Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Стеклов, Михаил Юрьевич

• Стеклов, Михаил Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Стеклов, Михаил Юрьевич

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ПРЕДИСЛОВИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Методы изучения активного сайта рецептора.

1.1. Фотоаффшшая модификация.

1.2. Химическая модификация боковых групп аминокислот.

2. История открытия и особенности строения агонистов и антагонистов рецепторов цитокининов.

3. Идентификация индивидуальных рецепторов цитокининов.

4. Доменный состав рецепторов цитокининов.

5. Система передачи цитокининового сигнала и участвующие в ней белки.

6. Локализация рецепторов цитокининов.

7. Особенности лигандной специфичности рецепторов цитокининов.

8. История изучения и особенности третичной структуры рецептора АНК4.

9. Точечные мутации в рецепторах цитокининов и их влияние на передачу сигнала.

10. Молекулярные аспекты действия цитокининов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы и материалы.

1.2 Синтез азидопроизводных цитокининов.

1.3 Фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов.

1.4 Модификация отдельных амвинокислот в рецепторах цитокининов.

2. Модельные системы.

2. 1 Модельные системы на основе Е. coli.

2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса.

2.3 Модельная система на основе амаранта.

3. Сайт-специфичный мутагенез методом ПЦР.

4. Получение химически-компетентных клеток Е. coli.

5. Химическая трансформация Е. coli.

6. Выделение плазмид из Е. coli.

7. Рестрикция.

8. Получение химически компетентных клеток.

Agrobacterium tumefaciens GV3101.

9. Трансформация химически компетентных.

Agrobacterium tumefaciens GV3101.

10. Трансформация растений Nicotiana benthamiana.

11. Получение сферопластов.

12. Выделение мембран из Е. coli.

12.2 Выделение мембран растительных клеток.

13. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе бактерий и сферопластов.

14. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе растительных или бактериальных мембран.

15. Анализ активности ß-глюкуронидазы (GUS) в. проростках PARR5:GUS арабидопсиса.

16. Биотест на цитокининовую активность с проростками амаранта (амарантовый биотест).

17. Компьютерное моделирование сайта связывания цитокининов.

18. Математические и статистические методы анализа.

19. Биоинформатический анализ последовательностей белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

Синтез азидопроизводных цитокининов и фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов.

Модификация отдельных аминокислот.

Биоинформатический анализ сенсорного модуля рецепторов цитокининов.

Экспрессия полноразмерного рецептора АНК2 и исследование его лигандной специфичности.

Молекулярное моделирование сенсорных модулей рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы: структурное обоснование лигандной специфичности.

Молекулярные модели гомологов CHASE домена АНК4.

Обоснование лигандной специфичности шести цитокининовыхрецепторов из арабидопсиса и кукурузы, основанное на молекулярном докинге различных цитокининов.

Влияние N9-pit6o3wiupoeanuH цитокининов на их связывание с рецептором.

Докинг азидопроизводных цитокининов: 2-азидо-б-бензшюминопурина и 8-азидо-б-бензиламинопурина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов»

Рост, развитие и защитные реакции растений находятся под постоянным контролем фитогормонов, что обусловливает важность исследований молекулярных основ действия этих эндогенных регуляторов. Среди известных фитогормонов цитокинины занимают особое место, так как обладают широким спектром действия и регулируют такие важнейшие процессы, как деление, рост и жизнеспособность клеток. Цитокинины активно используются в современных биотехнологиях, с хорошими перспективами применения в агропроизводстве. Открытие рецепторов цитокининов в 2001 г. (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001) дало мощный импульс исследованиям молекулярных механизмов действия данных фитогормонов. Было установлено, что рецепторы цитокининов являются трансмембранными сенсорными гистидинкиназами и передают гормональный сигнал в клеточное ядро посредством так называемой двухкомпонентной системы. Благодаря рецепторам были раскрыты механизмы, с помощью которых данные фитогормоны участвуют в регуляции роста и развития растения, адаптации к различным неблагоприятным внешним воздействиям, взаимодействии с другими сигнальными процессами и т.д. Все последующие годы проводилось интенсивное изучение сигналинга цитокининов на молекулярном уровне, при этом большое внимаиие было уделено собственно рецепторам цитокининов. Во всех расшифрованных растительных геномах, а их известно уже более 30, были идентифицированы рецепторы цитокининов (Ломин и др., 2012). Однако пока наиболее детально исследованы рецепторы арабидопсиса, которых оказалось три: АНК 2, 3 и 4. Следует отметить, что все цитокининовые рецепторы филогенетически образуют 3 группы ортологов, и практически все рецепторы разных видов являются ортологами того или иного рецептора арабидопсиса. В участке рецептора, расположенном между трансмембранными спиралями, был идентицифирован так называемый CIIASE-домен, которому сразу приписали функцию связывания лиганда (Anantharaman & Aravind, 2001; Mougel & Zhulin, 2001), а весь участок получил название сенсорного модуля. Вскоре в составе CHASE-домена рецептора был обнаружен широко распространенный PASсубдомен, который, как было постулировано, и связывал цитокинины (Pas et al., 2004). Экспериментальное подтверждение того, что именно сенсорный модуль рецептора связывает цитокинины, появилось в 2007 году (Ileyl et al., 2007), после разработки простого и количественного метода тестирования связывания гормона рецептором (Romanov et al., 2005). Этот же метод позволил охарактеризовать лиганд-связывающую способность цитокининовых рецепторов арабидопсиса и выявить существенные различия между ними (Romanov et al., 2006). Была предложена гипотетическая схема цитокининовой сигнализации между корнем и побегом, объясняющая возможную физиологическую роль различий лигандной специфичности рецепторов (Romanov et al., 2006; Романов, 2009). Важное значение для сигналинга гормона имеет субклеточная локализация рецепторов. Разноплановые эксперименты показали, что основная масса рецепторов цитокипинов находится внутри клетки, в составе эндоплазматического ретикулума (Lomin et al., 2011; Wulfetange et al., 2011; Caesar et al., 2011). Эти данные позволяют предполагать особую роль внутриклеточных цитокининов в сигналинге этих фитогормонов. Большие усилия были предприняты для изучения пространственной структуры цитокининовых рецепторов. Наконец, в конце 2011 года была опубликована статья (Hothorn et al., 2011), был идеитифицирован CIIASE-домен у N-конца рецепторов цитокипинов, включающий PAS-субдомен, в составе которого находится сайт связывания цитокининов. Но остается еще много вопросов, ответы на которые пока не найдены. Например, все еще неясны особенности строения цитокинин-связывающих сайтов рецепторов, ответственные за различия в их лигандной специфичности, а также биологическая роль этих различий. Неизвестны закономерности структуры сенсорного модуля, конкретная функциональная роль и способы взаимодействия составляющих его доменов, характер конформационных изменений рецептора, которые происходят при связывании цитокининов и, наоборот, не происходят при связывании рецепторных антагонистов.

