Исследование влияния метилирования аденозина (m6A) в мРНК на кэп-зависимую инициацию трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Смолин Егор Алексеевич

• Смолин Егор Алексеевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Смолин Егор Алексеевич

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень разработанности

Цель и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Апробация результатов работы и публикации

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Функционирование ш6Л-метилтрнсферазного комплекса

1.1. мРНК т6А - метилтрансферазы

1.2. Специфичность ш6Л-модификации

1.3. Деметилазы

1.4. Белки, ответственные за распознавание ш6Л (ш6Л-ридеры)

1.5. Функции ш6А в метаболизме мРНК

1.6. Альтернативный сплайсинг мРНК

1.7. Экспорт мРНК из ядра

1.8. Стабильность мРНК

1.9. Влияние ш6Л-модификации в мРНК на регуляцию трансляции

1.9.1. Метилирование аденозина в НТО влияет на эффективность трансляции

1.9.2. Влияние т6А в кодирующих областях на трансляцию

1.9.3. ш6Л-опосредованный контроль кэп-независимой трансляции

1.9.4. ш6Л-опосредованная регуляция инициации трансляции во время комплексной реакции на стресс (ISR)

1.9.5. ш6Л-зависимое образование кольцевой структуры мРНК облегчает трансляцию

1.9.6. Роль 6А метилирования рибосомной РНК в синтезе белка

2. Роль ш6Л в сигнальных клеточных путях

2.1. m6A и TGFp

2.2. m6A и сигнальный путь ERK

2.3. m6A и mTOR-сигнальный каскад

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ

МЕТОДЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Изучение влияния т6А модификации в мРНК на регуляцию ее трансляции в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации трансляции in vitro

5.2. Изучение влияние т6А-модификации в мРНК на регуляцию ее трансляции в нормальных условиях и в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации in vivo

5.3. Получение клеточных линий с различной степенью метилирования эндогенной мРНК

5.4. Влияния метилирования аденозина в мРНК на регуляцию трансляции мРНК в условиях ингибирования mTOR киназы in vivo

5.5. LARP и т6А-опосредованный механизм mTOR зависимой регуляции трансляции

5.6. Измерение глобального уровня трансляции и активности mTOR сигнального каскада в клетках с нокдауном по метилазам METTL3/14 по сравнению с клетками HEK293T дикого типа

5.7. Оценка связывания метилированной и неметилированной мРНК с факторами инициации трансляции в нормальных условиях и при ингибировании кэп-зависимой инициации с помощью torin

5.8. Исследование влияние m6A в масштабах транскриптома

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень разработанности

Инициация трансляции представляет собой критически важный этап в процессе биосинтезе белка. Для большинства эукариотических мРНК инициация трансляции начинается со связывания с кэп-структуры на 5'-конце мРНК фактором инициации 4Е (еШ4Е) в составе eIF4F комплекса. Данное взаимодействие способствует связыванию с фактором инициации еШ3, привлекающим рибосому на мРНК.

Один из основных способов глобальной регуляции инициации трансляции основан на модулировании взаимодействия мРНК с инициаторным комплексом eIF4F за счет изменения кэп-связывающей активности еШ4Е. Так, в различных стрессовых условиях (аминокислотное голодание, недостаток факторов роста, гипоксия, нарушение энергетического баланса, обработка некоторыми видами ксенобиотиков и т.п) снижается активность киназы mTOR, что в том числе приводит к дефосфорилированию 4Е-связывающего белка (4Е-ВР) и как следствие к ингибированию инициации [1]. Однако в условиях, когда кэп-зависимая инициация трансляции подавлена, синтез некоторых белков, необходимых для выживания клеток и восстановления после стресса, продолжается посредством альтернативных механизмов [2,3]. В недавних исследованиях было обнаружено, что инициация трансляции на мРНК, содержащих №-метиладенозин (т6А), может протекать по кэп-независимому механизму инициации трансляции. Однако четкого понимания причин и деталей этого явления на настоящий момент неизвестно.

Метилирование аденозина в молекулах мРНК (т6А модификация) было впервые обнаружено еще в 1970-х годах. Модификация аденозина в молекулах мРНК, известная как т6А, была первоначально выявлена в 1970-х годах. За десятилетия исследований были определены ключевые ферменты, такие как МЕТТЬЗ и МЕТТЬ14 [4], отвечающие за метилирование, и деметилазы, такие как FTO и ЛЬКВН5, способные убирать эту модификацию [5,6]. На данный момент показано, что т6Л-модификация является чрезвычайно важной эпигенетической

модификацией, участвующей во многих клеточных процессах, включая сплайсинг [7-10], экспорт мРНК в цитоплазму [11-13], регуляцию стабильности [14] и регуляцию трансляции мРНК [15,16].

На сегодняшний день роль метилирования т6А в регуляции трансляции не вызывает сомнений. Показано, что при нокдауне метилазы METLL3 (снижении уровня метилирования) тотальный белковый синтез становится более чувствительным к ингибиторам mTOR. Это подразумевает, что в обычных условиях значительная часть мРНК метилирована, а в условиях ингибирования кэп-зависимой трансляции (например, при стрессах, подавляющих активность mTOR-киназы) это позволяет ей эффективно транслироваться. Однако вопрос механизма работы и контроля этого процесса остается открытым. Предполагается, что наличие т6А в 5'-НТО мРНК достаточно для связывания еШЗ фактора, что способствует не зависимой от кэпа посадки рибосомы на мРНК [16]. Однако остается неизвестным, как при этом связываются другие факторы инициации. Кроме того, остается неизвестным, как изменяется трансляция в масштабах всего транскриптома в ответ на ингибирование mTOR сигнального каскада в клетках без метилаз (МЕТ^З или МЕТт4).

Таким образом, несмотря на значительные достижения в изучении регуляции инициации трансляции в контексте т6А модификации мРНК, данные процессы все еще остается предметом дальнейших исследований, что и определяет актуальность данной диссертационной работы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование влияния метилирования аденозина (m6A) в мРНК на кэп-зависимую инициацию трансляции»

Цель и задачи работы

Цель данной работы состояла в определении влияния метилирования аденозина по 6 положению в мРНК на регуляцию трансляции в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации трансляции. Согласно цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние т6А-модификации в мРНК на трансляцию в бесклеточной системе трансляции в нормальных условиях и в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации трансляции;

2. Оценить изменение связывания факторов инициации трансляции с метилированной и неметилированной мРНК в нормальных условиях и в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации в бесклеточной системе трансляции;

3. Выяснить влияние m6A в мРНК на регуляцию трансляции в нормальных условиях и в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации в контрольных клетках HEK293T и клетках HEK293T с нокаутом по деметилазам (FTO, ALKBH5) или с нокдауном по метилазам (METTL3, METTL14);

4. Определить изменения в трансляции в нормальных условиях и в условиях ингибирования mTOR киназы для контрольных клеток HEK293T и клеток HEK293T с нокдауном метилаз (METLL3, METLL14) в масштабах всего транскриптома методом рибосомного профайлинга.

Научная новизна

Впервые показано, что метилирование аденозина (m6A) в мРНК способствует устойчивости трансляции репортерных мРНК в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации in vitro независимо от последовательности 5' и 3' НТО.

Впервые установлено, что метилирование аденозина повышает сродство компонентов комплекса факторов инициации eIF4F к метилированной мРНК и способствует их связыванию в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации.

Впервые продемонстрировано, что нокдаун белков метилтрансферазного комплекса METTL3 и METTL14 в клетках HEK293T приводит к снижению общего уровня трансляции, что сопровождается снижением активности mTOR сигнального каскада.

Впервые показано, что при ингибировании mTOR сигнального каскада в клетках HEK293T наблюдается снижение общего уровня m6A в тотальной клеточной РНК.

