Изучение функции белка DAP5 в трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Смирнова Виктория Владимировна

• Смирнова Виктория Владимировна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Смирнова Виктория Владимировна

Введение

Обзор литературы

Введение

Кэп-зависимая инициация трансляции у высших эукариот

eIF4G1 - каркасный фактор инициации трансляции

Регуляция инициации трансляции

Неканонические способы инициации трансляции

DAP5 (eIF4G2) - фактор инициации трансляции

Трансляция DAP5

Структура белка DAP5

Механизм работы DAP5

Взаимодействие с факторами трансляции

IRES-опосредованная инициация

Альтернативная кэп-зависимая инициация

Функция DAP5

Апоптоз

Дифференцировка

Трансляция специфических мРНК

Результаты и обсуждение

Консервативность нуклеотидной и аминокислотной последовательностей DAP5

Консервативность белка DAP5

мРНК DAP5

Рибосомный профайлинг

Метод рибосомного профайлинга

Поиск мишеней DAP5 в клетках 293T

Поиск мишеней DAP5 в клетках NIH3T3

Подтверждение обнаруженных мишеней DAP5

Взаимодействие eIF4G1 и DAP5

Взаимная регуляция трансляции PCBP2 и DAP5

PCBP2 взаимодействует с мРНК DAP5

PCBP2 регулирует трансляцию DAP5 in vivo

Рекомбинантный PCBP2 подавляет трансляцию DAP5 in vitro

DAP5-зависимость мРНК BCL-2

Заключение

Выводы

Материалы и методы

Множественное выравнивание

Плазмиды для получения репортерных мРНК

In vitro транскрипция

Культивация клеточных культур и трансфекция

Вестерн-блот

Рибосомный профайлинг

Клетки 293T с индуцируемым нокдауном DAP5

Клетки NIH 3T3 с нокаутом DAP5

Получение библиотек для секвенирования

Получение рекомбинантных белков

In vitro трансляция

Олигонуклеотиды, использовавшиеся в работе

Благодарности

Список использованной литературы

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Трансляция полипептидов с матричной РНК является одним из важнейших и древнейших процессов, необходимых для жизни клетки. Регуляция трансляции сопутствует таким важным событиям, как дифференцировка, рост, движение, апоптоз и другие. Изучение любого аспекта трансляции одновременно вносит вклад в фундаментальную науку и расширяет возможности поиска средств лечения различных заболеваний, в особенности раковых, так как сильно повышенный уровень трансляции является характерным для раковых клеток.

Фактор инициации трансляции DAP5 (известный также как eIF4G2, Natl и p97) был открыт 25 лет назад, однако ни его функции в клетке, ни механизм его работы до сих пор не ясны. К настоящему времени опубликовано более 50 работ, в которых представлены различные экспериментальные данные о DAP5, но они не только не складываются в единую картину, но и зачастую противоречат друг другу. Кроме того, значительная часть этих исследований посвящена изучению возможного участия DAP5 во внутренней инициации трансляции, но в последние годы стало понятно, что стандартная методология их изучения не вполне корректна и приводит к артефактам.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение функции белка DAP5 в трансляции»

Цель работы

Цель данной работы - изучение функции белка DAP5 в инициации трансляции: поиск неизвестных ранее аспектов работы этого фактора и проверка некоторых уже опубликованных данных.

Поставленные задачи:

1. Идентификация мРНК, трансляция которых зависит от DAP5, посредством рибосомного профайлинга клеток, лишённых DAP5 путём генетического нокаута либо транзиентной РНК-интерференции.

2. Верификация обнаруженных и некоторых известных ранее мРНК-мишеней методом РНК-трансфекции соответствующих репортерных конструкций.

3. Изучение взаимодействия eIF4G1 и DAP5 в инициации трансляции.

4. Исследование влияния белка PCBP2 на трансляцию мРНК DAP5 в клетке. Научная новизна и практическая значимость работы

В рамках данной работы были идентифицированы и подтверждены новые мРНК -мишени DAP5. Кроме того, с помощью корректного метода РНК-трансфекции были подтверждены некоторые ранее опубликованные мишени.

Впервые исследован вопрос взаимодействия DAP5 и eIF4G1 в кэп-зависимой инициации трансляции в противовес рассматриваемой в большинстве работ роли DAP5 в альтернативных механизмах.

Показана неизвестная ранее взаимная регуляция трансляции DAP5 и PCBP2, исследована DAP5-зависимость различных вариантов транскрипта BCL-2.

Положения, выносимые на защиту

1. С помощью рибосомного профайлинга обнаружены новые мРНК-мишени DAP5.

2. Валидированы мишени Pcbp2, Map3k3, Mafl, Stard7, CCNI, PPFIA4, CES2.

3. Подтверждена DAP5-зависимость трансляции APAF-1 и нескольких вариантов транскрипта BCL-2.

4. DAP5 участвует в кэп-зависимой инициации трансляции.

5. DAP5 и eIF4G1 частично взаимозаменяемы.

6. PCBP2 и DAP5 регулируют друг друга, образуя систему с отрицательной обратной связью.

Методология исследования

Основные методы данной работы: рибосомный профайлинг, позволяющий определить трансляционные мишени DAP5, и метод трансфекции репортерных мРНК, служащий для подтверждения мишеней и дальнейшего изучения их трансляции. Для деплеции изучаемого белка в клетках использовались РНК-интерференция или CRISPR-опосредованный нокаут, эффективность деплеции оценивалась по Вестерн блоту. Для получения репортерных мРНК использовались методы молекулярного клонирования и in vitro транскрипции. Рекомбинантный PCBP2 экспрессировали в E. coli и очищали методом

афинной хроматографии. In vitro трансляция проводилась в экстракте S30 асцитной карциномы Кребс-2.

Личный вклад соискателя

Личный вклад соискателя состоит в анализе литературы, планировании и проведении экспериментов, обработке и анализе полученных данных и подготовке публикаций. Основные результаты, представленные в данной работе, получены самим автором. И. Теренин, Е. Шестакова и Д. Бикметов участвовали в изготовлении генетических конструкций и выполняли отдельные повторности некоторых трансфекций. И. Остерман и А. Чугунова получили нокаут DAP5 в клетках NIH/3T3. Т. Зацепин и Т. Приказчикова выполняли подбор и синтез формулированных киРНК. М. Логачёва секвенировала подготовленные нами библиотеки для рибосомного профайлинга, И. Кулаковский и Д. Ногина проводили биоинформатический анализ результатов секвенирования.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов, представленных в данной работе, обусловлена использованием современных методов исследования со всеми необходимыми контролями и подтверждается их воспроизводимостью (несколько биологических повторностей в разных биологических моделях) и согласованностью данных, полученных разными методами.

По теме диссертационной работы было опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, индексируемых в международных системах цитирования и рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.01.03 - «молекулярная биология».

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 79 страницах и включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Диссертация содержит 21 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает 127 источников.

Обзор литературы

Введение

Кэп-зависимая инициация трансляции у высших эукариот

Трансляция мРНК - энергетически затратный и сложный процесс, состоящий из четырех стадий: инициации, элонгации, терминации и ресайклинга рибосом. Инициация считается лимитирующей - и, как следствие, наиболее сложно регулируемой стадией всего процесса.

Факты, которые легли в основу модели канонического механизма инициации трансляции, были открыты в 1970-х годах, и с тех пор модель кэп-зависимой инициации трансляции постоянно корректируется и уточняется (один из последних литературных обзоров - авторства Н. Широких и Т. Прайса1). Важнейшими принципами этого механизма являются привлечение малой субъединицы рибосомы на самый 5'-конец мРНК и дальнейшее её последовательное продвижение по нетранслируемой области мРНК в направлении З'-конца до стартового кодона в оптимальном контексте -сканирование. После узнавания стартового кодона происходит присоединение большой субъединицы рибосомы и начинается собственно синтез полипептидной цепи (элонгация).

На 5'-конце всех цитоплазматических мРНК эукариот находится кэп-структура - 7-метилгуанозин (m7G), соединённый 5',5'-трифосфатным линкером с первым нуклеотидным остатком; рибоза в первых двух остатках также может быть метилирована. При кэп-зависимой инициации трансляции привлечение рибосомы на 5'-конец осуществляется благодаря способности инициаторного белкового комплекса eIF4F связываться одновременно с кэпом и с 43S комплексом, содержащим малую субчастицу рибосомы. eIF4F состоит из трех эукариотических инициаторных факторов (eukaryotic initiation factors, eIFs): хеликазы eIF4A, кэп-связывающего фактора eIF4E и каркасного белка eIF4G1, связывающего eIF4E, eIF4A и eIF3. eIF3 в свою очередь связывает малую субчастицу рибосомы в 43S комплексе, куда также входят eIF1, eIF1A, eIF2-TC (Ternary Complex, состоящий из eIF2, инициаторной метионил-тРНК и ГТФ) и eIF5. Таким образом,

через цепь белковых взаимодействий рибосома оказывается связана с кэпом и привлекается на 5'-конец мРНК. Кроме того, каркасный фактор е!Р4С1 взаимодействует с ро!уД-связываюш,им белком (РАВР), вследствие чего полиаденилированный З'-конец мРНК также оказывается соединен с инициаторным комплексом, и мРНК образует замкнутую петлю.

Важным элементом в привлечении рибосомы на мРНК и дальнейших событиях инициации является мультисубъединичный фактор е!Р3. У млекопитающих он состоит из 13 субъединиц и служит посредником между е!Р4С1 и рибосомой, а также взаимодействует с е!Р1, е!Р5 и, возможно, е^2.