Между тем взаимодействие гормонов с рецептором является ключевым процессом сигналинга гормона и включает всю последующую цепь событий, приводящую к ответной реакции клетки на гормон. Поэтому поиск ответов на вышеуказанные вопросы является важной и актуальной научной задачей и может помочь прояснить на молекулярном уровне механизм действия цитокининов и особенности их взаимодействия с рецепторами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являются изучение особенностей строения сенсорных модулей рецепторов цитокининов и идентификация структурных детерминант, определяющих лигандную специфичность этих модулей на примере рецепторов арабидопсиса и кукурузы. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) охарактеризовать аминокислотный состав лиганд-связывающих сайтов рецепторов цитокининов методами фотоаффинной и химической модификации отдельных аминокислотных остатков;

2) с помощью биоинформатических подходов изучить особенности строения сенсорного модуля рецепторов цитокининов и выделить консервативные участки, потенциально важные для функционирования рецептора;

3) экспрессировать полноразмерный рецептор АНК2 и провести анализ его лиганд-связывающих свойств;

4) с помощью компьютерного моделирования сенсорных модулей цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы определить аминокислотные остатки, потенциально важные для лигандной специфичности рецепторов;

5) провести направленный мутагенез рецептора ZmHKl и экспериментально оценить роль конкретных аминокислотных остатков в детерминации лигандной специфичности изучаемых рецепторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Стеклов, Михаил Юрьевич

выводы

1) Разработан новый метод синтеза Б-азидо-Л^-бензиламинопурина, физиологически активного цитокинина. Выяснена вероятная причина отсутствия пришивки 2- и 8-азидопроизводных цитокининов к лиганд-связывающему сайту цитокининового рецептора.

2) Методом модификации отдельных аминокислот установлено, что остаток аспартата, в отличие от остатков аргинина, цистеина и лизина, играет важную роль в связывании цитокининов рецептором.

3) Впервые охарактеризована лигандная специфичность полноразмерного цитокининового рецептора АНК2 из арабидопсиса.

4) С помощью сравнения первичных структур сенсорных модулей более 100 рецепторов цитокининов разных видов растений обнаружены новые консервативные структурные мотивы. Наиболее консервативной частью сенсорного модуля рецептора оказалась стержневая а-спираль, примыкающая к >1-концу СНА8Е-домена.

5) Построены пространственные модели сенсорного модуля пяти рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы (АНК2, АНКЗ, гтНК1, гтНК2 и 7тНКЗа) на основе структуры рецептора АНК4 как шаблона. Пептидный остов домена рецептора, формирующий сайт связывания цитокинина, оказался сходен у всех шести изученных рецепторов.

6) С помощью анализа структур лиганд-связывающих сайтов цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы идентифицированы вариабельные аминокислоты, которые могут играть определяющую роль в лигандной специфичности изучаемых рецепторов.

7) С помощью направленного мутагенеза получены новые изоформы рецептора ZmHKl с одиночными или множественными заменами аминокислот. Среди них тройные (У160Н+Ы61У+А2328) или пятерные (У 160Н+Ь161У+1176 У+У2021+А232V; У160Н+Ь161У+1176У+У2021+А2321) мутанты обладали профилем лигандной специфичности, приближенным к профилю рецепторов АНК2/2тНКЗ.

