геннадьевна

• Попова, Анастасия Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попова, Анастасия Геннадьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ ^

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирусные заболевания культивируемых видов рыб

2.1.1. Семейство Rhabdoviridae

2.1.1.1. Структура рабдовирусов

2.1.1.2. Особенности генома рабдовирусов рыб

2.1.2. Некоторые заболевания культивируемых видов рыб, вызываемые рабдовирусами

2.1.2.1 Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ)

2.1.2.2. Вирусная геморрагическая септицимия (ВГС)

- 2.1.2.3. Весенняя виремия карпа (ВВК)

2.1.3 Методы профилактики и лечения вирусных заболеваний рыб

2.2. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб

2.2.1. Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре

2.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот

2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и молекулярно-генетический анализ * 25 2.2.3.1. Новейшие модификации метода ПЦР в диагностике вирусных инфекций рыб '

2.2.3.1.1. Мультиплексная ПЦР

2.2.3.1.2 ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)

2.3. Генетическое типирование и филогенетический анализ рабдовирусов рыб

2.3.1. Вирус геморрагической септицимии

2.3.2. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани

2.3.3. Вирус весенней виремии карпа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот»

История аквакультуры насчитывает тысячи лет, беря свое начало в государствах Древнего Востока. Однако за последние 20-25 лет в ее развитии произошли революционные изменения, вызванные истощением биологических ресурсов океана и континентальных пресных вод, издавна служивших человеку источником высокоценных пищевых продуктов. Будучи сегодня самым перспективным и быстрорастущим сектором сферы производства продуктов питания, аквакультура все больше замещает промышленный промысел гидробионтов в дикой природе. Серьезным препятствием на пути успешного развития аквакультуры являются болезни объектов культивирования, при этом основной ущерб наносят вирусные инфекции рыб. Несмотря на то, что современная ихтиовирусология - сравнительно молодая наука, уже обнаружено около 350 вирусов гидробионтов. Список открываемых вирусов, как правило, пополняется после введения в аквакультуру новых объектов разведения (Щелкунов И. С., 2006).

Рабдовирусы составляют группу особо значимых вирусных патогенов культивируемых видов рыб. Наиболее интенсивно изучались вирусы, инфицирующие лососевые породы, такие как вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) и вирусной геморрагической септицемки (VHSV), так как именно эти патогены имеют наибольшее экономическое значение для мирового производства рыбы. В России, наряду с инфекционным некрозом гемопоэтцческой ткани лососевых, весьма масштабной проблемой является весенняя виремия карпа (ВВК), вызываемая вирусом SVCV.

В последнее время большое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетической диагностики вирусных инфекций рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти методы обладают рядом очевидных достоинств, среди которых быстрота получения результата, высокая чувствительность и специфичность, возможность осуществления генетического типирования изолятов.

Для создания эффективной системы ПЦР-диагностики очень важны данные по изменчивости геномов патогенных штаммов вируса, выделенных от хозяев из разных географических областей. Эти данные необходимы для создания тест-систем, способных различать генетические варианты вируса и, тем самым, прослеживать пути распространения инфекции.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования было создание эффективных диагностических тест-систем на вирусы SVC и JHN на основе методов ПЦР и молекулярной гибридизации, изучение генетического разнообразия данных патогенов, а также разработка методов их генотипирования с помощью молекулярно-биологических методов.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Разработка метода ОТ-пгПЦР для выявления вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых.

2. Конструирование зондов и создание системы детекции IHNV с помощью гибридизационного анализа.

3. Определение чувствительности и специфичности разработанных методов идентификации SVCV и IHNV в зараженной культуре клеток и в клиническом материале от инфицированных рыб.

4. Разработка способов генетического типирования штаммов SVCV и IHNV на основании методов ПЦР и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

5. Филогенетический анализ штаммов SVCV и IHNV на основе данных о нуклеотидной последовательности участков генов нуклеопротеина.

Положения, выносимые на защиту

1. Системы ОТ-пгПЦР-диагностики на вирусы весенней виремии карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) позволяющие выявлять вирусную РНК с высокой .чувствительностью и специфичностью в препаратах культуральных вирусов и в клиническом материале от больных рыб.

