Изоцитратлиаза из сои: очистка, каталитические характеристики, идентификация генов icl1 и icl2 и регуляция их экспрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Чан Тхи Хоанг Куен

• Чан Тхи Хоанг Куен
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чан Тхи Хоанг Куен

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение глиоксилатного цикла, динамика активности изоцитратлиазы в растениях и её изоферментный состав.

1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла.

1.1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла у растений.

1.1.1.2. Распространение глиоксилатного цикла у микроорганизм ов.

1.1.1.3. Распространение глиоксилатного цикла у животных.

1.1.2. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях.

1.1.3. Изоферментный состав.1.

1.2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы.

1.3. Анализ схемы очистки изоцитратлиазы.

1.3.1. Разрушение клеток и экстракция.

1.3.2. Фракционирование солями.

1.3.3. Гель-фильтрация.

1.3.4. Аффинная хроматография.

1.3.5. Ионообменная хроматография.

1.4. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы.

1.4.1. Колебание значений константы Михаэлиса-Ментен.

1.4.2. Значения рН оптимума.

1.4.3. Величины температурного оптимума.

1.4.4. Влияние катионов металлов.

1.4.5. Действие метаболитов.

1.5. Молекулярные аспекты функционирования изоферментов изоцитратлиазы.

1.5.1. Идентификация генов изоцитратлиазы.

1.5.2. Роль дифференциальной экспрессии генов в адаптации и развитии организмов и факторы экспрессии.

1.5.2.1. Роль дифференциальной экспрессии генов.

1.5.2.2. Факторы экспрессии.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1. Схема очистки изоцитратлиазы.

2.2.2.1.1. Получение экстрактов.

2.2.2.1.2 Высаливание сульфатом аммония.

2.2.2.1.3. Гель-фильтрация на сефадексе С-25.

2.2.2.1.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

2.2.2.1.5. Гель-хроматография на сефадексе 0-150.

2.2.2.2. Определение активности ферментов.

2.2.2.3. Определение количества белка.

2.2.2.4. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.2.2.5. Электрофоретические исследования.

2.2.2.5.1. Определение гомогенности ферментов.

2.2.2.5.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы.

2.1.2.5.3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом ЗБЗ-ПААГ-электрофореза.

2.2.2.6. Субклеточная локализация изоцитратлиазы.

2.2.2.6.1. Дифференциальное центрифугирование.

2.2.2.6.1. Изоплотностное центрифугирование.

2.2.2.7. Кинетические характеристики и регуляция активности ферментов.

2.2.2.7.1. Величины константы Михаэлиса-Ментен.

2.2.2.7.2. Значения рН оптимума.

2.2.2.7.3. Влияние катионов металлов на активность изоформ.

2.2.2.7.4. Регуляция метаболитами.

2.2.2.8. Разработка условий длительного хранения изоцитратлиазы.

2.2.2.9. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии.

2.2.2.9.1. Экстракция суммарной РНК по методу фенол-хлороформной экстракции.

2.2.2.9.2. Экстракция суммарной РНК помощью колонок Bio-Rad.

2.2.2.9.3. Выделение геномной ДНК с мочевиной.

2.2.2.9.4. Определение количества РНК.

2.2.2.9.5. Определение количества ДНК.

2.2.2.9.6. Проведение обратной транскрипции мРНК.

2.2.2.9.7. Подбор праймеров.

2.2.2.9.8. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.2.2.9.9. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени.

2.2.2.9.10. Выделение ДНК из полиакриламидных гелей.

2.2.2.9.11. Секвенирование ПЦР-продукта.

2.2.2.9.12 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот.

2.2.2.10. Статистическая обработка данных.

2.3. Результаты и их обсуждение.

2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои разных сортов.

2.3.2. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои.

2.3.3. Очистка изоцитратлиазы из сои разных сортов.

2.3.3.1. Очистка изоцитратлиазы из сои вьетнамского сорта

DT-84».

2.3.3.2. Очистка изоцитратлиазы из сои сорта Воронежский-31».

2.3.3.3. Очистка изоцитратлиазы из сои белорусского сорта «Игорь».

2.3.4. Электрофоретический анализ очищенных препаратов изоцитратлиазы.

2.3.5. Физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики.

2.3.5.1. Молекулярная масса и субъединичное строение изоформ изоцитратлиазы.

2.3.5.2. Влияние концентрации изоцитрата на активность изоцитратлиазы.

2.3.5.3. Значения pH оптимума.

2.3.5.4. Влияние катионов металлов на активность изоформ.

2.3.5.4. Влияние глицина и гликолата на активность изоферментов изоцитратлиазы.

2.3.6. Условия длительного хранения изоцитратлиазы.

2.3.7. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии.

2.3.7.1. Подбор праймеров.

2.3.7.2. Идентификация генов методом ОТ-ПЦР.

2.3.7.3. Секвенирование ПЦР-продуктов.

2.3.7.4. Уровень экспрессии генов icl¡ и ich в онтогенезе проростков сои.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изоцитратлиаза из сои: очистка, каталитические характеристики, идентификация генов icl1 и icl2 и регуляция их экспрессии»

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Глиоксилат-ный цикл выступает важнейшим этапом глюконеогенеза, т. к. осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой в дальнейших реакциях, что обеспечивает синтез углеводов. Этот метаболический процесс имеет широкое распространение в природе, функционируя в различные физиологические периоды жизни многих организмов. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. У высших растений малатсинтаза и, особенно, изоцитратлиаза присутствуют в тканях, активно утилизирующих жиры. Обычно активность глиоксилатного цикла коррелирует с содержанием жира в семенах. Епринцев А. Т. с соавт. (2007) показали, что при прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые дальше транспортируются к метаболически активным точкам, где утилизируются в энергетических и анаболических процессах. Физиологическая роль глиоксилатного цикла для растений — важный этап глюконеогенеза, обеспечивающий растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества [12].

Ключевыми ферментами глиоксилатного цикла являются изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1) и малатсинтаза. Изоцитратлиаза — фермент «метаболической вилки», как правило, является матриксным ферментом глиоксисом [19]. ИЦЛ легко высвобождается из органелл после осмотического шока, причём при наличии нескольких изоформ фермента никаких различий в их локализации не наблюдалось. Ферменты в одинаковой степени солюбилизируются из глиоксисом в растворимую фракцию при выделении органелл и одинаково хорошо освобождаются из них при осмотическом шоке. При градиентном фракционировании клеточных органелл процент солюбилизации изоцитратлиазы из глиоксисом оказывался неодинаковым для разных растений. В семядолях сои было обнаружено две формы изоцитратлиазы в глиоксисомах. Однако, в настоящее время, в ряде работ показано, что в зелёных листьях изоцитратлиаза локализована в пероксисомальной фракции [88]. В клетке могут одновременно присутствовать пероксисомальная и глиоксисомальная ИЦЛ, выполняющие по всей видимости, различные функции в метаболизме растительной клетки [141]. Два уникальных фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза присутствуют в развивающихся семенах, листьях, пыльце и в других органах (корни, лепестки и плоды), а также в различных типах клеточных культур и т. д. После прорастания важнейшей функцией масличной пероксисомы в АгаЫс1ор31$ зр. является трансформация жирных кислот в углеводы до начала фотоавтотрофного роста. Ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза преобразуют ацетил-КоА из жирных кислот в субстраты глюконеогенеза и находятся в пероксисомах зрелых проросших семян и саженцев [117].