После посадки рибосомы на мРНК инициаторный комплекс начинает движение в сторону З'-конца, для чего необходима АТФ-зависимая активность хеликаз (е^4А и других), расплетающих вторичную структуру мРНК.

Сканирование матрицы продолжается до узнавания инициаторного кодона в Р-сайте рибосомы, которое обеспечивается за счет постоянной проверки комплементарности сканируемого участка мРНК к антикодону инициаторной метионил-тРНК. Для большей вероятности инициации стартовый кодон должен находиться в оптимальном нуклеотидном контексте, что обеспечивает паузу сканирующей рибосомы. Важнейшими в окружении стартового кодона для его узнавания являются пурин (К, аденин или гуанин) в положении -3 и гуанин в положении +4. Впервые оптимальный контекст был определен М. Козак для позвоночных как 5'-(йсс)йссКссДУСС-3' 2. Критическими для узнавания стартового кодона и регуляции точности этого узнавания являются факторы е!Р2 (приносит Мет-тРНК на рибосому), (дестабилизирует кодон-антикодон

взаимодействия, повышая точность) и е!Р5 (активирует ГТФазную активность е!Р2, запуская переход к элонгации).

Узнавание стартового кодона вызывает гидролиз ГТФ (связанного с е!Р2)3, происходит освобождение и затем фосфата4. Эти события приводят к конформационным

изменениям комплекса, фиксирующим его на мРНК, и высвобождению е!Р5 и комплекса е!Р2*ГДФ. После этого е^5В способствует присоединению большой субчастицы

рибосомы, оставшиеся инициаторные факторы диссоциируют и запускается элонгация.

8

На данный момент нет полной ясности, какие факторы и как долго остаются связанными с инициаторным комплексом во время сканирования. Наиболее вероятно, что связь с кэпом все же прерывается в процессе продвижения сканирующего комплекса, например, в ходе конформационных изменений, стабилизирующих связь рибосомной субъединицы с мРНК. В противном случае, при сохранении связи сканирующего комплекса с кэпом, одновременно на мРНК смогла бы присутствовать только одна сканирующая рибосома, что значительно снижало бы эффективность трансляции, причем пропорционально длине нетранслируемой области. Прямые доказательства в пользу одного из вышеописанных вариантов на данный момент отсутствуют. Более убедительными выглядят существующие аргументы в пользу разрыва сканирующего комплекса и кэп-структуры (обсуждаются, например, в обзорах У. Меррика5 и Н. Широких и Т. Прайса1), хотя в недавней работе, выполненной с использованием новых методов определения положения сканирующих рибосом на мРНК, авторы делают противоположный вывод6. При нарушении цепи взаимодействий кэп-рибосома по ходу сканирования надобность в «каркасных» свойствах фактора eIF4G1 отпадает, и теоретически он может быть заменен на альтернативный фактор, который может, например, не иметь сайтов связывания eIF4E, но обладать свойствами, полезными для процессивного сканирования.

eIF4G1 - каркасный фактор инициации трансляции Комплекс факторов инициации eIF4F был открыт в 1983 году Дж. Грифо и др.7, как необходимый для трансляции мРНК р-глобина in vitro. В составе комплекса обнаружили уже известный к тому моменту eIF4A, кэп-связывающий белок, ныне известный как eIF4E, и еще

один фактор с молекулярной массой Рис■ L Схема elF4G1 кок ^ркасного фактора,

взаимодействущего с кэп-связывающим eIF4E, около 200 кДа. В дальнейшем РНК-связывающими eIF4A и PABP и связывающим

„ рибосому eIF3. определили, что этот белок, названный

eIF4G1 и имеющий у человека молекулярную массу 175 кДа, взаимодействует с eIF4E, eIF4A, eIF3 и PABP, и таким образом играет роль каркасного фактора, опосредованно соединяющего в единый комплекс кэп, рибосому, хеликазу и 3' конец мРНК8,9 (схема eIF4G1 в роли каркасного фактора изображена на Рис. 1, схема расположения сайтов связывания eIF4G1 с другими факторами изображена на Рис. 3). Важность каркасной функции eIF4G1 подтверждается тем, что именно этот фактор является мишенью вирусных протеаз. Так, протеаза некоторых пикорнавирусов отделяет от eIF4G1 фрагмент, содержащий сайты связывания eIF4E и PABP, нарушая таким образом кэп-зависимую инициацию трансляции10 (сайт протеолиза обозначен на схеме на Рис. 3). Второй образовавшийся фрагмент eIF4G1 может использоваться вирусами для специфической кэп-независимой трансляции вирусных мРНК - таким образом разрезание вирусной протеазой eIF4G1 одновременно подавляет трансляцию клеточных белков и стимулирует - вирусных.

Структура полноразмерного eIF4G1 на данный момент не получена из-за сложности работы с белком такой большой молекулярной массы. Имеются данные рентгеноструктурного анализа всех трех HEAT-доменов (MIF4G11, MA3 и W212) и eIF4E-связывающего участка13, но конфигурация eIF4G1 в инициаторном комплексе остается неясной.

В геномах млекопитающих обнаружены несколько гомологов eIF4G1: eIF4G3, DAP5 (eIF4G2), PAIP1, PDCD4, CBP80, CTIF. Среди них наиболее похожими на eIF4G1 являются два белка: eIF4G3, близкий гомолог eIF4G1, точная функция которого до сих пор не ясна, и eIF4G2, или DAP5, гомологичный фрагменту eIF4G1. Последний заинтересовал нас и является объектом данной работы, к нему мы вернемся позже.

Регуляция инициации трансляции

Как правило, именно на стадии инициации происходит регуляция трансляции. От длины и структурированности 5'UTR пропорционально зависит время и успешность его сканирования, а значит, и всей трансляции конкретной мРНК. Мешать сканированию могут связанные с определенными последовательностями РНК-связывающие белки или микро РНК. Дополнительной преградой на пути сканирующей рибосомы могут быть

короткие рамки считывания (upstream Open Reading Frames, uORF). Чтобы добраться до основного стартового кодона, сканирующий инициирующий комплекс должен либо пропускать стартовый кодон короткой рамки (leaky scanning), либо эффективно реинициировать после окончания ее трансляции - от вероятности этих событий зависит эффективность трансляции основной кодирующей последовательности.14

Рис. 2. Нэп-зависимая инициация трансляции и ее регуляция через активацию 4Е-связывающего белка (4ЕВР). Описание механизма см. в тексте.

Регуляция общего уровня трансляции достигается за счет изменения активности отдельных факторов. Так, дезактивация е^2 вследствие фосфорилирования одной из специфических киназ снижает эффективность инициации трансляции15. В комбинации с ингибирующим эффектом коротких рамок считывания фосфорилирование е^2 может иметь обратный эффект: снижение вероятности инициации на стартовых кодонах коротких рамок увеличивает количество сканирующих комплексов, которые добираются до основного А^. Впервые такой механизм был описан для мРНК ССЫ4 S.cerevisiae16, а в дальнейшем - и для высших эукариот, например, для мРНК транскрипционных

факторов ATF417 и ATF518. Есть и другие, не основанные на реинициации случаи устойчивости трансляции к инактивации eIF2, связанной с uORF: UCP2, IFRD119, GADD3420, однако механизм этой устойчивости не до конца понятен.

Специфические способы регуляции кэп-зависимой инициации трансляции в клетке основаны на разрыве связи рибосомы с кэп-структурой. При ингибировании регуляторной киназы mTOR происходит дефосфорилирование е^4Е-связывающих белков (eIF4E-binding proteins, 4EBPs), вследствие чего они активируются. Связываясь с eIF4E, активированный 4EBP препятствует контакту eIF4E и eIF4G1 и, следовательно, привлечению рибосомы через кэп21,22. Тем не менее, ингибиторы mTOR хотя и оказывают значительное негативное влияние на трансляцию клеточных мРНК, но не блокируют ее полностью23, что говорит о неполном ингибировании eIF4E через 4EBP и/или об использовании клеткой альтернативных факторов и механизмов инициации трансляции.

Схема вышеописанного механизма кэп-зависимого привлечения рибосомы на мРНК и его регуляции изображена на Рис. 2.

Неканонические способы инициации трансляции

Помимо канонического кэп-зависимого сканирующего механизма инициации

трансляции существует механизм, использующий внутреннюю посадку рибосомы. В этом

механизме задействованы специфические участки мРНК - IRES-элементы (Internal

Ribosome Entry Site - место внутренней посадки рибосомы), за счет которых рибосома

привлекается не на конец мРНК, а сразу на стартовый кодон или на участок в

непосредственной близости от него. Впервые такой механизм инициации был

обнаружен для мРНК пикорнавирусов (вирусы полиомиелита, PV24, и

энцефаломиокардита, EMCV25), и на данный момент наличие IRES-элементов в мРНК

подтверждено для многих семейств РНК-вирусов. IRES-элементы имеют определенную

вторичную и третичную структуру, которая позволяет им напрямую взаимодействовать с

факторами трансляции, например, с eIF4G1, eIF3 и даже с самой рибосомой (обзор

литературы на тему известных типов вирусных IRES-элементов можно найти, например,

в статье Дж. Маллиота и Ф.Мартина26). За счет этого взаимодействия вирусные РНК, не

имеющие кэпа на 5'-конце, могут привлекать рибосому непосредственно на внутреннюю

12

область мРНК. В зависимости от типа IRES-элемента в инициации трансляции могут не участвовать некоторые (или даже вообще все) канонические факторы или, наоборот, могут требоваться дополнительные специфические белки; рибосоме может требоваться непродолжительное сканирование в поисках инициаторного кодона, или же она сразу помещается на место старта элонгации.