2. Способ генотипирования рабдовирусов рыб с помощью ПДРФ-анализа. Все исследуемые изоляты SVCV образуют пять генетических групп. Исследованные изоляты IHNV принадлежат к трем основным геногруппам (U, М и L).

3. Филогенетическое исследование участков гена нуклеопротеина для восемнадцати изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV. Изоляты SVCV образуют генетические группы в зависимости от географии их выделения. Камчатский изолят IHNV генетически близок североамериканским изолятам геногруппы U, а изоляты, выделенные в подмосковном регионе, образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы U.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проделанной работы на основе методов полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот впервые созданы тест-системы для идентификации РНК вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани в инфицированных культурах клеток, в органах и тканях рыб. Разработаны методы генетического типирования изолятов указанных патогенов с помощью ПЦР и ПДРФ-анализа. Впервые проведен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для 12 российских и 6 европейских изолятов SVCV и показано их различие на генетическом уровне. Также выполнен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для изолятов IHNV. Проведено сравнение изолятов, выделенных из естественных водоемов Камчатки и из форелевых рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей с изолятами, распространенными на Тихоокеанском побережье Северной Америки.

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес для практического рыбоводства, так как позволяют специфично, с высокой чувствительностью и в короткие сроки выявлять патогены, вызывающие наиболее опасные заболевания разводимых видов рыб (карповых" и лососевых). Знание эпизоотической обстановки как в естественных водоемах, так и на рыбоводных заводах и хозяйствах позволяет оценивать риск распространения опасных вирусных агентов среди разводимой рыбы, и, как следствие, избегать существенных экономических потерь. Информация, полученная с помощью разработанных методов генотипирования SVCV и IHNV, поможет проследить перемещение генетических вариантов вирусов, как в России, так и за рубежом при перевозке икры и живой рыбы для воспроизводства, что позволит своевременно и эффективно осуществлять соответствующие профилактические мероприятия.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации -опубликовано три статьи в реферируемых научных журналах и одна в книге «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Полученные результаты были пpeдcfaвлeны на трех международных конференциях: Second United States and Russia Bilateral Conference "Aquatic&Marine Animal Health" (Shepherdstown, West Virginia, USA, 2003), 2-ой международной конференции (Москва, МГУ, 2004), международной научно-практической конференции

Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006).

Вклад автора

Выделение препаратов РНК вирусов, конструирование ДНК-зонда для IHNV на основе ДНК фага М13, мечение ДНК-зонда N-гидрок^исукцинимидным эфиром биотина, гибридизационный анализ, выравнивание последовательностей фрагментов N-генов SVCV и IHNV, поиск сайтов рестрикции, ПЦР-ПДРФ анализ всех изученных изолятов SVCV и IHNV выполнен автором самостоятельно. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводилось А.Г. Блиновым (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), И.В. Бабкиным и А.В. Качко (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, г. Новосибирск). Филогенетический анализ генетического разнообразия изолятов вирусов проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Попова, Анастасия Геннадьевна

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы ОТ-ПЦР и ОТ-пгПЦР диагностики вирусов весенней виремии "карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. Методы позволяют детектировать РНК вирусов в культуре клеток и в клиническом материале от зараженных рыб.

2. С помощью клонирования участка N-гена IHNV в однонитевой вектор М13тр8 сконструирован ДНК-зонд на вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани. Показана пригодность зонда для детекции IHNV и VHSV в культуре клеток.

3. Разработан метод генотипирования штаммов вируса весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых с помощью ПДРФ-анализа. Впервые проведено изучение, генотипического разнообразия двадцати четырех .изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV.

В рамках исследования:

• показано, что все исследуемые изоляты SVCV подразделяются на пять генетических групп. Европейские штаммы входят в состав одной большой геногруппы 1, а изоляты из бывшего СССР образуют одну большую геногруппу 5 и три небольшие группы — 2, 3 и 4.

• определена принадлежность 10 исследованных изолятов IHNV к трем основным геногруппам (U, М и L), выявлена принадлежность камчатских изолятов к геногруппе U, подтверждена принадлежность европейских к геногруппе М.

