Изменения конформации и окислительно-восстановительного состояния цитохромов дыхательной цепи митохондрий в препаратах in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Никельшпарг Эвелина Ильинична

• Никельшпарг Эвелина Ильинична
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Никельшпарг Эвелина Ильинична

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение электрон-транспортной цепи митохондрий

1.1.1. Окислительное фосфорилирование

1.1.2. Функционирование переносчиков электронов дыхательной цепи

1.1.3. Цитохромы дыхательной цепи митохондрий

1.1.1. Окислительно-восстановительное состояние цитохромов при работе дыхательной цепи

1.1.2. Взаимодействие цитохрома С с редокс-партнерами

1.1.3. Организация комплексов ЭТЦ в респирасомы

1.1.4. Кардиолипин во внутренней мембране митохондрий

1.2. Механизмы регуляции электронного транспорта

1.2.1. Разобщение электронного транспорта и синтеза АТФ

1.2.2. Морфология митохондрий

1.2.3. Митохондрии в условиях гипоксии. Роль АФК

1.2.4. Регуляция электронного транспорта путем посттрансляционной модификации компонентов ЭТЦ

1.3. Спектроскопия комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния для исследования митохондрий

1.3.1. Принцип метода КР

1.3.2. Принцип метода ГКР

1.3.3. Спектроскопия КР изолированных митохондрий

1.3.4. Спектроскопия КР клеток

1.3.5. Спектроскопия ГКР клеток и биологических молекул

1.3.6. Определение конформации гемов методами КР и ГКР

2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

3. МЕТОДЫ

3.1. Получение наноструктур

3.1.1. Синтез наноструктур типа серебряных колец

3.1.2. Синтез наноструктур SiO2-Ag

3.2. Подготовка препаратов

3.2.1. Выделение митохондрий

3.2.2. Получение липосом

3.2.3. Получение субмитохондриальных частиц (СМЧ)

3.2.4. Культивирование клеточной линии НСТ116

3.3. Протоколы экспериментов

3.3.1. Регистрация спектров ГКР

3.3.2. Регистрация спектров КР живых клеток

3.3.3. Регистрация спектров КР миоцитов

3.3.4. Регистрация спектров КР сосудов мозга

3.3.5. Измерение дзета-потенциала (Z-потенциала)

3.3.6. Измерение потребления кислорода митохондриями методом оксиметрии

3.3.7. Определение окислительно-восстановительного состояния цитохромов митохондрий абсорбционной и дифференциальной абсорбционной спектроскопией

3.3.8. Качественное определение потенциала на внутренней митохондриальной мембране митохондрий

3.3.9. Статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Разработка подхода на основе ГКР для исследования конформации гема цитохрома С в функционирующих митохондриях

4.1.1. Структура спектра ГКР интактных митохондрий

4.1.2. Спектр ГКР митохондрий представляет собой спектр цитохрома С, но не других цитохромов

4.1.3. Вклад липидов в спектр ГКР митохондрий

4.1.4. Влияние различных факторов на спектры ГКР митохондрий

4.1.5. Сравнение резонансного и предрезонасного спектра ГКР митохондрий

4.1.6. Воспроизводимость спектров ГКР митохондрий в зависимости от типа наноструктур

4.1.7. Наноструктуры серебра не влияют на активность митохондрий и интактность внутренней мембраны в условиях эксперимента ГКР

4.1.8. Электростатические взаимодействия в системе наноструктуры-митохондрии не влияют на спектры ГКР митохондрий

4.1.9. Спектроскопия ГКР митохондрий позволяет селективно исследовать гем окисленного цитохрома С

4.1.10. На спектр ГКР митохондрий в подобранных условиях эксперимента оказывает влияние только состояние митохондрий

4.1.11. Детализация пиков на спектре ГКР митохондрий

4.1.12. Спектроскопические маркеры для детектирования конформационных изменений гема цитохрома С

4.2. Изучение конформационных изменений гема цитохрома С при модуляции активности электронного транспорта в митохондриях

4.2.1. Влияние субстратов и разобщителей на спектр ГКР митохондрий

4.2.2. Сближение мембран приводит к увеличению интенсивности сигнала ГКР митохондрий

4.2.3. Определение чувствительности спектров ГКР митохондрий к электрохимическому потенциалу на внутренней мембране

4.2.4. Определение чувствительности спектров ГКР митохондрий к скорости потребления кислорода митохондриями

4.3. Изучение изменений конформации гема цитохрома С в липосомах в ответ на изменения мембранного потенциала

4.4. Исследование окислительно-восстановительного состояния и конформации гемов цитохромов в живых клетках

4.5. Исследование окислительно-восстановительного состояния цитохромов в клетках при накоплении липидов

4.5.1. Разработка подхода для одновременного исследования состояния цитохромов и липидов в миоцитах

4.5.2. Исследование состояния липидов в миоцитах

4.5.3. Исследование состояния митохондрий в миоцитах

4.5.4. Корреляции между содержанием липидов в клетках и состоянием митохондрий

4.6. Мониторинг степени оксигенации крови in vivo методом КР

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Регуляция конформации гема цитохрома С

5.1. Гипотетические механизмы регуляции конформации гема цитохрома С в митохондриях

5.2. Плоская и скрученная конформация гема цитохрома С как потенциальный регулятор активности электронного транспорта

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

[Fe-S] - железосерный кластер

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

FCCP - карбоцианид 4-(трихлорметокси) фенилгидразон (carbonyl cyanide-

4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)

HIF-1 - Hypoxia-inducible factor

pCMF - 4-карбоксиметил4-фенилаланин

Q/QH2 - хинон/хинол

SDT - дитионит натрия

UCP - разобщающий белок (uncoupling protein)

- разность электрических потенциалов на мембране Ар - протон-движущая сила

АМФ/АДФ/АТФ/Ф - аденозин моно-/ди-/три-/фосфат АФК - активные формы кислорода Вал - валиномицин

ГКР (КР) - гигантское комбинационное рассеяние (комбинационное рассеяние)

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ЖК - жирные кислоты

ИК - инфракрасный

ММП - межмембранное пространство

НАД(Ф) - никотинамиддинуклеотид (фосфат)

СССР - карбоцианид m-хлорфенилгидразон ^arbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)

ТРИС - трисаминометан

ФАД - флавинадениндинуклеотид

цитА, цитВ, цитС - цитохромы А, В, С, соответственно

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПФ (ETF) - электронпереносящим флавопротеин (electron transporting flavoprotein)

ЭТЦ - электрон-транспортная (дыхательная) цепь

Для обозначения аминокислотных остатков в работе используются трехбуквенные и

однобуквенные обозначения в соответствии с номенклатурой Международного союза

теоретической и прикладной химии (IUPAC):

Аланин Ala A

Аргинин Arg R

Аспарагин Asn N

Аспарагиновая кислота Asp Б

Валин Val V

Гистидин His н

Глицин ^у G

Глутамин Ш

Глутаминовая кислота Glu Е

Изолейцин Па I

Лейцин Leu L

Лизин Lys К

Метионин Ме1 М

Пролин Рго Р

Серин Бег Б

Тирозин Туг У

Треонин ТЬг Т

Триптофан Тгр

Фенилаланин РЬе Б

Цистеин Cys С

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменения конформации и окислительно-восстановительного состояния цитохромов дыхательной цепи митохондрий в препаратах in vitro и in vivo»

ВВЕДЕНИЕ

Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ), или дыхательная цепь митохондрий осуществляет синтез АТФ, за счет энергии которого реализуется большинство биохимических процессов в клетках. Помимо энергетической функции митохондрии участвуют в продукции активных форм кислорода (АФК), инициации апоптоза, регуляции концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме, биосинтезе жирных кислот (ЖК) и т.д.

ЭТЦ митохондрий представлена пятью комплексами, расположенными во внутренней мембране. Организация, конформация, окислительно-восстановительное (редокс) состояние, взаимодействие с мембранами комплексов ЭТЦ определяет эффективность переноса электронов, скорость продукции АТФ и генерацию активных форм кислорода (АФК). Только один из переносчиков ЭТЦ не связан со внутренней мембраной митохондрий и диффундирует в межмембранном пространстве (ММП) - гем-содержащий белок цитохром С (цитС). ЦитС переносит электрон от цитС1 в комплексе Ш на СиА сайт комплекса IV - терминальной оксидазы ЭТЦ митохондрий. Также именно цитС участвует в инициации апоптоза.