8) На основе анализа свойств мутантных рецепторов установлено, что аминокислотные остатки, важные для сдвига профиля лигандной специфичности рецептора гтНК1 к профилю пары АНК2/2тНКЗ, находятся в сенсорном модуле на позициях 160, 161 и 232.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рецепторы являются ключевыми белками, определяющими чувствительность клетки к гормонам, поэтому установление структурно-функциональных характеристик рецепторов имеет первостепенное значение в исследовании гормонального сигналинга. В работе были использованы различные подходы для изучения особенностей строения сенсорных модулей рецепторов цитокининов.

Наибольший успех принесли методы биоинформатики, которые позволили выявить ряд новых черт строения этих модулей. На основе анализа последовательностей более 100 рецепторов цитокииинов разных видов растений предложена общая схема строения сенсорного модуля с прилегающими трансмембранными спиралями. Обнаружены новые консенсусные мотивы, которые могут иметь важное значение для функционирования рецепторов. В частности, установлена высокая консервативность стержневой а-спирали на N-конце сенсорного модуля, которая участвует как в процессе димеризации модулей, так и, видимо, в передаче сигнала от сенсорного к каталитическому модулю рецептора.

Другие выявленные консервативные мотивы на С-конце модуля, по всей видимости, также необходимы для внутрибелковой трансдукции цитокининового сигнала. Важной функциональной характеристикой рецепторов является их лигандная специфичность, выражающаяся в высоком сродстве к определенным природным лигандам, которые благодаря этому выполняют функцию гормонов.

Различные изоформы рецепторов цитокининов даже одного растения различаются по лигандной специфичности, что, очевидно, имеет определенный биологический смысл. Мы попытались идентифицировать структурные детерминанты лигандной специфичности, на примере цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы.

Предварительно был экспрессирован и охарактеризован полноразмерный рецептор

АНК2, что позволило завершить исследование лигандной специфичности полного набора рецепторов цитокининов арабидопсиса. На первом этапе исследования было проведено моделирование пространственной структуры пяти рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы, с использованием известной структуры рецептора AIIK4 как шаблона. В сочетании с биоинформатическими данными это дало возможность определить в лиганд-связывающих сайтах рецепторов 12

127 вариабельных а.о. - потенциальных детерминант лигандной специфичности. Среди этих 12 а.о. были отобраны 6 наиболее вероятных кандидатов, роль которых была исследована экспериментально. Для этого в рецепторе 7шНК1 проводили точечные замены вариабельных а.о. на а.о. других рецепторов, отличающихся по лиганд-связывающим свойствам. Всего с помощью направленного мутагенеза было получено 33 мутантных изоформ рецептора, из них 15 одиночных, 4 двойных, 6 тройных, 3 четверных, 4 пятерных и даже 1 семирной. У многих мутантных изоформ изменилось сродство к отдельным цитокининам, а у одного тройного и двух пятерных мутантов удалось впервые существенно изменить профиль лигандной специфичности, приблизив его к профилю рецепторов АНК2/7шНКЗ. Таким образом, была экспериментально подтверждена важная роль отобранных путем моделирования вариабельных а.о. (№№ 160, 161 и 232 белка 2шНК1) в придании рецептору необходимых свойств лигандной специфичности. Работа показала, что профиль лигандной специфичности является стабильной характеристикой рецепторов цитокининов, он сохраняется у ортологов из эволюционно далеких видов и устойчив к большинству одиночных замен вариабельных а.о. лиганд-связывающего сайта. А для перемены профиля лигандной специфичности рецептора цитокининов необходимы множественные замены определенных вариабельных а.о. в связывающем сайте одного рецептора на соответствующие а.о. другого.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Стеклов, Михаил Юрьевич, 2013 год

1. Зверева С.Д., Романов Г.А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. Физиология растений, 44, 479488.

2. Кривошеев Д.М., Колячкнна С.В., Михайлов С.Н., Ванюшин Б.Ф., Романовб

3. Г.А. (2012а) N -(бензилоксиметил)-аденозин новый антицитокинин, антагонист для рецептора CRE1/ATIK4 арабидопсиса. Доклады Академии наук. Биохимия, биофизика, молекулярная биология, 444, 687-690.

4. Кривошеев Д.М. (20126) Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 179 с.

5. Романов Г.А. (2009) Как цитокинины действуют на клетку. Физиология растений, 56, 295-319.

6. Anantharaman V., Aravind L. (2001) The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors. Trends Biochem. Sci., 26, 579-582.

7. Argueso C.T., Ferreira F.J., Epple P., To J.P., Hutchison C.E., Schaller G.E., Dangl J.L., Kieber J.J. (2012) Two-component elements mediate interactions between cytokinin and salicylic acid in plant immunity. PLoS Genet. 8, 1-7.

8. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., and Schwede T. (2006) The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, 22 ,195-201.

