Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Зимник, Ольга Валерьевна

• Зимник, Ольга Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зимник, Ольга Валерьевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структура и функции теломер.

1.2. Структура и функции теломеразы.

1.3. Теломерная гипотеза клеточного старения и иммортализации.

1.4. Активность теломеразы в опухолевых клетках человека.

1.5. Экспрессия теломеразы в нормальных клетках человека.

1.6. Регуляция длины теломер и активности теломеразы.

1.7. Ингибиторы теломеразы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Олигонуклеотиды.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови.

2.2.2. Получение экстрактов из лимфоцитов и клеток опухолевых линий

2.2.3. Анализ активности теломеразы.

2.2.4. Постановка контролей на ингибирование соединениями

Taq ДНК-полимеразы в системе амплификации фрагмента гена ß-глобина человека.

2.2.5. Очистка продуктов теломеразной реакции методом осаждения.

2.2.6. Очистка продуктов теломеразной реакции методом ультрафильтрации.

2.2.7. Определение ингибирующей активности соединений.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение активности теломеразы в экстрактах клеток опухолевых линий с помощью модифицированного метода ТИАР.

3.2. Определение активности теломеразы в экстрактах лимфоцитов больных гемобластозами.

3.3. Исследование влияния на активность теломеразы некоторых производных нуклеозидов.

3.4. Исследование влияния на активность теломеразы производных пиридоксина, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторых других соединений.

3.5. Исследование влияния на активность теломеразы производных ретиноевой кислоты.

3.6. Исследование влияния на активность теломеразы фосфодиэфирных и фосфоротиоатных синтетических олигонуклеотидов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro»

Одной из самых важных задач современной медицины и фармакологии является создание высокоэффективных и специфически действующих препаратов для лечения злокачественных новообразований. Большие усилия исследователей, ведущих поиск путей повышения эффективности и специфичности действия таких препаратов, направлены на более глубокое изучение природы опухолевого роста. Совершенно очевидно, что проникновение в суть данного процесса поможет выявить такие биологические и фенотипические особенности раковых клеток, которые станут своего рода объектами для воздействия на них с целью остановки роста опухолей. Одной из таких особенностей, которая в настоящее время исследуется наиболее интенсивно, является неограниченный репликативный потенциал или иммортальность (154). Данное свойство считается одним из основных признаков, отличающих раковые клетки от нормальных. В некотором смысле ограниченный репликативный потенциал нормальных соматических клеток, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления, может рассматриваться в качестве элементарного способа опухолевой супрессии (54). Иными словами, в нормальных соматических клетках существует генетически наследуемый механизм контроля пролиферации. Раковые клетки, как выяснилось, обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности. По мнению многих исследователей, приобретение свойства иммортальности клетками опухолей связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер (56).

К настоящему времени накоплено много данных, свидетельствующих в пользу того, что активация теломеразы может быть важным фактором в прогрессии злокачественных опухолей. С момента разработки высокочувствительного метода определения активности 6 теломеразы (TRAP) (79) были исследованы тысячи образцов различных тканей человека. Наличие активной теломеразы в подавляющем большинстве злокачественных опухолей и отсутствие ее в нормальных соматических тканях (79, 147) дают основание считать активность теломеразы наиболее специфической характеристикой раковых клеток. Именно поэтому данный фермент вызывает большой интерес в кругу исследователей в качестве потенциальной "мишени" в терапии злокачественных новообразований, а также маркера для диагностики онкологических заболеваний.

Золотым стандартом" в диагностике большинства злокачественных опухолей на сегодняшний день является гистологический анализ. В то же время в некоторых случаях использование теломеразы в качестве маркера раковых клеток могло бы позволить обойтись более простыми и щадящими способами получения клинических образцов для постановки диагноза. Так, например, высокая чувствительность метода, применяемого для измерения активности теломеразы, дает возможность при определенных типах опухолей зафиксировать наличие раковых клеток в образцах крови (161) и мочи (192), в промывных жидкостях толстого кишечника (191) и полости рта (22), а также в других образцах, полученных неинвазивными и минимально инвазивными способами. Многие авторы считают, что кроме диагностических тестов теломераза может найти применение и в качестве прогностического маркера, поскольку для некоторых видов опухолей была обнаружена корреляция между активностью теломеразы и определенными клиникопатологическими показателями (65, 66). Диагностический и прогностический потенциал теломеразы как наиболее специфичного и универсального на сегодняшний день опухолевого маркера требует дальнейшего проведения широких клинических исследований. В процессе таких исследований должно быть установлено, насколько четко активность теломеразы коррелирует с наличием того или иного типа злокачественной опухоли, какова разница между уровнем активности фермента в 7 клетках, вовлеченных в канцерогенез, и соответствующих интактных клетках. Для этих целей необходимо также усовершенствование методов количественного определения активности теломеразы.