В последнее время все больше обсуждается важность конформационной подстройки белковой части цитохромов относительно своих редокс-партнеров для осуществления электрон-транспортной функции. При этом, важна не только правильная ориентация и конформация сайтов связывания белков, но и конформация гемов. Так как цитС является единственным мобильным переносчиком электронов в ММП, можно предположить, что на него в большей степени оказывает влияние локальное окружение (рН, ионный состав и размер ММП и т.д.), которое меняется при функционировании ЭТЦ, что, в свою очередь, может определять эффективность электронного транспорта от комплекса III к IV. Данный вопрос как правило исследуют в условиях in vitro на выделенных комплексах ЭТЦ, однако наибольший интерес представляет исследование данных процессов в состоянии, максимально приближенном к естественному (нативном), так как при выделении комплексов ЭТЦ могут происходить значительные изменения их конформации и редокс-потенциала. Кроме того, в митохондриях комплексы ЭТЦ функционируют в условиях молекулярного краудинга, что не учитывается при исследовании изолированных комплексов.

Мы предполагаем, что эффективность переноса электрона в ЭТЦ митохондрий может изменяться в условиях in vivo в зависимости от активности электронного транспорта, при этом, конформационные изменения гемов цитохромов могут иметь не последнее значение в регуляции данного процесса. В данной работе было проведено исследование изменений окислительно-восстановительного состояния и конформации гема цитохромов С- и В-типа при модуляции активности ЭТЦ изолированных митохондрий и митохондрий в составе клеток и предложены механизмы регуляции электрон-транспортной активности цитС в зависимости от общей активности дыхательной цепи и величины потенциала внутренней митохондриальной мембраны.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение электрон-транспортной цепи митохондрий

1.1.1. Окислительное фосфорилирование

Окислительное фосфорилирование - заключительный этап катаболизма аэробных организмов. В клетках эукариот окислительное фосфорилирование происходит в митохондриях. В этом процессе участвует ряд комплексов внутренней мембраны митохондрий и подвижные переносчики. В результате перемещения электронов по электрон-транспортной цепи (ЭТЦ, или дыхательной цепи) происходит создание электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрий (Д¥ и АрН), который является также протондвижущей силой для производства АТФ (Ар). Этот процесс впервые был описан П. Митчеллом (Нобелевская премия по химии, 1978 г.) и назван хемиосмотической теорией [1]. Общая схема процесса представлена на рисунке 1.

1.1.2. Функционирование переносчиков электронов дыхательной цепи

В живых клетках первым этапом метаболизма глюкозы является гликолиз, который происходит в цитоплазме. В результате гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется 2 пирувата и вырабатывается 2 АТФ и 2 НАДН. Однако внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для НАДН, но проницаема для пирувата. Пируват поступает в матрикс митохондрий, где преобразуется в ацетилкофермент А (Ацетил-КоА), который поступает в цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот, ЦТК). В ходе цикла Кребса в матриксе митохондрий на 1 пируват вырабатывается 4 молекулы НАДН, которые окисляются I комплексом дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий. Кроме того, превращение сукцината в фумарат - одна из реакций цикла Кребса - катализируется II комплексом дыхательной цепи. Таким образом, во время работы дыхательной цепи электроны от восстановительных эквивалентов перемещаются по цепи переносчиков внутренней мембраны митохондрии (рис. 1), что сопровождается переносом протона в межмембранное пространство через I, III и IV комплекс дыхательной цепи, что создает электрический (Д¥) и химический (АрН) градиент, который запускает синтез АТФ за счет перемещения протонов по каналам АТФ-синтазы. Таким образом, благодаря переносу электронов по цепи переносчиков ЭТЦ митохондрии, клетка синтезирует АТФ [1].

Рисунок 1. Сверху показана просвечивающая электронная микрофотография среза сердечной ткани крысы. Внутренняя мембрана митохондрии обведена светло-коричневым, внешняя - темно-коричневым цветом. Снизу - схематической изображение ЭТЦ. На рисунке римскими цифрами обозначены комплексы ЭТЦ, 0 - убихинон, «с» в зеленом кружке - цитС. Перемещение электронов показано черными стрелками, протонов (Н+) - зелеными полупрозрачными стрелками. ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (Кребса), ММП -межмембранное пространство.

Для запуска I комплекса дыхательной цепи изолированных митохондрий, как правило, используют пируват или глутамат и малат. Для запуска II комплекса - сукцинат. Для обеспечения синтеза АТФ к суспензии изолированных митохондрий добавляют АДФ и фосфат [2,3]. Для изучения активности работы отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий используют различные селективные ингибиторы (таблица 1).

Таблица 1. Основные ингибиторы комплексов дыхательной цепи; на основании [1,4].

Комплексы ЭТЦ (синонимы) Ингибитор Блокирует:

Комплекс I (НАДН-дегидрогеназа, НАДН-убихинон- оксидоредуктаза) реин перенос электрона на флавин

ротенон, амитал, пиерицидин восстановление хинона

Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа, сукцинат-убихинон- оксидоредуктаза) тринитропропионат, малонат окисление сукцината

Комплекс III (цитохром С-редуктаза, убихинол-цитохром С-оксидоредуктаза, цитохром ВС1-комплекс) антимицин А перенос электрона с цитохрома Ьн

стигмателлин перенос электрона с хинола на ^е-2S], движение белка Риске

миксотиазол перенос электрона с хинола на [2Бе-2Б]

британский антилюизит перенос электрона с [2Бе-2Б] белка Риске на цитС1

Комплекс IV (Цитохром С-оксидаза, цитохромоксидаза, цитохром С-кислород-оксидоредуктаза, цитохром АА3) азиды, СО, KCN восстановление кислорода

Комплекс V (АТФ-синтаза) олигомицин, вентурицидин Бо и СБо (синтез АТФ)

ауровертин Б1 (синтез АТФ)

1.1.3. Цитохромы дыхательной цепи митохондрий

Как видно из рисунка 1, важную роль в транспорте электронов по дыхательной цепи играют цитохромы - гем-содержащие белки. В таблице 2 представлен список цитохромов дыхательной цепи и их основные функции. Гемы цитохромов отличаются простетическими группами. Единственным гемом, связанным ковалентными связями с белком через цистеиновые остатки, является цитохром С (цитС). Атом железа в геме цитС координирован метионином и гистидином (рисунок 2).

Таблица 2. Список основных цитохромов, участвующих в переносе электрона, их локализация в митохондрии и функция [1].

Тип цитохрома: Локализация Функция

Ai, Аз IV комплекс Восстановление молекулярного кислорода до воды электронами дыхательной цепи

В II комплекс Не участвует в переносе электрона, предотвращает появление АФК

В5 (гем Ьь, Ьн) III комплекс Q-цикл

Ci III комплекс Перенос электрона из пула хинонов на цитС

С Межмембранное пространство Перенос е от III к IV комплексу ЭТЦ

Связан с кардиолипином внутренней мембраны Пероксидазная функция, индуктор апоптоза

1.1.1. Окислительно-восстановительное состояние цитохромов при работе дыхательной цепи

Разность редокс-потенциалов (окислительно-восстановительных потенциалов) переносчиков дыхательной цепи является движущей силой электронного транспорта. Так, стандартный редокс-потенциал пары донора электронов комплекса I ЭТЦ митохондрий НАДН/НАД+ равен -0,32 В, а редокс-потенциал конечного акцептора электронов ЭТЦ - пары Н2О/О2 равен +0,816 В. Цитохромы В; С1; С; А3, являющиеся основными переносчиками электронов в ЭТЦ, имеют стандартные редокс-потенциалы: +0,07; +0,22; +0,26; +0,35 В,

соответственно [1].

Окислительно-восстановительное состояние цитохромов дыхательной цепи митохондрий изменяется при модуляции активности электронного транспорта. На изолированных митохондриях показано, что внесение субстратов дыхания приводит к восстановлению всех цитохромов дыхательной цепи, а внесение АДФ приводит к небольшому окислению цитохромов Вь, ААз и восстановлению цитохромов типа С [6].

Рисунок 2. (А) Структура цитС (1HRC, РОБ). (Б) Гем типа С в плоскости порфиринового цикла. (В) Гем цитС млекопитающих, вид сбоку.

1.1.2. Взаимодействие цитохрома С с редокс-партнерами

ЦитС является единственным мобильным переносчиком, диффундирующим в ММП. Согласно исследованиям Хэкенброк с соавторами, движение цитС в межмембранном пространстве представляет собой трехмерную диффузию. По оценкам максимального расстояния цитС от внутренней и внешней мембраны, проведенными этими исследователями с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии, это расстояние достигает 8.5 нм при физиологической ионной силе [7,8]. Это соответствует величине ММП [9]. С учетом того, что размер самого белка цитС порядка 3 нм, он диффундирует на расстояния, всего в 2-3 раза больше него самого.