С использованием методов высокопроизводительного секвенирования впервые показано, что чувствительность трансляции к ингибированию mTOR-сигнального каскада при нокдауне генов метилаз МЕТТЬЗ и МЕТТЬ14 проявляется не для всех клеточных мРНК, а лишь для определенной группы мРНК, в которых наблюдается значительное снижение уровня метилирования 6А.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическое значение данной работы заключается в углублении наших знаний о механизмах, регулирующих кэп-зависимую инициацию трансляции у эукариотических мРНК и влияния т6А-модификации на этот процесс. Практическое значение работы проявляется в разработке методов для получения и детекции т6-модифицированных мРНК-транскриптов, которые могут быть использованы в других исследованиях. Особенно ценным является анализ изменений в транскриптоме клеток НЕК293Т с нокаутом генов МЕТТЬ3/14 в условиях ингибирования mTOR по сравнению с клетками дикого типа, поскольку подобных данных на данный момент не опубликовано вовсе.

Известно, что процесс онкогенеза включает резервные механизмы, которые позволяют опухолевым клеткам справляться со стрессовыми условиями. Важную роль в этой адаптации к стрессу играют белки, синтез которых активируется в ответ на стрессовые сигналы [17,18]. Многие транскрипты, связанные с развитием рака, способны к кэп-независимому механизму инициации трансляции. Поскольку метилирование мРНК может способствовать такому способу инициации трансляции мРНК при различных стрессах, раковые клетки, могут использовать m6A-зависимый механизм инициации трансляции для преодоления неблагоприятных условий, в которых они зачастую находятся. В связи с этим исследование т6А-зависимой регуляции трансляции представляется весьма актуальным с точки зрения понимания функционирования раковых клеток и разработки методов диагностики и борьбы с раковыми заболеваниями.

Методология исследования

Для исследования влияния т6А-модификации в мРНК на регуляцию трансляции использовался широкий набор современных биохимических, молекулярно-биологических и генно-инженерных методов. Для получения репортерных мРНК, предназначенных для исследования регуляции трансляции, проводилось создание плазмидных конструкций для синтеза репортерных мРНК с различными 5' и 3' НТО. Далее, методом транскрипции in vitro были синтезированы соответствующие мРНК для последующего исследования трансляции in vitro. Метилированные формы этих мРНК были получены путем добавления метилированного аденозина в систему транскрипции. Включение m6A-модификации в исследуемые мРНК было подтверждено с использованием методов TLC и нозерн/вестерн-дотблота. Кэпирование и полиаденилирование in vitro синтезированных мРНК выполнялось энзиматическими методами. С использованием in vitro синтезированных репортерных мРНК было проведено исследование влияния т6А-модификации на трансляцию мРНК в бесклеточных системах трансляции, полученных из клеток HEK293T. Анализ трансляции in vivo проводился путем трансфекции плазмидных конструкций в клеточные линии, имеющих различный профиль эндогенного метилирования. Клеточные линии с нокаутом генов, ответственных за деметилирование FTO/ALKBH5 или регуляцию LARP1, были получены с использованием метода точного редактирования генома CRISPR/Cas9n. Для снижения экспрессии белков метилазного комплекса METTL3/14 использовался метод РНК-интерференции Анализ содержания белков и мРНК в образцах был выполнен с использованием методов иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР, соответственно. Общий уровень трансляции в исследуемых клетках был оценен по включению азидогомоаланина с последующей биохимической реакцией присоединения флюоресцентной метки Alexa488. Полнотранскриптомный анализ клеток со сниженной экспрессией метилаз был выполнен с использованием методов высокопроизводительного секвенирования RNA-Seq и Ribo-Seq.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Исследование трансляции in vitro синтезированных мРНК (YB1, HGS, CALR, BTF3, HSP70, SLU7, RPL32) в БСТ показало, что метилированные репортерные мРНК демонстрируют снижение чувствительности к ингибированию кэп-зависимой инициации, вызванной добавлением кэп-аналога или обработкой клеток Torin1, в сравнении с неметилированными мРНК. Наблюдаемое снижение чувствительности характерно для всех используемых репортерных мРНК независимо от нуклеотидного состава и длинны 5' и 3'НТО;

2. m6A-модификация в кэпированной мРНК повышает сродство компонентов eIF4F комплекса к мРНК, а также способствует связыванию факторов инициации в условиях ингибирования кэп-зависимой инициации;

3. Метилирование (m6A) в мРНК SLU7 необходимо для устойчивости трансляции этой мРНК к ингибированию кэп-зависимой инициации трансляции в клетках HEK293T;

4. Нокдаун белков метилтрансферазного комплекса METTL3 и METTL14 в клетках HEK293T приводит к снижению общего уровня трансляции, что сопровождается снижением активности mTOR сигнального каскада;

5. С использованием методов высокопроизводительного секвенирования показано, что нокдаун метилаз METTL3/14 в клетках HEK293T повышает чувствительность трансляции к ингибированию сигнального каскада mTOR в зависимости от степени 6А-метилирования мРНК. Наибольшее повышение чувствительности наблюдается для группы мРНК со средним уровнем метилирования.

Личный вклад автора

Автором был выполнен поиск и анализ литературы по теме исследования, разработан дизайн экспериментов, и были проведены основные экспериментальные и теоретические работы, изложенные в основном тексте настоящей работы. Подготовка библиотек для рибосомного профайлинга была выполнена совместно с Д.Н. Лябиным. Секвенирование образцов производилось на базе центра коллективного пользования Сколковского института науки и

технологий. Биоинформатический анализ результатов секвенирования был проведен совместно с И.В. Кулаковским и А.И. Буяном. Плазмидные конструкции на основе вектора pSP36T-Fluc-A50 с 5' и 3' НТО мРНК YB-1, CALR, HGS, BTF3 были ранее получены Лябиным Д.Н. и Елисеевой И.А.

Апробация результатов работы и публикации

По результатам исследования опубликовано 6 печатных работ в международных рецензируемых журналах, индексируемых в системах Web of Science, Scopus и РИНЦ. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: VII Съезд биохимиков России X Российский симпозиум "Белки и пептиды" (Сочи - Дагомыс, 2021); "Proceedings of Ribosomes and Translation meeting" (St. Petersburg, Russia, 2018); EMBL Conference "Protein Synthesis and Translational Control" (online, 2021).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Функционирование шбЛ-метилтрнсферазного комплекса

На данный момент идентифицировано более ста видов химических модификаций РНК [19]. Несмотря на то, что шбЛ модификация была впервые обнаружена еще в 1970-х годах [20], о ее распространенности и роли в регуляции экспрессии генов стало известно относительно недавно. В 2012 году с помощью метода высокопроизводительного секвенирования MeRIP-seq (секвенирование иммунопреципитированной метилированной РНК) было показано, что тысячи мРНК содержат шбЛ [21,22], что свидетельствует в пользу широкого распространения этой модификации в мРНК. Кроме того, в этих и ряде других исследований было показано, что остатками шбЛ обогащены 5' и 3'-нетранслируемые области мРНК (НТО) и участки, прилегающие к стартовому и стоп-кодонам [15,21-27] (Рис. 1).

5'НТО Кодирующая З'НТО

область

Рисунок 1. Схематическое распределение шбЛ-модификации в мРНК. Иллюстрация демонстрирует профиль, отображающий распределение пиков т6А (MeRIP-seq, шбЛ-ОКЬ) вдоль всей длины транскриптов мРНК. Материал взят из работы Yalun Xie et а1. 2022 [27] с изменениями.

В этих работах был идентифицирован консенсусный мотив ЯЕАСН (Я = А или G; Н = А, С или и), в котором, как правило, происходит метилирование аденозина (Рис. 1). Метилирование аденозина в мРНК происходит котранскрипционно в ядре с помощью метилтрансферазного комплекса, который включает белки, такие как МЕТТЬЗ и МЕТГЬ14. Помимо этого, в ядре также присутствуют белки, ответственные за деметилирование метилированных

нуклеотидов, такие как FTO и АЬКВН5 и белки, распознающие m6A-модификацию в тех или иных контекстах определяя дальнейшую судьбу модифицированной мРНК (Рис. 2).