Возможность практического применения теломеразы в онкологии распространяется не только на диагностику и прогнозирование исхода заболевания. Наибольшую ценность может иметь использование данного фермента в качестве терапевтической "мишени". Как указывалось выше, активация теломеразы является специфической характеристикой раковых клеток, поэтому избирательное воздействие на нее может стать основной целью при создании нового класса противоопухолевых препаратов. Основываясь на данных, полученных при изучении свойств теломеразы, в настоящее время уже ведется поиск ее ингибиторов (144). 8

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зимник, Ольга Валерьевна

Выводы

1. Разработан неизотопный вариант метода определения активности теломеразы в экстрактах клеток, по чувствительности практически не уступающий традиционному методу TRAP.

2. С помощью модифицированного метода TRAP теломеразная активность была обнаружена в лимфоцитах большинства больных злокачественными опухолями кроветворной и лимфоидной ткани. Полученные результаты подтверждают возможность использования данного варианта метода для анализа активности теломеразы в клинических образцах.

3. Показано, что производные нуклеозидов на основе тимина и 5-фторурацила, производные пиридоксина, а также эфиры нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами не оказывают заметного влияния на активность теломеразы.

4. Установлено, что производное бифосфоновой кислоты К-6, производное ретиноевой кислоты R-3, фосфономуравьиная кислота и препарат Олипифат способны подавлять активность теломеразы в микромолярных концентрациях.

5. Показано, что изучение ингибирующего действия на активность теломеразы фосфодиэфирных олигонуклеотидов, комплементарных РНК-компоненту фермента, и ТМО невозможно из-за их влияния на стадию отжига праймеров в TRAP-анализе.

6. Обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды являются очень эффективными ингибиторами теломеразы, однако их эффективность мало зависит от степени комплементарности РНК-компоненту фермента.

91

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зимник, Ольга Валерьевна, 2000 год

1. Оловников, A.M. Принципы маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. АН СССР, 1971, 201, 1496-1499.

2. Adams, M.D., Rudner, D.Z., Rio, D.C. Biochemistry and regulation of pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Cell Biol., 1996, 8, 331-339.

3. Aldous, W.K., Grabill, N.R. A fluorescent method for detection of telomerase activity. Diagnostic Molecular Pathology, 1997, 6, 102-110.

4. Allsopp, R.C., Vaziri, H., Patterson, C., Goldstein, S., Younglai, E.V., Futcher, А.В., Greider, C.W., Harley, C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10114-10118.

5. Bechter, O.E., Eisterer, W., Pall, G., Hilbe, W., Kuhr, Т., Thaler, J. Telomere length and telomerase activity predict survival in patients with В cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer Research, 1998, 58, 4918, 4922.

6. Beltz, L., Moran, R., Elsawy, O., Sadler, J., Jurgenson, J. The effects of telomerase inhibitors on lymphocyte function. Anticancer Research, 1999, 19, 3205-3212.

7. Bianchi, A., Smith, S., Chong, L., Elias, P., de Lange, T. TRF1 is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J., 1997, 16, 1785-1794.

8. Bilaud, Т., Gilson, E. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 1294-1303.

9. Blackburn, E.H., Gall, J.G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J. Mol. Biol., 1978, 120, 33-63.

10. Blasco, M.A., Lec, H., Hande, M.P., Samper, E., Lansdorp, P.M., DePinho, R.A., Greider, C.W. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell, 1997,91,25-34.

11. Bouffler, S.D. Involvment of telomeric sequences in chromosomal aberrations. Mutation Research, 1998,404, 199-204.

12. Broccoli, D., Smogorzewska, A., Chong, L., de Lange, T. Human telomeres contain twodistinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2. Nat. Genet., 1997, 17, 231-235.

13. Broccoli, D., Young, J.W., de Lange, T. Telomerase activity in normal and malignanthematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9082-9086.