ЦитС является акцептором электрона с комплекса III (рисунок 3). На изображении ЯМР структуры комплекса видно, что гемы цитС и цитС1 находятся в плоской конформации и ориентированы под углом так, что расстояние между гемами составляет 9 А. Между атомами железа расстояние 17.4 А [10].

Показано, что цитС лучше взаимодействует с комплексом III при низкой ионной силе (<160

А

Б

В

мМ). Предположительно при низкой ионной силе электростатическое взаимодействие между белками возрастает, а скорость диссоциации снижается, что приводит к меньшей активности комплекса.

ЦитС является донором электронов для комплекса IV. Для восстановления кислорода до воды комплексу IV необходимо 4 электрона от цитС. Цитохромоксидаза млекопитающих может функционировать в виде димера. Первичным акцептором электронов является СиА сайт, затем электрон передается на гем А, а впоследствии - на биядерный активный центр белка СиВ-гем А3.

В работе японских ученых 2016 года была представлена структура комплекса цитС -комплекс IV с разрешением 2 А. Комплекс уникален тем, что в зазоре между двумя белками обнаружено большое количество молекул воды, которые не участвуют в образовании комплекса (рисунок 4). Выдвинуто предположение, что такой тип взаимодействия ускоряет процесс ассоциации/диссоциации, что необходимо для поддержания высокой скорости переноса электрона по ЭТЦ [11].

Также в последнее время обсуждается возможность регуляции активности ЭТЦ комплексом IV [12-14]. В частности, посредством взаимодействия с цитС (рисунок 5).

Рисунок 3. Взаимодействие цитС с димером цитохром-ВС1-комплекса (показан серым цветом). (А) Взаимодействие цитС (показан зеленым цветом) с двумя субъединицами цитС1 (показаны розовым) комплекса III с разрешением 1.9 Ä. Молекулы воды показаны синими точками, мембраны - желтыми линиями, гемы - черным цветом. (Б) Стерео изображение взаимодействия цитС и цитСь Интерфейс взаимодействия белков обозначен пунктирными линиями. Рисунок адаптирован из [10].

Рисунок 4. (А) Поверхности белков: цитС (показан красным цветом), комплекса IV (показан зеленым). Аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии, показаны светло-серым цветом. Молекулы воды, не участвующие в формировании комплекса, показаны синими сферами. (Б) Схематическое изображение комплекса цитС (красный) и комплекса IV (зеленый) с молекулами воды (синие кружки) между ними. Зелеными и красными кружками показаны молекулы воды на поверхности комплекса IV и цитС, соответственно. Черные кружки и полукруги обозначают взаимодействующие белковые структуры на цитС и комплексе IV, соответственно. Рисунок адаптирован из [12].

Рисунок 5. Модель регуляции переноса электрона от цитС на комплекс IV по [15]. (А) Диффузия цитС к комплексу IV со стороны сайта СиА. (Б) Сформировавшийся комплекс не оптимизирован, поэтому цитС переориентируется для достижения лучшего взаимодействия (В). (Г) Чтобы увеличить площадь контакта между белками, цитС меняет свою конформацию таким образом, чтобы снизить энергию реорганизации (X).

(Д) Также происходит реорганизация СиА сайта таким образом, чтобы увеличивалась вероятность переноса электрона между двумя центрами (обозначено как |Н). (Е) В такой конформации вероятность туннелирования электрона (ЕТ) высока даже в отсутствие внешнего воздействия. (Ж) После редокс-реакции конформация цитС и сайта СиА меняется, что препятствует обратному переносу электрона на цитС и способствует переносу электрона на гем А. Предполагается, что существует отрицательная обратная связь между шагами (Б), (Г), и (Д) и величиной электрического поля, которая возрастает при закачивании протонов в ММП во время работы ЭТЦ. При снижении концентрации протонов в ММП и снижении ввиду работы АТФ-синтазы электрон-транспортная активность между цитС и комплексом IV может быть восстановлена.

1.1.3. Организация комплексов ЭТЦ в респирасомы

Исторически дыхательная цепь рассматривалась как отдельная единица, и только спустя годы были изолированы комплексы ЭТЦ и определены их функции. После чего началась обратная тенденция по «поиску суперкомплексов» [16]. Предпосылками к такому поиску оказались несколько наблюдений: большинство комплексов ЭТЦ выделялись вместе и только после этого их разделяли, а на электронных микрофотографиях митохондрий наблюдалась высокая организация крист, в частности АТФ-синтазой, что также противоречило диффузному расположению комплексов во внутренней мембране [17].

Этому также способствовало изучение стехиометрии комплексов. Разные авторы приводят разные соотношения числа комплексов. Например, долгое время использовали стехиометрию, приведенную в книге [17], К : КП : КШ : цитС : КГ^ : = 1 : 2 : 3 : 9 : 6-7 : 3-5. В работе [18] авторы определили молярное соотношение комплексов как Ю : КП : КШ : цитС : К^ : КV = 1 : 2 : 2: 6: 5.8 : 5.8. В обзоре [19] на основе анализа 8 работ авторы определили наиболее правдоподобное соотношение для митохондрий сердца млекопитающих Ю : КП : КШ : цитС : КТУ : КУ = 1 : 1.3 : 3 : 3.5-12 : 6.7 : 3.5-4. Несмотря на небольшие отличия, в любом случае количество молекул цитС как минимум в 3 раза превышает количество комплексов III и немного больше, чем количество комплексов IV.

В ряде работ последнего десятилетия также возобновилось обсуждение наличия, строения и функций суперкомплексов во внутренней мембране митохондрий, образованных комплексами ЭТЦ. Были описаны различные варианты суперкомплексов: Ю-ЮШ-К^, Ю-КПЬ, ЮШ-К^^ и др. [19-21]. Первый является наиболее распространенным вариантом, который визуализировали с помощью криоэлектронной микроскопии. Комплекс I практически не встречается в одиночном виде из-за нестабильной структуры [22], при этом может опосредовать взаимодействие комплексов I и III при участии субъединиц NDUFA11 и КВЦБВ9 [23] (рисунок

6. А). Впоследствии были обнаружены специальные белки - стабилизаторы суперкомплексов: Rcfl и 2 в клетках дрожжей и SCAFI - в клетках млекопитающих [24,25]. Шаперон MCJ/DnaJC15 выполняет обратную функцию: вызывает дестабилизацию суперкомплексов и снижение активности комплекса I [26]. Было показано, что MCJ/DnaJC15 препятствует патологическому накоплению липидов в печени при высокожировой диете, а его ингибирование или снижение экспрессии приводит к нарушениям метаболизма [26].

В работе [22] продемонстрировано, что изолированные суперкомплексы, содержащие как минимум 3 комплекса ЭТЦ (I, III и IV) обладают дыхательной активностью, то есть фактически являются респирасомой. В 2000 году была выдвинута теория, согласно которой организация комплексов в респирасому увеличивает скорость переноса электрона в ЭТЦ, в частности, на уровне цитС за счет близости между III и IV комплексом [27]. Эта теория получила название «цельная модель», или «твердофазная модель» («solid-state model»).

Предполагается, что без суперкомплексов восстановленный цитС должен преодолевать был бы большие расстояния, что замедляло бы скорость потока электронов. Например, в работе [28] обсуждается 2 возможных сайта связывания цитС с комплексом III, которые являются частью 2 потенциальных путей перемещения электрона (рисунок 6). В одном случае цитС должен преодолеть расстояние всего в 10 нм до комплекса IV, во втором - 11 нм. При этом, для последнего варианта сокращается количество шагов и общая длина пути перемещения электрона от НАДН до кислорода.

Однако группа Ф. Раппапорта оставила под сомнение данную теорию [29]. Авторы разработали методику на основе спектрофотомерии для исследования кинетики восстановления/окисления цитС в живых клетках дрожжей. Исследование опровергает теорию о том, что существует пул цитС, локализованного в определенных компартментах (например, между кристами или в составе респирасом), и подтверждает теорию свободной диффузии цитС вне зависимости от образования суперкомплексов и/или крист. Полученные данные хорошо согласуются с теорией «жидкой модели» ЭТЦ («fluid model»), предложенной Хэкенброком с соавторами в 1986 году [30]. Согласно этой теории, все редокс-компоненты ЭТЦ свободно и независимо диффундируют, в том числе цитС, который совершает трехмерную диффузию в ММП, что было подтверждено многочисленными исследованиями, а скорость электронного транспорта может быть лимитирована диффузией переносчиков.