Инициация трансляции посредством внутренней посадки рибосомы позволяет

транслировать мРНК, инициация трансляции которых каноническим способом

невозможна или затруднена вследствие определенных свойств: отсутствие кэпа, высокая

структурированность, полицистронность (несколько открытых рамок считывания в одной

РНК). Трансляция мРНК, содержащих IRES, невосприимчива к специфическим

ингибиторам кэп-зависимой трансляции - клеточным (4EBP) или вирусным (например,

протеаза пикорнавирусов разрезает eIF4G1 так, что оставшийся фрагмент («р100») не

может взаимодействовать с eIF4E, но может привлекаться на IRES). Во многих научных

работах подтверждается, что трансляция отдельных клеточных мРНК более устойчива к

некоторым стрессам, и часто такое поведение мРНК объясняется исследователями

наличием в ее структуре IRES-элемента. Обычно авторы этих работ предполагают, что

инициация трансляции может быть только двух типов: либо каноническая кэп-зависимая,

либо использующая внутреннюю посадку рибосомы. Часто в таких исследованиях для

доказательства наличия IRES используются некорректные методы, дающие

ложноположительный результат (наиболее полный обзор проблемы «клеточных IRES» и

методологии доказательства функциональности IRES-элемента можно найти в

опубликованной нашей лабораторией статье27). Тем не менее, возможны и другие

варианты инициации, объясняющие нетипичные свойства мРНК: например, кэп-

независимая, но использующая 5'-конец инициация трансляции через CITE (cap-

independent translation enhancers). CITE - впервые обнаруженные у вирусов растений

элементы мРНК, которые напрямую связывают факторы инициации и за счет этого

привлекают рибосому на 5'-конец независимо от кэпа (обзор28). Кроме того, появляются

данные о других возможных неканонических вариантах инициации трансляции:

привлечение рибосомы на кэп через кэп-связывающую субъединицу фактора eIF3

(eIF3d29 и/или eIF3l30), или посадка инициирующего комплекса на 5'UTR за счет

13

связывания фактора eIF3 c Ы6-метиладенозином (m6A), встречающимся в нетранслируемых областях некоторых мРНК31. Концепция CITE-опосредованной инициации трансляции клеточных мРНК и других альтернативных механизмах инициации обсуждается в опубликованном нашей лабораторией обзоре32.

С момента открытия фактора eIF4G1 в составе 4F комплекса7 механизм инициации, задействующий eIF4G1, считается основным. Хотя eIF4G1 является жизненно важным для развивающихся организмов33,34, его деплеция как в клетках дрожжей, так и млекопитающих, вопреки ожиданиям, не оказывала критического влияния на рост и жизнеспособность клеток в нормальных условиях35-38, что говорит о возможности поддерживать необходимый уровень белкового синтеза при пониженных концентрациях eIF4G1. Основным кандидатом на роль вспомогательного фактора инициации трансляции является DAP5.

DAP5 (eIF4G2) - фактор инициации трансляции

Белок DAP5, также известный как eIF4G2, NAT1 и p97, был открыт в 1997 году одновременно четырьмя исследовательскими группами39-42. В двух случаях белок был

41 «

открыт случайно, в ходе поиска факторов, ассоциированных с апоптозом , и мишеней РНК-редактирующего белка42. В двух других работах задачей было изучение гомолога фактора инициации трансляции eIF4G1, обнаруженного при биоинформатическом анализе человеческих кДНК 39,40. В ходе этих исследований было показано, что ген кодирует белок массой 97 kDa, гомологичный C-концевым двум третям eIF4G1. Кодирующая часть мРНК этого гена начинается не с AUG, а с GUG кодона. Как и eIF4G1, DAP5 связывает факторы eIF4A и eIF3, но, в отличие от eIF4G1, не взаимодействует с кэп-связывающим фактором eIF4E40,42. Совокупность полученных результатов позволила сразу предположить, что с большой вероятностью DAP5 участвует в инициации трансляции. Эта гипотеза подтвердилось в дальнейших исследованиях, но конкретная роль DAP5 до сих пор не ясна.

Трансляция DAP5

мРНК DAP5 характерна эволюционно консервативным не-AUG стартовым кодоном: GUG кодон является стартовым у мРНК DAP5 человека, мыши, данио, ксенопус. Консервативность составляет 60-80% для нуклеотидной последовательности мРНК и 7590% для кодируемой ей аминокислотной43. В особенности консервативны окрестности GUG-кодона, причем кодон находится в оптимальном нуклеотидном контексте. Гомолог DAP5 у дрозофилы, вероятнее всего, транслируется также не с AUG кодона (возможно, с UGG). Как и в случае других мРНК с не-AUG стартовыми кодонами, инициация трансляции на мРНК DAP5 регулируется факторами eIF5 и 5MP (BZW): оверэкспрессия eIF5 усиливает, а 5MP ингибирует трансляцию репортера, содержащего 54UTR DAP5 и GUG кодон в качестве стартового (в клетках HEK293T)44. Показано, что трансляция DAP5 и других мРНК с не-AUG стартовыми кодонами более устойчива к стрессам, ингибирующим элонгацию (видимо, из-за скопления элонгирующих рибосом следующие за ними инициирующие задерживаются в области стартового кодона и для нестандартного стартового кодона увеличивается обычно пониженная вероятность запуска трансляции)45. Кроме того, в 5'UTR DAP5 содержатся три uORF, они не ингибируют трансляцию основной ORF в нормальных условиях44, но могут участвовать в регуляции. Таким образом, синтез белка DAP5 может регулироваться в клетке отдельно от белков, инициация трансляции которых начинается со стандартного AUG кодона, коих в клетке большинство. При этом трансляция DAP5 может быть устойчива к некоторым стрессам, снижающим эффективность синтеза таких белков. Эти свойства DAP5 позволяют предположить, что его функция связана с определенными событиями в клетке.

Структура белка DAP5

Структурный анализ полноразмерного белка DAP5 (907 аминокислот) на данный момент не выполнен, однако различными исследовательскими группами были получены кристаллические структуры отдельных доменов: MIF4G (остатки 61-3 2 3)46,47 и C-концевая часть (540-897)48,49 (области DAP5, для которых известна кристаллическая структура, отмечены на Рис. 3). Полученные структуры сравнивали со структурами гомологичных областей eIF4G1 (полная структура для eIF4G1 также неизвестна). Максимальное

сходство наблюдается при сравнении MIF4G доменов DAP5 и eIF4G1, причем положение большинства важных для связывания eIF4A аминокислотных остатков также консервативно. Тем не менее, связывание eIF4A в центральной части белка характеризуется значительно большей константой диссоциации47. Заметные различия обнаружены в домене MA3: е^4А-связывающая поверхность MA3 домена в DAP5 менее отрицательно заряжена, что связано с заменой в DAP5 5 консервативных в eIF4G1 кислотных остатков в том числе на щелочные48. Показано, что DAP5 действительно в 2 раза слабее стимулирует хеликазную активность eIF4A по сравнению с eIF4G1, содержащим 2 функциональных сайта связывания eIF4A47. Кроме того, в C-концевом домене W2, который отвечает за связывание с eIF2p в белках eIF5 и eIF2B, в DAP5 имеется консервативный остаток отрицательно заряженного глутамата E862 (отмечен черной стрелкой на Рис. 6 раздела «Результаты и обсуждение»), необходимый для связывания с eIF2p, в то время как в eIF4G1 этот остаток заменен на положительно заряженный лизин49. Также на поверхности центрального домена DAP5 есть положительно заряженный участок, не имеющий соответствия в eIF4G1; он может связывать, например, нуклеиновые кислоты47. Сайт разрезания каспазами DETD792 (отмечен красной стрелкой на Рис. 6 раздела «Результаты и обсуждение») находится в неструктурированной петле и отсутствует в W2 доменах других белков49.

Рис. 3. Схема доменной организации eIF4G1 и DAP5. Под доменами подписаны связывающиеся с ними белки, вертикальными стрелками обозначены сайты разрезания eIF4G1 вирусными протеазами и DAP5 - каспазами. Серыми прямоугольниками отмечены области, для которых известна кристаллическая структура.

Механизм работы DAP5

Взаимодействие с факторами трансляции

Для определения механизма работы и функции фактора инициации DAP5 важно знать, с какими белками он взаимодействует. Данные о таком взаимодействии, как правило, получают путем иммунопреципитации нативного белка из клеточного лизата или преципитации за тэг оверэкспрессированного или добавленного в лизат рекомбинантного белка. Ко-преципитированные партнеры анализируются путем масс-спектрометрии или иммуноблоттинга.

Как и eIF4G1, DAP5 связывает хеликазу eIF4A40,47,49-52 и фактор eIF340,50,52-54, и, в отличие от eIF4G1 (или значительно сильнее, чем eIF4G1), связывает факторы инициации eIF2p36,51-53, eIF4A252 и d субъединицу фактора eIF352, малоизученные РНК-связывающие белки FXR1/252,54,55, FMR152,54 и PRRC252,54. Возможные роли некоторых из этих уникальных партнеров DAP5 обсуждаются ниже.