Рисунок 2. Значение m6A модификации в биогенезе мРНК. Метилирование N6-метиладенозина (m6A) осуществляется в ядре во время транскрипции с помощью метилтрансферазного комплекса (METTL3/14/WTAP). Деметилазы FTO и ALKBH5, ответственные за снятие m6A, также в значительной степени локализованы в ядре. Находясь в ядре, m6A может связываться со специфическими белками (в основном YTHDC1 (DC1)), что может влиять на сплайсинг или другие ядерные процессы, такие как экспорт мРНК. При экспорте мРНК в цитоплазму m6A связывается со специфическими белками-ридерами, которые влияют на стабильность, трансляцию и/или локализацию мРНК.

1.1. мРНК m6A - метилтрансферазы

Впервые комплекс метилтрансферазы (MTC — Methyltransferase Complex) был выделен из ядерных экстрактов клеток HeLa в 1990-х годах [28]. В 1997 году была охарактеризована первая каталитическая субъединица METTL3 [4]. METTL3 содержит домен, который способен связывать с S-аденозилметионин (SAM), и мотив DPPW (Asn-Pro-Pro-Trp), который необходим для передачи метильной группы от SAM к целевому аденозину в положении N6 [11]. Позднее был

обнаружен белок METTL14 - второй существенный компонент комплекса MTC, аминокислотная последовательность которого идентична последовательности METTL3. Анализ кристаллических структур показал, что только METTL3 может связывать SAM и катализировать перенос метильной группы, а METTL14 выступает в качестве структурного белка MTC комплекса, ответственного за связывание с РНК [29-31]. Было показано, что гетеродимер METTL3/METTL14 проявляет более высокую метилтрансферазную активность, чем мономер METTL3 [32]. При этом, согласно некоторым опубликованным данным, нокдаун METTL14 приводит к более выраженному снижению m6A-модификации в мРНК по

сравнению с нокдауном METTL3 [32].

HAKAI

WTAP

&Н1Э \

• i

• METTL14 METTL3

RBM15/15B '

m7GpppG i/%/t\L/t\ RRACH ¡/*\/ ÜUUU '%/tV/t\I/t\ 5'UTR 3'UTR

Рисунок 3. Основные компоненты комплекса MTC. Гетеродимер METTL3/14 является центральным компонентом комплекса MTC мРНК. Где METTL3 выполняет каталитическую функцию переноса метильной группы с SAM в N6 положение аденозина. Метилирование мРНК происходит в мотиве RRACH (R = A или G; H = A, C или U). Так же MTC комплекс включает в себя ряд адаптерных белков, таких как WTAP, VIRMA, RBM15/15B, ZC3H13 и HAKAI.

METTL3 и METTL14 являются основными субъединицами комплекса m6A-метилтрансферазы и играют ключевую роль в метилировании аденозина, однако в состав комплекса выходят и другие белки (Рис. 3). Примером такого белка является WTAP (Wilms' tumor 1-associating protein), который был идентифицирован как третья субъединица комплекса MTC [32]. Несмотря на отсутствие каталитической активности в отношении РНК, нокдаун WTAP приводит к значительному уменьшению уровня метилирования m6A в мРНК [32,33]. Дальнейшие исследования показали, что одним из возможных механизмов регуляции метилирования с помощью WTAP, является облегчение транслокации комплекса

METTL3-METTL14 в ядерные компартменты, в которых происходит регуляция сплайсинга [33].

До того, как WTAP был идентифицирован как субъединица m6A-метилтрансферазного комплекса, было показано, что WTAP может образовывать комплекс с белками VIRMA, HAKAI, RBM15, ZC3H13 [32-38] (Рис. 3). Оказалось, что эти и другие белки могут выполнять специфические функции в составе MTC. Например, белок из семейства белков с доменами цинковых пальцев - ZC3H13, важен для локализации MTC в ядре [36], что было доказано перемещением MTC в ядро после нокаута ZC3H13. Другой белок, VIRMA, опосредует предпочтительное метилирование m6A мРНК в 3'НТО и вблизи стоп-кодона [35], в то время как HAKAI влияет на модификацию N6-A в 5'НТО мРНК и вокруг старт-кодона [37]. В одной из недавних работ было показано, что нокдаун VIRMA вызывает резкое падение количества m6A в 3'НТО мРНК и удлинение транскриптов за счет изменения сайтов альтернативного полиаденилирования. Авторы предположили, что VIRMA связывается с факторами специфичности расщепления и полиаденилирования CPSF5/CPSF6, однако прямых доказательств приведено не было [35]. Белки RBM15 и RBM15B связывают U-богатые мотивы мРНК [38] и, таким образом, могут способствовать привлечению MTC к специфическим сайтам мРНК. Почему модификация m6A зависит от работы такого большого комплекса, и какова в точности роль каждого из компонентов еще предстоит выяснить.

Следует учесть, что семейство метилтрансфераз (METTL) включает в себя большую группу ферментов, специализирующихся на переносе метильных групп от S-аденозилметионина (SAM) на различные субстраты, такие как белки, РНК и ДНК. На сегодняшний день мы знаем о существовании более 200 потенциальных метилтрансфераз у человека, хотя функции многих из них все еще остаются неизученными [39].

Кроме комплекса m6A метилтрансфераз мРНК METTL3 и METTL14 существует несколько других метилтрансфераз способных метилировать аденозин по шестому положению в других типах РНК. К примеру, белок ZCCHC4 демонстрирует специфичное метилирование аденозина в AAC мотиве 28S

рибосомной РНК человека [40]. Интересно отметить, что при нокдауне ZCCHC4 наблюдается снижение общего уровня трансляции и ингибирование клеточной пролиферации клеточной линии HAP1 [41]. Другой пример — это метилтрансфераза METTL5 которая специфично метилирует 18S рРНК, в составе гетеродимерного комплекса с гомологом тРНК метилтрансферазы 112 (TRMT112) [42].

Другая метилтрансфераза, METTL16, может модифицировать аденозин по 6 положению в малой ядерной РНК U6 и других высокоструктурированных некодирующих РНК и пре-мРНК [43-45]. METTL16 может действовать как энхансер сплайсинга пре-мРНК MAT2A (кодирует SAM-синтетазу) в условиях низкой концентрации SAM [43]. Недавнее исследование выявило, что нокаут METTL16 препятствует раннему эмбриональному развитию мыши, однако механизм данного явления не известен [10].

Так же недавно была открыта новая кэп-метилтрансфераза. CAPAM (кэп-специфическая аденозин- N- 6-метилтрансфераза), которая катализирует N- 6-метилирование первого транскрибируемого нуклеотида аденозина с образованием кэп-структуры m7G(5')ppp(5')m6Am [46]. m6Am в составе кэп-структуры является довольно распространенным вариантом и, следовательно, может быть биологически важным. В клетках HEK293T 92% мРНК, начинающихся с аденозина, имеют m6Am в составе кэп-структуры, но этот показатель может колебаться в зависимости от типа клеточной линии [47].

1.2. Специфичность т6А-модификации

Поскольку RRACH мотив встречается примерно каждые 60 нуклеотидов в мРНК, транскрипт имеет много потенциальных сайтов метилирования [21]. Однако очень немногие из этих последовательностей в последствии метилированы. Более того, несмотря на широкую распространенность последовательностей RRACH, только специфические транскрипты имеют m6A-модификацию. Основа этого сайт-специфического или транскрипт-специфического метилирования изучена довольно слабо. Одним из механизмов отбора транскриптов для метилирования, может быть, рекрутирование комплекса метилтрансферазы на специфические

промоторы через связывание с транскрипционными факторами. Например, в эмбриональных стволовых клетках человека факторы транскрипции SMAD2/3 связывают метилтрансферазный комплекс METTL3/METTL14/WTAP, тем самым способствуя метилированию SMAD2/3-индуцированных транскриптов в ответ на активацию TGFß/SMAD-сигнального пути (Рис. 4А). Было показано, что примерно 150 генов регулируются с помощью этого механизма [48]. В клетках острого миелоидного лейкоза (AML) CAATT-box связывающий белок CEBPZ взаимодействует примерно с промоторами 70 различных генов и привлекает к ним MTC, что приводит к увеличению метилирования соответствующих транскриптов

[49] (Рис. 4A) А

Рисунок 4. Механизмы сайт специфичного шбЛ метилирования транскриптов мРНК.