В настоящее время лидирующей гипотезой является «пластичная модель» («plasticity model»), предложенная в 2008 году [22]. Согласно этой модели, одновременное наличие отдельных комплексов и суперкомплексов способствует большей пластичности ЭТЦ. Динамика формирования суперкомплексов в ЭТЦ может являться механизмом адаптации к различным источникам электронов и общему состоянию клеток [22,25] (рисунок 7).

Рисунок 6. (А-Б) Прозрачными цветами обозначены комплексы ЭТЦ, образующие респирасому, в трех проекциях. Голубым цветом показан комплекс I, желтым - комплекс III, розовым -комплекс IV. (Б) Комплекс I в той же проекции, что и на верхнем левом рисунке, с обозначениями всех субъединиц. Рисунок из [23]. (В-Г) Варианты перемещения электрона от НАДН к кислороду через суперкомплекс в 2 проекциях. Рисунок из [28] с модификациями.

Рисунок 7. Пластичная модель ЭТЦ. (А) В отсутствие суперкомплексов (например, при мутации в гене белка SCAFI, отвечающем за формирование суперкомплексов) электроны поступают на все комплексы IV (CIV Ац) от любых субстратов. (Б) При наличии как суперкомплексов (CI CIII CIV и CIII CIV), так и отдельных комплексов, что наблюдается в норме, можно выделить 3 пула комплекса IV, получающих электроны как отдельно по НАДН- (CIV nadh) и ФАД-опосредованному пути (CIV fad), так и по ним обоим (CIV both). Рисунок адаптирован из [25]. CoQ - хинон, Cyt C - цитС.

1.1.4. Кардиолипин во внутренней мембране митохондрий

Важную роль в формировании суперкомплексов отводят кардиолипину - анионному липиду, составляющему до 20% липидов внутренней мембраны митохондрий [19,23,31,32]. Впервые значимость кардиолипина в структурировании внутренней мембраны митохондрий отметила группа Скулачева В.П. [33]. В работах [31,32] показано, что в митохондриях мутантов дрожжей, нокаутных по гену кардиолипин-синтазы, которая производит кардиолипин из фосфатидилглицерина, комплексы III и IV не образуют суперкомплексы, а АТФ-синтаза не димеризуется. На активность комплекса III и АТФ-синтазы отсутствие синтеза кардиолипина не влияло, но приводило к инактивации комплекса IV. Добавление внешнего кардиолипина к таким клеткам приводит к появлению суперкомплексов [32]. В работе [34] проанализированы псевдоатомные модели суперкомплексов и предложены потенциальные сайты связывания кардиолипина с комплексами III и IV.

Положительно-заряженный цитС может взаимодействовать с мембранами в присутствии отрицательно-заряженного кардиолипина [35]. Причем, это взаимодействие необходимо для выхода цитС из митохондрий при развитии апоптоза. Впервые связь выхода цитС в цитоплазму с апоптозом была выявлена в 1996 году [36]. В 1998 Б. Животовский с соавторами показали, что добавление внешнего цитС в цитоплазму клеток также приводит к запуску апоптоза [37]. В. Каган с соавторами обнаружили, что на первых стадиях развития апоптоза цитС взаимодействует с кардиолипином, вызывая его окисление. Окисленный кардиолипин необходим для выхода проапоптотических факторов из митохондрий. Таким образом, при взаимодействии с кардиолипином цитС приобретает пероксидазные свойства [38]. Впоследствии это было подтверждено на модельных системах - липосомах, содержащих кардиолипин. Было показано, что добавление к липосомам, содержащим флуоресцентный краситель (флуоресцеин или декстран), раствора цитС как в присутствии перекиси водорода [39], так и без дополнительных агентов [40] приводит к выходу красителя, что свидетельствует об образовании пор в мембранах липосом. Причем характерные времена аналогичны порообразованию эквинотоксином. Также в статье [40] выявили, что холестерин способствует порообразованию, а АТФ - наоборот, снижает вероятность образования пор. Однако следует заметить, что ионы кальция сами по себе могут способствовать порообразованию в кардиолипин-содержащих липосомах [41], тогда как в работе [40] не использовали хелаторы кальция.

Механизм образования пор и выхода цитС до сих пор не совсем ясен. В одной из первых работ на эту тему [41] обсуждается, что перенос отдельных молекул цитС через мембрану представляет собой «пробуравливание» белка через мембрану за счет создания инвертированных мицеллоподобных структур. Другой механизм предложили в работе [40]. Предполагается, что С-концевая альфа-спираль цитС может проникать в толщу мембраны в области скопления кардиолипина и тем самым стабилизировать пору.

Предпосылками к такому объяснению являлись работы группы Плетневой [42,43]. С использованием ряда методов, в частности Ферсторовского резонансного переноса энергии с временным разрешением (TR-FRET), они показали, что конформация цитС может значительно изменяться при взаимодействии с кардиолипином: может происходить разворачивание С-концевой альфа-спирали белка. В работе [44] синтезировали пептид, аналогичный по составу этому участку цитС, и показали, что он обладает пермеабилизирующими свойствами.

Взаимодействие цитС с липосомам также исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР). Для этого использовали проточную ячейку: в первом отсеке содержалась суспензия липосом 800 нм в диаметре с меткой 3-нитробензойносульфат натрия, во втором - 100 мкМ цитС. Спектр КР регистрировался при смешивании двух растворов при возбуждении светом 647 нм. Было обнаружено, что ключевые пики, имеющие гемовое

происхождение, на спектре КР цитС исчезали при взаимодействии цитС с липосомами, содержащими кардиолипин. Это свидетельствует о том, что произошел разрыв ключевой связи гемового железа с метионином ^е-М80), что наблюдается при денатурации белка. Также обнаруживались изменения в конформации белковой части цитС и липидов[45].

В обзоре 2014 года [46] предложена следующая последовательность взаимодействия цитС с кардиолипином: электростатическое взаимодействие (1); структурные изменения в цитС, включая разрыв водородной связи между Н26 и Р44, трансформация неструктурированной петли в Р-лист, разрыв Fe-M80 связи (2); погружение белка в мембрану или встраивание жирно-кислотного хвоста кардиолипина в цитС (3). В случае проникновения цитС в липидный слой происходит «плавление» цитС, разрыв контактов между К- и С-концевой спиралью и проникновение С-концевой спирали в липид (4). Это, в свою очередь, вызывает порообразование и выход цитС (5). При этом, существует равновесие между состоянием (3) и (4), которое зависит от концентрации кардиолипина.

Однако существует мнение, что денатурация цитС и порообразование кардиолипин-содержащих липосом обусловлены положительной кривизной поверхности мембраны и отсутствием характерного для ММП митохондрий краудинга. Так, в работе [47] методом ЯМР показано, что мицеллы с отрицательной кривизной не вызывают денатурации цитС и образования пор. Это объясняет тот факт, что в митохондриях при нормально функционирующей дыхательной цепи есть фракция цитС, связанного с кардиолипином внутренней мембраны. Примерно 15% молекул цитС находятся в связанном состоянии и не участвуют в переносе электрона по ЭТЦ, но при этом и не вызывают апоптоз [12]. В настоящее время считается, проявление пероксидазной и порообразующей активности зависит от того, с каким именно сайтом цитС взаимодействует кардиолипин [48].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Никельшпарг Эвелина Ильинична, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th ed. / ed. Ahr K. New York, NY: W.H. Freemanand Company, 2008. 1158 p.

2. Frezza C., Cipolat S., Scorrano L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 2. P. 287-295.

3. Gnaiger E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. Innsbruck, Austria: OROBOROS INSTRUMENTS Corp, 2014. 81 p.

4. Скулачев В.П., Богачев A3., ^старин^ий Ф.О. Mембранная биоэнергетика: Учебное пособие. Mосква: Издательство Mосковского Университета, 2010. - 368 c.

5. Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th ed. / ed. Ahr K. New York, NY: W.H. Freemanand Company, 2008.

6. Chess D.J. et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions // Anal. Biochem. 2013. Vol. 439, № 2. P. 161172.

7. Gupte S.S., Hackenbrock C.R. The role of cytochrome c diffusion in mitochondrial electron transport. // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263, № 11. P. 5248-5253.

8. Cortese J.D., Hackenbrock C.R. Motional dynamics of functional cytochrome c delivered by low pH fusion into the intermembrane space of intact mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1142, № 1-2. P. 194-202.