К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, грибов [ЮЗ], высших растений [19], нематод [118], клещей [101], насекомых [10] и крыс [157]. Известно, что изоцитратлиаза в растениях представлена несколькими изоформами, имеющими различную локализацию в клетке.

В последнее время сообщается об использовании этого фермента при диагностике заболеваний растений. Так, Бауер П. С соавт. (Р. Во\ууег е1. а1., 2000) показали, что созданная ими конструкция гибрида промотора гена ИЦЛ АТеигоярога сгазяа с геном флуоресцирующего белка, экспрессировалась и заметно индуцировалась во время инфекции в паразите пшеницы Тарез1а уа11ипс1ае [53].

В настоящее время одной из важнейших культур в растительном мире признана соя, семена которой являются великолепной комбинацией жирных кислот и высокоценного растительного белка, в связи с чем служат объектом большого количества исследований. Отличительной особенностью сои является самое высокое содержание фосфолипидов по сравнению с другими культурами. Фосфолипиды способствуют регенерации мембран, увеличивают детоксика-ционную способность печени, обладают антиоксидантной активностью, снижают у диабетиков потребность в инсулине, предотвращают дегенеративные изменения в нервных клетках, мышцах, укрепляют капилляры. Полиненасыщенные жирные кислоты являются предшественниками в биосинтезе гормоноподобных веществ —- простагландинов, одной из многочисленных функций которых является препятствование отложению холестерина в стенках кровеносных сосудов, приводящего к образованию атеросклеротических бляшек. Наличие очень большого количества токоферолов в соевом масле обусловливает его способность в наибольшей степени повышать защитные свойства организма, замедлять старение. Поэтому представляется чрезвычайно важным охарактеризовать регуляторные свойства, ферментов сои в прорастающих семенах и особенно при смене типов питания.

Цель работы. Целью нашей работы являлось получение в гомогенном состоянии препаратов изоформ изоцитратлиазы из сои, изучение их физико-химических, регуляторных и кинетических характеристик, выявление генетической детерминированности и исследование уровня экспрессии генов изоцитратлиазы у прорастающих семян. Задачи исследования.

1. Выявить динамику активности, изоферментный состав и субклеточную локализацию изоцитратлиазы в проростках сои.

2. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоцитратлиазы из проростков сои.

3. Изучить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиазы.

4. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов ИЦЛ с использованием методов сравнительной геномики.

5. Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.

6. Секвенировать участки генов изоферментов изоцитратлиазы из сои и провести сравнительный анализ с генами ИЦЛ других организмов.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов изоцитратлиазы сои на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои и условий выращивания.

Полученные результаты изучения субклеточной локализации изоцитратлиазы позволяют предположить, что в клетке изоцитратлиаза может находиться в глиоксисомальной, пероксисомальной и цитоплазматической фракциях. Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, тогда как в цитоплазме активность фермента находится в пределах загрязнения.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков сои позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики.

В данной работе праймеры для амплификации гена ИЦЛ были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов изоцитратлиазы из различных организмов. Секвенирование полученных в ходе ПЦР продуктов показало, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т. е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью.

Выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов и 1с12 от времени прорастания семян и зеленения проростков сои. Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

Практическая значимость. С помощью четырёхстадийной очистки с высокой эффективностью можно получать электрофоретически гомогенные препараты изоформ изоцитратлиазы. Использование изоформ ИЦЛ, выделенных из семядолей семян сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности, для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, спецкурсов по энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на студенческой научной конференции по итогам работы за 2006 год (ВГПУ, 2007), 12-й международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология — наука 21-ого века» (Пущино,

2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2007, 2008, 2009, 2010).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях — 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (212 источников). Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 6 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Чан Тхи Хоанг Куен

ВЫВОДЫ

1. Динамика активности изоцитратлиазы из Glycine max L. сортов «Воронежский-31», вьетнамского «DT-84» и белорусского «Игорь» показала, что она имеет колоколообразный вид. Максимальные значения активности изоцитратлиазы при прорастании сои на свету наблюдали на 5-й день у вьетнамского сорта «DT-84» и сорта «Воронежский-31», на 3-й день — у растений белорусского сорта «Игорь». В темноте картина динамики активности отличается только у растений сорта «Воронежский-31».

2. В семядолях проростков сои присутствуют две формы фермента — ИЦЛ, с относительной электрофоретической подвижностью Rf— 0,28 и ИЦЛ2 с. Rf— 0,44. Исследуемый фермент имеет преимущественно пероксисо-мальную локализацию, поскольку величина активности фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения. Функции выделенных изоформ в семядолях семян сои различны: первая изоформа обеспечивает функционирование глиоксилатного цикла, а вторая участвует в метаболизме органических кислот.

3. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить гомогенные препараты изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Так, параметры препаратов фермента из сои вьетнамского сорта «DT-84» составили: удельная активность ИЦЛ1 2,50 Е/мг белка, при этом степень очистки 62,50 раза; выход — 9,77 %. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности равнялось 3,56 Е/мг белка, а степень очистки — 89,00 раз; выход — 10,87 %.

4. Значения молекулярной массы первого изофермента составляло 272 кДа, а второго — 246 кДа. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и SDS-ПААГ-электрофореза было установлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц, т. е. являются гомотетрамерами с молекулярной массой субъединиц 66 кДа. Выделенные изоферменты отличались по электрофоретической подвижности и четвертичной структуре.

5. Механизм ферментативного действия изучаемого фермента подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Значения константы Михаэлиса, характеризующие сродство изоцитратлиазы к субстрату (изоцитрату), для первой изоформы составляли 16 мкМ, для второй изоформы — 50 мкМ, т. е. первый изофермент обладает большим сродством к субстрату.

6. Комплекс Mg2+ с изоцитратом является истинным субстратом ИЦЛ. Глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ,) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие одно- и двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы.

7. Влияние различной концентрации фотодыхательных метаболитов — глицина и гликолата на активность изоформы ИЦЛ показало, что глицин активировал ИЦЛ, в концентрации 5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к понижению активности фермента. Максимальную активность - ИЦЛ ( наблюдали в присутствии гликолата с концентрацией 100 мкМ. Было обнаружено, что ИЦЛ2 проявляла наибольшую активность при 5 мкМ концентрации глицина и гликолата.

8. Были использованы различные методики выделения РНК. Подобранные нами праймеры позволили получить два ПЦР-продукта гена изоцитратлиазы.

9. Секвенирование полученных ампликонов подтвердило их специфичность, а методами сравнительной геномики было установлено, что гомология гена icl 1 с кДНК ИЦЛ Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004 и кДНК ИЦЛ Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069 составляет 98,3 % и 97,9 %, соответственно. Для icl2 она равняется 98,5 % и 88,2 % гомологии с кДНК Glycine max GMFL01-09-J11 и кДНК Glycine max GMFL01-15-P18, соответственно.