4. На основанйи нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые проведено филогенетическое исследование восемнадцати изолятов SVCV, принадлежащих к пяти геногруппам. Показано, что исследованные изоляты имеют тенденцию образовывать генетические группы в зависимости от географии их выделения. Филогенетический анализ подтвердил достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ, что дает основания рекомендовать эту более простую методику к использованию в диагностических лабораториях для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований.

5. В результате проведенного филогенетического анализа изолятов IHNV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента гена нуклеопротеина впервые обнаружено, что на территории'России наряду с камчатскими изолятами, генетически ,близкими североамериканским изолятам геногруппы U, в подмосковном регионе циркулируют штаммы, образующие отдельную подгруппу в составе геногруппы U, что указывает на их монофилетическое происхождение.

2.4. Заключение

Ресурсы рек, озёр, Морей и океанов не безграничны, и уловы ценной в пищевом отношении рыбы ежегодно снижаются. Таким образом, ускоренное развитие рыбоводства, позволяющего реально и в короткие сроки обеспечить население рыбой и её продукцией, становится все более актуальным.

Вирусные болезни разводимых видов гидробионтов, возникающие вследствие бурного развития аквакультуры, наносят большой ущерб этой отрасли. Наибольший урон для мирового производства рыбы наносят вирусы IHN и VHS, поражающие рыбу лососевых пород. В России, в странах бывшего СССР и Восточного блока основной вирусной болезнью рыб является весенняя виремия карпа, традиционного объекта выращивания в европейской аквакультуре.

В настоящее время не существует эффективных методов лечения вирусных заболеваний гидробионтов, поэтому на первое место выходит разработка методов профилактики возникновения эпизоотии, в том числе своевременная и быстрая диагностика вирусных инфекций. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб традиционно основаны на выделении вируса в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией в реакции нейтрализации со специфическими антителами (Amos, 1985). Однако эти методы требуют много времени и не позволяют дифференцировать генотипы вируса. Попытки преодолеть эти проблемы привели к созданию иммунологических тестов, таких как ELISA, иммунофлуоресцентный, иммуноферментный и радиоиммунный анализ. Данные методы обеспечивают быстрое получение результата, но, с другой стороны, они недостаточно чувствительны и специфичны, в частности, при идентификации рабдовирусов рыб (Dixon and Longshaw, 2005).

Новым этапом в совершенствовании методик, используемых для диагностики вирусных заболеваний гидробионтов, стало применеие для этих целей методов молекулярной биологии, основанных на гибридизации и полимеразной цепной реакции. Как видно из обзора литературы, в настоящее время такие методы разработаны для диагностики многих экономически значимых патогенов культивируемых рыб, моллюсков и ракообразных (Asche, 1996; Miller et al., 1998, Walker and Subasinghe, 2000). IHNV стал первым рабдовирусом рыб, для которого такой метод был разработан (Arakawa et al., 1990).

Необходимость изучения вариабельности геномов вирусных агентов, поражающих разводимые виды гидробионтов, продиктована тем, что эти патогены были обнаружены далеко за пределами прежних хорошо известных ареалов. Так, IHNV, широко распространенный в Северной Америке и встречавшийся в Японии, в 1987 г. был выявлен в Европе (Bovo et al., 1987), a VHSV, считавшийся исключительно европейским эндемиком, в 1988 г. был изолирован в США от идущих на нерест лососей (Meyers et al., 1999). Вирус весенней виремии карпа, традиционно являющегося объектом европейской аквакультуры, в 2002 г. был обнаружен на территории США (Goodwin, 2002), а в 2004 г. - в одном из северных регионов Китая (Liu et al., 2004). В связи с этим в мировой ихтиовирусологии появилось новое направление - молекулярная эпизоотология. Предметом ее исследования стало генетическое разнообразие и родство изолятов, базирующееся на особенностях изменчивости генома вируса. Из приведенных выше литературных данных видно, что это дало возможность устанавливать географию происхождения вирусных изолятов, отслеживать пути их перемещения и эволюцию вирусов. Рабдовирусам, как группе наиболее значимЬтх патогенов рыб, было уделено особое внимание, что отражено в литературном обзоре.

Успех генетического анализа вирусов VHS и IHN, а также первые попытки филогенетического анализа SVCV, описанные в литературе, подтверждают широкие возможности использования методов молекулярной биологии для генотипирования вирусных изолятов.