9. Perkins G. et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. // J. Struct. Biol. 1997. Vol. 119, № 3. P. 260-272.

10. Solmaz S.R.N., Hunte C. Structure of Complex III with Bound Cytochrome c in Reduced State and Definition of a Minimal Core Interface for Electron Transfer // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, № 25. P. 17542-17549.

11. Shimada S. et al. Complex structure of cytochrome c -cytochrome c oxidase reveals a novel protein-protein interaction mode // EMBO J. 2017. Vol. 36, № 3. P. 291-300.

12. Alvarez-Paggi D. et al. Multifunctional Cytochrome c : Learning New Tricks from an Old Dog // Chem. Rev. 2017. Vol. 117, № 21. P. 13382-13460.

13. Pérez-Mejías G. et al. Cytochrome c: Surfing Off of the Mitochondrial Membrane on the Tops of Complexes III and IV // Comput. Struct. Biotechnol. J. The Authors, 2019. Vol. 17. P. 654-660.

14. Guerra-Castellano A. et al. Oxidative stress is tightly regulated by cytochrome c phosphorylation and respirasome factors in mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. 2018. Vol. 115, № 31. P. 79557960.

15. Alvarez-Paggi D., Zitare U., Murgida D.H. The role of protein dynamics and thermal fluctuations

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

in regulating cytochrome c/cytochrome c oxidase electron transfer // Biochim. Biophys. Acta -Bioenerg. 2014. Vol. 1837, № 7. P. 1196-1207.

Frontiers of Cellular Bioenergetics / ed. Papa S., Guerrieri F., Tager J.M. Boston, MA: Springer US, 1999. 801 p.

Hatefi Y., Ragan C.I., Galante Y.M. The Enzymes and the Enzyme Complexes of the Mitochondrial Oxidative Phosphorylation System // The Enzymes of Biological Membranes. Volume 4. Electron transport systems and receptors. second / ed. Martonosi A. New York: Springer Science + Business Media, LLC, 1984. P. 3-258.

Schwerzmann K. Molecular architecture of the inner membrane of mitochondria from rat liver: a combined biochemical and stereological study // J. Cell Biol. 1986. Vol. 102, № 1. P. 97-103. Lenaz G., Genova M.L. Structure and Organization of Mitochondrial Respiratory Complexes: A New Understanding of an Old Subject // Antioxid. Redox Signal. 2010. Vol. 12, № 8. P. 9611008.

Sun F. et al. Revealing various coupling of electron transfer and proton pumping in mitochondrial respiratory chain // Curr. Opin. Struct. Biol. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 23, № 4. P. 526-538. Dudkina N. V. et al. Structure and function of mitochondrial supercomplexes // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2010. Vol. 1797, № 6-7. P. 664-670.

Acin-Pérez R. et al. Respiratory Active Mitochondrial Supercomplexes // Mol. Cell. 2008. Vol. 32, № 4. P. 529-539.

Gu J. et al. The architecture of the mammalian respirasome // Nature. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 537, № 7622. P. 639-643.

Strogolova V. et al. Rcf1 and Rcf2, Members of the Hypoxia-Induced Gene 1 Protein Family, Are Critical Components of the Mitochondrial Cytochrome bc1-Cytochrome c Oxidase Supercomplex // Mol. Cell. Biol. 2012. Vol. 32, № 8. P. 1363-1373.

Lapuente-Brun E. et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain // Science (80-. ). 2013. Vol. 340, № 6140. P. 1567-1570. Hatle K.M. et al. MCJ/DnaJC15, an Endogenous Mitochondrial Repressor of the Respiratory Chain That Controls Metabolic Alterations // Mol. Cell. Biol. 2013. Vol. 33, № 11. P. 2302-2314. Schagger H., Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 8. P. 1777-1783.

Althoff T. et al. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I 1 III 2 IV 1 // EMBO J. 2011. Vol. 30, № 22. P. 4652-4664. Trouillard M., Meunier B., Rappaport F. Questioning the functional relevance of mitochondrial supercomplexes by time-resolved analysis of the respiratory chain // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 108, № 45. P. E1027-E1034.

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

Hackenbrock C.R., Chazotte B., Gupte S.S. The random collision model and a critical assessment of diffusion and collision in mitochondrial electron transport // J. Bioenerg. Biomembr. 1986. Vol. 18, № 5. P. 331-368.

Zhang M., Mileykovskaya E., Dowhan W. Gluing the respiratory chain together: Cardiolipin is required for supercomplex formation in the inner mitochondrial membrane // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 46. P. 43553-43556.

Pfeiffer K. et al. Cardiolipin Stabilizes Respiratory Chain Supercomplexes // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 52. P. 52873-52880.

Микельсаар Х., Северина И.И., Скулачев В.П. Фосфолипиды и окислительное фосфорилирование // Успехи современной биологии. 1978. N. 3, № 6. c. 348-370. Mileykovskaya E., Dowhan W. Cardiolipin-dependent formation of mitochondrial respiratory supercomplexes // Chem. Phys. Lipids. 2014. Vol. 179, № 2. P. 42-48.

Mustonen P. et al. Binding of cytochrome c to liposomes as revealed by the quenching of fluorescence from pyrene-labeled phospholipids // Biochemistry. 1987. Vol. 26, № 11. P. 29912997.

Liu X. et al. Induction of Apoptotic Program in Cell-Free Extracts: Requirement for dATP and Cytochrome c // Cell. 1996. Vol. 86, № 1. P. 147-157.

Zhivotovsky B. et al. Injected cytochrome c induces apoptosis // Nature. 1998. Vol. 391, № 6666. P. 449-450.

Kagan V.E. et al. Cytochrome C Acts As A Cardiolipin Oxygenase Required for Release of Proapoptotic Factors // Nat. Chem. Biol. 2005. Vol. 1, № 4. P. 223-232.

Firsov A.M. et al. Biochimica et Biophysica Acta Peroxidative permeabilization of liposomes induced by cytochrome c / cardiolipin complex // BBA - Biomembr. Elsevier B.V., 2015. Vol. 1848, № 3. P. 767-774.

Bergstrom C.L. et al. Cytochrome c causes pore formation in cardiolipin-containing membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. Vol. 110, № 16. P. 6269-6274.

de Kruijff B., Cullis P.R. Cytochrome c specifically induces non-bilayer structures in cardiolipin-containing model membranes // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1980. Vol. 602, № 3. P. 477-490.

Morenz A.M. et al. Conformational properties of cardiolipin-bound cytochrome c // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 109, № 1. P. 125-130.

Hong Y. et al. Origin of the Conformational Heterogeneity of Cardiolipin-Bound Cytochrome c // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134, № 45. P. 18713-18723.

Jones S. et al. Characterization of Bioactive Cell Penetrating Peptides from Human Cytochrome c: Protein Mimicry and the Development of a Novel Apoptogenic Agent // Chem. Biol. 2010. Vol.

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

17, № 7. P. 735-744.

Kitt J.P. et al. Raman Spectroscopy Reveals Selective Interactions of Cytochrome c with Cardiolipin That Correlate with Membrane Permeability // J. Am. Chem. Soc. 2017. Vol. 139, № 10. P. 3851-3860.

Muenzner J., Pletneva E. V. Structural transformations of cytochrome c upon interaction with cardiolipin // Chem. Phys. Lipids. 2014. Vol. 179. P. 57-63.

O'Brien E.S. et al. Defining the Apoptotic Trigger. The interaction of cytochrome c and cardiolipin // J. Biol. Chem. 2015. Vol. 290, № 52. P. 30879-30887.

Pandiscia L.A., Schweitzer-Stenner R. Coexistence of Native-like and Non-Native Partially Unfolded Ferricytochrome c on the Surface of Cardiolipin-Containing Liposomes // J. Phys. Chem. B. 2015. Vol. 119, № 4. P. 1334-1349.

Lanza I.R., Nair K.S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. // Methods Enzymol. 2009. Vol. 457, № 09. P. 349-372.

Mailloux R.J., Harper M.-E. Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen species production. // Free Radic. Biol. Med. 2011. Vol. 51, № 6. P. 1106-1115. Zhang D.X., Gutterman D.D. Mitochondrial reactive oxygen species-mediated signaling in endothelial cells. 2007. Vol. 53226. P. 2023-2031.

Couplan E. et al. High Level of Uncoupling Protein 1 Expression in Muscle of Transgenic Mice Selectively Affects Muscles at Rest and Decreases Their IIb Fiber Content // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 45. P. 43079-43088.