10. Динамика экспрессии генов ici] и icl2 при прорастании семян и зеленении проростков сои показала, что относительные концентрации транскриптов генов ici 1 и icl2 являются максимальными на 3-й день экспозиции, а к 6-му дню значительно снижаются. К 9-му дню наблюдается отсутствие транскрипции ici], в то время как уровень экспрессии icl2 возрастает, что обусловлено физиологическим переходом (зеленением), вызывающим доминирование фотосинтеза и снижение интенсивности глюконеогенеза. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с динамикой активности изоферментов ИЦЛ в сое при прорастании, являясь одним из важных механизмов их функциональной регуляции.

И. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоферментов изоцитратлиазы в сое, показывающая, что функциональный переход растений к автотрофному питанию вызывает интенсификацию экспрессии icl2. Функционирование данного изофермента (ИЦЛ2) не связано с работой глиоксилатного цикла.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает сортовую специфичность, обусловленную их генотипическими свойствами. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои и условий выращивания.

Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, активность фермента в цитоплазме находится в пределах значений загрязнения. В некоторых публикациях есть сообщения, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое связано с глиоксисомаль-ной и пероксисомальной фракциями. В момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов [68].

С помощью многостадийной очистки можно получать в электрофотрети-чески гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом концентрации КС1 позволило получить в высокоочищенном состоянии две изоформы изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. с Rf — 0,28 (ИЦЛ,) и Rf — 0,44 (ИЦЛ2) и провести их сравнительный анализ. Использование изоформ изоцитратлиазы, выделенных из семядолей сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах [47, 183].

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из семян сои позволило провести сравнительное исследование физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоцитратлиазы. Установлено, что основные свойства изучаемого фермента мало отличаются по своим характеристикам (молекулярной массе, сродству к различным субстратам, рН оптимуму, влиянию катионов металлов и т. д.) от ИЦЛ из других организмов. Было выявлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц с молекулярной массой 66 кДа, т. е. являются гомотетрамерами. Согласно большинству данных литературы, изоцитратлиаза из других объектов, как правило, имеет чётное число субъединиц с молекулярной массой 60 кДа. Выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы изоцитратлиазы обладают различным сродством к субстрату. Это свидетельствует, главным образом, о различии форм изоцитратлиазы, что позволяет предположить их различную генетическую детерминированность [135]. Было выявлено, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ[) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие одно- и двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Полученные нами данные коррелируют с результатами, проведёнными на других объектах исследования. ИЦЛ, выделенной из семядолей проростка Lupinus, необходимо присутствие Mg2+ тоже в концентрации 5 мМ, при этом достигается максимальная активация ИЦЛ [203].

Большое внимание было уделено молекулярным аспектам функционирования изоферментов изоцитратлиазы, т. е. идентификации генов ici! и icl2 и регуляции их экспрессии. В нашей работе был использован метод подбора праймеров по последовательности нуклеотидов из различных организмов. Нам удалось получить два продукта гена изоцитратлиазы. Было выявлено, что в семенах сои существуют два гена ИЦЛ — ici 1 и icl2.

Нуклеотидная последовательность iclj имеет 98,3 % гомологию с к ДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004; 97,9% — Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069. У второго продукта была прочитана последовательность длиной 594 н.п. Эта последовательность нуклеотидов на 98,5 % соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01-09-J11 и 88,2 % — Glycine max GMFL01-15-P18. Полученные продукты отличаются по своему нуклеотидному составу друг от друга и имеют гомологию между собой 19,9 %. Следовательно, наличие двух форм фермента и двух ПТ IP-продуктов с геноспецифическими праймерами является результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме сои.

В данной работе выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов iclj и icl2 от времени прорастания семян и в процессе зеленения проростков сои. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с полученными данными о суммарной активности ИЦЛ в сое при прорастании, и, вероятно, является одним из механизмов её регуляции. После зеленения семядолей сои, уровень экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию, резко снижается, и преобладает фотодыхательная деятельность пероксисом [68]. Данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

На основании полученных результатов разработана гипотетическая схема участия изоферментов изоцитратлиазы в регуляции мобилизации запасных жиров и фотодыхания в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода. Установлена различная генетическая детерминированность изоформ исследуемого фермента. Предполагается, что функционирование в клетках зелёных растений ИЦЛ2 не связано с работой глиоксилатного цикла (рис. 36).

ЖЁЛТЫЕ (ЭТИОЛИРОВАННЫЕ^ СЕМЯДОЛИ

Глутамат — 2-ОГ •

Изоцитрат ицл2

Глицин Гликолат

Глиоксилат?-^-Глицин-V»- Глицин

Глутамат н,о

2-ОГ о2

-----Глицерат-^-1^^^" Серии ----Серии

ФОТОДЫХАНИЕ ЗЕЛЁНЫХ СЕМЯДОЛЕЙ

Рис. 36. Гипотетическая схема участия изоферментов ИЦЛ в мобилизации запасных жиров и фотодыхании в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода.

ГЦ — глиоксилатный цикл, ТАГ — триацилглицерол, ЖК — жирные кислоты, ФЕП — фосфоренол пиру ват, 2-ОГ — 2-оксоглутарат, 1 — липаза, 2 — малатдегидрогеназа, 3 — цитратсинтаза, 4 — аконитатгидра-таза, 5 — изоцитратлиаза (ИЦЛ,), 6 — малатсинтаза, Р — рибулёза-бисфосфаткарбоксилаза, Г — гликолатоксидаза, К — каталаза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чан Тхи Хоанг Куен, 2010 год

1. Айала Ф. Современная генетика в 3-х т. / Ф. Айала. — М.: Мир, 1988. — 998 с.

2. Березин И. В. Основы физической химии ферментативного катализа / И. В. Березин, К. Мартинек. — М.: Высш. шк., 1977. — 280 с.

3. Березов Т. Т. Биологическая химия: Учебник.— 3-е изд., перераб. и доп. / Т. Т. Березов, Б. Ф.Коровкин. —М.: Медицина, 1998. — 704 с.

4. Волвенкин С. В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С. В. Волвенкин, В. Н. Попов, А. Т. Епринцев // Биохимия. — 1999. — Т. 64, Вып. 9. —С. 1185-1191.

5. Гродзинский А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. —- Киев: Наукова думка, 1973. — 273 с.

6. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970. — 173 с.

7. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб; перевод с англ. Л. М. Гинодмана, М. И. Левянт; под ред. В. К. Антонова, А. Е. Браунштейна. — М.: Мир, 1982. — 1117 с.

8. Епринцев А. Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А. Т. Епринцев, Е. А. Москалёв, В. Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинскихсистемах. — 2001. — T. 54, №1. — С. 9-14.

9. Епринцев А. Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. // Биохимия. — 2004. — Т. 69, № 4. — С. 467-472.

10. Епринцев А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — Воронеж.: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. —224с.

11. Епринцев А. Т. Глиоксилатный цикл: Универсиальный механизм адаптации? / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. — 228 с.

12. Землянухин JL А. Очистка и свойства изоцитратлиазы из подсолнечника / JI. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1984. — Т. 49, Вып. 3. — С. 387-393.

13. Землянухин А. А. Регуляция активности изоцитратлиазы в растениях конопли / А. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев // Физиология растений. — 1985. — Т. 32, Вып. 4. — С. 739-746.