В связи с высоким риском распространения опасных вирусных болезней в аквакультуре необходимы новые более удобные, экономичные и чувствительные методы генотипирования вирусов. Это позволит оперативно отслеживать перемещение патогенных вирусных штаммов между континентами и внутри них и своевременно принимать необходимые меры профилактики и борьбы с болезнями.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1. Материалы

Реактивы:

В работе использованы реактивы следующих фирм:

1. "Sigma", США: ЭДТА, 2-р-меркаптоэтанол, агароза А9539, акриламид, метиленбисакриламид, поливинилпирралидон, глицин, MOPS, IPTG, найлоновые фильтры для гибридизации, размер пор 0,45 мкм, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, конъюгат стрептаведина со щелочной фосфотазой.

2. "Serva", ФРГ: бромистый этидий, бромфеноловый синий, SDS, ТЕМЕД, Tween-20;

3. "ICN Biomedicals", США - нитротетразолевый синий, 5-бром-З-индолил-фосфат;

4. "Fluka", Швейцария: дрожжевой экстракт, пептон;

5. "Difco", США: триптон, бакто-агар;

6. "Сибэнзим", г. Новосибирск, Россия: Y-Gal, буферы для эндонуклеаз рестрикции (1(B), 2(G), 4(W), 5(Y)), набор для проведения реакции обратной транскрипции (буфер, вода, 0,5 mM dNTP), набор для проведения ПЦР (буфер, вода, 0,5 тМ dNTP), ферменты (эндонуклеазы рестрикции Bsa29l, As'oMAI, Rsal, Fokl, Tru9l, Psil, Hindlll, Sfr21Al, Sail, BstNl, Bse II, Bsc4l, Hp all, Hgal, ДНК-лигаза фага T4, ДНК-полимераза Thermus aquaticus, обратная транскриптаза M-MuLV), маркеры молекулярного веса ДНК.

Все остальные реактивы были произведены в ВО "Реахим" и имели квалификацию "осч", "чда" и 'Ччм.

Олигонуклеотиды:

Олигонуклеотиды, использованные в данной работе, были синтезированы фосфонатным методом (Froechler et al., 1986) в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Горбуновым Ю.А.

Последовательности праймеров указаны в таблице 2. Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных в работе п/п Праймер Ориентация Последовательность Положение на геноме

1 IHNV2Rev прямой 5'-ACAGAACAAGCAGAACTATTT 111 - 131

2г IHNV1 обратный 5'-TTGATGAGAATGATCCCATAG 748 - 770

3 IHNV2 обратный 5'-GAAGAGGAGGCCGGTCAC 553 - 570

4 GSout прямой 5 '-AG AG АТСССТАС АСС AGAGAC 3507 - 3527

5 GSin прямой 5'-TCACCCTGCCAGACTCATTGG 3567 - 3587

6 GASin обратный 5 '-ATAGATGGAGCCTTTGTGCAT 4028 - 4049

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попова, Анастасия Геннадьевна, 2008 год

1. Адаричев В. А., Дымшиц Г. М., Калачиков С. М. Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование её флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации. // Биоорган. Химия. 1987. - Т. 13. - №8. -С. 1066-1069.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 101-102.

3. Найк Д. Вирусологоия. М.: Мир, 1989. С. 419-443.

4. Орешкова С. Ф., Тикунова Н. В., Щелкунов И. С., Щелкунова Т. И., Ильичёв А. А. Обнаружение вируса весенней виремии карпа гибридизацией с нерадиоактивными ДНК-зондами. //Молек. генет., микробиол. вирусол. 1996. - №2. - С. 22-25.

5. Рудакова С. Л. Некроз гемопоэтической ткани у производителей нерки и предполагаемые источники инфекции. // Вопросы рыболовства. — 2003. Т. 4. - №1 (13).1. С. 93-102.

6. Рудакова С.Л. Анализ развития эпизоотии, вызванной вирусом инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) у мальков нерки Oncorhynchus пегка при искусственном выращивании (Камчатка). // Вопр. рыбол. 2004. - Т. 5. - № 2 (18). - С. 362-374.

7. Херрингтон С., Манги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. -1999. С. 374, 395-402.