Morota S., Piel S., Hansson M.J. Respiratory uncoupling by increased H(+) or K(+) flux is beneficial for heart mitochondrial turnover of reactive oxygen species but not for permeability transition. // BMC Cell Biol. BMC Cell Biology, 2013. Vol. 14, № 1. P. 40. Hackenbrock C.R. States of Activity and Structure in Mitochondrial Membranes // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1972. Vol. 195, № 1. P. 492-504.

Yotsuyanagi Y. Études sur le chondriome de la levure // J. Ultrastruct. Res. 1962. Vol. 7, № 1-2. P. 121-140.

Cogliati S., Enriquez J.A., Scorrano L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality // Trends Biochem. Sci. 2016. Vol. 41, № 3. P. 261-273.

Lizana L., Bauer B., Orwar O. Controlling the rates of biochemical reactions and signaling networks by shape and volume changes // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Vol. 105, № 11. P. 40994104.

Strauss M. et al. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane // EMBO J. 2008. Vol. 27, № 7. P. 1154-1160.

Habersetzer J. et al. ATP synthase oligomerization: From the enzyme models to the mitochondrial

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

morphology // Int. J. Biochem. Cell Biol. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 45, № 1. P. 99-105. Paumard P. et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. // The EMBO journal. 2002. Vol. 21, № 3. P. 221-230.

Khalifat N. et al. Membrane Deformation under Local pH Gradient: Mimicking Mitochondrial Cristae Dynamics // Biophys. J. 2008. Vol. 95, № 10. P. 4924-4933.

Blum T.B. et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase induce membrane curvature and self-assemble into rows // Proc. Natl. Acad. Sci. 2019. Vol. 116, № 10. P. 4250-4255. Quintana-Cabrera R. et al. The cristae modulator Optic atrophy 1 requires mitochondrial ATP synthase oligomers to safeguard mitochondrial function // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 3399.

Garlid K.D., Paucek P. Mitochondrial potassium transport: the K+ cycle // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2003. Vol. 1606, № 1-3. P. 23-41.

Garlid K.D. et al. Mitochondrial potassium transport: the role of the mitochondrial ATP-sensitive K+ channel in cardiac function and cardioprotection // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2003. Vol. 1606, № 1-3. P. 1-21.

Laskowski M. et al. What do we not know about mitochondrial potassium channels? // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2016. Vol. 1857, № 8. P. 1247-1257.

Mannella C.A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2006. Vol. 1763, № 5-6. P. 542-548.

Picard M. et al. Trans-mitochondrial coordination of cristae at regulated membrane junctions // Nat. Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 6259.

English A.M., Hughes A.L. Knowing When to Let Go: Lysosomes Regulate Inter-Mitochondrial Tethering // Dev. Cell. 2019. Vol. 50, № 3. P. 259-260.

Beavis A.D., Brannan R.D., Garlid K.D. Swelling and contraction of the mitochondrial matrix. I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 25. P. 13424-13433.

Szabô I. et al. Physiology of potassium channels in the inner membrane of mitochondria. // Pflugers Arch. 2012. Vol. 463, № 2. P. 231-246.

Safiulina D. et al. Loss of mitochondrial membrane potential is associated with increase in mitochondrial volume: physiological role in neurones. // J. Cell. Physiol. 2006. Vol. 206, № 2. P. 347-353.

Kevin L.G. et al. Ischemic preconditioning alters real-time measure of O2 radicals in intact hearts with ischemia and reperfusion. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. Vol. 284, № 2. P. H566-74.

Brazhe N. et al. In situ Raman study of redox state changes of mitochondrial cytochromes in a

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

perfused rat heart. // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 8. P. e70488.

Chouchani E.T. et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS // Nature. 2014. Vol. 515, № 7527. P. 431-435.

Lucero M., Suarez A.E., Chambers J.W. Phosphoregulation on mitochondria : Integration of cell and organelle responses. 2019. № March. P. 837-858.

Semenza G.L. Oxygen-dependent regulation of mitochondrial respiration by hypoxia-inducible factor 1 // Biochem. J. 2007. Vol. 405, № 1. P. 1-9.

Lee I. et al. New Prospects for an Old Enzyme : Mammalian Cytochrome c Is Tyrosine-Phosphorylated in Vivo f. 2006. P. 9121-9128.

Yu H. et al. Mammalian liver cytochrome c is tyrosine-48 phosphorylated in vivo, inhibiting mitochondrial respiration // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2008. Vol. 1777, № 7-8. P. 10661071.

Pecina P. et al. Phosphomimetic Substitution of Cytochrome c Tyrosine 48 Decreases Respiration and Binding to Cardiolipin and Abolishes Ability to Trigger Downstream Caspase Activation // Biochemistry. 2010. Vol. 49, № 31. P. 6705-6714.

Guerra-Castellano A. et al. Mimicking Tyrosine Phosphorylation in Human Cytochrome c by the Evolved tRNA Synthetase Technique // Chem. - A Eur. J. 2015. Vol. 21, № 42. P. 15004-15012. Moreno-Beltran B. et al. Structural basis of mitochondrial dysfunction in response to cytochrome c phosphorylation at tyrosine 48 // Proc. Natl. Acad. Sci. 2017. Vol. 114, № 15. P. E3041-E3050. Никельшпарг Э.И. SERS - изучение цитохрома с в живых митохондриях // Природа РАН. 2016. Т. 3. с. 17-25.

Кери П. Применение спектрокопии КР и РКР к биохимии / под ред. Соловьянова А.А., Локшина Б.В. Москва: Мир, 1985.

Нанобиотехнологии: практикум / под ред. Рубина А.Б. Москва: Бином. Лаборатория знаний, 2012.

Kneipp J. et al. Surface-enhanced Raman scattering: a new optical probe in molecular biophysics and biomedicine // Theor. Chem. Acc. 2009. Vol. 125, № 3-6. P. 319-327. Fleischmann M., Hendra P.J., McQuillan A.J. Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode // Chem. Phys. Lett. 1974. Vol. 26, № 2. P. 163-166.

Ray K. et al. Distance dependence of surface plasmon-coupled emission observed using Langmuir-Blodgett films. // Applied physics letters. 2007. Vol. 90, № 25. P. 251116. Moskovits M. Surface roughness and the enhanced intensity of Raman scattering by molecules adsorbed on metals // J. Chem. Phys. 1978. Vol. 69, № 9. P. 4159.

Wokaun a. et al. Energy transfer in surface enhanced luminescence // The Journal of Chemical Physics. 1983. Vol. 79, № 1. P. 509.

91. Kneipp J. et al. Novel optical nanosensors for probing and imaging live cells. // Nanomedicine. Elsevier Inc., 2010. Vol. 6, № 2. P. 214-226.

92. Еремина О.Е. et al. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния в современном химическом анализе: достижения и перспективы использования // Успехи химии. 2018. Vol. 87, № 8. P. 741-770.

93. Adar F., Erecinska M. Resonance Raman spectra of whole mitochondria. // Biochemistry. 1978. Vol. 17, № 25. P. 5484-5488.

94. Hu S. et al. Complete assignment of cytochrome c resonance Raman spectra via enzymic reconstitution with isotopically labeled hemes // J. Am. Chem. Soc. 1993. Vol. 115, № 26. P. 12446-12458.

95. Berezhna S., Wohlrab H., Champion P.M. Resonance Raman investigations of cytochrome c conformational change upon interaction with the membranes of intact and Ca2+-exposed mitochondria. // Biochemistry. 2003. Vol. 42, № 20. P. 6149-6158.

96. Cortese J., Voglino A.L., Hackenbrock C.R. Persistence of cytochrome c binding to membranes at physiological mitochondrial intermembrane space ionic strength // Biochim. Biophys. Acta -Bioenerg. 1995. Vol. 1228, № 2-3. P. 216-228.

97. Wu H. et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 108, № 9. P. 3809-3814.

98. Uzunbaj akava N. et al. Nonresonant Raman imaging of protein distribution in single human cells // Biopolymers. 2003. Vol. 72, № 1. P. 1-9.

99. Okada M. et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109, № 1. P. 28-32.

100. Palonpon A.F. et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. // Nat. Protoc. 2013. Vol. 8, № 4. P. 677-692.

101. Kallepitis C. et al. Quantitative volumetric Raman imaging of three dimensional cell cultures // Nat. Commun. 2017. Vol. 8, № 1. P. 14843.

102. Brazhe N.A. et al. Monitoring of blood oxygenation in brain by resonance Raman spectroscopy // J. Biophotonics. 2018. Vol. 11, № 6.