14. Brousset, P., A1 Saati, T., Chaouche, N., Zenou, R.-C., Schlaifer, D., Chittal, S., Delsol, G.

15. Telomerase activity in reactive and neoplastic lymphoid tissues: infrequent detection ofactivity in Hodgkin's disease. Blood, 1997, 89, 26-31.

16. Burger, A.M., Biddy, M.C., Double, J.A. Telomerase activity in normal and malignant tissues: feasibility of telomerase as a target for cancer chemotherapy. British Journal of Cancer, 1997, 75,516-522.

17. Califano, J., Ahrendt, S.A., Meininger, G., Westra, W.H., Koch, W.M., Sidransky, D. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res., 1996, 56, 5720-5722.

18. Chen, S.-F., Maine, I.P., Windle, B. Effect of 3'-azidothymidine triphosphate (AZTTP) and 3'-azidothymidine (AZT) on telomerase activiy and telomere function. Abstract. Proc. Ann. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 1995, 36, A3302.

19. Chiu, C.-P., Dragowska, W., Kim, N.W., Vaziri, H., Yui, J., Thomas, T.E., Harley, C.B., Lansdorp, P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow. Stem Cells, 1996, 14, 239-248.

20. Cooke, H.J., Smith, B.A. Variability at the telomeres of human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 1986, 51,213-219.

21. Counter, C.M., Botelho, F.M., Wang, P., Harley, C.B., Bacchetti, S. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes. J. Virol., 1994, 68, 3410-3414.

22. Fletcher, T.M., Salazar, M., Chen, S.-F. Human telomerase inhibition by 7-deaza-2'-deoxypurine nucleoside triphosphates. Biochemistry, 1996, 35, 15611-15617.

23. Fletcher, T.M., Sun, D., Salazar, M., Hurley, L.H. Effect of DNA secondary structure on human telomerase activity. Biochemistry, 1998, 37, 5536-5541.

24. Fujimoto, K., Takahashi, M. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1997, 241, 775-781.

25. Geliert M., Lipsett, M.N., Davies, D.R. Helix formation by guanylic acid. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1962, 48, 2013-2918.

26. Greider, C.W., Blackburn, E.H. Telomeres, telomerase and cancer. Scientific American, 1996, 274,92-97.

27. W.R., Shay, J.W., Corey, D.R. Identification of determinants for inhibitor binding within the RNA active site of human telomerase using PNA scanning. Biochemistry, 1997, 36, 11873-11880.

28. Harley, C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutation Research, 1991, 256, 271-282.

29. Harley, C.B. Telomeres and aging. In "Telomeres" (E.H. Blackburn and C.W. Greider, Eds.). Cold Spring Harbor Press, New York, 1995, 247-263.

30. Harley, C.B., Futcher, A.B., Greider, C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990, 345, 458-460.

31. Harley, C.B., Kim, N.W. Telomerase and cancer. In De Vita, V.T., Hellmans, S., Rosenberg, S.A. eds. /Important Advances in Oncology 1996/. Philadelphia, LippincottRaven Publishers, 1996, 57-67.

32. Harley, C.B., Vaziri, H., Counter, C.M., Allsopp, R.C. The telomere hypothesis of cellular aging. Exp. Gerontol., 1992, 27, 375-382.

33. Harley, C.B., Villeponteau, B. Telomeres and telomerase in aging and cancer. Curr. Opin. Genet. Dev., 1995, 5, 249-255.

34. Harrington, L., McPhail, T., Mar, V., Zhou, W., Oulton,R., Bass, M.B., Arruda, I., Robinson, M.O. A mammalian telomerase-associated protein. Science, 1997, 275, 973977.

35. Harrington, L., Zhou, W., McPhail, T., Oulton, R., Yeung, D.S.K., Mar, V., Bass, M.B., Robinson, M.O. Human telomerase contains evolutionarily conserved catalytic and structural subunits. Genes Dev., 1997, 11, 3109-3115.

36. Hastie, N.D., Dempster, M., Dunlop, M.G., Thompson, A.M., Green, D.K., Allshire, R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with aging. Nature, 1990, 346,866.868.

37. Hayflick, L., Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res., 1961,25,585-621.

38. Heidenreich, O., Kang, S.-H., Xu, X., Nerenberg, M. Application of antisense technology to therapeutics. Molecular Medicine Today, 1995, 1, 128-133.