14. Землянухин А. А. Глиоксилатный цикл растений / А. А. Землянухин, JI. А. Землянухин, А. Т. Епринцев, А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1986. — 148 с.

15. Землянухин А. А. Большой практикум по физиологии растений. Учеб. пособие / А. А. Землянухин / JI. А. Землянухин. — Воронеж: ВГУ, 1996. — 188с.

16. Игамбердиев А. У. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин, И. В. Мещерякова // Физиология растений. — 1986. — Т. 33, Вып.6. — С. 1113-1120.

17. Игамбердиев А. У. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1987. — Т. 52, Вып. 8. — С. 1286-1293.

18. Игамбердиев А. У. Микротельца в метаболизме растений / А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1990. — 148 с.

19. Игамбердиев А. У. Роль пероксисом в организации метаболизма растений / А. У. Игамбердиев // Соросовский Образовательный журнал. — 2000.—Т. 6, № 12. —С. 113-124.

20. Климова М. А. Физико-химические и кинетические характеристики изоцитратлиазы из МасвомопаБ ШрипММа / М. А. Климова // Весник ВГУ. Серия. Химия, Биология, Фармация. — 2004. — №2. ■— С. 139-141.

21. Климова А. Т. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств: Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) / М. А. Климова, А. Т. Епринцев. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 2008,— 36 с.

22. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности / Ф. Коэн — Москва: Мир, 1986. — 144 с.

23. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. — Москва: Высшая школа, 1990. — 352 с.

24. Лебкова Н. П. Субстратное обеспечение энергетического гомеостаза при голодании / Н. П. Лебкова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1991. — № 11. — С.475-480.

25. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер. — М.: Мир, 1985. — 1056 с.

26. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. — М.: Мир, 1984. — 480с.

27. Маслова Е. В. Субклеточная локализация активности изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е. В. Маслова, Д. Н. Федорин, В. Ю. Башмаков и др. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. — 2007. — №2. —С. 71-74.

28. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр / Пер. с англ. — Москва: Мир, 1971. —222 с.

29. Остерман JI. А. Исследование биологических макромолекул / Л. А. Остерман. — Москва: Мир, 1983. — 297 с.

30. Северина С. Е. Практикум по биохимии / С. Е. Северин, Г. А. Соловьева. — М.: Изд-во МГУ. — 1989. — 509 с.

31. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. — М.: Изд-во Мир. — 1985. —358 с.

32. Соколовский В. Ю. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crassa / В. Ю. Соколовский, Т. А. Белозерская // Успехи биол.химии. — 2000. — Т. 40. — С. 85-152.

33. Страйер Л. Биохимия; Пер. с англ. / Л. Страйер. — М.: Мир, 1984 — Т. 1 — 232 с.

34. Чернышов Г. А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г. А. Чернышев, В. H Стариков. — Воронеж: ВГУ, 1998. — 270 с.

35. Чиков В. И. Фотодыхание / В. И. Чиков // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. — № 11. — С. 2-8

36. Шевченко М. Ю. Выделение и очистка изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / M. Ю. Шевченко, Е. А. Москалёв, А. Т. Епринцев // Биология — наука XXI века: Материалы 7-й Пущинской конф. молодых учёных, Пущино. — 2003. — Т. 1. — С. 390-391.

37. Шевченко М. Ю. Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов Gallus domesticus L. / M. Ю. Шевченко и др. // Сорбционные хроматографи-ческие процессы . — 2006. — Т. 6, Вып. 5. — С. 851-854.

38. Abba S. The role of the glyoxylate cycle in the symbiotic fungus Tuber borchii:expression analysis and subcellular localization/ S. Abba // Biomedical and Life Sciences. — 2007. — Vol. 52, No. 3-4. — P. 159-170.

39. Arai Y. Proteomic Analysis of Highly Purified Peroxisomes from Etiolated Soybean Cotyledons / Y. Arai // Plant and Cell Physiology. — 2008.— Vol. 49, I. 4. — P. 526-539.

40. Asakura M. Multiple Contributions of Peroxisomal Metabolic Function to Fungal Pathogenicity in Colletotrichum lagenarium / M. Asakura, T. Okuno, Y. Takano // Applied and Environmental Microbiology. — 2006. — Vol. 72, No. 9. — P. 6345-6354.

41. Atomi H. Peroxisomal Isocitrate Lyase of the «-Alkane-Assimilating Yeast: Gene Analysis and Characterization / H. Atomi et. al. // Journal of Biochemistry. — 1990. — Vol. 107, No. 2. — 262 p.

42. Bahk Y. Y. Acidic isocitrate lyase from Acinetobacter calcoaceticus Grown on malonat / Y. Y. Bahk // Korean Biochem. — 1987. — Vol. 20, No. 2. — P. 191-197.

43. Bailon P. Affinity chromatography. Methods and protocols / P. Bailon // Humana Press. — 2000. — 240 p.

44. Bassi A. S. Carbon Paste Biosensor Based on Crude Soybean Seed Hull Extracts for Phenol Detection / A. S. Bassi, C. McGrath // J. Agric. Food Chem. — 1999. — Vol. 47. — P. 322-326.

45. Beeching J. R. Nucleic acid (cDNA) and amino acid sequences of isocitrate lyase from castor bean / J. R. Beeching // Plant Molecular Biology. — 1987. — Vol. 8, No. 6. —P. 471-475.

46. Bellion E. Two Distinct Isocitrate Lyases from a Pseudomonas Species / E. Bellion // J Bacteriol. — 1975. — Vol. 122, No. 2. — P. 557-564.

47. Bentrup K. H. Z. Characterization of Activity and Expression of Isocitrate Lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis / K. H. Z. Bentrup //Journal of Bacteriol. — 1999. — Vol. 181, No. 23. — P. 7161-7167.

48. Birnboim H. C. A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinant plasmid DNA / H. C. Birnboim, J. Doly // Nucleic Acid Res. — 1979,—Vol. 7. —P. 1513-1523.

49. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B. L. Jailkhani // J Biol Chem. — 1979. — Vol. 254. — P. 12488-12493.

50. Bowyer P. Use of an isocitrate lyase promoter—GFP fusion to monitor carbon metabolism of the plant pathogen Tapesia yallimdae during infection of wheat / P. Bowyer, E. Mueller, J. Lucas // Mol. Plant Pathol. — 2000. — V. 1, No. 1.—P. 253-262.

51. Britton K. L. The structure and domain organization of Escherichia coli isocitrate lyase / K. L. Britton // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. — 2001.—Vol. 57, Part9.—P. 1209-1218.

52. Cánovas D. Developmental regulation of the glyoxylate cycle in the human pathogen Penicillhtm marneffei / D. Cánovas, A. Andrianopoulos // Mol Microbiol. —2006. —Vol. 62, No. 6. —P. 1725-1738.

53. Chaves R. S. Isocitrate lyase localisation in Saccharomyces cerevisiae cells / R. S. Chaves//Gene. — 1997. —Vol. 198,1. 1-2. —P. 165-169.

54. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / Chomczynski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162. — P. 156-159

55. Cioni M. Comparative biochemistry of the glyoxylate cycle / M. Cioni, G. Pinzauti, P. Vanni // Comp. Biochem. Physiol. — 1981. — Vol.70, No. 1. — P. 1-26.