IRES-опосредованная инициация

Как уже упоминалось ранее, DAP5, в отличие от eIF4G1, не взаимодействует с кэп-связывающим белком eIF4E, поскольку гомологичен только С-концевому фрагменту eIF4G1 (сходство С-концевой части eIF4G1 и DAP5 отображено на Рис. 3). Примечательно, что протеазы некоторых вирусов способны расщеплять eIF4G1 с образованием фрагмента, практически идентичного DAP5. Этот фрагмент, называемый иногда р100 (по его размеру), также не взаимодействует с eIF4E и участвует в трансляции вирусных мРНК, связываясь с находящимися в них ^Бами. Сходство DAP5 и p100 легло в основу идеи о том, что DAP5 задействован в кэп-независимой IRES-опосредованной инициации трансляции53,56-59. Авторы всех этих работ исходили из предположения о том, что клеточные IRESbi существуют, однако на данный момент функциональность ни одного предполагаемого клеточного IRES не была показана с помощью корректных методов. До сих пор при изучении клеточных IRES-элементов, в том числе в вышеупомянутых работах о DAP5, часто используют методы, приводящие к артефактам и ложноположительным результатам, и доверять сделанным на основе таких экспериментов выводам нельзя

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Смирнова Виктория Владимировна, 2022 год

Список использованной литературы

(1) Shirokikh, N. E.; Preiss, T. Translation Initiation by Cap-Dependent Ribosome Recruitment: Recent Insights and Open Questions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 2018, 9 (4), e1473. https://doi.org/10.1002/wrna.1473.

(2) Kozak, M. An Analysis of 5'-Noncoding Sequences from 699 Vertebrate Messenger RNAs. Nucleic Acids Research 1987, 15 (20), 8125-8148. https://doi.org/10.1093/nar/15.20.8125.

(3) Unbehaun, A.; Borukhov, S. I.; Hellen, C. U. T.; Pestova, T. V. Release of Initiation Factors from 48S Complexes during Ribosomal Subunit Joining and the Link between Establishment of Codon-Anticodon Base-Pairing and Hydrolysis of EIF2-Bound GTP. Genes Dev. 2004, 18 (24), 3078-3093. https://doi.org/10.1101/gad.1255704.

(4) Nanda, J. S.; Saini, A. K.; Muñoz, A. M.; Hinnebusch, A. G.; Lorsch, J. R. Coordinated Movements of Eukaryotic Translation Initiation Factors EIF1, EIF1A, and EIF5 Trigger Phosphate Release from EIF2 in Response to Start Codon Recognition by the Ribosomal

Preinitiation Complex*. Journal of Biological Chemistry 2013, 288 (8), 5316-5329. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.440693.

(5) Merrick, W. C. EIF4F: A Retrospective*. Journal of Biological Chemistry 2015, 290 (40), 24091-24099. https://doi.org/10.1074/jbc.R115.675280.

(6) Bohlen, J.; Fenzl, K.; Kramer, G.; Bukau, B.; Teleman, A. A. Selective 40S Footprinting Reveals Cap-Tethered Ribosome Scanning in Human Cells. Molecular Cell 2020. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.06.005.

(7) Grifo, J. A.; Tahara, S. M.; Morgan, M. A.; Shatkin, A. J.; Merrick, W. C. New Initiation Factor Activity Required for Globin MRNA Translation. J. Biol. Chem. 1983, 258 (9), 5804-5810.

(8) Lamphear, B. J.; Kirchweger, R.; Skern, T.; Rhoads, R. E. Mapping of Functional Domains in Eukaryotic Protein Synthesis Initiation Factor 4G (EIF4G) with Picornaviral Proteases: IMPLICATIONS FOR CAP-DEPENDENT AND CAP-INDEPENDENT TRANSLATIONAL INITIATION (*). Journal of Biological Chemistry 1995, 270 (37), 21975-21983. https://doi.org/10.1074/jbc.270.37.21975.

(9) Wells, S. E.; Hillner, P. E.; Vale, R. D.; Sachs, A. B. Circularization of MRNA by Eukaryotic Translation Initiation Factors. Molecular Cell 1998, 2 (1), 135-140. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(00)80122-7.

(10) Castello, A.; Alvarez, E.; Carrasco, L. The Multifaceted Poliovirus 2A Protease: Regulation of Gene Expression by Picornavirus Proteases. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2011, 2011, e369648. https://doi.org/10.1155/2011/369648.

(11) Marcotrigiano, J.; Lomakin, I. B.; Sonenberg, N.; Pestova, T. V.; Hellen, C. U. T.; Burley, S. K. A Conserved HEAT Domain within EIF4G Directs Assembly of the Translation Initiation Machinery. Molecular Cell 2001, 7 (1), 193-203. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(01)00167-8.

(12) Bellsolell, L.; Cho-Park, P. F.; Poulin, F.; Sonenberg, N.; Burley, S. K. Two Structurally Atypical HEAT Domains in the C-Terminal Portion of Human EIF4G Support Binding to EIF4A and Mnk1. Structure 2006, 14 (5), 913-923. https://doi.org/10.1016/j.str.2006.03.012.

(13) Grüner, S.; Peter, D.; Weber, R.; Wohlbold, L.; Chung, M.-Y.; Weichenrieder, O.; Valkov, E.; Igreja, C.; Izaurralde, E. The Structures of EIF4E-EIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell 2016, 64 (3), 467-479. https://doi.org/10.1016/j~.molcel.2016.09.020.

(14) Hinnebusch, A. G.; Ivanov, I. P.; Sonenberg, N. Translational Control by 5'-Untranslated Regions of Eukaryotic MRNAs. Science 2016, 352 (6292), 1413-1416. https://doi.org/10.1126/science.aad9868.

(15) Kimball, S. R.; Fabian, J. R.; Pavitt, G. D.; Hinnebusch, A. G.; Jefferson, L. S. Regulation of Guanine Nucleotide Exchange through Phosphorylation of Eukaryotic Initiation Factor EIF2a: ROLE OF THE a- AND 5-SUBUNITS OF EIF2B *. Journal of Biological Chemistry 1998, 273 (21), 12841-12845. https://doi.org/10.1074/jbc.273.21.12841.

(16) Abastado, J. P.; Miller, P. F.; Jackson, B. M.; Hinnebusch, A. G. Suppression of Ribosomal Reinitiation at Upstream Open Reading Frames in Amino Acid-Starved Cells Forms the Basis for GCN4 Translational Control. Molecular and Cellular Biology 1991, 11 (1), 486496. https://doi.org/10.1128/mcb.11.1.486-496.1991.

(17) Vattem, K. M.; Wek, R. C. Reinitiation Involving Upstream ORFs Regulates ATF4 MRNA Translation in Mammalian Cells. PNAS 2004, 101 (31), 11269-11274. https://doi.org/10.1073/pnas.0400541101.

(18) Zhou, D.; Palam, L. R.; Jiang, L.; Narasimhan, J.; Staschke, K. A.; Wek, R. C. Phosphorylation of EIF2 Directs ATF5 Translational Control in Response to Diverse Stress Conditions *. Journal of Biological Chemistry 2008, 283 (11), 7064-7073. https://doi.org/10.1074/jbc.M708530200.

(19) Andreev, D. E.; O'Connor, P. B.; Fahey, C.; Kenny, E. M.; Terenin, I. M.; Dmitriev, S. E.; Cormican, P.; Morris, D. W.; Shatsky, I. N.; Baranov, P. V. Translation of 5' Leaders Is Pervasive in Genes Resistant to EIF2 Repression. eLife 2015, 4, e03971. https://doi.org/10.7554/eLife.03971.

(20) Lee, Y.-Y.; Cevallos, R. C.; Jan, E. An Upstream Open Reading Frame Regulates Translation of GADD34 during Cellular Stresses That Induce EIF2a Phosphorylation *. Journal of Biological Chemistry 2009, 284 (11), 6661-6673. https://doi.org/10.1074/jbc.M806735200.

(21) Gingras, A.-C.; Raught, B.; Gygi, S. P.; Niedzwiecka, A.; Miron, M.; Burley, S. K.; Polakiewicz, R. D.; Wyslouch-Cieszynska, A.; Aebersold, R.; Sonenberg, N. Hierarchical Phosphorylation of the Translation Inhibitor 4E-BP1. Genes Dev. 2001, 15 (21), 28522864. https://doi.org/10.1101/gad.912401.

(22) Lukhele, S.; Bah, A.; Lin, H.; Sonenberg, N.; Forman-Kay, J. D. Interaction of the Eukaryotic Initiation Factor 4E with 4E-BP2 at a Dynamic Bipartite Interface. Structure 2013, 21 (12), 2186-2196. https://doi.org/10.1016Zj.str.2013.08.030.

(23) Thoreen, C. C.; Chantranupong, L.; Keys, H. R.; Wang, T.; Gray, N. S.; Sabatini, D. M. A Unifying Model for MTORC1-Mediated Regulation of MRNA Translation. Nature 2012, 485 (7396), 109-113. https://doi.org/10.1038/nature11083.

(24) Pelletier, J.; Sonenberg, N. Internal Initiation of Translation of Eukaryotic MRNA Directed by a Sequence Derived from Poliovirus RNA. Nature 1988, 334 (6180), 320325. https://doi.org/10.1038/334320a0.

(25) Jang, S. K.; Kräusslich, H. G.; Nicklin, M. J.; Duke, G. M.; Palmenberg, A. C.; Wimmer, E. A Segment of the 5' Nontranslated Region of Encephalomyocarditis Virus RNA Directs Internal Entry of Ribosomes during in Vitro Translation. Journal of Virology 1988, 62 (8), 2636-2643.