8. Щелкунов И. С., Орешкова С. Ф. Новые перспективы в диагностике вирусных болезней рыб: разработка тест-систем для выявления возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома. // Москва. 2006.

9. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Новосибирск, Издательтво новосибирского университета, 1994. Т. 1. С. 138-150.

10. Ahne W., Bjorklund H.V., Essbauer S., Fijan N., Kurath G., Winton J.R. Spring Viremia of Carp (SVC). // Deseases of aquatic organisms. 2002. - N10. - P. 261-272.

11. Ahne W., Kurath G., Winton J. R. A ribonuclease protection assay can distinguish spring viremia of carp virus from pike fry rhabdovirus. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1998. - V. 18. -P.220-224.

12. Amos К. H. Procedures for the detection and identification of certain fish pathogens. // 3-rd Ed. 1985,- Corvallis, Oregon.

13. Asche V. Recent advances in microbiology. // The Australian Society for Microbiology Inc. -1996.-P. 41-55.

14. Ball L. A., Pringle C. R., Flangan В., Perepelitsa V. P., Wertz G. W. Phenotypic Consequences of Rearranging the P, M, and G Genes of Vesicular Stomatitis Virus. // J. Virology. 1999. - June. - P. 4705-4712.

15. Basurco В., Vende P., Monnier A. F., Winton J. R., de Kinkelin P., Benmansour A. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV). // Vet Res. 1995. - V. 26. - P. 460-463

16. Benmansour A, de Kinkelin P. Live fish vaccines: history and perspectives. // Dev Biol Stand. 1997. -V. 90. - P. 279-289.

17. Bernard J., Bremont M. Molecular biology of fish viruses: a review. // Vet. Res. 1995. - V. 26.-P. 341-351.'

18. Bernard J., Bremont M., Winton J. Nucleocapsid gene sequence of a North American isolate of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus. // J. Gen. Virol. 1992. — V. 77 — P.1011-1014.

19. Bernard J., Lecocq-Xhonneux F., Rossius M., Thiry M.E., de Kinkelin P. Cloning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral haemorrhagic septicaemia virus. // J. Gen. Virol.- 1990.-V.71-P. 1669-1674.

20. Bjorklund H.V., Emmenegger E. J., Kurath G. Comparison of the polymerase (L genes) of spring virmia of carp virus and infectious hematopoetic necrosis virus. // Vet Res. 1995. - V.26.-P. 394-398.

21. Bovo G., Gioggetti G., Jorgensen P. E. V., OlsenN. J. Infectious haematopoietic necrosis: first detection in Italy. // Bui. Eur. Ass. Fish Pathol. 1987. - V.7. - P. 124.т

22. Bruchhof В., Marquardt O., Enzmann P.-J. Differential diagnosis of fish pathogenic rhabdoviruses by reverse transcriptase-dependent polymerase chain reaction. // J.Virol. Methods.- 1995.-V.55.-P. 111-119.

23. Brown L.L., Sperker S.A., Clouthier S., Thornton J.C. Development of a vaccine against infectious salmon anemia virus. // 9th International Conference "Diseases of fish and Shellfish".- 1999. Rhodes, Greece. - Abstract book. - P. 258.

24. Christie K.E. Immunization with viral antigens: infectious pancreatic necrosis. // Dev.Biol.Stand. 1997. -V. 90. - P. 191-199.

25. Chou P. P., Drolet B. S., Leong J. C. Polimerase chain amplification of infectious hematopoetic necrosis virus RNA extracted from fixed and embadded fish tissue. // Journal of Aquatic Animal Health. 1995. - V. 7. - P. 9-15.

26. Chico V., Gomez N., Estepa A., Perez L. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR. // Journal of Virological Methods. 2006. - V. 132. - P. 154-159.

27. Chomczynski P.; Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. - V.162. - P. 156-159.

28. Cupit P.M., Lorenzen N., Strachan G., Kemp G.J.L., Secombes C.J., Cunningham C. Neutralisation and binding of VHS virus by monovalent antibody fragments. // Virus Research. -2001.-V. 81.-P. 47-56.