39. Henderson, S., Allsopp, R., Spector, D., Wang, S.-S., Harley, C. In situ analysis of changes in telomere size during replicative aging and cell transformation. Journal of Cell Biology, 1996, 134,1-12.

40. Hiyama, E., Hiyama, K., Tatsumoto, N., Shay, J.W., Yokoyama, T. Telomerase activity in human intestine. Int. J. Oncol., 1996, 9, 453-458.

41. Hiyama, E., Hiyama, K., Yokoyama, T., Ichikawa, T., Matsuura, Y. Length of telomeric repeats in neuroblastoma; correlation with prognosis and other biological characteristics. Jpn. J. Cancer Res., 1992, 83, 159-164.

42. Hiyama, E., Hiyama, K., Yokoyama, T., Matsuura, Y., Piatyszek, M.A., Shay, J.W. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nature Med., 1995,1,249-255.

43. Holt, S.E., Shay, J.W., Wright, W.E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer. Nature Biotech., 1996,14, 834-837.

44. Joshi, S.S., Palen, B.N., Mata, J.E., Iversen, P.L. Growth inhibitory effects of telomere -mimic oligonucleotides on human leukemia/lymphoma cells in vitro. Abstract., Proc. Ann. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 1995, 36, A2449.

45. Joshi, S.S., Wu, A.G., Verbik, D.J. et al. Oligonucleotides complementary c-myb messenger RNA inhibit cell growth and induce apoptosis in human Burkitt lymphoma cells. Int. J. Oncol., 1996, 8, 815-820.

46. Kang, C., Zhang, X., Ratliff, R., Moyzis, R., Rich, A. Crystal structure of four-stranded Oxytricha telomeric DNA. Nature, 1992, 356, 126-131.

47. Kang, M.K., Guo, W., Park, N.-H., Replicative senescence of normal human oral keratinocytes is associated with the loss of telomerase activity without shortening oftelomeres. Cell Growth Differ., 1998, 9, 85-95.

48. Kondo, S., Kondo, Y., Li, G., Silverman, R.H., Cowell, J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene, 1998, 16, 3323-3330.

49. Kramer, K.M., Haber, J.E. New telomeres in yeast are initiated with a highly selected subset of TG1.3 repeats. Genes Develop. 1993, 7, 2345-2356.

50. Kyo, S., Takakura, M., Kohama, T., Inoue, M. Telomerase activity in human endometrium. Cancer Res., 1997, 57, 610-614.

51. Makarov, V.L., Hirose, Y., Langmore, J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell, 1997, 88, 657-666.

52. Marusic, L., Anton, M., Tidy, A., Wang, B., Villeponteau, B., Bacchetti, S.

53. Reprogramming of telomerase by expression of mutant telomerase RNA template in human cells leads to altered telomeres that correlate with reduced cell viability. Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 6394-6401.

54. Matthes, E., Lehmann, Ch. Telomerase protein rather than its RNA is the target of phosphorothioate-modified oligonucleotides. Nucleic Acids Research, 1999, 27, 11521158.

55. McClintock, B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics, 1941, 26, 234-282.

56. Melana, S.M., Holland, J.F., Pogo, B.G.-T. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3'-azido-3'-deoxythymidine. Clin. Cancer Res., 1998, 4, 693-696.

57. Melek, M., Shippen, D.E. Chromosome healing: Spontaneous and programmed de novo telomere formation by telomerase. BioEssays, 1996, 18, 301-308.

58. Mergny, J.-L., Mailliet, P., Lavelle, F., Riou, J.-F., Laoui, A., Helene, C. The development of telomerase inhibitors: the G-quartet approach. Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14, 327339.

59. Metcalfe, J.A., Parkhill, J., Campbell, L. et al. Accelerated telomere shortening in ataxia telangiectasia. Nature Genet., 1996, 13, 350-353.

60. Meyerson, M., Counter, C.M., Eaton, E.N., Ellisen, L.W., Steiner, P., Caddie, S.D., Ziaugra, L., Beijersbergen, R.L., Davidoff, M.J., Liu, Q., Bacchetti, S., Haber, D.A.,

61. Morin, G. Recognition of a chromosome truncation site associated with alpha-thalassemia by human telomerase. Nature, 1991, 353, 454-456.

62. Mueller, H.J. The remaking of chromosome. The Colleting Net Woods Hole, 1938, 13, 181-198.

63. Murnane, J.P., Sabatier, L., Marder, B.A., Morgan, W.F. Telomere dynamics in an immortal human cell line. EMBO J., 1994, 13, 4953-4962.