(26) Mailliot, J.; Martin, F. Viral Internal Ribosomal Entry Sites: Four Classes for One Goal. WIREs RNA 2018, 9 (2), e1458. https://doi.org/10.1002/wrna.1458.

(27) Terenin, I. M.; Smirnova, V. V.; Andreev, D. E.; Dmitriev, S. E.; Shatsky, I. N. A Researcher's Guide to the Galaxy of IRESs. Cell. Mol. Life Sci. 2017, 74 (8), 1431-1455. https://doi.org/10.1007/s00018-016-2409-5.

(28) Simon, A. E.; Miller, W. A. 3' Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annu. Rev. Microbiol. 2013, 67 (1), 21-42. https://doi.org/10.1146/annurev-micro-092412-155609.

(29) Lee, A. S. Y.; Kranzusch, P. J.; Cate, J. H. D. EIF3 Targets Cell-Proliferation Messenger RNAs for Translational Activation or Repression. Nature 2015, 522 (7554), 111-114. https://doi.org/10.1038/nature14267.

(30) Kumar, P.; Hellen, C. U. T.; Pestova, T. V. Toward the Mechanism of EIF4F-Mediated Ribosomal Attachment to Mammalian Capped MRNAs. Genes Dev. 2016, 30 (13), 15731588. https://doi.org/10.1101/gad.282418.116.

(31) Meyer, K. D.; Patil, D. P.; Zhou, J.; Zinoviev, A.; Skabkin, M. A.; Elemento, O.; Pestova, T. V.; Qian, S.-B.; Jaffrey, S. R. 5' UTR M6A Promotes Cap-Independent Translation. Cell 2015, 163 (4), 999-1010. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.10.012.

(32) Shatsky, I. N.; Terenin, I. M.; Smirnova, V. V.; Andreev, D. E. Cap-Independent Translation: What's in a Name? Trends in Biochemical Sciences 2018, 43 (11), 882-895. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2018.04.011.

(33) Contreras, V.; Richardson, M. A.; Hao, E.; Keiper, B. D. Depletion of the Cap-Associated Isoform of Translation Factor EIF4G Induces Germline Apoptosis in C. Elegans. Cell Death Differ 2008, 15 (8), 1232-1242. https://doi.org/10.1038/cdd.2008.46.

(34) Goyer, C.; Altmann, M.; Lee, H. S.; Blanc, A.; Deshmukh, M.; Woolford, J. L.; Trachsel, H.; Sonenberg, N. TIF4631 and TIF4632: Two Yeast Genes Encoding the High-Molecular-Weight Subunits of the Cap-Binding Protein Complex (Eukaryotic Initiation Factor 4F) Contain an RNA Recognition Motif-like Sequence and Carry out an Essential Function. Molecular and Cellular Biology 1993, 13 (8), 4860-4874. https://doi.org/10.1128/MCB.13.8.4860.

(35) Dave, P.; George, B.; Raheja, H.; Rani, P.; Behera, P.; Das, S. The Mammalian Host Protein DAP5 Facilitates the Initial Round of Translation of Coxsackievirus B3 RNA. J. Biol. Chem. 2019, jbc.RA119.009000. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.009000.

(36) Bryant, J. D.; Brown, M. C.; Dobrikov, M. I.; Dobrikova, E. Y.; Gemberling, S. L.; Zhang, Q.; Gromeier, M. Regulation of Hypoxia-Inducible Factor 1a during Hypoxia by DAP5-Induced Translation of PHD2. Molecular and Cellular Biology 2018, 38 (11), e00647-17. https://doi.org/10.1128/MCB.00647-17.

(37) Ramírez-Valle, F.; Braunstein, S.; Zavadil, J.; Formenti, S. C.; Schneider, R. J. EIF4GI Links Nutrient Sensing by MTOR to Cell Proliferation and Inhibition of Autophagy. The Journal of Cell Biology 2008, 181 (2), 293-307. https://doi.org/10.1083/jcb.200710215.

(38) Park, E.-H.; Zhang, F.; Warringer, J.; Sunnerhagen, P.; Hinnebusch, A. G. Depletion of EIF4G from Yeast Cells Narrows the Range of Translational Efficiencies Genome-Wide. BMC Genomics 2011, 12 (1), 68. https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-68.

(39) Shaughnessy, J. D.; Jenkins, N. A.; Copeland, N. G. CDNA Cloning, Expression Analysis, and Chromosomal Localization of a Gene with High Homology to Wheat EIF-(Iso)4F and Mammalian EIF-4G. Genomics 1997, 39 (2), 192-197. https://doi.org/10.1006/geno.1996.4502.

(40) Imataka, H.; Olsen, H. S.; Sonenberg, N. A New Translational Regulator with Homology to Eukaryotic Translation Initiation Factor 4G. The EMBO Journal 1997, 16 (4), 817-825. https://doi.org/10.1093/emboj/16.4.817.

(41) Levy-Strumpf, N.; Deiss, L. P.; Berissi, H.; Kimchi, A. DAP-5, a Novel Homolog of Eukaryotic Translation Initiation Factor 4G Isolated as a Putative Modulator of Gamma Interferon-Induced Programmed Cell Death. Molecular and Cellular Biology 1997, 17 (3), 1615-1625. https://doi.org/10.1128/MCB.173.1615.

(42) Yamanaka, S.; Poksay, K. S.; Arnold, K. S.; Innerarity, T. L. A Novel Translational Repressor MRNA Is Edited Extensively in Livers Containing Tumors Caused by the Transgene

Expression of the ApoB MRNA-Editing Enzyme. Genes Dev. 1997, 11 (3), 321-333. https://doi.Org/10.1101/gad.11.3.321.

(43) Takahashi, K.; Maruyama, M.; Tokuzawa, Y.; Murakami, M.; Oda, Y.; Yoshikane, N.; Makabe, K. W.; Ichisaka, T.; Yamanaka, S. Evolutionarily Conserved Non-AUG Translation Initiation in NAT1/P97/DAP5 (EIF4G2). Genomics 2005, 85 (3), 360-371. https://doi.org/10.1016/j~.ygeno.2004.11.012.

(44) Tang, L.; Morris, J.; Wan, J.; Moore, C.; Fujita, Y.; Gillaspie, S.; Aube, E.; Nanda, J.; Marques, M.; Jangal, M.; Anderson, A.; Cox, C.; Hiraishi, H.; Dong, L.; Saito, H.; Singh, C. R.; Witcher, M.; Topisirovic, I.; Qian, S.-B.; Asano, K. Competition between Translation Initiation Factor EIF5 and Its Mimic Protein 5MP Determines Non-AUG Initiation Rate Genome-Wide. Nucleic Acids Res 2017, 45 (20), 11941-11953. https://doi.org/10.1093/nar/gkx808.

(45) Kearse, M. G.; Goldman, D. H.; Choi, J.; Nwaezeapu, C.; Liang, D.; Green, K. M.; Goldstrohm, A. C.; Todd, P. K.; Green, R.; Wilusz, J. E. Ribosome Queuing Enables Non-AUG Translation to Be Resistant to Multiple Protein Synthesis Inhibitors. Genes Dev. 2019. https://doi.org/10.1101/gad.324715.119.

(46) Frank, F.; Virgili, G.; Sonenberg, N.; Nagar, B. Crystallization and Preliminary X-Ray Diffraction Analysis of the MIF4G Domain of DAP5. Acta Cryst F 2010, 66 (1), 15-19. https://doi.org/10.1107/S1744309109044315.

(47) Virgili, G.; Frank, F.; Feoktistova, K.; Sawicki, M.; Sonenberg, N.; Fraser, C. S.; Nagar, B. Structural Analysis of the DAP5 MIF4G Domain and Its Interaction with EIF4A. Structure 2013, 21 (4), 517-527. https://doi.org/10.1016Zj.str.2013.01.015.

(48) Fan, S.; Jia, M.-Z.; Gong, W. Crystal Structure of the C-Terminal Region of Human P97/DAP5. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2010, 78 (10), 2385-2390. https://doi.org/10.1002/prot.22735.

(49) Liberman, N.; Dym, O.; Unger, T.; Albeck, S.; Peleg, Y.; Jacobovitch, Y.; Branzburg, A.; Eisenstein, M.; Marash, L.; Kimchi, A. The Crystal Structure of the C-Terminal DAP5/P97 Domain Sheds Light on the Molecular Basis for Its Processing by Caspase Cleavage. Journal of Molecular Biology 2008, 383 (3), 539-548. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.08.013.

(50) Henis-Korenblit, S.; Strumpf, N. L.; Goldstaub, D.; Kimchi, A. A Novel Form of DAP5 Protein Accumulates in Apoptotic Cells as a Result of Caspase Cleavage and Internal Ribosome Entry Site-Mediated Translation. Molecular and Cellular Biology 2000, 20 (2), 496-506. https://doi.org/10.1128/MCB.20.2.496-506.2000.

(51) Lee, S. H.; McCormick, F. P97/DAP5 Is a Ribosome-Associated Factor That Facilitates Protein Synthesis and Cell Proliferation by Modulating the Synthesis of Cell Cycle Proteins. The EMBO Journal 2006, 25 (17), 4008-4019. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601268.

(52) Parra, C. de la; Ernlund, A.; Alard, A.; Ruggles, K.; Ueberheide, B.; Schneider, R. J. A Widespread Alternate Form of Cap-Dependent MRNA Translation Initiation. Nature Communications 2018, 9 (1), 3068. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05539-0.