56. Comai L. Coordinate Expression of Transcriptionally Regulated Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes in Brassica napus L / L. Comai // The Plant Cell. — 1989.—Vol. 1,1 3.— P. 293-300.

57. Davis B. J. A new high-resolution electrophoresis method / B. J. Davis, L. Ornstein // Delivered at the society for the study at the New York Academy of Medicine. — 1959.—P. 112-118.

58. Davis W. L. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment / W. L. Davis, J. L. Matthews, D. B. Goodman // Faseb J. — 1989. — Vol. 3. — P. 1651-1655.

59. Davis W. L. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue / W. L. Davis, D. B. Goodman, L. A. Crawford // Biochim Biophys Acta. — 1990. — Vol. 1051, No. 3. — P. 276-278.

60. Davis W. L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W. L. Davis, D. B. Goodman // Source Anatomical Record. — 1992. — V. 234, No. 4. — P. 461-468.

61. De Bellis L. Localization of glyoxylate-cycle marker enzymes in peroxisomes of senescent leaves and green cotyledons / L. De Bellis, P. Picciarelli, L. Pistelli // Planta. — 1990. — Vol. 180, No. 3. — P. 435-439.

62. De Hoop M. J. Import of proteins into peroxisomes and other microbodies / M. J. De Hoop, A. B. Geert // Biochem J. — 1992. — Vol. 286. — P. 657-669.

63. De Lucas J. R. Purification and properties of isocitrate lyase from Aspergillus nidulans, a model enzyme to study catabolite inactivation in filamentous fungi / J. R. De Lucas et. al. // Microbiol. — 1997. — Vol. 101. — P. 410414.

64. Delkin G. Specific elements of the glyoxylate pathway play a significant role in the functional transition of the soybean cotyledon during seedling development / G. Delkin, L. Vodkin // BMC Genomics. — 2007. — Vol. 8, No. 468.—P. 1-22.

65. Dunn M. F. Major roles of isocitrate lyase and malate synthase in bacterial and fungal pathogenesis / M. F. Dunn, J. A. Ramírez-Trujillo, I. Hernández-Lucas // Microbiology. —2009. —Vol. 155,1. 10.—P. 3166-3175.

66. Eastmond P. J. Postgerminative growth and lipid catabolism in oilseeds lacking the glyoxylate cycle / P. J. Eastmond, V. Germain, P. R. Lange // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97,1. 10. — P. 5669-5674.

67. Eprintsev A. T. Physicochemical and kinetic characteristics of isoforms of isocitrate lyase from corn / A. T. Eprintsev, E. V. Maslova, D. N. Fedorin et. al. // Biochemistry (Mosc). — 2009. — Vol. 74,1. 5. — P. 528-532.

68. Ernesto J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / J. Ernesto // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638-644.

69. Eubel H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis / H. Eubel, L. J. Heazlewood, A. H. Millar // Plant Proteomics, Methods in Molecular Biology. — 2007. — Vol. 355. — P. 49-62.

70. Fargeix C. Soybean (Glycine max L.) and bacteroid glyoxylate cycle activities during nodular senescence / C. Fargeix, K. Gindro, F. Widmer // J. Plant Physiol. — 2004. — Vol. 161. — P. 183-190.

71. Fernandez E. The ICL1 gene from Saccaaromyces cerevisiae II E. Fernandez, F. Moreno // Biochem. — 1992. — Vol. 204, No. 1. — P. 983-990.

72. Firenzuoli A. M. Enzymes of glyozylate cycle in conifers / A. M. Firenzuoli, P. Vanni, E. Mastronuzzi // Plant Physiol. — 1968. — V. 43, No. 7. — P. 11251128.

73. Forster A. Overexpression of the ICL1 gene changes the product ratio of citricacid production by Yarrowia lipolytica // A. Forster et. al. // Appl Microbiol Biotechnol. — 2007. — Vol. 77, No. 4. — P. 861-870.

74. Frevert J. Purification and Glycoprotein Nature of Glyoxysomal Isocitrate Lyase from Cucumber Cotyledons / J. Frevert, H. Kindl // Eur J Biochem. — 1978. — Vol. 92. — P. 35-43.

75. Frevert J. Occurrence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds / J. Frevert, W. Koller, H. Kindl // Physiol.Chem. — 1980. — Vol. 361, No. 10.—P. 1557-1565.

76. Gemmrich A. R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern Anemia phyllitids / A. R. Gemmrich // Phytochemistry. — 1979. — Vol. 18, No. 6. — P. 1143-1146.

77. Giachetti E. Effect of Mg2+ and Mn2+ on isocitrate lyase, a non-essentially metal-ion-activated enzyme A graphical approach for the discrimination of the model for activation / E. Giachetti, P. Vanni // Biochem J. — 1991. — Vol. 276. — P. 223-230.

78. Godavari H. R. Isocitrate lyase in green leaves / H. R. Godavari// Plant Physiol. — 1973. — Vol. 51, No. 6 — P. 863-867.

79. Goodman D. B. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone / D. B. Goodman, W. L. Davis, R. G. Jones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1980. — Vol. 77, No. 3. — P. 1521-1525.

80. Guo Y. Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence / Y. Guo et. al. // Plant Cell EnViron. — 2004. — Vol. 27. — P. 521-549.

81. Hashimoto K. Peroxisomal localization of a myosin XI isoform in Arabidopsis thaliana / K. Hashimoto, H. Igarashi, S. Mano et. al. // Plant Cell Physiol. — 2005. — Vol. 46. — P. 782-789.

82. Hayashi M. Functional transformation of plant peroxisomes / M. Hayashi, K. Toriyama, M. Kondo et. al. // Cell Biochemistry and Biophysics. — 2000. — Vol. 32,1. 1-3.—P. 295-304.

83. Hayashi M. Arabidopsis thaliana — A model organism to study plantperoxisomes / M. Hayashi, M. Nishimura // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). —2006.—Vol. 1763,1. 12. — P. 1382-1391.

84. Holmes R. P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver / R. P. Holmes // Biochim. Biophys. Acta. — 1993. — Vol. 1158. —P. 47-51.

85. Hou W. C. Activity staining of isocitrate lyase after electrophoresis on either native or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels / W. C. Hou et. al. // Electrophoresis. — 2001. — Vol. 22, No. 13. — P. 2653-2658.

86. Hoyt J. C. Purification and Characterization of Acinetobacter calcoaceticus Isocitrate Lyase / J. C. Hoyt // J Bacteriol. — 1991. — Vol. 173, No. 21. — P. 6844-6848.

87. Hunt L. Subcellular Localization of Isocitrate Lyase in Nongreen Tissue Culture Cells / L. Hunt // Plant Physiology. — 1978. — Vol. 61. — P. 10101013.

88. Hynes M. J. Genetic Analysis of the Role of Peroxisomes in the Utilization of Acetate and Fatty Acids in Aspergillus nidulans / M. J. Hynes // Genetics. — 2008. —Vol. 178.—P. 1355-1369.

89. Idnurm A. Isocitrate Lyase Is Essential for Pathogenicity of the Fungus Leptosphaeria maculans to Canola (Brassica napus) / A. Idnurm, B. J. Howlett // Eukaryot Cell. — 2002. — Vol. 1, No. 5. — P. 719-724.