103. Jermyn M. et al. Intraoperative brain cancer detection with Raman spectroscopy in humans // Sci. Transl. Med. 2015. Vol. 7, № 274. P. 1-10.

104. You A.Y.F. et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta // Sci. Adv. 2017. Vol. 3, № 12. P. e1701156.

105. Haka A.S. et al. Diagnosing breast cancer using Raman spectroscopy: prospective analysis // J. Biomed. Opt. 2009. Vol. 14, № 5. P. 054023.

106. Aubertin K. et al. Raman Spectroscopy for Prostate Cancer Detection and Characterization //

107

108

109

110.

111.

112.

113.

114

115.

116.

117

118

119

120

121

Biophys. J. 2017. Vol. 112, № 3. P. 584a.

Kakita M., Kaliaperumal V., Hamaguchi H. Resonance Raman quantification of the redox state of cytochromes b and c in-vivo and in-vitro. // J. Biophotonics. 2012. Vol. 5, № 1. P. 20-24. Brazhe N.A. et al. Mapping of redox state of mitochondrial cytochromes in live cardiomyocytes using Raman microspectroscopy. // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 9. P. e41990. Ohira S. et al. Label-free detection of myocardial ischaemia in the perfused rat heart by spontaneous Raman spectroscopy // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 7, № February. P. 1-9.

Nabiev I., Morjani H., Manfait M. Selective analysis of antitumor drug interaction with living cancer cells as probed by surface-enhanced Raman spectroscopy // Eur. Biophys. J. 1991. Vol. 19, № 6. P. 311-316.

Nabiev I., Chourpa I., Manfait M. Applications of Raman and surface-enhanced Raman scattering spectroscopy in medicine // J. Raman Spectrosc. 1994. Vol. 25, № 1. P. 13-23. Никельшпарг Э.И. Спектроскопия КР: новые возможности старого метода // Биомолекула.ру. 2015.

Talley C.E. et al. Intracellular pH sensors based on surface-enhanced raman scattering. // Anal. Chem. 2004. Vol. 76, № 23. P. 7064-7068.

Pissuwan D. et al. Distribution of label free cationic polymer-coated gold nanorods in live macrophage cells reveals formation of groups of intracellular SERS signals of probe nanoparticles // RSC Adv. 2014. Vol. 4, № 11. P. 5536.

Kneipp J. et al. In Vivo Molecular Probing of Cellular Compartments with Gold Nanoparticles and Nanoaggregates // Nano Lett. 2006. Vol. 6, № 10. P. 2225-2231.

Oyelere A.K. et al. Peptide-Conjugated Gold Nanorods for Nuclear Targeting // Bioconjug. Chem. 2007. Vol. 18, № 5. P. 1490-1497.

Willets K.A. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) for probing internal cellular structure and dynamics // Anal. Bioanal. Chem. 2009. Vol. 394, № 1. P. 85-94.

Liu T.-Y. et al. Functionalized arrays of Raman-enhancing nanoparticles for capture and culture-free analysis of bacteria in human blood. // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 2. P. 538.

Li M. et al. Alkyne- and Nitrile-Anchored Gold Nanoparticles for Multiplex SERS Imaging of

Biomarkers in Cancer Cells and Tissues // Nanotheranostics. 2019. Vol. 3, № 1. P. 113-119.

Li Z. et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for differentiation between benign and

malignant thyroid tissues // Laser Phys. Lett. 2014. Vol. 11, № 4. P. 045602.

Potara M. et al. Plasmonic-Based SERS-Traceable Drug Nanocarriers in Cancer Theranostics //

Plasmonics in Chemistry and Biology / ed. de la Chapelle M.L., Felidj N. Jenny Stanford

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

Publishing, 2019. P. 159-177.

Brazhe N. a et al. New insight into erythrocyte through in vivo surface-enhanced Raman spectroscopy. // Biophys. J. Biophysical Society, 2009. Vol. 97, № 12. P. 3206-3214. Semenova A. a. et al. Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips // J. Mater. Chem. 2012. Vol. 22, № 47. P. 24530.

Eremina O.E. et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy in modern chemical analysis: advances and prospects // Russ. Chem. Rev. 2018. Vol. 87, № 8. P. 741-770. Bruzas I. et al. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond // Analyst. 2018. Vol. 143, № 17. P. 3990-4008. Saint-Pierre Chazalet M. et al. Surface-enhanced Raman scattering studies of lipid planar bilayers in water // Thin Solid Films. 1994. Vol. 244, № 1-2. P. 852-856.

Kundu J., Levin C.S., Halas N.J. Real-time monitoring of lipid transfer between vesicles and hybrid bilayers on Au nanoshells using surface enhanced Raman scattering (SERS) // Nanoscale. 2009. Vol. 1, № 1. P. 114.

Taylor R.W. et al. Watching individual molecules flex within lipid membranes using SERS // Sci. Rep. 2014. Vol. 4. P. 1-6.

Ma J.-G. et al. The Structural Origin of Nonplanar Heme Distortions in Tetraheme Ferricytochromes c3 // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 36. P. 12431-12442. Sun Y. et al. Investigations of heme distortion, low-frequency vibrational excitations, and electron transfer in cytochrome c // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. Vol. 111, № 18. P. 6570-6575. Chertkova R. V. et al. New insight into the mechanism of mitochondrial cytochrome c function // PLoS One. 2017. Vol. 12, № 5. P. e0178280.

Sarycheva A.S. et al. New nanocomposites for SERS studies of living cells and mitochondria // J. Mater. Chem. B. 2016. Vol. 4, № 3.

Schacterle G., Pollack R. A simplified method for the quantitative assay of small amounts of

protein in biologic material // Anal Biochem. 1973. Vol. 51, № 2. P. 654-655.

Burgess S. Liposome Preparation - Avanti® Polar Lipids [Electronic resource]. 1998. URL:

https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/liposome-preparation.html.

Blair P. V. The large-scale preparation and properties of heart mitochondria from slaughterhouse

material // MeThods Enzymology. 1967. P. 78-81.

Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 1990. Vol. 1019, № 2. P. 151-158. Burbaev D.S. et al. Ubisemiquinone in the NADH-ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain // FEBS Lett. 1989. Vol. 254, № 1-2. P. 47-51. Grivennikova V.G., Kozlovsky V.S., Vinogradov A.D. Respiratory complex II: ROS production

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

and the kinetics of ubiquinone reduction // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2017. Vol. 1858, № 2. P. 109-117.

Brazhe A.R. https://bitbucket.org/alexeybrazhe/pyraman.

Chance B. et al. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. // J. Biol. Chem. 1955. Vol. 217, № 1. P. 439-451.

Brazhe N.A. et al. Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5, № 1. P. 13793. Gupte S.S., Hackenbrock C.R. The role of cytochrome c diffusion in mitochondrial electron transport. // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263, № 11. P. 5248-5253.

Frey T.G., Mannella C.A. The internal structure of mitochondria. // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25, № 7. P. 319-324.

Zhang Z. et al. Electron transfer by domain movement in cytochrome bc1 // Nature. 1998. Vol. 392, № 6677. P. 677-684.

Borchman D., Tang D., Yappert M.C. Lipid composition, membrane structure relationships in lens and muscle sarcoplasmic reticulum membranes // Biospectroscopy. 1999. Vol. 5, № 3. P. 151167.

Krafft C. et al. Near infrared Raman spectra of human brain lipids // Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2005. Vol. 61, № 7. P. 1529-1535.

Ren M., Phoon C.K.L., Schlame M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin // Prog. Lipid Res. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 55. P. 1-16.

Wang H.-W., Wei Y.-H., Guo H.-W. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) fluorescence for the detection of cell death. // Anticancer. Agents Med. Chem. 2009. Vol. 9, № 9. P. 1012-1017.

Brandes R., Bers D.M. Increased work in cardiac trabeculae causes decreased mitochondrial NADH fluorescence followed by slow recovery. // Biophys. J. 1996. Vol. 71, № 2. P. 1024-1035. Bose S. et al. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 40. P. 39155-39165.

Dudkina N. V. et al. The higher level of organization of the oxidative phosphorylation system: mitochondrial supercomplexes // J. Bioenerg. Biomembr. 2008. Vol. 40, № 5. P. 419-424. Votyakova T. V., Reynolds I.J. A¥m-Dependent and -independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria // J. Neurochem. 2008. Vol. 79, № 2. P. 266-277. Matoba S. p53 Regulates Mitochondrial Respiration // Science (80-. ). 2006. Vol. 312, № 5780. P. 1650-1653.