(53) Liberman, N.; Gandin, V.; Svitkin, Y. V.; David, M.; Virgili, G.; Jaramillo, M.; Holcik, M.; Nagar, B.; Kimchi, A.; Sonenberg, N. DAP5 Associates with EIF2p and EIF4AI to Promote Internal Ribosome Entry Site Driven Translation. Nucleic Acids Res 2015, 43 (7), 37643775. https://doi.org/10.1093/nar/gkv205.

(54) Sugiyama, H.; Takahashi, K.; Yamamoto, T.; Iwasaki, M.; Narita, M.; Nakamura, M.; Rand, T. A.; Nakagawa, M.; Watanabe, A.; Yamanaka, S. Natl Promotes Translation of Specific Proteins That Induce Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. PNAS 2017, 114 (2), 340-345. https://doi.org/10.1073/pnas.1617234114.

(55) Bukhari, S. I. A.; Truesdell, S. S.; Lee, S.; Kollu, S.; Classon, A.; Boukhali, M.; Jain, E.; Mortensen, R. D.; Yanagiya, A.; Sadreyev, R. I.; Haas, W.; Vasudevan, S. A Specialized Mechanism of Translation Mediated by FXR1a-Associated MicroRNP in Cellular Quiescence. Molecular Cell 2016, 61 (5), 760-773. https://doi.org/10.1016/j~.molcel.2016.02.013.

(56) Henis-Korenblit, S.; Shani, G.; Sines, T.; Marash, L.; Shohat, G.; Kimchi, A. The Caspase-Cleaved DAP5 Protein Supports Internal Ribosome Entry Site-Mediated Translation of Death Proteins. PNAS 2002, 99 (8), 5400-5405. https://doi.org/10.1073/pnas.082102499.

(57) Nevins, T. A.; Harder, Z. M.; Korneluk, R. G.; Holcik, M. Distinct Regulation of Internal Ribosome Entry Site-Mediated Translation Following Cellular Stress Is Mediated by Apoptotic Fragments of EIF4G Translation Initiation Factor Family Members EIF4GI and P97/DAP5/NAT1. J. Biol. Chem. 2003, 278 (6), 3572-3579. https://doi.org/10.1074/jbc.M206781200.

(58) Hundsdoerfer, P.; Thoma, C.; Hentze, M. W. Eukaryotic Translation Initiation Factor 4GI and P97 Promote Cellular Internal Ribosome Entry Sequence-Driven Translation. PNAS 2005, 102 (38), 13421-13426. https://doi.org/10.1073/pnas.0506536102.

(59) Lewis, S. M.; Cerquozzi, S.; Graber, T. E.; Ungureanu, N. H.; Andrews, M.; Holcik, M. The EIF4G Homolog DAP5/P97 Supports the Translation of Select MRNAs during Endoplasmic Reticulum Stress. Nucleic Acids Res 2008, 36 (1), 168-178. https://doi.org/10.1093/nar/gkm1007.

(60) Andreev, D. E.; Dmitriev, S. E.; Terenin, I. M.; Prassolov, V. S.; Merrick, W. C.; Shatsky, I. N. Differential Contribution of the M7G-Cap to the 5' End-Dependent Translation Initiation of Mammalian MRNAs. Nucleic Acids Res 2009, 37 (18), 6135-6147. https://doi.org/10.1093/nar/gkp665.

(61) Kozak, M. New Ways of Initiating Translation in Eukaryotes? Molecular and Cellular Biology 2001, 21 (6), 1899-1907. https://doi.org/10.1128/MCB.21.6.1899-1907.2001.

(62) Marash, L.; Liberman, N.; Henis-Korenblit, S.; Sivan, G.; Reem, E.; Elroy-Stein, O.; Kimchi, A. DAP5 Promotes Cap-Independent Translation of Bcl-2 and CDK1 to Facilitate Cell Survival during Mitosis. Molecular Cell 2008, 30 (4), 447-459. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2008.03.018.

(63) Weingarten-Gabbay, S.; Khan, D.; Liberman, N.; Yoffe, Y.; Bialik, S.; Das, S.; Oren, M.; Kimchi, A. The Translation Initiation Factor DAP5 Promotes IRES-Driven Translation of P53 MRNA. Oncogene 2014, 33 (5), 611-618. https://doi.org/10.1038/onc.2012.626.

(64) Haizel, S. A.; Bhardwaj, U.; Gonzalez, R. L.; Mitra, S.; Goss, D. J. 5'-UTR Recruitment of the Translation Initiation Factor EIF4GI or DAP5 Drives Cap-Independent Translation of a Subset of Human MRNAs. J. Biol. Chem. 2020, 295 (33), 11693-11706. https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.013678.

(65) Yoffe, Y.; David, M.; Kalaora, R.; Povodovski, L.; Friedlander, G.; Feldmesser, E.; Ainbinder, E.; Saada, A.; Bialik, S.; Kimchi, A. Cap-Independent Translation by DAP5

Controls Cell Fate Decisions in Human Embryonic Stem Cells. Genes Dev. 2016, 30 (17), 1991-2004. https://doi.org/10.1101/gad.285239.116.

(66) van 't Spijker, H. M.; Stackpole, E. E.; Almeida, S.; Katsara, O.; Liu, B.; Shen, K.; Schneider, R. J.; Gao, F.-B.; Richter, J. D. Ribosome Profiling Reveals Novel Regulation of C9ORF72 GGGGCC Repeat-Containing RNA Translation. RNA 2021, rna.078963.121. https://doi.org/10.1261/rna.078963.121.

(67) Vasudevan, S.; Steitz, J. A. AU-Rich-Element-Mediated Upregulation of Translation by FXR1 and Argonaute 2. Cell 2007, 128 (6), 1105-1118. https://doi.org/10.1016/j~.cell.2007.01.038.

(68) Vasudevan, S.; Tong, Y.; Steitz, J. A. Switching from Repression to Activation: MicroRNAs Can Up-Regulate Translation. Science 2007, 318 (5858), 1931-1934. https://doi.org/10.1126/science.1149460.

(69) Lee, A. S. Y.; Kranzusch, P. J.; Doudna, J. A.; Cate, J. H. D. EIF3d Is an MRNA Cap-Binding Protein That Is Required for Specialized Translation Initiation. Nature 2016, 536 (7614), 96-99. https://doi.org/10.1038/nature18954.

(70) Volta, V.; Pérez-Baos, S.; de la Parra, C.; Katsara, O.; Ernlund, A.; Dornbaum, S.; Schneider, R. J. A DAP5/EIF3d Alternate MRNA Translation Mechanism Promotes Differentiation and Immune Suppression by Human Regulatory T Cells. Nat Commun 2021, 12 (1), 6979. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27087-w.

(71) Ozpolat, B.; Akar, U.; Zorrilla-Calancha, I.; Vivas-Mejia, P.; Acevedo-Alvarez, M.; Lopez-Berestein, G. Death-Associated Protein 5 (DAP5/P97/NAT1) Contributes to Retinoic Acid-Induced Granulocytic Differentiation and Arsenic Trioxide-Induced Apoptosis in Acute Promyelocytic Leukemia. Apoptosis 2008, 13 (7), 915. https://doi.org/10.1007/s10495-008-0222-9.

(72) Warnakulasuriyarachchi, D.; Cerquozzi, S.; Cheung, H. H.; Holcík, M. Translational Induction of the Inhibitor of Apoptosis Protein HIAP2 during Endoplasmic Reticulum Stress Attenuates Cell Death and Is Mediated via an Inducible Internal Ribosome Entry Site Element. J. Biol. Chem. 2004, 279 (17), 17148-17157. https://doi.org/10.1074/jbc.M308737200.

(73) Liberman, N.; Marash, L.; Kimchi, A. The Translation Initiation Factor DAP5 Is a Regulator of Cell Survival during Mitosis. Cell Cycle 2009, 8 (2), 204-209. https://doi.org/10.4161/cc.8.2.7384.

(74) Alard, A.; Marboeuf, C.; Fabre, B.; Jean, C.; Martineau, Y.; Lopez, F.; Vende, P.; Poncet, D.; Schneider, R. J.; Bousquet, C.; Pyronnet, S. Differential Regulation of the Three Eukaryotic MRNA Translation Initiation Factor (EIF) 4Gs by the Proteasome. Front. Genet. 2019, 10. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00254.

(75) Bushell, M.; Poncet, D.; Marissen, W. E.; Flotow, H.; Lloyd, R. E.; Clemens, M. J.; Morley, S. J. Cleavage of Polypeptide Chain Initiation Factor EIF4GI during Apoptosis in Lymphoma Cells: Characterisation of an Internal Fragment Generated by Caspase-3-Mediated Cleavage. Cell Death Differ 2000, 7 (7), 628-636. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4400699.

(76) Blanc, V.; Davidson, N. O. APOBEC-1-Mediated RNA Editing. WIREs Systems Biology and Medicine 2010, 2 (5), 594-602. https://doi.org/10.1002/wsbm.82.

(77) Yamanaka, S.; Zhang, X.-Y.; Maeda, M.; Miura, K.; Wang, S.; Farese, R. V.; Iwao, H.; Innerarity, T. L. Essential Role of NAT1/P97/DAP5 in Embryonic Differentiation and the

Retinoic Acid Pathway. The EMBO Journal 2000, 19 (20), 5533-5541. https://doi.org/10.1093/emboj/19.20.5533.