9. Balibrea Lara M.E., Gonzalez Garcia M.C., Fatima Т., Ehness R., Lee Т.К., Proels R., Tanner W., Roitsch T. (2004) Extracellular invertase is an essential component of cytokinin- mediated delay of senescence. Plant Cell, 16, 1276-1287.

10. Basle' E., Joubert N., Pucheault M. (2010) Protein Chemical Modification131on Endogenous Amino Acids. Chemistry & Biology, 17, 213-227.

11. Biddington N.L., Thomas T.H. (1973) A modified Amaranthus betacyanin bioassay for the rapid determination of cytokinins in plant extracts. Planta, 9. IV., Ill, 2, 183-186.

12. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

13. Brandizzi F., Frangne N., Marc-Martin S., Hawes C., Neuhaus J.M., Paris N. (2002) The destination for single-pass membrane proteins is influenced markedly by the length of the hydrophobic domain. Plant Cell, 4, 1077-1092.

14. Brandstatter I., Kieber J.J. (1998) Two Genes with Similarity to Bacterial Response Regulaors Are Repidly and Specifically Induced by Cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 1009-1019.

15. Brinegar C.A., Cooper G., Stevens A., Hauer C.R., Shabanowitz J., Hunt D.F., Fox

16. Briskin D.P., Leonard R.T., Hodges T.K. (1987) Isolation of the plasma membrane: membrane markers and general principles. Original research. Methods in Enzymology, 148, 542-558.

17. Bond C.S. (2003) TopDraw: a sketchpad for protein structure topology cartoons. Bioinformatics, 19, 311-312.

18. Borders C.L., Pearson L.J., McLaughlin A.E., Gustafson M.E., Vasiloff J., An F.Y., Boonman A., Prinsen E., Gilmer F., Schurr U., Peeters A. J., Voesenek L. A., Pons

19. T. L. (2007) Cytokinin import rate as a signal for photosynthetic acclimation to canopy light gradients. Plant Physiol., 143, 1841-1852.

20. Brunncr J. (1993) New photolabeling and crosslinking methods. Ann. Rev. Biochem., 62, 483-514.

21. Caesar K., Thamm A.M., Witthoft J., Elgass K., Huppenberger P., Grefen C., Horak J., Harter K. (2011) Evidence for the localization of the Arabidopsis cytokinin receptors AHK3 and AIIK4 in the endoplasmic reticulum. J. Exp. Bot., 62, 5571-5580.

22. Caplin S.M., Steward F.C. (1948) Effect of coconut milk on the growth of the explants from carrot root. Science, 108, 655-657.

23. Cary A. J., Liu W., Howell S. H. (1995) Cytokinin Action Is Coupled to Ethylene in Its Effects on the Inhibition of Root and Hypocotyl Elongation in Arabidopsis thaliana Seedlings. Plant Physiol., 107, 1075-1082.

24. Casimiro I., Marchant A., Bhalerao R.P., Beeckman T., Dhooge S., Swarup R., Graham N., Inzer D., Sandberg G., Casero P.J., Bennett M. (2001) Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell, 13, 843-852.

25. Chen Y.-F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. (2002) Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. J. Biol. Chem., 277, 19861-19866.

26. Cheng Y.C., Prusoff W.H. (1973) Relationship between the inhibitor constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50% inhibition of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. Med., 22, 3099-3108.

27. Choi J., Huh S.U., Kojima M., Sakakibara H., Paek K.H., Hwang I. (2010) The cytokinin-activated transcription factor ARR2 promotes plant immunity via TGA3/NPR1- dependent salicylic acid signaling in Arabidopsis. Dev. Cell, 19, 284-295.

28. Choi J., Choi D., Lee S., Ryu C.M., Hwang I. (2011) Cytokinins and plant immunity: old foes or new friends? Trends Plant Sci., 16, 388-394.

29. Chu Z.X., Ma Q., Lin Y.X., Tang X.L., Zhou Y.Q., Zhu S.W., Fan J., Cheng B.J.2011) Genome-wide identification, classification, and analysis of two-component signal system genes in maize. Genet. Mol. Res., 10, 3316-3330.

30. Couvineau A., Ceraudo E., Tan Y.-V., Laburthe M. (2010) VPAC1 receptor binding site: Contribution of photoaffinity labeling approach. Neuropeptides, 44, 127-132.

31. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. (2004) WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14, 1188-1190.

32. D'Agostino IB, Deruére J, Kieber JJ. (2000) Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulator Gene Family to Cytokinin. Plant Physiol., 124, 17061717.

33. Dewitte W., Riou-khamlichi C., Scofield S., Healy J.M.S., Jacqmard A., Kilby N.J., Murray J.A.H. (2003) Altered Cell Cycle Distribution, Hyperplasia, and Inhibited Differentiation in Arabidopsis Caused by the D-Type Cyclin CYCD3. Plant Cell, 15, 7992.

34. Di Giacomo E., Sestili F., Iannelli M.A., Testone G., Mariotti D., Frugis G. (2008) Characterization of KNOX genes in Medicago truncatula. Plant Mol. Biol., 67, 135-150.