Kuhar N. et al. Challenges in application of Raman spectroscopy to biology and materials // RSC Adv. Royal Society of Chemistry, 2018. Vol. 8, № 46. P. 25888-25908.

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

Pecina P. et al. Functional alteration of cytochrome c oxidase by SURF1 mutations in Leigh syndrome // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 2003. Vol. 1639, № 1. P. 53-63. Antonicka H. et al. Defective kinetics of cytochrome c oxidase and alteration of mitochondrial membrane potential in fibroblasts and cytoplasmic hybrid cells with the mutation for myoclonus epilepsy with ragged-red fibres ('MERRF') at position 8344 nt. // Biochem. J. 1999. Vol. 342 Pt 3. P. 537-544.

Brazhe N.A. et al. Raman probing of lipids, proteins, and mitochondria in skeletal myocytes: a case study on obesity // J. Raman Spectrosc. 2017. Vol. 48, № 9.

Coen P.M., Goodpaster B.H. Role of intramyocelluar lipids in human health // Trends Endocrinol. Metab. 2012. Vol. 23, № 8. P. 391-398.

Movasaghi Z., Rehman S., Rehman I.U. Raman spectroscopy of biological tissues // Appl. Spectrosc. Rev. 2007. Vol. 42, № 5. P. 493-541.

Chan J.W. et al. Raman Spectroscopic Analysis of Biochemical Changes in Individual Triglyceride-Rich Lipoproteins in the Pre- and Postprandial State // Anal. Chem. 2005. Vol. 77, № 18. P. 5870-5876.

Frank C.J. et al. Characterization of human breast biopsy specimens with near-IR Raman spectroscopy // Anal. Chem. 1994. Vol. 66, № 3. P. 319-326.

Weng Y.-M. et al. Structural Analysis of Triacylglycerols and Edible Oils by Near-Infrared Fourier Transform Raman Spectroscopy // Appl. Spectrosc. 2003. Vol. 57, № 4. P. 413-418. Richardson R.S. et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability // J. Physiol. 2006. Vol. 571, № 2. P. 415-424.

Anderson E.J. et al. Mitochondrial H2O2 emission and cellular redox state link excess fat intake to insulin resistance in both rodents and humans. // J. Clin. Invest. 2009. Vol. 119, № 3. P. 573581.

Murphy M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species. // Biochem. J. 2009. Vol. 417, № 1. P. 1-13.

Hahn W.S. et al. Proinflammatory cytokines differentially regulate adipocyte mitochondrial metabolism, oxidative stress, and dynamics // Am. J. Physiol. Metab. 2014. Vol. 306, № 9. P. E1033-E1045.

Attwell D. et al. Glial and neuronal control of brain blood flow // Nature. 2010. Vol. 468, № 7321. P. 232-243.

Devor A. et al. Frontiers in Optical Imaging of Cerebral Blood Flow and Metabolism // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2012. Vol. 32, № 7. P. 1259-1276.

Zhang S., Murphy T.H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo // PLoS Biol. 2007. Vol. 5, № 5. P. 1152-1167.

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

Bolay H. et al. Intrinsic brain activity triggers trigeminal meningeal afferents in a migraine model // Nat. Med. 2002. Vol. 8, № 2. P. 136-142.

Schwartz T.H. et al. Preictal changes in cerebral haemodynamics: Review of findings and insights from intracerebral EEG // Epilepsy Res. 2011. Vol. 97, № 3. P. 252-266.

Barretto R.P.J. et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy // Nat. Med. 2011. Vol. 17, № 2. P. 223-228. Grinvald A. et al. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals // Nature. 1986. Vol. 324, № 6095. P. 361-364.

Nakamichi Y. et al. Optical intrinsic signal imaging with optogenetics reveals functional cortico-cortical connectivity at the columnar level in living macaques // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 6466.

Schwartz T.H., Bonhoeffer T. In vivo optical mapping of epileptic foci and surround inhibition in ferret cerebral cortex // Nat. Med. 2001. Vol. 7, № 9. P. 1063-1067.

Jobsis F. Noninvasive, infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters // Science (80-. ). 1977. Vol. 198, № 4323. P. 1264-1267. Wolf M., Ferrari M., Quaresima V. Progress of near-infrared spectroscopy and topography for brain and muscle clinical applications // J. Biomed. Opt. 2007. Vol. 12, № 6. P. 062104. Nemoto M. et al. Functional signal- and paradigm-dependent linear relationships between synaptic activity and hemodynamic responses in rat somatosensory cortex. // J. Neurosci. 2004. Vol. 24, № 15. P. 3850-3861.

Jobsis F.F. et al. Reflectance spectrophotometry of cytochrome aa3 in vivo // J. Appl. Physiol. 1977. Vol. 43, № 5. P. 858-872.

LaManna J.C. et al. Detection of an oxidizable fraction of cytochrome oxidase in intact rat brain. // Am. J. Physiol. 1987. Vol. 253, № 3 Pt 1. P. C477-83.

Iyengar A. et al. Direct measurement of tissue oxygenation in neonates via resonance raman

spectroscopy: A pilot study // Neonatology. 2017. Vol. 112, № 2. P. 137-142.

Tiba M.H. et al. Tissue oxygenation monitoring using resonance Raman spectroscopy during

hemorrhage // J Trauma Acute Care Surg. 2014. Vol. 76, № 2. P. 402-408.

Filho I.T. et al. Oxygen saturation monitoring using resonance Raman spectroscopy // J. Surg.

Res. 2016. Vol. 201, № 2. P. 425-431.

Dopner S. et al. Alkaline Conformational Transitions of Ferricytochrome c Studied by Resonance Raman Spectroscopy // J. Am. Chem. Soc. 1998. Vol. 120, № 44. P. 11246-11255. Lanir A., Yu N.T., Felton R.H. Conformational transitions and vibronic couplings in acid ferricytochrome c: a resonance Raman study. // Biochemistry. 1979. Vol. 18, № 9. P. 1656-1660. Battistuzzi G. et al. Effects of nonspecific ion-protein interactions on the redox chemistry of

cytochrome c. 1999. P. 601-607.

187. Clark R.A. et al. Impact of Surface Immobilization and Solution Ionic Strength on the Formal Potential of Immobilized Cytochrome c. 2005. № c. P. 6308-6316.

188. Osellame L.D., Blacker T.S., Duchen M.R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 26, № 6. P. 711723.

189. Wackerbarth H., Hildebrandt P. Redox and Conformational Equilibria and Dynamics of Cytochrome c at High Electric Fields // ChemPhysChem. 2003. Vol. 4, № 7. P. 714-724.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Браже Надежде Александровне за то, что годы совместной работы, начиная со второго курса университета, были такими счастливыми, насыщенными, продуктивными и наполненными смыслом. Надеюсь, что мы продолжим в том же духе. Благодарю профессора Максимова Г.В. и весь коллектив лаборатории Биофизики клетки, прежде всего Браже А.Р., Юсиповича А.И. и Паршину Е.Ю., за теплое отношение, поддержку и помощь в любых вопросах. Особенная благодарность Байжуманову А.А. за неоценимую помощь в работе с животными; профессору Гудилину Е.А. и его научной группе, в первую очередь Семеновой А.А., за разработку плазмонных наноструктур, помощь в их синтезе и сотрудничество; профессору Сосновцевой О. за приглашения в Копенгагенский университет, где была выполнена часть данного исследования; Дееву Л.И. за обучение методу оксиметрии и дальнейшее наставничество; Гривенниковой В.Г. за плодотворное сотрудничество; также моей студентке Бочковой Ж.В. за стимул работать больше и лучше формулировать задачи и идеи. Отдельно благодарю профессора Булычева А.А. за рецензирование моей дипломной и аспирантской научно-квалификационной работы, благодаря чему данная работа заметно усовершенствовалась. Выражаю благодарность заведующему кафедрой биофизики профессору Рубину А.Б. за детальные обсуждения результатов по ходу работы и значительную помощь в доработке автореферата и диссертации. Искренне благодарю всех представителей кафедры биофизики за обучение, сотрудничество и поддержку.

Выражаю благодарность оппонентам д.б.н. Лопиной О.Д., д.ф.-м.н. Олейникову В.А., д.б.н. Сурину А.М. за согласие рассмотреть и оппонировать диссертационную работу.

Выражаю особую признательность своему супругу, родителям, братьям и дедушке за всестороннюю поддержку, терпение и стимулирование получить научную степень.

Работа выполнена при поддержке РФФИ 18-34-00503 мол_а (руководитель Никельшпарг

Э.И.).