(78) Yoshikane, N.; Nakamura, N.; Ueda, R.; Ueno, N.; Yamanaka, S.; Nakamura, M. Drosophila NAT1, a Homolog of the Vertebrate Translational Regulator NAT1/DAP5/P97, Is Required for Embryonic Germband Extension and Metamorphosis. Development, Growth & Differentiation 2007, 49 (7), 623-634. https://doi.org/10.1111/j.1440-169X.2007.00956.x.

(79) Nousch, M.; Reed, V.; Bryson-Richardson, R. J.; Currie, P. D.; Preiss, T. The EIF4G-Homolog P97 Can Activate Translation Independent of Caspase Cleavage. RNA 2007, 13 (3), 374-384. https://doi.org/10.1261/rna.372307.

(80) Harris, M. N.; Ozpolat, B.; Abdi, F.; Gu, S.; Legler, A.; Mawuenyega, K. G.; Tirado-Gomez, M.; Lopez-Berestein, G.; Chen, X. Comparative Proteomic Analysis of All-Trans-Retinoic Acid Treatment Reveals Systematic Posttranscriptional Control Mechanisms in Acute Promyelocytic Leukemia. Blood 2004, 104 (5), 1314-1323. https://doi.org/10.1182/blood-2004-01-0046.

(81) Ozpolat, B.; Akar, U.; Steiner, M.; Zorrilla-Calancha, I.; Tirado-Gomez, M.; Colburn, N.; Danilenko, M.; Kornblau, S.; Berestein, G. L. Programmed Cell Death-4 Tumor Suppressor Protein Contributes to Retinoic Acid-Induced Terminal Granulocytic Differentiation of Human Myeloid Leukemia Cells. Mol Cancer Res 2007, 5 (1), 95-108. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-06-0125.

(82) Chassé, H.; Boulben, S.; Cormier, P.; Morales, J. Translational Control of Canonical and Non-Canonical Translation Initiation Factors at the Sea Urchin Egg to Embryo Transition. International Journal of Molecular Sciences 2019, 20 (3), 626. https://doi.org/10.3390/ijms20030626.

(83) Masek, T.; Valasek, L.; Pospisek, M. Polysome Analysis and RNA Purification from Sucrose Gradients. In RNA: Methods and Protocols; Nielsen, H., Ed.; Methods in Molecular Biology; Humana Press: Totowa, NJ, 2011; pp 293-309. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-248-9_20.

(84) Ingolia, N. T.; Ghaemmaghami, S.; Newman, J. R. S.; Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science 2009, 324 (5924), 218-223. https://doi.org/10.1126/science.1168978.

(85) Bradley, S.; Narayanan, S.; Rosbash, M. NAT1/DAP5/P97 and Atypical Translational Control in the Drosophila Circadian Oscillator. Genetics 2012, 192 (3), 943-957. https://doi.org/10.1534/genetics.112.143248.

(86) Hanson, P. J.; Ye, X.; Qiu, Y.; Zhang, H. M.; Hemida, M. G.; Wang, F.; Lim, T.; Gu, A.; Cho, B.; Kim, H.; Fung, G.; Granville, D. J.; Yang, D. Cleavage of DAP5 by Coxsackievirus B3 2A Protease Facilitates Viral Replication and Enhances Apoptosis by Altering Translation of IRES-Containing Genes. Cell Death Differ 2016, 23 (5), 828-840. https://doi.org/10.1038/cdd.2015.145.

(87) Madeira, F.; Park, Y. M.; Lee, J.; Buso, N.; Gur, T.; Madhusoodanan, N.; Basutkar, P.; Tivey, A. R. N.; Potter, S. C.; Finn, R. D.; Lopez, R. The EMBL-EBI Search and Sequence Analysis Tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res 2019, 47 (W1), W636-W641. https://doi.org/10.1093/nar/gkz268.

(88) Villa, N.; Do, A.; Hershey, J. W. B.; Fraser, C. S. Human Eukaryotic Initiation Factor 4G (EIF4G) Protein Binds to EIF3c, -d, and -e to Promote MRNA Recruitment to the

Ribosome. J Biol Chem 2013, 288 (46), 32932-32940. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.517011.

(89) Lizio, M.; Harshbarger, J.; Shimoji, H.; Severin, J.; Kasukawa, T.; Sahin, S.; Abugessaisa, I.; Fukuda, S.; Hori, F.; Ishikawa-Kato, S.; Mungall, C. J.; Arner, E.; Baillie, J. K.; Bertin, N.; Bono, H.; de Hoon, M.; Diehl, A. D.; Dimont, E.; Freeman, T. C.; Fujieda, K.; Hide, W.; Kaliyaperumal, R.; Katayama, T.; Lassmann, T.; Meehan, T. F.; Nishikata, K.; Ono, H.; Rehli, M.; Sandelin, A.; Schultes, E. A.; 't Hoen, P. A.; Tatum, Z.; Thompson, M.; Toyoda, T.; Wright, D. W.; Daub, C. O.; Itoh, M.; Carninci, P.; Hayashizaki, Y.; Forrest, A. R.; Kawaji,

H.; the FANTOM consortium. Gateways to the FANTOM5 Promoter Level Mammalian Expression Atlas. Genome Biology 2015, 16 (1), 22. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0560-6.

(90) Leffers, H.; Dejgaard, K.; Celis, J. E. Characterisation of Two Major Cellular Poly(RC)-Binding Human Proteins, Each Containing Three K-Homologous (KH) Domains. European Journal of Biochemistry 1995, 230 (2), 447-453. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1995.0447h.x.

(91) Smirnova, V. V.; Shestakova, E. D.; Bikmetov, D. V.; Chugunova, A. A.; Osterman, I. A.; Serebryakova, M. V.; Sergeeva, O. V.; Zatsepin, T. S.; Shatsky, I. N.; Terenin, I. M. EIF4G2 Balances Its Own MRNA Translation via a PCBP2-Based Feedback Loop. RNA 2019, 25 (7), 757-767. https://doi.org/10.1261/rna.065623.118.

(92) Brar, G. A.; Weissman, J. S. Ribosome Profiling Reveals the What, When, Where and How of Protein Synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol 2015, 16 (11), 651-664. https://doi.org/10.1038/nrm4069.

(93) Ingolia, N. T.; Brar, G. A.; Rouskin, S.; McGeachy, A. M.; Weissman, J. S. The Ribosome Profiling Strategy for Monitoring Translation in Vivo by Deep Sequencing of Ribosome-Protected MRNA Fragments. Nature Protocols 2012, 7 (8), 1534-1550. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.086.

(94) Ingolia, N. T.; Hussmann, J. A.; Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harb Perspect Biol 2019, 11 (5), a032698. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a032698.

(95) Andreev, D. E.; O'Connor, P. B. F.; Loughran, G.; Dmitriev, S. E.; Baranov, P. V.; Shatsky,

I. N. Insights into the Mechanisms of Eukaryotic Translation Gained with Ribosome Profiling. Nucleic Acids Res 2017, 45 (2), 513-526. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1190.

(96) Robinson, J. T.; Thorvaldsdottir, H.; Winckler, W.; Guttman, M.; Lander, E. S.; Getz, G.; Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer. Nat Biotechnol 2011, 29 (1), 24-26. https://doi.org/10.1038/nbt.1754.

(97) Mi, H.; Muruganujan, A.; Ebert, D.; Huang, X.; Thomas, P. D. PANTHER Version 14: More Genomes, a New PANTHER GO-Slim and Improvements in Enrichment Analysis Tools. Nucleic Acids Research 2019, 47 (D1), D419-D426. https://doi.org/10.1093/nar/gky1038.

(98) The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology Resource: Enriching a GOld Mine. Nucleic Acids Research 2021, 49 (D1), D325-D334. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1113.

(99) Andreev, D. E.; Terenin, I. M.; Dmitriev, S. E.; Shatsky, I. N. Pros and Cons of PDNA and MRNATransfection to Study MRNATranslation in Mammalian Cells. Gene 2016, 578 (1), 1-6. https://doi.org/10.1016/j.gene.2015.12.008.

(100) Martineau, Y.; Derry, M. C.; Wang, X.; Yanagiya, A.; Berlanga, J. J.; Shyu, A.-B.; Imataka, H.; Gehring, K.; Sonenberg, N. Poly(A)-Binding Protein-Interacting Protein 1 Binds to Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 To Stimulate Translation. Molecular and Cellular Biology 2008, 28 (21), 6658-6667. https://doi.org/10.1128/MCB.00738-08.

(101) Feldman, M. E.; Apsel, B.; Uotila, A.; Loewith, R.; Knight, Z. A.; Ruggero, D.; Shokat, K. M. Active-Site Inhibitors of MTOR Target Rapamycin-Resistant Outputs of MTORC1 and MTORC2. PLOS Biology 2009, 7 (2), e1000038. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1000038.

(102) Akulich, K. A.; Andreev, D. E.; Terenin, I. M.; Smirnova, V. V.; Anisimova, A. S.; Makeeva, D. S.; Arkhipova, V. I.; Stolboushkina, E. A.; Garber, M. B.; Prokofjeva, M. M.; Spirin, P. V.; Prassolov, V. S.; Shatsky, I. N.; Dmitriev, S. E. Four Translation Initiation Pathways Employed by the Leaderless MRNA in Eukaryotes. Sci Rep 2016, 6 (1), 37905. https://doi.org/10.1038/srep37905.