90. Idnurm A. Peroxisome Function Regulates Growth on Glucose in the Basidiomycete Fungus Cryptococcus neoformans / A. Idnurm // Eukdaryotic Cell. — 2007. — Vol. 6, No. 1. — P. 60-72.

91. Ishii A. Isozymes of Isocitrate Dehydrogenase from an Obligately Psychrophilic Bacterium, Vibrio Sp. Strain ABE-1: Purification,and

92. Modulation of Activities by Growth Conditions / A. Ishii // The Journal of Biochemistry. — 1987. — Vol. 102,1. 6. — P. 1489-1498.

93. John P. C. L. The Purification and Properties of Isocitrate Lyase from Chlorella / P. C. L. John // Biochem J. — 1967. — Vol. 105, No. 1. — P. 409416.

94. Kamel M. Y. Biochemical studies of tick embriogenesis. Purification and partial characterisation of isocitrate lyase from eggs of the tick Hyalomma dromedarii / M. Y. Kamel, A. S. Fahmy // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1982.—Vol. 72. —P. 107-115.

95. Karlekar K. Salt mediated changes in some enzymes of carbohydrate metabolism in halotolerant Cladosporium sphaerospermum / K. Karlekar, T. V. Parekh, H. S. Chhatpar 11 Journal of Biosciences. — 1985. — Vol. 9, No. 3-4.—P. 197-201.

96. Kazuo N., Amano Y., Nakadate M. // Ferment and Bioeng. 1989. — V. 67. No. 3. —P. 153-157.

97. Khan F. R. Purification and properties of isocitrate lyase from flax seedlings / F. R. Khan, M. Saleemuddin, M. Siddiqi et. al. //Arch. Biochem. Biophys. — 1977.—Vol. 183. —P. 13-23.

98. Khan F. R. McFadden B. A. Embryogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett. — 1980.-Vol. 115. —P. 312-314.

99. Khan F. R. Isocitrate Lyase from Flax. Terminal Residues, Composition, Active Site, and Catalysis / F. R. Khan, B. A. McFadden // Plant Physiol. — 1982. — Vol. 70, No. 4. — P. 943-948.

100. Kochlcina V. M. Isolation, Purification, and Crystallization of Aspartate Aminotransferase from Wheat Grain / V. M. Kochkina // Biochemistry

101. Moscow). — 2004. — Vol. 69, No. 8. — P. 897-900.

102. Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature. — 1957. — Vol.179. — P. 988-991.

103. Kretzschmar U. Function and transcriptional regulation of the isocitrate lyase in Pseudomoncis aeruginosa / U. Kretzschmar et. al. // Arch Microbiol. — 2008.—Vol. 190, No. 2.—P. 151-158.

104. Kunze M. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function / M. Kunze, I. Pracharoenwattana, S. M. Smith et. al. // Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763.—P. 1441-1452.

105. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during te assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680-683.

106. Large P. J. Subcellular location of the enzymes of purine breakdown in theyeast Candida famata grown on uric acid / P. J. Large, H. R. Waterham, M. Veenhuis // FEMS Microbiology Letters. — 1990. — Vol. 72, I. 3. — P. 303307.

107. Lee M. S. Oilseed isocitrate lyases lacking their essential type 1 peroxisomal targeting signal are piggybacked to glyoxysomes / M. S. Lee, R. T. Mullen, R. N. Trelease // Plant Cell. — 1997. — Vol. 9. — P. 185-197.

108. Li J. Differential expression of isocitrate lyase in P. marneffei phagocytized by nonstimulated and stimulated murine macrophages / J. Li et. al. // Chinese. — 2007. — Vol. 27, No. 5. — P. 631-634.

109. Lin S. F. Purification, Identification, and Characterization of Peanut Isocitrate Lyase / S. F. Lin, P. L. Ong, C. R. Jhou et. al. // J Agric Food. Chem. —2008. — Vol. 26. — P. 1845-1851.

110. Lingard M.J. Peroxisome-associated matrix protein degradation in Arabidopsis / M. J. Lingard, M. Monroe-Augustus, B. Bartel // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2009. — Vol. 106, No. 11. — P. 45614566.

111. Liu F., Thatcher J. D., Epstein H. F. // Biochemistry. — 1997. — V. 36, No. 1. — P. 255-260.

112. Liu S. Crystal structures of 2-methylisocitrate lyase in complex with product and with isocitrate inhibitor provide insight into lyase substrate specificity, catalysis and evolution / S. Liu et. al. // Biochemistry. — 2005. — Vol.44. — P. 2949-2962.

113. Lopez M. Enzyme activity and dynamics in near-anhydrous conditions / M. Lopez, V. Kurkal-Siebert, R. Dunn //. Nature proceedings. — 2009. — hdl: 10101/npre.2009.3884.1.

114. Lopez-Boado Y. S. Purification of isocitrate lyase from Saccharomyces cerevisiae / Y. S. Lopez-Boado, P. Herrero, M. Fernandez et. al. // Yeast. — 1988. — Vol. 4, Issue 1. — P. 41-46.

115. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosenbourgh, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. — 1951.—V. 194. —P. 265-275.

116. Luttik A. H. The Saccharomyces cerevisiae ICL2 Gene Encodes a Mitochondrial 2-Methylisocitrate Lyase Involved in Propionyl-Co-A Metabolism / A. H. Luttik et. al. // Journal of Bacteriology. — 2000. — Vol. 182, No. 5. —P. 7007-7013

117. MacKintosh C. Purification and regulatory properties of isocitrate lyase from Escherichia coli ML308 / C. MacKintosh, H. G. Nimmo // Biochem J. — 1988. — Vol. 250. —P. 25-31.

118. Maharjan R. P. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation / R. P. Maharjan et. al. // Res Microbiol. — 2005. — Vol.156, No. 2. — P. 178-183.

119. Malhotra 0. P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm / O. P. Malhotra, P. K. Srivastava // Arch Biochem Biophys. — 1982.—Vol. 214,No. 1. —P. 164-171.

120. Mano S. Plant peroxisomes / S. Mano, N. Nishimura // Vitam Horm. — 2005. —Vol. 72. —P. 111-154.

121. Masaaki U. Properties of isocitrate lyase from an alkane-utilizable yeast, Candida tropicalis I / U. Masaaki, M. Ueda, T. Matsuki et. al. // Agr. And Biol. Chem.— 1986.— Vol. 50, No. 1.—P. 127-134.

122. Mateos R. M. Peroxisomes from pepper fruits (Capsicum annuum L.): purification, characterisation and antioxidant activity / R. M. Mateos // J Plant Physiol.—2003.—Vol. 160,1. 12. —P. 1507-1516.

123. Masayoshi M. Isolation, Hyperexpression, and Sequencing of the ace A Gene Encoding Isocitrate Lyase in Escherichia coli / M. Masayoshi // J. of Bacteriology. — 1988. — Vol. 170,1. 10. — P. 4528-4536.

124. McFadden B. A. Itaconate, an Isocitrate Lyase-Directed Inhibitor in Pseudomonas indigofera / B. A. McFadden // J Bacteriol. — 1977. —Vol. 131, No. 1.—P. 136-144.