35. Dormán G., Prestwich G.D. (2000) Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends Biotechnol., 18, 64-77.

36. Dortay H., Mehnert N., Bürkle L., Schmiilling T., Heyl A. (2006) Analysis of protein interactions within the cytokinin-signaling pathway of Arabidopsis thaliana. FEBS J., 273,4631-4644.

37. Durbak A.R., Tax F.E. (2011) CLAVATA Signaling Pathway Receptors of Arabidopsis Regulate Cell Proliferation in Fruit Organ Formation as well as in Meristems. Genetics, 189, 177-194.

38. Ecker J.R., Kieber J.J. (2004) Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell., 16, 658-671.

39. Erion J.L. &Fox J.E. (1981) Purification and Properties of a Protein Which Binds Cytokinin-active 6-Substituted Purines. Plant Physiol., 67, 156-162.

40. Ferreira F.G., Kieber J.J. (2005) Cytokinin signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 8, 518525.

41. Fleming S.A. (1995) Chemical reagents in photoaffinity labeling. Tetrahedron, 51, 12479-12520.

42. Gan S., Amasino R.M. (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270, 1986-1988.

43. Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. (2006) The Medicago truncatula CRE1 cytokinin receptor regulates lateral root development and early symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti. Plant Cell, 18, 2680-2693.

44. Gordon S.P., Chickarmane V.S., Ohno C., Meyerowitz E.M. (2009) Multiple feedback loops through cytokinin signaling control stem cell number within the Arabidopsis shoot meristem. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 106, 16529-16534.

45. Gupta S., Rashotte A.M. (2012) Down-stream components of cytokinin signaling and the role of cytokinin throughout the plant. Plant Cell Rep., 31, 801-812.

46. Hass C., Lohrmann J., Albrecht V., Sweere U., Hummel F., Yoo S. D., Hwang I., Zhu T., Schäfer E., Kudla J., Harter K. (2004). The response regulator 2 mediates ethylene signalling and hormone signal integration in Arabidopsis. EMBO J., 23, 32903302.

47. Henry J.T., Crosson S. (2011) Ligand-Binding PAS Domains in a Genomic, Cellular, and Structural Context. Annual Rev. Microbiol., 65, 261-286.

48. Heyl A., Schmiilling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Cur. Opin. Plant Biol., 6,480-488.

49. Heyl A., Wulfetange K., Pils B., Nielsen N., Romanov G.A., Schmiilling T. (2007) Evolutionary proteomics identifies amino acids essential for ligand-binding of the cytokinin receptor CHASE domain. BMC Evol. Biol., 1, 62.

50. Heyl A., Riefler M., Romanov G.A., Schmiilling T. (2012) Properties, functions and evolution of cytokinin receptors. Eur. J. Cell Biol., 91, 246-256.

51. Hosoda K., Imamura A., Katoh E., Hatta T., Tachiki M., Yamada H., Mizuno T., Yamazaki T. (2002) Molecular structure of the GARP family of plant Myb-related DNA binding motifs of the Arabidopsis response regulators. Plant Cell., 14, 2015-2029.

52. Hothorn M., Dabi T., Chory J. (2011) Structural basis for cytokinin recognition by Arabidopsis thaliana histidine kinase 4 Nature Chem. Biol., 7, 766-768.

53. Hwang I., Sheen J. (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature, 413, 383-389.

54. Franco-Zorrilla J.M., Martin A.C., Solano R., Rubio, V., Leyva, A., Paz-Ares J.2002) Mutations at CRE1 impair cytokinin-induced repression of phosphate starvation responses in Arabidopsis. Plant J., 32, 353-360.

55. Jain M., Tyagi A.K., Khurana J.P. (2006) Molecular characterization and differential expression of cytokinin-responsive type-A response regulators in rice (Oryza saliva). BMC Plant Biol., 6, 1-11.

56. Jasinski S., Piazza P., Craft J., Hay A., Woolley L., Rieu I., Phillips A., Hedden P., Tsiantis M. (2005) KNOX action in Arabidopsis is mediated by coordinate regulation of cytokinin and gibberellin activities. Curr. Biol., 15, 1560-1565.

57. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. (1987) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBOJ., 6, 3901-3907.

58. Jones J.D., Dangl J.L. (2006) The plant immune system. Nature, 444, 323-329.

59. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidine kinase homolog implicated incytokinin signal-transduction. Science, 274, 982-985.

60. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol., 54, 605-627.

61. Kiba T., Aoki K., Sakakibara H., Mizuno T. (2004) Arabidopsis response regulator, ARR22, ectopic expression of which results in phenotypes similar to the wol cytokinin-receptor mutant. Plant Cell Physiol., 45, 1063-1077.

62. Kiefer F., Arnold K., Kiinzli M., Bordoli L., Schwede T. (2009). The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Research, 37, D387-D392.