Преимущественно ^-метилирование аденозина в мРНК происходит ко-транскрипционно, а специфичность метилирования определяется взаимодействием комплекса m6A-метилтрансферазы (МТС) с (Л) модифицированными участками гистонов (триметилированным лизином 36 гистона Н3 (Н3К36те3)), (Б) РНК-связывающими белками (ЯВР) или (В) транскрипционными факторами, которые рекрутируют МТС комплекс к сайтам метилирования аденозина RRACH. Г Взаимодействие MTC c РНК-полимеразой II (Ро1 II) так же способствует метилированию мРНК, а скорость работы РНК-полимеразы II определяет степень метилирования мРНК транскриптов.

Специфичность К6А-метилирования аденозина и положение m6A в мРНК могут зависеть от модификаций гистонов. Было показано, что m6A преимущественно обнаруживается в длинных экзонах [21,50]. Экзоны обладают

уникальными свойствами, такими как значительно более высокая плотность нуклеосом, чем у интронов [51,52], и высокий уровень некоторых модификаций гистонов. Так, показано, что триметилирование лизина 36 гистона Н3 (H3K36me3) может глобально регулировать наличие m6A в зрелом транскрипте [53]. Н3К36те3 связывается белком МЕТТЫ4, что способствует посадке MTC на синтезируемую РНК [54]. Примерно 70% детектирующихся m6A-модификаций расположены вблизи сайтов H3K36me3. Нокдаун гистон-метилтрансферазы STED2 приводит к снижению триметилирования Н3 и как следствие к уменьшению уровня m6A в РНК [54] (Рис. 4Б).

Поскольку метилирование мРНК происходит ко-транскрипционно [55], события во время транскрипции, вероятно, определяют, какие сайты RRACH метилируются. Так было показано, что METTL3 связывается с РНК-полимеразой II [50], что указывает на то, что метилтрансферазный комплекс может специфично метилировать мРНК транскрибируемую РНК-полимеразой II. Замедление РНК-полимеразы II с помощью химических ингибиторов или использование мутантных форм РНК-полимеразы II со сниженной скоростью синтеза РНК, приводило к привлечению METTL3 и, как следствие, к увеличению количества m6A в мРНК [50] (Рис. 4В).

Кроме того, РНК-связывающие белки, взаимодействующие с комплексом MTC, могут нацеливать его на определенные мРНК и облегчать тем самым метилирование соседних сайтов. Одними из таких белков являются уже упоминавшиеся белки RBM15/15B, сайты связывания которых находятся рядом с сайтами m6A в мРНК [38] (Рис. 4Г).

Хотя метилирование аденозина в мРНК происходит преимущественно в ядре клетки, но при некоторых обстоятельствах метилирование может происходить в цитоплазме. Так, для Флавивирусов, геном которых представлен "+" цепью РНК и репликация которых происходит в цитоплазме, было показано, что метилирование аденозина по 6 положению ингибирует образование вирусных частиц [56,57]. Присутствие в этих транскриптах m6A предполагает, что некоторая доля METTL3

локализуется в цитоплазме [56], [58,59]. Похож ли комплекс MTC, который собирается в цитоплазме, на канонический ядерный комплекс неизвестно.

1.3. Деметилазы

Открытие ферментов, способных к деметилированию m6A, стало важной вехой в изучении данной модификации, поскольку до этого m6A модификация считалась статичной и неспособной к тонкой регуляции. На данный момент идентифицировано две m6A-деметилазы мРНК: FTO и ALKBH5. Эти белки принадлежат к семейству AlkB и для их ферментативной активности необходимо наличие ионов двухвалентного железа, а-кетоглутарата и кислорода [60,61]. Способность этих белков к деметилированию была продемонстрирована как in vitro так и in vivo [5,62]. Было обнаружено, что FTO предпочтительно связывается с интронами в пре-мРНК, что может оказывать влияние на регуляцию альтернативного сплайсинга и процессинг 3'-НТО [63] (Рис. 2). Помимо m6A, FTO также может деметилировать нуклеотиды m1A в специфических тРНК и кэп-m6Am в мРНК [64]. Следует отметить, что FTO обладает существенно более высокой каталитической активностью в отношении деметилирования N6, 2-O-диметиладенозина (m6Am ), чем m6A [65].

Для второй идентифицированной деметилазы ALKBH5 m6A является единственным известным на сегодняшний день субстратом [5]. В отличие от FTO, ALKBH5 не проявляет активности в отношении m6Am и является ядерным белком с локализацией в ядерных компартментах ответственных за сплайсинг [66]. Поэтому вероятнее всего ALKBH5 деметилирует m6A в ядерной РНК или в мРНК во время ее биогенеза в ядре. ALKBH5 также может активироваться при стрессе. Согласно данным иммунопреципитации хроматина (ChIP) фактор транскрипции HIF-la связывается с промотором ALKBH5 и усиливает его транскрипцию в условиях гипоксии [66]. Также сообщалось об индукции ALKBH5 и FTO в результате вирусной инфекции [67]. Таким образом, можно говорить о потенциальной роли деметилаз в модификации эпитранскриптома в ответ на различные стрессовые условия.

1.4. Белки, ответственные за распознавание шбЛ (шбЛ-ридеры)

Многие функции m6A реализуются через белки, которые распознают эту метку. В основном, это высококонсервативные белки семейства YTH. У человека существует пять белков, содержащих домен YTH, а именно: YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3. YTHDF1-3 являются цитоплазматическими ридерами m6A (Рис. 2). Первоначально было продемонстрировано, что YTHDF1 связывается с сайтом m6A вблизи стоп-кодона и способствует инициации трансляции повышая эффективность трансляции [68]. Напротив, YTHDF2 ускоряет деградацию m6A-модифицированной РНК, напрямую рекрутируя комплекс CCR4-NOT для деаденилирования транскрипта [69]. YTHDF3 можно рассматривать как белок, осуществляющий тонкую настройку доступности РНК факторам YTHDF1 и YTHDF2, поскольку YTHDF3 может взаимодействовать как с YTHDF1, способствуя трансляции метилированной РНК, так и с YTHDF2, ускоряя деградацию мРНК [70,71]. Функция YTHDC1 заключается в регуляции альтернативного сплайсинга путем рекрутирования фактора сплайсинга РНК SRSF3 и предотвращения взаимодействия другого фактора SRSF10 с мРНК [7]. YTHDC1 также взаимодействует с SRSF3 и NXF1, что способствует ядерному экспорту m6A-метилированных мРНК [72]. Предполагается, что YTHDC2 является РНК-хеликазой [73], которая может повышать эффективность трансляции и в то же время способствовать направленной деградации РНК за счет привлечения экзонуклеазы XRN1 [74,75].

Другой класс белков, распознающих m6A, принадлежит семейству гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP). Белки hnRNPC и HNRNPG не способны связываться с метилированным аденозином. Однако m6A может регулировать взаимодействие hnRNP с мРНК путем перестройки вторичной структуры мРНК. Механизм этой регуляции заключается в способности m6A дестабилизировать вторичные структуры мРНК, в которых находится, тем самым влияя на связывание белков [9,76].

1.5. Функции т6А в метаболизме мРНК

Вскоре после открытия m6A в клеточных мРНК [20] исследователи предположили, что m6A может играть важную роль в регуляции трансляции мРНК. Однако из-за отсутствия методов детекции этой модификации в отдельных мРНК было трудно определить глобальное влияние m6A на экспрессию генов. Появление методов секвенирования следующего поколения позволило обнаружить m6A в масштабах всего транскриптома [21,22]. В сочетании с идентификацией белков, регулирующих метилирование N6-A [77], это способствовало быстрому росту числа исследований, посвященных функциям m6A. Основная идея, возникшая в результате этих исследований, заключается в том, что m6A может регулировать несколько этапов жизненного цикла мРНК, включая сплайсинг, экспорт, стабильность и трансляцию.