125. McKinney J. D. Persistanse of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase / J. D. McKinney, Z. U. Honer, K. Bentrup // Nature. — 2000. — Vol. 406. — P. 735738.

126. Mullen R. T. Isocitrate lyase from germinated loblolly pine megagametophytes: enzyme purification and immunocharacterization / R. T. Mullen, D. J.

127. Gifford // Plant Physiol, and Biochem. — 1995. — Vol. 33, No. 1. — P. 87-95.

128. Muñir E. New role for glyoxylate cycle enzymes in wood-rotting basidiomycetes in relation to biosynthesis of oxalic acid / E. Muñir, J. Yoon , T. Tokimatsu et. al. // Journal of Wood Science. — 2001. — Vol. 47, No. 5. — P. 368-373.

129. Muñoz-Elias E. J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / E. J. Muñoz-Elias, J. D. McKinney // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638-644.

130. Nguyen A. T. Metal-catalyzed oxidation induces carbonylation of peroxisomal proteins and loss of enzymatic activities / A. T. Nguyen, R. P. Donaldson // Arch Biochem Biophys. — 2005. — Vol.439, No.l. — P. 25-31.

131. Nishimura M. Leaf peroxisomes are directly transformed to glyoxysomes during senescence of pumpkin cotyledons / M. Nishimura, Y. Takeuchi, L. De Bellis, I. Hara-Nishimura // PROTOPLASMA. — 1993. — Vol. 175, No. 3-4,—P. 131-137.

132. Nyathi Y. Plant peroxisomes as a source of signalling molecules / Y. Nyathi, A. Baker//Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763,1. 12. —P. 1478-1495.

133. Okay ama H. High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama // Methods Enzymol. — 1987. — Vol. 154. — P. 3-28.

134. Olsen L. J. Targeting of Glyoxysomal Proteins to Peroxisomes in Leaves and

135. Roots of a Higher Plant / L. J. Olsen, W. F. Ettinger, B. Damsz et. al. // Plant Cell. — 1993. — Vol. 5,1. 8. — P. 941-952.

136. Ono K. Purification and Characterization of Isocitrate Lyase from Ethanol-grown Euglena gracilis / K. Ono, M. Okihashi, H. Inui // Journal of Eukaryotic Microbiology. — 1994 . — Vol. 41,1. 6. — P. 536-539.

137. Ono K. Presence of glyoxylate cycle enzymes in the mitochondria of Euglena gracilis / K. Ono, M. Kondo, T. Osafune // Journal of Eukaryotic Microbiology. —2003. — Vol. 50,1. 2. — P. 92-96.

138. Onyeocha I. Targeting of castor bean glyoxysomal isocitrate lyase to tobacco leaf peroxisomes / I. Onyeocha, R. Behari, D. Hill, A. Baker // Plant Mol Biol. — 1993. — Vol. 22. — P. 385-396.

139. Palma J. M. Proteome of plant peroxisomes: new perspectives on the role of these organelles in cell biology / J. M. Palma, F. J. Corpas, L. A. del Rio // Proteomics. — 2009. — Vol. 9. — P. 2301-2312.

140. Phue J. N. Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli B (BL21) and E. coli K (JM109) / J. N. Phue, J. Shiloach // J. Biotechnol. — 2004. — Vol. 109, No. 2. —P. 21-30.

141. Piekarska K. The activity of the glyoxylate cycle in peroxisomes of Candida albicans depends on a functional (3-oxidation pathway: evidence for reduced metabolite transport across the peroxisomal membrane / K. Piekarska, G.

142. Hardy, E. Mol et. al. // Microbiology. — 2008. — Vol. 154. — P. 30613072.

143. Pinzauti G. Isocitrate lyase of conifers {Pinus pined) / G. Pinzauti, E. Giachetti, P. Vanni // Int. J. Biochem. — 1982. — Vol.14, No. 4. — P. 267-275.

144. Piques M. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis / M. Piques, W. X. Schulze, M. Hôhne et. al. // Mol Syst Biol. — 2009. — Vol. 5, No. 314.

145. Pistelli L. Effect of Leaf Senescence on Glyoxylate Cycle Enzyme activities / L. Pistelli, P. Perata, A. Alpi // Australian Journal of Plant Physiology. — 1992. — Vol. 19, tto. 6. — P. 723-729.

146. Pistelli L. Evidences of glyoxylate cycle in peroxisomes of senescent cotyledons / L. Pistelli // Plant Sci. — 1995. — Vol. 109, No. 1. — P. 13-21.

147. Polanowski A. J. Soybean isocitrate lyase: Purification, immunoassay and N-terminal sequence / A. J. Polanowski, R. L. Obendorf // Plant Physiol. Biochem. — 1991. — Vol. 29. — P. 119-129.

148. Popov V.N. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation / V. N. Popov, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger et. al. // FEBS Lett. — 1996. — Vol. 390. — P. 258-260.

149. Popov V.N. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V. N. Popov, S. V. Volvenkin, A. T. Eprintsev // FEBS Lett. — 1998. — Vol. 440. — P. 55-58.

150. Pracharoenwattana I. When is a peroxisome not a peroxisome? / I. Pracharoenwattana, S. M. Smith // Trends Plant Sci. — 2008. — Vol. 13. — P. 522-525.

151. Ranaldi F. Multisite Inhibition of Pinns pinea Isocitrate Lyase by Phosphate / F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Plant Physiol. — 2000. — Vol. 124. — P. 1131-1138.

152. Ranaldi F. Enzyme catalysis in microgravity: steady-state kinetic analysis of the isocitrate lyase reaction, F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Biophys

153. Chem. —2003.— Vol. 103.— P. 169-177.

154. Reeves H. C. Determination of isocitrate lyase activity in poly aery lamide gels / H. C. Reeves, M. J. Volk // Anal. Biochem. — 1972. — Vol. 48, No. 2. — P. 437-441.

155. Regev-Rudzki N. Yeast Aconitase in Two Locations and Two Metabolic Pathways: Seeing Small Amounts Is Believing / N. Regev-Rudzki, S. Karniely, N. N. Ben-Haim et. al. // MBoC in Press. — 2005. — Vol. 16, I. 9. — P. 4163-4171.

156. Rehman A. Cysteine 195 has a critical functional role in catalysis by isocitrate lyase from Escherichia coli / A. Rehman, B. A. McFadden // Curr. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — P. 267-269

157. Reiss U. Isocitrate lyase from the free-living nematode, Turbatrix aceti.

158. Purification and properties / U. Reiss, M. Rothstein // Biochemistry. —1974. — Vol. 13. —P. 1796-1800.

159. Reynolds S. J. Regulation of expression of the cucumber isocitrate lyase gene in cotyledons upon seed germination and by sucrose / S. J. Reynolds, S. M. Smith // Plant Molecular Biology. — 1995. — Vol. 29, No. 5. — P. 885-896.

160. Rickie B. T. Ontogeny of cotton seeds: gametogenesis, embryogenesis, germination, and seedling growth / B. T. Rickie, K. D. Chapman // Physiology of cotton. — 2010. — P. 332-341.