29. De Kinkelin'P., Bearzotti M., Castric J., Nougayrede P., Lecocq-Xhonneux F., Thiry M. Eighteen years of vaccination against viral haemorrhagic septicaemia in France. // Vet Res. — 1995.-N. 26(5-6).-P. 379-387.

30. Deering R. E., Arakawa С. K., Oshima К. H., O'Hara P. J., Landolt M. L., Winton J. R. Development of a biotinilated DNA probe and identification of infectious hematopoetic necrosis virus. // Dis. Aquat. Org. 1991. - V. 11. P. - 57-65.

31. Dixon P. F., Longshaw C.B. Assessment of commercial test kits for identification of spring viraemia of carp virus. // Dis. Aquat. Org. 2005. - V.67.- P. 25-29.

32. Dixon P. Immunization with viral antigens: viral diseases of carp and catfish. // Dev Biol Stand. 1997. - V. 90. - P. 221-32.

33. DNA-based molecular diagnostic techniques. Research needs for standardization and validation of the detection of aquatic animal pathogens and diseases // FAO Fisheries Technical Paper. 1999. - V. 395. - P. 1-3.

34. Einer-Jensen, K., Bjorklund, H., Oreshkova, S., Shchelkunov, I., Vesely, Т., Lorenzen, N. Detection and typing offish viruses. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 2002. - V.22. - P. 158-165.

35. Einer-Jensen K., Ahrens P., Forsberg R., Lorenzen N. Evolution of the fish rhabdovirus viralhaemorrhagic septicaemia virus. // Journal of General Virology. — 2004. — V. 85. P. 1167— 1179.

36. Einer-Jensen K., Winton J., Lorenzen N. Genotyping of the fish rhabdovirus, viral haemorrhagic septicaemia virus, by restriction fragment length polymorphisms. // Veterinary Microbiology. 2005. - V. 106. - P. 167-178.

37. Emmenegger R. J., Meyers T. R., Burton Т. O., Kurath, G. Genetic diversity and epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus in Alaska. // Dis Aquat Org. 2000. — V. 40.-P. 163-176.

38. Enzmann P. J., Kurath G., Fichtner D., Bergmann S. M. Infectious hematopoietic necrosis virus: monophyletic origin of European isolates from North American genogroup M. // Dis. Aquat. Organ. 2005. - V.*66(3). - P. 187-95.

39. Estepa A., De Bias C., Ponz F., Coll J. M. Detection of trout hemorrhagic septicemia rhabdovirus by capture with monocldnal antibodies and amplification with PCR. // Vet. Res. -1995.-V. 26. -P. 530-532.

40. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 783-791.

41. Fichtner D., Bergmann S., Enzmann P. J., Weiland F., Granzow H. Characterization of viral haemorrhagic septicemia (VHS) virus isolates. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1998. - V. 18. - P. 56-61.

42. Fijan N., Petrinec Z., Sulimanovic D., Zwillenberg L.O. Isolation of the viral causative agent from the acute form of infectious dropsy of carp. // Vet. Arh. 1971.-V. 41.-P. 125-138.

43. Fijan N. Spring Viraemia of carp,and other viral disaeses and agents of warm-water fish. // In: Fish Diseases and Disorders. V. 3; Viral, Bacterial and Fungal infections, Woo P.T.K. & Bruno D.W., eds. CABI Publishing, UK. 1999. - P. 177-244.

44. Froehler B.C., Ny P. G. , Mattencci M. D. Synthesis of DNA via deoxinucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acds Res. 1986. - V. 14. - P. 5399-5407.

45. Garver K.A., Troyer R.M., Kurath G. Two distinct phylogenetic clades of infectious hematopoietic necrosis virus overlap within the Columbia river basin. // Dis. Aquat. Org. 2003. -V. 55.-P.187-203.

46. Goldberg T.L., Coleman D.A., Grant E.C., Inendino K.R., Philipp D.P. Strain variation in an emerging iridovirus of warm-water fishes. // J.Virol. 2003. - V. 77.- P. 8812-8818.

47. Goodwin A.E. Spring Viraemia of Carp Virus in North America. // 5th international symposium for viruses of lower vertebrates. Seattle, Washington. - 2002. - Abstract book. - P. 6.