1.6. Альтернативный сплайсинг мРНК

Роль метилирования т6А в альтернативном сплайсинге мРНК заключается в контроле взаимодействия активаторов и репрессоров альтернативного сплайсинга, таких как гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNP) и белки, богатые серином и аргинином (SR), с соответствующими цис-регуляторными элементами (сайленсерами и энхансерами) в пре-мРНК.

Изначально на участие m6A-модификации в регуляции сплайсинга указывала повышенная концентрация сайтов метилирования аденозина в интронах пре-мРНК, по сравнению со зрелой мРНК [78,79]. Кроме того, было показано, что m6A чаще находится в интронах и экзонах, которые подвергаются альтернативному сплайсингу [21]. Накопленные на данный момент экспериментальные данные подтверждают, что m6A действительно регулирует события сплайсинга, и его присутствие либо в интронных, либо в экзонных областях играет важную роль в альтернативном сплайсинге.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Смолин Егор Алексеевич, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Merrick W.C., Pavitt G.D. Protein synthesis initiation in eukaryotic cells // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018.

2. Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. England, 2010. Vol. 11, № 2. P. 113-127.

3. Hinnebusch A.G., Ivanov I.P., Sonenberg N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. // Science. United States, 2016. Vol. 352, № 6292. P. 1413-1416.

4. Bokar J.A. et al. Purification and cDNA cloning of the AdoMet-binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. // RNA. United States, 1997. Vol. 3, № 11. P. 1233-1247.

5. Zheng G. et al. ALKBH5 Is a Mammalian RNA Demethylase that Impacts RNA Metabolism and Mouse Fertility // Mol. Cell. 2013. Vol. 49, № 1. P. 18-29.

6. Jia G. et al. N6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO // Nat. Chem. Biol. 2011.

7. Xiao W. et al. Nuclear m6A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2016. Vol. 61, № 4. P. 507-519.

8. Tang C. et al. ALKBH5-dependent m6A demethylation controls splicing and stability of long 3'-UTR mRNAs in male germ cells // Proc. Natl. Acad. Sci. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018. Vol. 115, № 2. P. E325-E333.

9. Zhou K.I. et al. Regulation of Co-transcriptional Pre-mRNA Splicing by m(6)A through the Low-Complexity Protein hnRNPG. // Mol. Cell. United States, 2019. Vol. 76, № 1. P. 70-81.e9.

10. Mendel M. et al. Methylation of Structured RNA by the m6A Writer METTL16 Is Essential for Mouse Embryonic Development // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2018. Vol. 71, № 6. P. 986-1000.e11.

11. Oerum S. et al. A comprehensive review of m6A/m6Am RNA methyltransferase structures // Nucleic Acids Res. 2021. Vol. 49, № 13. P. 7239-7255.

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

Roundtree I.A. et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine

methylated mRNAs. // Elife. England, 2017. Vol. 6.

Lesbirel S. et al. The m6A-methylase complex recruits TREX and regulates

mRNA export // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 13827.

Wang X. et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA

stability // Nature. 2014. Vol. 505, № 7481. P. 117-120.

Coots R.A. et al. m6A Facilitates eIF4F-Independent mRNA Translation // Mol.

Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 68, № 3. P. 504-514.e7.

Meyer K.D. et al. 5' UTR m6A Promotes Cap-Independent Translation // Cell.

2015. Vol. 163, № 4. P. 999-1010.

Topisirovic I., Sonenberg N. mRNA translation and energy metabolism in cancer: The role of the MAPK and mtorc1 Pathways // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2011.

Leprivier G. et al. The eEF2 kinase confers resistance to nutrient deprivation by blocking translation elongation. // Cell. United States, 2013. Vol. 153, № 5. P. 1064-1079.

Boccaletto P. et al. MODOMICS: A database of RNA modification pathways. 2017 update // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46, № D1. P. D303-D307. Desrosiers R., Friderici K., Rottman F. Identification of methylated nucleosides in messenger RNA from Novikoff hepatoma cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 71, № 10. P. 3971-3975.

Dominissini D. et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq // Nature. 2012.

Meyer K.D. et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons // Cell. 2012. Mao Y. et al. m6A in mRNA coding regions promotes translation via the RNA helicase-containing YTHDC2 // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 5332. Batista P.J. et al. M6A RNA modification controls cell fate transition in mammalian embryonic stem cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2014. Vol. 15, № 6. P. 707-719.

25. Chen T. et al. M6A RNA methylation is regulated by microRNAs and promotes reprogramming to pluripotency // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2015. Vol. 16, № 3. P. 289-301.

26. Sibbritt T., Patel H.R., Preiss T. Mapping and significance of the mRNA methylome. // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. United States, 2013. Vol. 4, № 4. P. 397-422.

27. Xie Y. et al. Transcriptome-wide profiling of N (6)-methyladenosine via a selective chemical labeling method. // Chem. Sci. England, 2022. Vol. 13, № 41. P. 12149-12157.

28. Bokar J.A. et al. Characterization and partial purification of mRNA N6-adenosine methyltransferase from HeLa cell nuclei. Internal mRNA methylation requires a multisubunit complex. // J. Biol. Chem. United States, 1994. Vol. 269, № 26. P. 17697-17704.

29. Wang X. et al. Structural basis of N6-adenosine methylation by the METTL3-METTL14 complex // Nature. 2016. Vol. 534, № 7608. P. 575-578.

30. Schöller E. et al. Interactions, localization, and phosphorylation of the m6A generating METTL3-METTL14-WTAP complex // RNA. 2018. Vol. 24. P. 499512.

31. Sledz P., Jinek M. Structural insights into the molecular mechanism of the m6A writer complex // Elife. 2016. Vol. 5, № September.

32. Liu J. et al. A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation. // Nat. Chem. Biol. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 10, № 2. P. 93-95.

33. Ping X.-L. et al. Mammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6-methyladenosine methyltransferase // Cell Res. 2014. Vol. 24. P. 177-189.

34. Horiuchi K. et al. Identification of Wilms' tumor 1-associating protein complex and its role in alternative splicing and the cell cycle // J. Biol. Chem. A© 2013 ASBMB. Currently published by Elsevier Inc; originally published by American Society for Biochemistry and Molecular Biology., 2013. Vol. 288, № 46. P. 33292-33302.

35. Yue Y. et al. VIRMA mediates preferential m6A mRNA methylation in 3'UTR and near stop codon and associates with alternative polyadenylation // Cell Discov. 2018. Vol. 4. P. 10.

36. Wen J. et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m(6)A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal. // Mol. Cell. United States, 2018. Vol. 69, № 6. P. 1028-1038.e6.

37. Wang Y. et al. Role of Hakai in m6A modification pathway in Drosophila // Nat. Commun. 2021. Vol. 12.

38. Patil D.P. et al. M6A RNA methylation promotes XIST-mediated transcriptional repression // Nature. 2016. Vol. 537, № 7620. P. 369-373.

39. Wong J.M., Eirin-Lopez J.M. Evolution of Methyltransferase-Like (METTL) Proteins in Metazoa: A Complex Gene Family Involved in Epitranscriptomic Regulation and Other Epigenetic Processes // Mol. Biol. Evol. 2021. Vol. 38, № 12. P. 5309-5327.

40. Ma H. et al. N 6-Methyladenosine methyltransferase ZCCHC4 mediates ribosomal RNA methylation // Nat. Chem. Biol. 2019. Vol. 15, № 1. P. 88-94.

41. Ren W. et al. Structure and regulation of ZCCHC4 in m6A-methylation of 28S rRNA // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1.

42. Van Tran N. et al. The human 18S rRNA m6A methyltransferase METTL5 is stabilized by TRMT112 // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № 15. P. 7719-7733.

43. Pendleton K.E. et al. The U6 snRNA m6A Methyltransferase METTL 16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention // Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 169, № 5. P. 824-835.e14.

44. Warda A.S. et al. Human METTL16 is a N6-methyladenosine (m6A) methyltransferase that targets pre-mRNAs and various non-coding RNAs // EMBO Rep. 2017. Vol. 18, № 11. P. 2004-2014.

45. Brown J.A. et al. Methyltransferase-like protein 16 binds the 3'-terminal triple helix of MALAT1 long noncoding RNA // PNAS. 2016. Vol. 6, № 49. P. 1401314018.