161. Robertson E. F. Purification and characterization of isocitrate lyase from Escherichia coli / E. F. Robertson, H. C. Reeves // Current microbiology. — 1986 . —Vol. 14, No. 6. — P. 347-350.

162. Rua J. Isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus. The role of Mg2+ ions, kinetics and evidence for two classes of modifiable thiol groups / J. Rua, D. de

163. Arriaga, F. Busto et. al. // Biochem J. — 1990 . — Vol. 272. — P. 359-367.

164. Rubin H. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Suum ascaris larvae / H. Rubin, R. N. Trelease // J Cell Biol. — 1976. — Vol. 70. — P. 374-383.

165. Ruchti M. Isocitrate Lyase from Germinating Soybean Cotyledons: Purification and Characterization / M. Ruchti, F. Widmer // Journal of Experimental Botany. — 1986. — Vol. 37, No. 1. — P. 1685-1690.

166. Sariaslani F. S. Control of Isocitrate Lyase in Nocardia salmonicolor / F. S. Sariaslani, A. W. Westwood, I. J. Higgins // Journal of General Microbiology. — 2001. — Vol. 91. — P. 315-324.

167. Schnarrenberger C. Development of microbodies in sunflower cotyledons and castor bean endosperm during germination / C. Schnarrenberger, A. Oeser, N.E. Tolbert // Plant Physiol. — 1971. — Vol. 48, No. 5. — P. 566-574.

168. Schöbel F. Aspergillus fumigatus Does Not Require Fatty Acid Metabolism via Isocitrate Lyase for Development of Invasive Aspergillosis Felicitas / F. Schöbel, O. Ibrahim-Granet, R Ave // Infection and Immunity. — 2007. — Vol. 75,No. 3.—P. 1237-1244.

169. Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistence factor of Mycobacterium tuberculosis / V. Sharma, H. Bentrup, J. D. McKinney et. al. // Nat. Struct. Biol. — 2000. — Vol.7. — P. 663-668.

170. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide / A. Shevchenko, H. Wilm, O. Vorm // Anal. Chem. — 1996. —Vol. 68.—P. 850-858.

171. Shi L. Hydrogen peroxide biosensor based on direct electrochemistry of soybean peroxidase immobilized on single-walled carbon nanohorn modified electrode / L. Shi, X. Liu, W. Niu, H. Li et. al. // Biosens Bioelectron. — 2009. —Vol. 24, —P. 1159-1163.

172. Shiio I. Isocitrate lyase from Pseudomonas indigoferal. Preparation, amino acid composition and molecular weight / I. Shiio, T. Shiio, B. A. McFadden // Biochim. Biophys. Acta. — 1965. — Vol. 96,1. 1. — P. 114-122.

173. Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round worm Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. — 2000. — Vol. 7. — P. 233-236.

174. Simanshu D. K. Crystal structure of Salmonella typhimurium 2-methylisocitrate lyase (PrpB) and its complex with pyruvate and Mg2+ / D. K. Simanshu et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. —Vol. 311.— P. 193-201.

175. Singh V. K. Kinetic modeling of tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypassin Mycobacterium tuberculosis, and its application to assessment of drug targets / V. K. Singh, I. Ghosh // Theor Biol Med Model. — 2006.

176. Sjogren R. E. Evidence for Multiple Forms of Isocitrate Lyase in Neurospora crassa / R. E. Sjogren, A. H. Romano // J Bacteriol. — 1967. —■ Vol. 93. — R 1638-1643.

177. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? / S. Song // Med. Hypotheses. — 2000. — Vol. 54. — P. 739-747.

178. Stabenau H. Glycolate metabolism in green algae / H. Stabenau, U.Winkler // Physiologia Plantarum. — 2005. — Vol. 123,1. 3. — P. 235-245.

179. Surendranathan K. K. Properties of an Mg2 ^-independent isocitrate lyase from gamma irradiated preclimacteric banana {Musa cavendishii) / K. K. Surendranathan, P. M. Nair // Proc. Indian Acad. Sci. — 1978. — Vol. 87, Ser. B, No. 4.— P. 119-126.

180. Taylor K. M. Localization and targeting of isocitrate lyases in Saccharomyces cerevisiae / K. M. Taylor, C. P. Kaplan, X. Gao // Biochem J. — 1996. — Vol. 319.—P. 255-262.

181. Theologis A. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana / A. Theologis et. al. //Nature. — 2000. — Vol. 408. — P. 816-820.

182. Turley R. B. Characterization of a cDNA clone encoding the complete amino acid sequence of cotton isocitrate lyase / R. B. Turley, S. M. Choe, R. N.

183. Trelease // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Gene Structure and Expression. — 1990. —Vol. 1049,-1. 2. —P. 223-226.

184. Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. — 2003. —Vol. 31. —P. 105-109. .

185. Uhrigshardt H. Evidence for an operative glyoxylate cycle in the thermoacidophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius / H. Uhrigshardt et. al. // FEBS Lett. — 2002. — Vol. 513. — P. 223-229.

186. Van den Bosch H. Biochemistry of peroxisomes / H. Van den Bosch // Annual Review of Biochemistry. — 1992. — Vol. 61. — P. 157-197.

187. Vanni P. Studies on isocitrate lyase isolated from Lupinus colyledons / P. Vanni, M. T. Vincenzini, F. M. Nerozz et. al. // Can. J. Biochem. — 1979. — Vol.57, No. 9. —P. 1131-1137.

188. Vincenzin M. T. Isolation and properties of isocitrate lyase from Lupinus seed/ M. T. Vincenzini, F. Nerozzi, F. F. Vincieri // Phytochemistry. — 1980. — Vol. 19,1. 5, — 1980, P. 769-774.

189. Volvenkin S. V. Subcellular Localization and Properties of Glyoxylate Cycle Enzymes in the Liver of Rats with Alloxan Diabetes / S. V. Volvenkin, V. N. Popov, A. T. Eprintsev // Biochemistry (Mosc). — 1999. — Vol. 64. — P. 994-999.

190. Wall D. M. Isocitrate Lyase Activity Is Required for Virulence of the1.tracellular Pathogen Rhodococcits equi / D. M. Wall, P. S. Duffy, C. DuPont // Infect Immun. — 2005. — Vol. 73. — P. 6736-6741.

191. Watanabe S. Purification and Characterization of a Cold-adapted Isocitrate Lyase and a Malate Synthase from Colwellia maris, a Psychrophilic Bacterium / S. Watanab // Biosci Biotechnol Biochem. — 2001. — Vol. 65. — P. 1095-1103.

192. Wolfson P. J. Inhibition of Isocitrate Lyase: the Basis for Inhibition of Growth of Two Arthrobacter Species by Pyruvate / P. J. Wolfson, T. A. Krulwich // Journal of bacteriology. — 1972. — P. 356-364.

193. Zhang J. Z. Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes from Brassica napus L. Are Active in Pollen / J. Z. Zhang, D. L. Laudencia-Chingcuanco, L. Comai et. al. // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104,1. 3. — P. 857-864.

194. Zhang J. Z. DNA sequences that activate isocitrate lyase gene expression during late embryogenesis and during postgerminative growth / J. Z. Zhang, C. M. Santes, M. L. Engel et. al. // Plant Physiol. — 1996. — Vol. 110,1. 4. — P. 1069-1079.