48. Gudding R., A. Lillehaug, O. Evensen. Recent developments in fish vaccinology. // Vet. Immunology & Immunopathology. 1999. - V. 72. - N. 12. - P. 203-212.

49. Heistinger H., Behm D., Janacek R. Experiences in oral vaccination of carp against spring viremia of carp. // 3th international Symposium on fish vaccinology. Bergen, Norway. - 2003. -Abstract book. - P.73.

50. Hoffmann В., Schutze II., Mettenleiter T.C. Determination of the complete genomic sequence and analisis of the gene products of the virus of Spring Viremia of Carp, a fish rhabdovirus. // Virus Research. 2002. - V. 84. - P. 89-100.

51. Hoffmann В., Schutze H:, Mettenleiter T.C. Determination of the complete genomic sequence and analisis of the gene products of the virus of Spring Viremia of Carp, a fish rhabdovirus. // Virus Research. 2002. - V. 84. - P. 89-100.

52. Hsu Y. L., Engelking H. M., Leong J. C. Occurrence of different types of infectious hematopoietic necrosis virus in fish. // Appl Environ Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 1353— 1361.

53. Jensen, M. H. Research on the virus of Egtved disease. // Ann NY Acad Sci. 1965. - V. 126.-P. 422-426.

54. Jorgensen P. E. V., Olsen N. J., Ahne Lorenzen N. SVC and PFR viruses serological examination of 22 isolates identicates close relationship between the two rhabdoviruses. // Viruses of Lower Vertebrates, Spring Verlag. Heidelberg. 1989. - P. 349-366.

55. Koutna M., Vesely Т., Psikal I., Hulova J. Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR. // Dis Aquat Org. 2003. - V. 55(3). - P. 229235.

56. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. // Briefings in Bioinformatics. 2004. - V. 5. — P. 150-163.

57. Kurath G., Higman К. H., Bjorklund H. V. The NV genes of fish rhabdoviruses: development of RNase protection assays for rapid assessment of genetic variation. // Vet Res. -1995. V. 26. - P. 477-485

58. Kurath G., Garver K.A, Troyer R.M., Emmenegger E.J., Einer-Jensen K., Anderson E.D. Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America. // J. Gen. Virol. -2003.-V. 84.-P. 803-814.

59. Leong J.C, Bootland L., Anderson E. et al. Viral vaccine for aquaculture. // J. Marine Biotechnology. -1995. V. 3. - P. 16-23.

60. Leong J. C., Hsu Y. L., H. Engelking M., Mulcahy D. Strains of infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus may be identified by structural protein differences. // Dev. Biol. Stand. -1981.-V. 49.-P. 43-55.

61. Liu H, Gao L, Shi X, Gu T, Jiang Y & Chen H (2004). Isolation of spring viraemia of carp virus (SVCV) from cultured koi (Cyprinus carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio carpio) in P.R. China. // Bull. EAFP. 2004. - V.24. - P. 194-202.

62. Liljeqvist S., Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. // J. Bacteriology. — 1999. V. 73. - P. 1-33.

63. Lorenzen N, Lorenzen E, Einer-Jensen K. Immunity to viral hemorrhagic septicemia (VHS) following DNA vaccination of rainbow trout at an early life-stage. // Fish Shellfish Immunol. -2001.-V.l 1(7). P. 585-591.

64. Maxam A. M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. - V. 65. - P. 499.

65. Meyers T. R., Short S., Lipson K. Isolation of the North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) associated with epizootic mortality in two new host species of Alaskan marine fish. // Dis. Aquat. Org. 1999. - V. 38. - P. 81-86.

66. Messing J., Vieira J. A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand of double-digest restriction fragments. // Gene. 1982. - V. 19. - P. 269-276.

67. Nadin-Davis S. A. Polimerase chain reaction protocols for rabies virus discrimination. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 75. - P. 1-8.

68. Nichol S. Т., Rowe J. E., Winton, J. R. Molecular epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein genes of infectious hematopoietic necrosis virus, a fish rhabdovirus. // Virus Res. -Л995. V. 38. - P. 159-173.

69. Nunam, L.M., Tang-Nelson, K., Lightner, D.V. Real-time RT-PCR determination of viral copy number in Penaeus vannamei experimentally infected with Taura syndrome virus. // Aquaculture. 20*04. - V. 229. - P. 1-10.