46. Sugita A. et al. The cap-specific m6A methyltransferase, PCIF1/CAPAM, is

dynamically recruited to the gene promoter in a transcription-dependent manner. // J. Biochem. England, 2021. Vol. 170, № 2. P. 203-213.

47. Cowling V.H. CAPAM: The mRNA Cap Adenosine N6-Methyltransferase // Trends Biochem. Sci. 2019. Vol. 44, № 3. P. 183-185.

48. Bertero A. et al. The SMAD2/3 interactome reveals that TGFß controls m6A mRNA methylation in pluripotency // Nature. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 555, № 7695. P. 256-259.

49. Barbieri I. et al. Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent translation control // Nature. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 552, № 7683. P. 126-131.

50. Slobodin B. et al. Transcription Impacts the Efficiency of mRNA Translation via Co-transcriptional N6-adenosine Methylation // Cell. Elsevier, 2017. Vol. 169, № 2. P. 326-337.e12.

51. Spies N. et al. Biased Chromatin Signatures around Polyadenylation Sites and Exons // Mol. Cell. Elsevier, 2009. Vol. 36, № 2. P. 245-254.

52. Tilgner H. et al. Nucleosome positioning as a determinant of exon recognition // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 16, № 9. P. 9961001.

53. Kolasinska-Zwierz P. et al. Differential chromatin marking of introns and expressed exons by H3K36me3 // Nat. Genet. 2009. Vol. 41, № 3. P. 376-381.

54. Huang H. et al. Histone H3 trimethylation at lysine 36 guides m6A RNA modification co-transcriptionally // Nature. 2019. Vol. 567, № 7748. P. 414-419.

55. Salditt-Georgieff M. et al. Methyl labeling of HeLa cell hnRNA: a comparison with mRNA // Cell. 1976. Vol. 7, № 2. P. 227-237.

56. Gokhale N.S. et al. N6-Methyladenosine in Flaviviridae Viral RNA Genomes Regulates Infection // Cell Host Microbe. Elsevier Inc., 2016. Vol. 20, № 5. P. 654-665.

57. Lichinchi G. et al. Dynamics of the human and viral m6A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells HHS Public Access Author manuscript // Nat Microbiol. 2018. P. 1-21.

58. Alarcon C.R. et al. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing // Nature. 2015. Vol. 519, № 7544. P. 482-485.

59. Choe J. et al. mRNA circularization by METTL3-eIF3h enhances translation and promotes oncogenesis // Nature. Springer US, 2018. Vol. 561, № 7724. P. 556560.

60. Gerken T. et al. The obesity-associated FTO gene encodes a 2-oxoglutarate-dependent nucleic acid demethylase // Science (80-. ). 2007. Vol. 318, № 5855. P. 1469-1472.

61. Falnes P., Johansen R.F., Seeberg E. AlkB-mediated oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia coli // Nature. 2002. Vol. 419, № 6903. P. 178-182.

62. Jia G. et al. N6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO // Nature Chemical Biology. 2012. Vol. 8, № 12. P. 1008.

63. Bartosovic M. et al. N6-methyladenosine demethylase FTO targets pre-mRNAs and regulates alternative splicing and 3-end processing // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 19. P. 11356-11370.

64. Wei J. et al. Differential m6A, m6A m , and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2018. Vol. 71, № 6. P. 973-985.e5.

65. Mauer J. et al. Reversible methylation of m6 Am in the 5' cap controls mRNA stability // Nature. 2017. Vol. 541, № 7637. P. 371-375.

66. Thalhammer A. et al. Human AlkB Homologue 5 Is a Nuclear 2-Oxoglutarate Dependent Oxygenase and a Direct Target of Hypoxia-Inducible Factor 1a (HIF-1a) // PLoS One. 2011. Vol. 6, № 1. P. 16210.

67. Rubio R.M. et al. RNA m6A modification enzymes shape innate responses to DNA by regulating interferon ß // Genes & Dev. Department of Microbiology, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, USA., 2018. Vol. 32, № 23-24. P. 1472-1484.

68. Wang X. et al. N6-methyladenosine modulates messenger RNA translation efficiency // Cell. Elsevier Inc., 2015. Vol. 161, № 6. P. 1388-1399.

69. Du H. et al. YTHDF2 destabilizes m6A-containing RNA through direct recruitment of the CCR4-NOT deadenylase complex // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 7.

70. Li A. et al. Cytoplasmic m 6 A reader YTHDF3 promotes mRNA translation // Cell Research. 2017. Vol. 27, № 3. P. 444-447.

71. Shi H. et al. YTHDF3 facilitates translation and decay of N6-methyladenosine-modified RNA // Cell Res. 2017. Vol. 27. P. 315-328.

72. Roundtree I.A. et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N6-methyladenosine methylated mRNAs // Elife. 2017. Vol. 6.

73. Kretschmer J. et al. The m6A reader protein YTHDC2 interacts with the small ribosomal subunit and the 5 '-3 ' exoribonuclease XRN1 // Cold Spring Harb. Lab. Press. 2018. Vol. 24. P. 1339-1350.

74. Hsu P.J. et al. Ythdc2 is an N6-methyladenosine binding protein that regulates mammalian spermatogenesis // Nat. Publ. Gr. 2017. Vol. 27. P. 1115-1127.

75. Wojtas M.N. et al. Regulation of m6A Transcripts by the 3'^5' RNA Helicase YTHDC2 Is Essential for a Successful Meiotic Program in the Mammalian Germline // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 68, № 2. P. 374-387.e12.

76. Liu N. et al. N6 -methyladenosine-dependent RNA structural switches regulate RNA-protein interactions // Nature. 2015.

77. Patil D.P., Pickering B.F., Jaffrey S.R. Reading m6A in the Transcriptome: m6A-Binding Proteins // Trends Cell Biol. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 28, № 2. P. 113127.

78. Louloupi A. et al. Transient N-6-Methyladenosine Transcriptome Sequencing Reveals a Regulatory Role of m6A in Splicing Efficiency // Cell Rep. 2018. Vol. 23, № 12. P. 3429-3437.

79. Luo Z. et al. Exon-intron boundary inhibits m6A deposition, enabling m6A distribution hallmark, longer mRNA half-life and flexible protein coding // Nat. Commun. 2023. Vol. 14, № 1. P. 4172.

80. Geula S. et al. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation // Science (80-. ). American Association for

the Advancement of Science, 2015. Vol. 347, № 6225. P. 1002-1006.

81. Xu K. et al. Mettl3-mediated m6A regulates spermatogonial differentiation and meiosis initiation // Cell Res. 2017. Vol. 27, № 9. P. 1100-1114.

82. Zhao X. et al. FTO-dependent demethylation of N6-methyladenosine regulates mRNA splicing and is required for adipogenesis // Cell Res. 2014. Vol. 24, № 12. P. 1403-1419.

83. Xie Y., Ren Y. Mechanisms of nuclear mRNA export: A structural perspective. // Traffic. England, 2019. Vol. 20, № 11. P. 829-840.

84. Edens B.M. et al. FMRP Modulates Neural Differentiation through m(6)A-Dependent mRNA Nuclear Export. // Cell Rep. United States, 2019. Vol. 28, № 4. P. 845-854.e5.

85. Cullen B.R. Nuclear RNA export // J. Cell Sci. 2003. Vol. 116, № 4. P. 587-597.

86. Schwartz S. et al. Perturbation of m6A writers reveals two distinct classes of mRNA methylation at internal and 5' sites // Cell Rep. 2014.

87. Zhu T. et al. Crystal structure of the YTH domain of YTHDF2 reveals mechanism for recognition of N6-methyladenosine // Cell Research. 2014. Vol. 24, № 12. P. 1493-1496.

88. Park O.H. et al. Endoribonucleolytic Cleavage of m(6)A-Containing RNAs by RNase P/MRP Complex. // Mol. Cell. United States, 2019. Vol. 74, № 3. P. 494-507.e8.