63. Kim H.J., Ryu H., Hong S.H., Woo H.R., Lim P.O., Lee I.C., Sheen J., Nam H.G., Hwang I. (2006) Cytokinin-mediated control of leaf longevity by AHK3 through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 103, 814-819.

64. Kim Y.-S., Park C.-M. (2007) Membrane Regulation of Cytokinin- Mediated Cell Division in Arabidopsis. Plant Signal. Behav., 2, 15-16.

65. Kopecny D., Sebela M., Briozzo P., Spichal L., Houba-Hérin N., Masek V., Joly N., Madzak C., Anzcnbachcr P., Laloue M. (2008) Mechanism-Based Inhibitors of Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase Attack FAD Cofactor. J. Mol. Biol., 380, 886-899.

66. Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M., Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007) Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature, 445, 652-655.

67. Kuroha T., Ueguchi C., Sakakibara H., Satoh S. (2006) Cytokinin receptors are required for normal development of auxin-transporting vascular tissues in the hypocotyl but not in adventitious roots. Plant Cell Physiol., 47, 234-243.

68. J., Mo X., Wang J., Chen N., Fan H., Dai C.,Wu P. (2009) BREVIS RADIX is involved in cytokinin-mediated inhibition of lateral root initiation in Arabidopsis. Planta, 229, 593-603.

69. Mähönen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y.2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev., 14, 2938-2943.

70. Mähönen A.P., Bishopp A., Higuchi M., Nieminen K.M., Kinoshita K., Törmäkangas K., Ikeda Y., Oka A., Kakimoto T., Helariutta Y. (2006a) Cytokinin signaling and its inhibitor AI-IP6 regulate cell fate during vascular development. Science, 6, 94-98.

71. Mahonen A.P., Higuchi M., Tormakangas K., Miyawaki K., Pischke M.S., Sussman M.R., Hclariutta Y., Kakimoto T. (2006b) Cytokinins regulate a bidirectional phosphorelay network in Arabidopsis. Can. Biol., 16, 1116-1122.

72. Mason M.G., Li J., Mathews D.E., Kieber J.J., Schaller G.E. (2004) Type-B response regulators display overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiol., 135, 927-937.

73. Mason M.G., Mathews D.E., Argyros D.A., Maxwell B.B., Kieber J.J., Alonso J.M., Ecker J.R., Schaller G.E. (2005) Multiple Type-B Response Regulators Mediate Cytokinin Signal Transduction in Arabidopsis. Plant Cell., 17, 3007-3018.

74. Martin A.C., del Pozo J.C., Iglesias J., Rubio V., Solano R., de la Pena A., Leyva A., Paz-Ares J. (2000) Influence of cytokinins on the expression of phosphate starvation responsive genes in Arabidopsis. Plant J., 24, 559-567.

75. Maxwell B.B., Kieber J.J. (2005) Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! P.J. Davies, ed. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 321— 349.

76. Miller C.O., Skoog F., von Saltza N.M., Strong F.M. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Soc., 77, 1329-1334.

77. Mizuno T., Nakamichi N. (2005) Pseudo-response regulators (prrs) or true oscillator components (toes). Plant Cell Physiol., 46, 677-685.

78. Mok D.W., Mok M.C. (2001) Cytokinin Metabolism and Action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, 89-118.

79. Morgan D.J. (1979) 4-Hydroxy-3-nitrophenylglyoxal. A chromophoric reagent for arginyl residues in proteins. Biochim. Biophys. Acta, 568, 491-495.

80. Mornet R., Theiler J.B., Leonard N.J., Schmitz R.Y., Moore III F.H., Skoog F.1979) Active cytokinins. Photoaffinity labeling agents to detect binding. Plant Physiol., 64, 600-610.

81. Mougcl C., Zhulin I.B. (2001) CHASE: an extracellular sensing domain common to transmembrane receptors from prokaryotes, lower eukaryotes and plants. Trends Biochem. Sci., 26, 582-584.

82. Miiller B. (2011) Generic signal-specific responses: cytokinin and context-dependent cellular responses. J. Exp. Bot., 62, 3273-3288.

83. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S., Ueguchi C. (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell., 16, 1365-1377.

84. Nisler J., Zatloukal M., Popa I., Dolezal K., Strnad M., Spichal L. (2010) Cytokinin receptor antagonists derived from 6-benzylaminopurine. Phytochemistry, 71, 823-830.

85. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Kulaeva O.N., Hall M.A. (1999) The effect of ethylene and cytokinin on guanosine 5'-triphosphate binding and protein phosphorylation in leaves of Arabidopsis thaliana, Planta, 208, 239-246.

86. Pareek A., Singh A., Kumar M., Kushwaha H.R., Lynn A.M., Singla-Pareek S.L.2006) Whole genome analysis of Oiyza sativa reveals similar architecture of two component signaling machinery with Arabidopsis. Plant Physiol, 142, 380-397.

87. Pas J., von Grotthuss M., Wyrwicz L.S., Rychlewski L., Barciszewski J. (2004) Structure prediction, evolution and ligand interaction of CHASE domain. FEBS Letters., 576, 287-290.