64. Naasani, I., Seimiya, H., Tsuruo, T. Telomerase inhibition, telomere shortening and senescence of cancer cells by tea catechins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 249, 391-396.

65. Nakamura, T.M., Morin, G.B., Chapman, K.B., Weinrich, S.L., Andrews, W.H., Lingner, J., Harley, C.B., Cech, T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science, 1997, 277, 955-959.

66. Nakayama, J., Tahara, H., Tahara, E., Saito, K.I., Nakamura, H., Nakanishi, T., Tahara, E., Ide, T., Ishikawa, F. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nature Genetics, 1998, 18, 65-68.

67. Nakayama, J.-I., Saito, M., Nakamura, H., Matsuura, A., Ishikawa, F. TLP1: A gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. Cell, 1997, 88, 875-884.

68. Neer, E.J., Schmidt, C.J., Nambudripad, R., Smith, T.F. The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature, 1994, 371, 297-300.

69. Nilsson, P., Mehle, C., Remes, K., Roos, G. Telomerase activity in vivo in human malignant hematopoietic cells. Oncogene, 1994, 9, 3043-3048.

70. Noble, J.R., Rogan, E.M., Neumann, A.A., Maclean, K., Bryan, T.M., Reddel, R.R. Association of extended in vitro proliferative potential with loss of pl6INK4 expression. Oncogene, 1996, 13, 1259-1268.

71. Odagiri, E., Kanda, N., Jibiki, K., Demura, R., Aikawa, E., Demura, H. Reduction of telomeric length and c-erbB-2 gene amplification in human breast cancer, fibroadenoma and gynecomastia. Cancer, 1994, 73, 2978-2984.

72. Ohnuma, T., Li, F.-L., Holland, J.F. Inhibitory effects of telomere-mimic phosphorothioate oligonucleotides on various human tumor cells in vitro. Anticancer Research, 1997, 17, 2455-2458.

73. Ohyashiki, J., Ohyashiki, K., Fujimura, T., Kawakubo, K., Shimamoto, T., Iwabuchi, A., Toyama, K. Telomere shortening associated with disease evolution patterns in myelodisplastic syndromes. Cancer Res., 1994, 54, 3557-3560.

74. Page, T.J., Mata, J.E., Bridge, J.A., Siebler, J.C., Neff, J.R., Iversen, P.L. The cytotoxic effects of single-stranded telomere mimics on OMA-BL1 cells. Experimental Cell Research, 1999, 252,41-49.

75. Perry, P.J., Gowan, S.M., Reszka, A.P., Polucci, P., Jenkins, T.C., Kelland, L.R., Neidle,

76. S. 1,4- and 2,6-Disubstituted amidoanthracene-9,10-dione derivatives as inhibitors ofhuman telomerase. Journal of medicinal Chemistry, 1998, 41, 3253-3260.

77. Perry, P.J., Reszka, A.P., Wood, A.A., Read, M.A., Gowan, S.M., Dosanjh, H.S., Trent,

78. J.O., Jenkins, T.C., Kelland, L.R., Neidle, S. Human telomerase inhibition byregioisomeric disubstituted amidoanthracene-9,10-diones. Journal of Medicinal Chemistry,1998,41,4873-4884.

79. Pitts, A.E., Corey, D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-0-methyl-RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 11549-11554.

80. Renauld, H., Aparicio, O.M., Zierath, P.D., Billington, B.L., Chhablani, S.K., Gottschling,

81. D.E. Silent domains are assembled continuously from the telomere and are defined bypromoter distance and strength. Genes Develop., 1993, 7, 1133-1145.

82. Rhodes, D., Giraldo, R. Telomere structure and function. Curr. Opin. Struct. Biol., 1995, 5,311.322.

83. Rogan, E.M., Bryan, T.M., Hukku, B., Maclean, K., Chang, A.C.-M., Moy, E.L., Englezou,

84. A., Warneford, S.G., Dalla-Pozza, L., Reddel, R.R. Alterations in p53 and pl6iNK4 expression and telomere length during spontaneous immortalization of Li-Fraumeni syndrome fibroblasts. Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 4745-4753.

85. Schechtman, M.G. Isolation of telomeric DNA from Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol., 1987, 7,3168-3177.