89. Boo S.H. et al. UPF1 promotes rapid degradation of m(6)A-containing RNAs. // Cell Rep. United States, 2022. Vol. 39, № 8. P. 110861.

90. Huang H. et al. Recognition of RNA N(6)-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation. // Nat. Cell Biol. England, 2018. Vol. 20, № 3. P. 285-295.

91. Edupuganti R.R. et al. N6-methyladenosine (m6A) recruits and repels proteins to regulate mRNA homeostasis // Nat. Struct. Mol. Biol. 2017. Vol. 24, № 10. P. 870-878.

92. Zhou J. et al. Dynamic m6A mRNA methylation directs translational control of heat shock response HHS Public Access // Nature. 2015. Vol. 526, № 7574. P.

591-594.

93. Liu B., Qian S.-B. Translational reprogramming in cellular stress response. // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. United States, 2014. Vol. 5, № 3. P. 301-315.

94. Dever T.E., Dinman J.D., Green R. Translation Elongation and Recoding in Eukaryotes. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. United States, 2018. Vol. 10, № 8.

95. Hoernes T.P., Hüttenhofer A., Erlacher M.D. mRNA modifications: Dynamic regulators of gene expression? // RNA Biol. United States, 2016. Vol. 13, № 9. P. 760-765.

96. C Roost et.al. Structure and Thermodynamics of N6-Methyladenosine in RNA: A Spring-Loaded Base Modification // Ugeskr. Laeger. 2000. Vol. 162, № 8. P. 1060-1067.

97. Choi J. et al. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics // Nat. Struct. Mol. Biol. 2016. Vol. 23, № 2. P. 110-115.

98. Holcik M., Sonenberg N. Translational control in stress and apoptosis // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005.

99. Xiang Y. et al. RNA m6A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response // Nature. 2017. Vol. 543, № 7646. P. 573-576.

100. Zhou J. et al. N6-Methyladenosine Guides mRNA Alternative Translation during Integrated Stress Response // Mol. Cell. 2018. Vol. 69, № 4. P. 636-647.e7.

101. Li F. et al. Structure of the YTH domain of human YTHDF2 in complex with an m6A mononucleotide reveals an aromatic cage for m6A recognition // Cell Research. 2014. Vol. 24, № 12. P. 1490-1492.

102. Linder B. et al. Single-nucleotide resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome // Nat Methods. 2015. Vol. 12, № 8. P. 767-772.

103. Mauer J. et al. The RNA demethylase FTO targets m6Am in snRNA to establish distinct methyl isoforms that influence splicing // bioRxiv. 2018. P. 327924.

104. Wei C.M., Gershowitz A., Moss B. N6, O2'-dimethyladenosine a novel methylated ribonucleoside next to the 5' terminal of animal cell and virus mRNAs

// Nature. 1975. Vol. 257, № 5523. P. 251-253.

105. Ma X.M., Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. England, 2009. Vol. 10, № 5. P. 307-318.

106. Pakos-Zebrucka K. et al. The integrated stress response // EMBO Rep. 2016. Vol. 17, № 10. P. 1374-1395.

107. Vattem K.M., Wek R.C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 31. P. 11269-11274.

108. Hinnebusch A.G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation // Annu. Rev. Biochem. 2014. Vol. 83, № January. P. 779-812.

109. Kahvejian A., Roy G., Sonenberg N. The mRNA closed-loop model: The function of PABP and PABP-interacting proteins in mRNA translation // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. Vol. 66. P. 293-300.

110. Ramanathan A., Robb G.B., Chan S.H. mRNA capping: Biological functions and applications // Nucleic Acids Research. 2016. Vol. 44, № 16. P. 7511-7526.

111. Wilkie G.S., Dickson K.S., Gray N.K. Regulation of mRNA translation by 5'- and 3'-UTR-binding factors // Trends Biochem. Sci. 2003. Vol. 28, № 4. P. 182-188.

112. Wakiyama M., Imataka H., Sonenberg N. Interaction of elF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus oocyte maturation // Curr. Biol. 2000. Vol. 10, № 18. P. 1147-1150.

113. Kahvejian A. et al. Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms // Genes Dev. 2005. Vol. 19. P. 104-113.

114. Lin S. et al. The m6A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2016. Vol. 62, № 3. P. 335-345.

115. Demirci H. et al. Modification of 16S ribosomal RNA by the KsgA methyltransferase restructures the 30S subunit to optimize ribosome function // RNA. 2010. Vol. 16, № 12. P. 2319-2324.

116. Liu N. et al. Probing N6-methyladenosine RNA modification status at single nucleotide resolution in mRNA and long noncoding RNA // RNA. 2013. Vol. 19,

№ 12. P. 1848-1856.

117. Sergiev P. V. et al. Structural and evolutionary insights into ribosomal RNA methylation // Nature Chemical Biology. 2018. Vol. 14, № 3. P. 226-235.

118. Ignatova V. V et al. The rRNA m6A methyltransferase METTL5 is involved in pluripotency and developmental programs // Genes Dev. 2020. Vol. 34, № 9-10. P. 715-729.

119. Xing M. et al. The 18S rRNA m6A methyltransferase METTL5 promotes mouse embryonic stem cell differentiation // EMBO Rep. 2020. Vol. 21, № 10. P. 1-15.

120. Rong B. et al. Ribosome 18S m6A Methyltransferase METTL5 Promotes Translation Initiation and Breast Cancer Cell Growth // Cell Rep. Elsevier, 2020. Vol. 33, № 12.

121. Ma H. et al. N6-Methyladenosine methyltransferase ZCCHC4 mediates ribosomal RNA methylation // Nat. Chem. Biol. 2019. Vol. 15, № 1. P. 88-94.

122. Pinto R. et al. The human methyltransferase ZCCHC4 catalyses N6-methyladenosine modification of 28S ribosomal RNA // Nucleic Acids Res. 2020. Vol. 48, № 2. P. 830-846.

123. Derynck R., Zhang Y.E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. // Nature. England, 2003. Vol. 425, № 6958. P. 577584.

124. Hata A., Chen Y.-G. TGF-ß Signaling from Receptors to Smads. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. United States, 2016. Vol. 8, № 9.

125. James D. et al. TGFbeta/activin/nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells. // Development. England, 2005. Vol. 132, № 6. P. 1273-1282.

126. Lin X. et al. RNA m(6)A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail. // Nat. Commun. England, 2019. Vol. 10, № 1. P. 2065.

127. Lavoie H., Gagnon J., Therrien M. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. England, 2020. Vol. 21, № 10. P. 607-632.

128. Sun H.-L. et al. Stabilization of ERK-Phosphorylated METTL3 by USP5 Increases m(6)A Methylation. // Mol. Cell. United States, 2020. Vol. 80, № 4. P. 633-647.e7.

129. Fang R. et al. EGFR/SRC/ERK-stabilized YTHDF2 promotes cholesterol dysregulation and invasive growth of glioblastoma // Nat. Commun. 2021. Vol. 12, № 1. P. 177.

130. Yu F. et al. Post-translational modification of RNA m6A demethylase ALKBH5 regulates ROS-induced DNA damage response // Nucleic Acids Res. 2021. Vol. 49, № 10. P. 5779-5797.

131. Tahmasebi S. et al. Translation deregulation in human disease // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018. Vol. 19, № 12. P. 791-807.

132. Porta C., Paglino C., Mosca A. Targeting PI3K/Akt/mTOR Signaling in Cancer // Frontiers in Oncology . 2014. Vol. 4.

133. Cho S. et al. mTORC1 promotes cell growth via m(6)A-dependent mRNA degradation. // Mol. Cell. United States, 2021. Vol. 81, № 10. P. 2064-2075.e8.

134. Villa E. et al. mTORC1 stimulates cell growth through SAM synthesis and m(6)A mRNA-dependent control of protein synthesis. // Mol. Cell. United States, 2021. Vol. 81, № 10. P. 2076-2093.e9.

135. Han D. et al. Dynamic assembly of the mRNA m6A methyltransferase complex is regulated by METTL3 phase separation. // PLoS Biol. United States, 2022. Vol. 20, № 2. P. e3001535.