(103) Blyn, L. B.; Swiderek, K. M.; Richards, O.; Stahl, D. C.; Semler, B. L.; Ehrenfeld, E. Poly(RC) Binding Protein 2 Binds to Stem-Loop IV of the Poliovirus RNA 5' Noncoding Region: Identification by Automated Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. PNAS 1996, 93 (20), 11115-11120. https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11115.

(104) Yanatori, I.; Richardson, D. R.; Toyokuni, S.; Kishi, F. The New Role of Poly (RC)-Binding Proteins as Iron Transport Chaperones: Proteins That Could Couple with Inter-Organelle Interactions to Safely Traffic Iron. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 2020, 1864 (11), 129685. https://doi.org/10.1016Zj.bbagen.2020.129685.

(105) Blyn, L. B.; Towner, J. S.; Semler, B. L.; Ehrenfeld, E. Requirement of Poly(RC) Binding Protein 2 for Translation of Poliovirus RNA. Journal of Virology 1997, 71 (8), 6243-6246. https://doi.org/10.1128/jvi.71.8.6243-6246.1997.

(106) Asnani, M.; Pestova, T. V.; Hellen, C. U. T. Initiation on the Divergent Type I Cadicivirus IRES: Factor Requirements and Interactions with the Translation Apparatus. Nucleic Acids Research 2016, 44 (7), 3390-3407. https://doi.org/10.1093/nar/gkw074.

(107) Asnani, M.; Pestova, T. V.; Hellen, C. U. T. PCBP2 Enables the Cadicivirus IRES to Exploit the Function of a Conserved GRNA Tetraloop to Enhance Ribosomal Initiation Complex Formation. Nucleic Acids Research 2016, 44 (20), 9902-9917. https://doi.org/10.1093/nar/gkw609.

(108) Walter, B. L.; Nguyen, J. H.; Ehrenfeld, E.; Semler, B. L. Differential Utilization of Poly(RC) Binding Protein 2 in Translation Directed by Picornavirus IRES Elements. RNA 1999, 5 (12), 1570-1585.

(109) Han, W.; Xin, Z.; Zhao, Z.; Bao, W.; Lin, X.; Yin, B.; Zhao, J.; Yuan, J.; Qiang, B.; Peng, X. RNA-Binding Protein PCBP2 Modulates Glioma Growth by Regulating FHL3. J Clin Invest 2013, 123 (5), 2103-2118. https://doi.org/10.1172/JCI61820.

(110) Davis, C. A.; Hitz, B. C.; Sloan, C. A.; Chan, E. T.; Davidson, J. M.; Gabdank, I.; Hilton, J. A.; Jain, K.; Baymuradov, U. K.; Narayanan, A. K.; Onate, K. C.; Graham, K.; Miyasato, S. R.; Dreszer, T. R.; Strattan, J. S.; Jolanki, O.; Tanaka, F. Y.; Cherry, J. M. The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE): Data Portal Update. Nucleic Acids Research 2018, 46 (D1), D794-D801. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1081.

(111) Van Nostrand, E. L.; Pratt, G. A.; Shishkin, A. A.; Gelboin-Burkhart, C.; Fang, M. Y.; Sundararaman, B.; Blue, S. M.; Nguyen, T. B.; Surka, C.; Elkins, K.; Stanton, R.; Rigo, F.; Guttman, M.; Yeo, G. W. Robust Transcriptome-Wide Discovery of RNA-Binding Protein Binding Sites with Enhanced CLIP (ECLIP). Nat Methods 2016, 13 (6), 508-514. https://doi.org/10.1038/nmeth.3810.

(112) Van Nostrand, E. L.; Pratt, G. A.; Yee, B. A.; Wheeler, E. C.; Blue, S. M.; Mueller, J.; Park, S. S.; Garcia, K. E.; Gelboin-Burkhart, C.; Nguyen, T. B.; Rabano, I.; Stanton, R.; Sundararaman, B.; Wang, R.; Fu, X.-D.; Graveley, B. R.; Yeo, G. W. Principles of RNA Processing from Analysis of Enhanced CLIP Maps for 150 RNA Binding Proteins. Genome Biology 2020, 21 (1), 90. https://doi.org/10.1186/s13059-020-01982-9.

(113) Dmitriev, S. E.; Andreev, D. E.; Adyanova, Z. V.; Terenin, I. M.; Shatsky, I. N. Efficient Cap-Dependent Translation of Mammalian MRNAs with Long and Highly Structured 5'-Untranslated Regions in Vitro and in Vivo. Mol Biol 2009, 43 (1), 108-113. https://doi.org/10.1134/S0026893309010154.

(114) Tsujimoto, Y.; Cossman, J.; Jaffe, E.; Croce, C. M. Involvement of the Bcl-2 Gene in Human Follicular Lymphoma. Science 1985. https://doi.org/10.1126/science.3874430.

(115) Cleary, M. L.; Smith, S. D.; Sklar, J. Cloning and Structural Analysis of CDNAs for Bcl-2 and a Hybrid Bcl-2/Immunoglobulin Transcript Resulting from the t(14;18) Translocation. Cell 1986, 47 (1), 19-28. https://doi.org/10.1016/0092-8674(86)90362-4.

(116) Sherrill, K. W.; Byrd, M. P.; Eden, M. E. V.; Lloyd, R. E. BCL-2 Translation Is Mediated via Internal Ribosome Entry during Cell Stress. J. Biol. Chem. 2004, 279 (28), 29066-29074. https://doi.org/10.1074/jbc.M402727200.

(117) Seto, M.; Jaeger, U.; Hockett, R. D.; Graninger, W.; Bennett, S.; Goldman, P.; Korsmeyer, S. J. Alternative Promoters and Exons, Somatic Mutation and Deregulation of the Bcl-2-Ig Fusion Gene in Lymphoma. EMBO J 1988, 7 (1), 123-131.

(118) Shahid, R.; Bugaut, A.; Balasubramanian, S. The BCL-2 5' Untranslated Region Contains an RNA G-Quadruplex-Forming Motif That Modulates Protein Expression. Biochemistry 2010, 49 (38), 8300-8306. https://doi.org/10.1021/bi100957h.

(119) Smirnova, V. V.; Shestakova, E. D.; Nogina, D. S.; Mishchenko, P. A.; Prikazchikova, T. A.; Zatsepin, T. S.; Kulakovskiy, I. V.; Shatsky, I. N.; Terenin, I. M. Ribosomal Leaky Scanning through a Translated UORF Requires EIF4G2. Nucleic Acids Research 2022, 50 (2), 11111127. https://doi.org/10.1093/nar/gkab1286.

(120) Waterhouse, A. M.; Procter, J. B.; Martin, D. M. A.; Clamp, M.; Barton, G. J. Jalview Version 2—a Multiple Sequence Alignment Editor and Analysis Workbench. Bioinformatics 2009, 25 (9), 1189-1191. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp033.

(121) Severin, J.; Lizio, M.; Harshbarger, J.; Kawaji, H.; Daub, C. O.; Hayashizaki, Y.; Bertin, N.; Forrest, A. R. R. Interactive Visualization and Analysis of Large-Scale Sequencing Datasets Using ZENBU. Nat Biotechnol 2014, 32 (3), 217-219. https://doi.org/10.1038/nbt.2840.

(122) Michel, A. M.; Fox, G.; M. Kiran, A.; De Bo, C.; O'Connor, P. B. F.; Heaphy, S. M.; Mullan, J. P. A.; Donohue, C. A.; Higgins, D. G.; Baranov, P. V. GWIPS-Viz: Development of a Ribo-Seq Genome Browser. Nucleic Acids Research 2014, 42 (D1), D859-D864. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1035.

(123) Toth, E.; Weinhardt, N.; Bencsura, P.; Huszar, K.; Kulcsar, P. I.; Talas, A.; Fodor, E.; Welker, E. Cpf1 Nucleases Demonstrate Robust Activity to Induce DNA Modification by Exploiting Homology Directed Repair Pathways in Mammalian Cells. Biology Direct 2016, 11 (1), 46. https://doi.org/10.1186/s13062-016-0147-0.

(124) Sergeeva, O.; Sergeev, P.; Melnikov, P.; Prikazchikova, T.; Dontsova, O.; Zatsepin, T. Modification of Adenosine196 by Mettl3 Methyltransferase in the 5'-External Transcribed Spacer of 47S Pre-RRNA Affects RRNA Maturation. Cells 2020, 9 (4), 1061. https://doi.org/10.3390/cells9041061.

(125) Wiederschain, D.; Wee, S.; Chen, L.; Loo, A.; Yang, G.; Huang, A.; Chen, Y.; Caponigro, G.; Yao, Y.-M.; Lengauer, C.; Sellers, W. R.; Benson, J. D. Single-Vector Inducible Lentiviral RNAi System for Oncology Target Validation. Cell Cycle 2009, 8 (3), 498-504. https://doi.org/10.4161/cc.8.3.7701.

(126) Ran, F. A.; Hsu, P. D.; Wright, J.; Agarwala, V.; Scott, D. A.; Zhang, F. Genome Engineering Using the CRISPR-Cas9 System. Nat Protoc 2013, 8 (11), 2281-2308. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.143.

(127) Ostareck, D. H.; Ostareck-Lederer, A.; Wilm, M.; Thiele, B. J.; Mann, M.; Hentze, M. W. MRNA Silencing in Erythroid Differentiation: HnRNP K and HnRNP E1 Regulate 15-Lipoxygenase Translation from the 3' End. Cell 1997, 89 (4), 597-606. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80241-X.