88. Patthy L., Smith E. L. (1975) Reversible modification of arginine residues. Application to sequence studies by restriction of tryptic hydrolysis to lysine residues. J. Biol. Chem., 250, 557-564.

89. Perilli S., Moubayidin L., Sabatini S. (2010) The molecular basis of cytokinin function. Curr. Opin. Plant Biol., 13, 21-26.

90. Pils B., Heyl A. (2009) Unraveling the evolution of cytokinin signaling. Plant Physiol., 151, 782-791.

91. Pleban K., Kopp S., Csaszar E., Peer M., Hrebicek T., Rizzi A., Ecker G.F., Chiba

92. P. (2005) P-glycoprotein substrate binding domains are located at the transmembrane domain interfaces: a combined photoaffinity labeling-protein homology modeling approach. Mol. Pharm., 67, 365-374.

93. Punwani J.A., Hutchison C.E., Schaller G.E., Kieber J.J. (2010) The subcellular distribution of the Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins is independent of cytokinin signaling. Plant J., 62, 473-482.

94. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol., 132, 1998-2011.

95. Rashotte A.M., Mason M.G., Huychison C.E., Ferreira F.J.,Schaller G.E., Kieber

96. J.J. (2006) A subset of Arabidopsis AP2 transcription factors mediates cytokinin responses in concert with a two-component pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 11081-11085.

97. Rashotte A.M., Goertzen L.R. (2010) The CRF domain defines cytokinin response factor proteins in plants. BMC Plant Biol., 10, 74-83.

98. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmulling T. (2006) Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism. Plant Cell, 18, 40-54.

99. Riordan J. F. (1973) Functional arginyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione. Biochemistry, 12, 3915-3923.

100. Riordan J. F., McEIvany K. D., Borders C. L. (1977) Arginyl residues: anion recognition sites in enzymes. Science, 195, 884-886.

101. Riou-Khamlichi C., Huntley R., Jacqmard A., Murray J. A. (1999) Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science, 283, 1541-1544.

102. Rivero R.M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E. (2007) Delayed leaf senescence indused extreme drought tolerance in flowering plant. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 104, 19631-19636.

103. Rogers T. B., Borresen T., Feeney R. E. (1978) Chemical modification of the arginines in transferrins. Biochemistry, 17, 1105-1109.

104. Romanov G.A. Kiebcr J.J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in Cytokinin Signalling. FEBS Lett., 515,39-43.

105. Romanov G.A., Spichal L., Lomin S.N., Strnad M., Schmulling T. (2005) A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing a eukaryotic receptor protein. Anal. Biochem., 347, 129-134.

106. Romanov G.A., Lomin S.N., Schmiilling T. (2006) Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AIIK3 compared to CRE1/AIIK4 as revealed by a direct binding assay. J. Exp. Bot., 57, 4051-4058.

107. Sablowski R. (2009) Cytokinin and WUSCHEL tie the knot around plant stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 16016-16017.

108. Saenz L., Jones L.H., Oropeza C., Vlacil D., Strnad M. (2003) Endogenous isoprenoid and aromatic cytokinins in different plant parts of Cocos nucifera (L.). Plant Growth Re gill., 39, 205-215.

109. Sakai H., Aoyama T., Bono H., Oka A. (1998) Two-component response regulators from Arabidopsis thaliana contain a putative DNA-binding motif. Plant Cell Physiol., 39, 1232-1239.

110. Sakai H., Aoyama T., Oka A. (2000) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J., 24, 703-711.

111. Sakai H., Honma T., Aoyama T., Sato S., Kato T., Tabata S., Oka A. (2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science, 294, 15191521.

112. Sakai M., Fujiwara M., Nakamatsu T. (2006) Process for preparing 2,6-dichloropurine. US Patent Application 2006/0235224 Al.

113. Schaller G.E., Shiu S-H., Armitage J.P. (2011) Two-component systems 820 and their co-option for eukaryotic signal transduction. Curr. Biol., 821, 320-330.

114. Schippers J.H.M., Jing H.-C., Hille J., Dijkwel P.P. (2007) Developmental and hormonal control ofleaf senescence. Annu. Plant Rev., 26, 9-44.

115. Schneider T.D., Stephens R.M. (1990) Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences. Nucleic Acids Res., 18, 6097-6100.

116. Shi X., Rashotte A.M. (2012) Advances in upstream players of cytokinin phosphorelay: receptors and histidine phosphotransfer proteins. Plant Cell Rep., 31, 789-799.

117. Sing A., Thornton E.R., Westheimer F.H. (1962) The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. J. Biol. Client., 237, 3006-3008.

118. Soni R., Carmichael J. P., Shah Z. H., Murray J. A. H. (1995) A family of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell, 7, 85-103.

119. Sparkes I.A., Runions J., Kearns A., Hawes C. (2006) Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols., 4, 2019-2025.

120. Spichal L., Werner T., Popa I., Riefler M., SchmuIIing T., Strnad M. (2009) The purine derivative PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition. FEBS J., 276, 244-253.

121. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. (2000) Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem., 69, 183-215.

122. Strnad M. (1997) The aromatic cytokinins. Physiol Plant, 101, 674-688.

123. Sussman M.R., Kende H. (1977) The synthesis and biological properties of 8-azido-M5-benzyladenine, a potential photoaffinity reagent for cytokinin. Planta, 137, 91-96.145

124. Suzuki Т., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AIIK4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol., 42, 107-113.

125. Takahashi K. (1968) The Reaction of Phenylglyoxal with Arginine Residues in Proteins. J. Biol. Chem., 243, 6171-6179.

126. Tanaka Y., Suzuki Т., Yamashino Т., Mizuno T. (2004) Comparative studies of the AHP histidine-containing phosphotransmitters implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 462-465.

127. Taniguchi M., Sasaki N., Tsuge Т., Aoyama Т., Oka A. (2007) ARR1 Directly Activates Cytokinin Response Genes that Encode Proteins with Diverse Regulatory Functions. Plant Cell Physiol., 48, 263-277.

128. Temple K., Kussner C.L., Montgomery J.A. (1966) Studies on the azidoazomethine-tetrazole equilibrium. V. 2- and 6-azidopurines. J. Org. Chem., 31, 2210-2215.

129. Theiller R.B., Leonard N.J. (1976) Photoaffinity-labeled cytokinins. Plant Physiol., 58, 803-805.

130. Tian M., von Dahl C.C., Liu P., Friso G., van Wijk K.J., Klessig D.F. (2012) The combined use of photoaffinity labeling and surface plasmon resonance-based technology identifies multiple salicylic acid-binding proteins. The Plant Journal, 72, 1027-1038.

131. To J.P., Haberer G., Ferreira F.J., Deruere J., Mason M.G., Schaller G.E., Alonso J.M., Ecker J.R., Kieber J.J. (2004) Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell., 16, 658-671.

132. To J.P., Kieber J.J. (2008) Cytokinin signaling: two-components and more. Trends Plant Sci., 13, 85-92.

133. To J.P., Haberer G., Ferreira F.J., Deruere J., Mason M.G., Schaller G.E., Alonso J.M., Miiller B. (2011) Generic signal-specific responses: cytokinin and context-dependent cellular responses. J. Exp. Bot., 62, 3273-3288.

134. Verhage A., van Wees S.C., Pieterse C.M. (2010) Plant immunity: it's the hormones talking, but what do they say? Plant Physiol., 154, 536-540.

135. Voinnet O., Rivas S., Mestre P., Baulcombe D. (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J., 33, 949-956.

136. Wang N., Soderbom F., Anjard C., Shaulsky G., Loomis W.F. (1999) SDF-2 induction of terminal differentiation in Dictyostelium discoideum is mediated by the membrane-spanning sensor kinase DhkA. Mol. Cell Biol., 19, 4750-4756.

137. Wen B., Doneanu C.E., Gartner C.A., Roberts A.G., Atkins W.M., Nelson S.D.2005) Fluorescent photoaffinity labeling of cytochrome P450 3A4 by lapechenole: identification of modification sites by mass spectrometry. Biochem., 44, 1833-1845.

138. Werner T., Motyka V., Strnad M., Schmulling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10487-10492.

139. Werner T., Hoist K., Pors Y., Guivarc'h A., Mustroph A., Chriqui D., Grimm B., Schmulling T. (2008) Cytokinin deficiency causes distinct changes of sink and source parameters in tobacco shoots and roots. J. Exp. Bot., 59, 2659-2672.

140. Werner T, Schmulling T. (2009) Cytokinin action in plant development. Cwr Opin Plant Biol., 12, 527-538.

141. Wingler A., Schaewen A.V., Leegood R.C., Lea P.J., Quick W.P. (1998) Regulation of Leaf Senescence by Cytokinin, Sugars, and Light Effects on NADH-Dependent Hydroxypyruvate Reductase. Plant Physiol., 116, 329-335.

142. Wulfetange K., Lomin S.N., Romanov G.A., Stolz A., Heyl A., Schmulling T. (201 lb) The cytokinin receptors of Arabidopsis are located mainly to the endoplasmic reticulum. Plant Physiol., 156, 1808-1818.

143. Yamasaki R. B., Vega A., Feeney R. E. (1980) Modification of available arginine residues in proteins by p-hydroxyphenylglyoxal. Anal. Biochem., 109, 32-40.

144. Yan Y. (2001) 2-amino-6-chloropurine and method for preparing the same. US Patent 6,187,921 Bl.

145. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya T., Sakakibara H. (2004) Molecular characterization of cytokininresponsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to cw-zeatin. Plant Physiol., 134, 1654-1661.

146. Zhang K., Letham D. S., John P. C. L. (1996) Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34cdc2-like HI histone kinase. Planta, 200, 2-12.

147. Zhang Z., Hendrickson W.A. (2010) Structural Characterization of the Predominant Family of Histidine Kinase Sensor Domains. J. Mol. Biol., 400, 335-353.