136. Terenin I.M. et al. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, № 3. P. 1807-1816.

137. Andreev D.E. et al. Cap-independent translation initiation of Apaf-1 mRNA based on a scanning mechanism is determined by some features of the secondary structure of its 5' untranslated region // Biochem. 2013. Vol. 78, № 2. P. 157-165.

138. Presolski S.I., Hong V.P., Finn M.G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. // Curr. Protoc. Chem. Biol. United States, 2011. Vol. 3, № 4. P. 153-162.

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

Gerashchenko M. V, Gladyshev V.N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 17. P. e134-e134.

McGlincy N.J., Ingolia N.T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. // Methods. United States, 2017. Vol. 126. P. 112-129. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads // EMBnet.journal. 2011. Vol. 17. P. 10-12.

Shen W. et al. SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation. // PLoS One. United States, 2016. Vol. 11, № 10. P. e0163962. Dobin A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. // Bioinformatics. England, 2013. Vol. 29, № 1. P. 15-21.

Frankish A. et al. GENCODE 2021. // Nucleic Acids Res. England, 2021. Vol. 49, № D1. P. D916-D923.

Zhang Y., Parmigiani G., Johnson W.E. ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data. // NAR genomics Bioinforma. England, 2020. Vol. 2, № 3. P. lqaa078.

Ritchie M.E. et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. // Nucleic Acids Res. England, 2015. Vol. 43, № 7. P. e47.

Canzler S., Hackermuller J. multiGSEA: a GSEA-based pathway enrichment analysis for multi-omics data. // BMC Bioinformatics. England, 2020. Vol. 21, № 1. P. 561.

Anisimova A.S. et al. Multifaceted deregulation of gene expression and protein synthesis with age // Proc. Natl. Acad. Sci. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020. Vol. 117, № 27. P. 15581-15590. Shi H. et al. m(6)A facilitates hippocampus-dependent learning and memory through YTHDF1. // Nature. England, 2018. Vol. 563, № 7730. P. 249-253. Hong S. et al. LARP1 functions as a molecular switch for mTORC1-mediated translation of an essential class of mRNAs. // Elife. England, 2017. Vol. 6. Agrawal S. et al. Functional annotation of human long noncoding RNAs using

chromatin conformation data. 2021.

152. Patro R. et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. // Nat. Methods. United States, 2017. Vol. 14, № 4. P. 417-419.

153. Capitanchik C. et al. How Do You Identify m(6) A Methylation in Transcriptomes at High Resolution? A Comparison of Recent Datasets. // Front. Genet. Switzerland, 2020. Vol. 11. P. 398.

154. Xiao Y.-L. et al. Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination // Nat. Biotechnol. 2023. Vol. 41, № 7. P. 993-1003.

155. Bodi Z., Fray R.G. Detection and quantification of N6-methyladenosine in messenger RNA by TLC // Methods in Molecular Biology. 2017. Vol. 1562. P. 79-87.

156. Mishima E. et al. Immuno-northern blotting: Detection of RNA modifications by using antibodies against modified nucleosides // PLoS One. 2015.

157. Dorrello N.V. et al. S6K1- and betaTRCP-mediated degradation of PDCD4 promotes protein translation and cell growth. // Science. United States, 2006. Vol. 314, № 5798. P. 467-471.

158. Thoreen C.C. et al. An ATP-competitive mammalian target of rapamycin inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1. // J. Biol. Chem. United States, 2009. Vol. 284, № 12. P. 8023-8032.

159. Thoreen C.C. et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. // Nature. England, 2012. Vol. 485, № 7396. P. 109-113.

160. Meyuhas O., Kahan T. The race to decipher the top secrets of TOP mRNAs // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. Elsevier B.V., 2015. Vol. 1849, № 7. P. 801-811.

161. Eliseeva I., Vasilieva M., Ovchinnikov L.P. Translation of human ß-actin mRNA is regulated by mTOR pathway // Genes (Basel). 2019. Vol. 10, № 2.

162. Lyabin D.N., Eliseeva I.A., Ovchinnikov L.P. YB-1 synthesis is regulated by mTOR signaling pathway. // PLoS One. United States, 2012. Vol. 7, № 12. P. e52527.

163. Gandin V. et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. // Genome Res. United States, 2016. Vol. 26, № 5. P. 636-648.

164. Patursky-Polischuk I. et al. Reassessment of the Role of TSC, mTORCl and MicroRNAs in Amino Acids-Meditated Translational Control of TOP mRNAs // PLoS One. 2014.

165. Barreau C. et al. Liposome-mediated RNA transfection should be used with caution. // RNA (New York, N.Y.). United States, 2006. Vol. 12, № 10. P. 17901793.

166. Fonseca B.D. et al. LARP1 is a major phosphorylation substrate of mTORC1 // bioRxiv. 2018. P. 491274.

167. Lahr R.M. et al. La-related protein 1 (LARP1) binds the mRNA cap, blocking eIF4F assembly on TOP mRNAs // Elife / ed. Wolberger C. eLife Sciences Publications, Ltd, 2017. Vol. 6. P. e24146.

168. Tcherkezian J. et al. Proteomic analysis of cap-dependent translation identifies LARP1 as a key regulator of 5'TOP mRNA translation. // Genes Dev. United States, 2014. Vol. 28, № 4. P. 357-371.

169. Philippe L. et al. Global analysis of LARP1 translation targets reveals tunable and dynamic features of 5' TOP motifs // Proc. Natl. Acad. Sci. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020. Vol. 117, № 10. P. 5319-5328.

170. Ingolia N.T. et al. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. // Science. United States, 2009. Vol. 324, № 5924. P. 218-223.

171. Ogami K. et al. mTOR- and LARP1-dependent regulation of TOP mRNA poly(A) tail and ribosome loading. // Cell Rep. United States, 2022. Vol. 41, № 4. P. 111548.

172. Chang J.-W. et al. mRNA 3'-UTR shortening is a molecular signature of mTORC1 activation // Nat. Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 7218.

173. Haimov O. et al. Efficient and Accurate Translation Initiation Directed by TISU Involves RPS3 and RPS10e Binding and Differential Eukaryotic Initiation Factor

1A Regulation. // Mol. Cell. Biol. United States, 2017. Vol. 37, № 15.

174. Sinvani H. et al. Translational tolerance of mitochondrial genes to metabolic energy stress involves TISU and eIF1-eIF4GI cooperation in start codon selection. // Cell Metab. United States, 2015. Vol. 21, № 3. P. 479-492.

175. Elfakess R. et al. Unique translation initiation of mRNAs-containing TISU element. // Nucleic Acids Res. England, 2011. Vol. 39, № 17. P. 7598-7609.

176. Missios P. et al. LIN28B alters ribosomal dynamics to promote metastasis in MYCN-driven malignancy. // J. Clin. Invest. United States, 2021. Vol. 131, № 22.

177. Wang Y. et al. DDX6 Orchestrates Mammalian Progenitor Function through the mRNA Degradation and Translation Pathways. // Mol. Cell. United States, 2015. Vol. 60, № 1. P. 118-130.

178. Muto A. et al. The mRNA-binding protein Serbp1 as an auxiliary protein associated with mammalian cytoplasmic ribosomes. // Cell Biochem. Funct. England, 2018. Vol. 36, № 6. P. 312-322.

179. Baudin A. et al. Structural Characterization of the RNA-Binding Protein SERBP1 Reveals Intrinsic Disorder and Atypical RNA Binding Modes. // Front. Mol. Biosci. Switzerland, 2021. Vol. 8. P. 744707.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Рисунок 26. Избранные функциональные группы (GO термины) по данным GSEA, которыми значимо обогащены исследуемые группы генов. Анализ проводился для нескольких групп генов, отличающихся чувствительностью к ингибированию mTOR между клетками HEK293T с нокдауном по метилазам METTL3/14 (KD) и клетками HEK293T дикого типа (WT). Группа "Down" включает гены, трансляция которых снижается в обеих клеточных линиях, в то время как группа "Neutral" включает гены, уровень трансляции которых остается неизменным в обеих клеточных линиях.