70. Oshima К. H., Higmafi К. Н., Arakawa С. К. Genetic comparison of viral haemorrhagic septicemia virus isolated from North America and Europe. // Dis. Aquat. Org. 1993. - V. 17. -P. 73-80.

71. Oshima К. H., Arakawa С. K., Higman К. H., Landolt M. L., Nichol S. Т., Winton J. R. The genetic diversity and epizootiology of infectious hematopoietic necrosis virus. // Virus Res. -1995.-V. 35.-P. 123-141.

72. Overturf K., LaPatra S.E., Powell M. Real-time PCR for the detection and quantitative analysis of IHNV in salmonids. // J. Fish Dis. 2001. - V. 24. - P. 325-333.

73. Poinan A., Gomes A., Oliveira R., Silva J. Migration of vesicular stomatitis virus glycoprotein to the nucleus of infected cells. // Biochemistry. 1996. - V. 93. - P. 8268-8273.

74. Roy P., Gupta K.C., Kiuchi A. Characterisation of .spring viremia of carp virus mRNA species and the 3'sequence of the viral RNA. // Virus Res. 1984. - V.l. - P. 189-202.

75. Rudakova S.L., Kurath G., Bochkova E.V. Occurrence and genetic typing of infectious hematopoietic necrosis virus in Kamchatka, Russia // Dis Aquat Org. 2007 - V.75. - P. 1-11.

76. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. - V. 4. - P. 40-425.

77. Schutze H., Enzmann P. J., Kuchling R., Mundt E., Niemann H., Mettenleitter Т. C. Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious hematopoetic necrosis virus. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2519-2527.

78. Scherba G., Jin L., Schitzlein W. H., Vodkin M. H. Differential polimerase chain reaction for detection of wild-type and a vaccine strain of Aujeszky's disease (pseudorabies) virus. // J. Virol. Methods. 1992. - V. 32. - P. 131-143.

79. Shchelkunov I. S. Report on results of FAO consultancy mission in Iraq aimed at identification and control of an acute epizootic in fish cultured in the national inland aquaculture, TEMP/INT/859/MSC. // Rome, FAO. 2002. - P,12.

80. Snow M., Cunningham C.O., Melvin W.T., Kurath G. Analysis of the glycoprotein gene identifies distinct lineages of viral haemorrhagic septicaemia virus within European marine environment. // Virus Res. 1999. - V. 63. - P. 35-44.

81. Spada E., Ciccaglione A. R., Dettori S., Chionfte P., Kondili L. A., Amoroso P., Guadagnino V., Greco M., Rapicetta M. Genotyping HCV isolates from Italy by type-specific PCR assay in the core region. // Res. Virol. 1998. - V. 149. - P. 209-218.

82. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 24. - P. 4876-4882.

83. Troyer R. M., LaPatra S., Kurath G. Genetic analyses reveal unusually high diversity of infectious hemat6poietic necrosis virus in rainbow trout aquaculture. // J Gen Virol. 2000. — V. 81.-P. 2823-2832.

84. Troyer R. M., Kurath G. Molecular epidemiology of infectious hematopoetic necrosisi virus reveals complex virus traffic and evolution within southern Idaho aquaculture. // Dis. Aquat. Org. 2003. - V.55. - P. 178-185.

85. Williams K., Blake S., Sweeney A., Singer J. Т., Nicholson B. L. Multiplex Reverse Transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses. // Journal of Clinical Microbiology. 1999. - V. 37. - P. 4139-4141.

86. Winton JR. Immunization with viral antigens: infectious haematopoietic necrosis. // Dev Biol Stand. 1997. - V. 90. - P. 211-220.

87. Walker P., Subasinghe R. (Eds.) DNA-based Molecular Diagnostic Techniques. Research Needs for Standardization and Validation of the Detection of Aquatic Animal Pathogens and Diseases. // FAO Fisheries Technical Paper 395. FAO, Rome. 2000. - P.93.

88. Wolf И., Haus M., Leser U. Sandwich nucleic acid hybridization as a universally usable method for routine diagnosis. // Zbl. Bakteriol., M;krobiol. und Hyg. 1985. - V. 4. - P. 519-520.