86. Sen, D., Gilbert, W. Formation of parallel four-stranded complex by guanine-rich motifs in DNA and its implication for meiosis. Nature, 1988, 334, 364-366.

87. Shay, J.W., Van Der Haegen, B.A., Ying, Y., Wright, W.E. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen. Exp. Cell Res., 1993, 209, 45-52.

88. Shay, J.W., Wright, W.E. Telomerase activity in human cancer. Curr. Opin. Oncol., 1996, 8,66-71.

89. Shulz, V.P., Zakian, V.A., Osbum, C.E. et al. Accelerated loss of telomeric repeats maynot explain accelerated replicative decline of Werner syndrome cells. Hum. Genet., 1996, 97, 750-754.

90. Slijepcevic, P., Hände, M.P., Bouffier, S.D., Lansdorp, P.M., Bryant, P.E. Telomere length, chromatin structure and chromosome fusigenic potential. Chromosoma, 1997, 106, 413421.

91. Smith, F.W., Feigon, J. Quadruplex structures of Oxytricha telomeric DNA oligonucleotides. Nature, 1992, 356, 164-168.

92. Smith, J., Yeh, G. Telomere reduction in endometrial adenocarcinoma. Am. J. Obstet. Gynecol., 1992, 167, 1883-1887.

93. Smith, S., de Lange, T. TRF1, a mammalian telomeric protein. Trends Genet., 1997, 13, 21-26.

94. Smith, S., Giriat, I., Schmitt, A., de Lange, T. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science, 1998, 282, 1484-1487.

95. Stamps, A.C., Gusterson, B.A., O'Hare, M.J. Are tumors immortal? Eur. J. Cancer, 1992, 28A, 1495-1499.

96. Sundquist, W.I., Klug, A. Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetradsbetween hairpin loops. Nature, 1989, 342, 825-829.

97. Tao, M., Naoko, M.-K., Takai, K., Takaku, H. Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent, FuGENE6-antisense phosphorothioate oligonucleotide complex in HeLa cells. FEBS Letters, 1999, 454, 312-316.

98. Vaziri, H., Benchimol, S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. Current Biology, 1998, 8, 279-282.

99. Vaziri, H., Dragowska, W., Allsopp, R.C., Thomas, T.E., Harley, C.B., Lansdorp, P.M. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 9857-9860.

100. Vaziri, H., Schachter, F., Uchida, I., Wei, L., Zhu, X., Effros, R., Cohen, D., Harley, C.B. Loss of telomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes. American Journal of Human Genetics, 1993, 52, 661-667.

101. Vermeesch, J.R., Petit, P., Speleman, F., Deuriendt, K., Fryns, J.P., Marynen, P. Interstitial telomeric sequences at the junction site of a jumping translocation. Hum. Genet., 1997, 99, 735-737.

102. Wainwright, J., Middleton, P.G., Rees, J.L. Changes in mean telomere length in basal cellcarcinomas of the skin. Genes, Chromosomes Cancer, 1995, 12, 45-49.

103. Wan, M.S.K., Fell, P.L., Akhtar, S. Synthetic 2'-0-methyl-modified hammerheadribozymes targeted to the RNA component of telomerase as sequence-specific inhibitors oftelomerase activity. Antisense & nucleic acid drug development, 1998, 8, 309-317.

104. Wang, J., Xie, L.Y., Allan, S., Beach, D., Hannon, G.J. Myc activates telomerase. Genes

105. Dev., 1998, 12, 1769-1774.

106. Wang, Y., Patel, D.J. Solution structure of the human telomeric repeat dAG3(T2AG3)3. G-tetraplex. Structure, 1993, 1, 263-282.

107. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Human naive and memory T lymphocytes differ in telomeric length and replicative potential. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92, 11091-11094.

108. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. J. Exp. Med., 1996, 183, 2471-2479.

109. Weng, N., Levine, B.L., June, C.H., Hodes, R.J. Regulation of telomerase RNA template expression in human T lymphocyte development and activation. The Journal of Immunology, 1997, 158, 3215-3220.

110. Wilkie, A.O.M., Lamb, J., Harris, P.C., Finney, R.D., Higgs, D.R. A truncated human chromosome 16 associated with a-thalassemia is stabilized by addition of telomeric repeats (TTAGGG)n. Nature, 1990, 346, 868-871.

111. Williamson, J.R. G-quartet structures in telomeric DNA. Ann. Rev. Boiphys. Biomol. Struct., 1994, 23, 703-730.