Исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-дуплексами в растворе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Тимченко, Мария Александровна

• Тимченко, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимченко, Мария Александровна

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ 7 I. РОЛЬ NF-кВ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ И ОСОБЕННОСТИ

СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА {Литературный обзор)

1.1. Роль NF-кВ в клеточных процессах

1.1.1. Семейство NF-kB

1.1.2. Роль NF-кВ в иммунном ответе организма и онкогенезе

1.1.3. Сигнальные пути активации NF-kB

1.1.4. Регуляция транскрипционной и ДНК-связывающей активности белка

1.1.4.1. Регуляция активности NF-кВ с помощью фосфорилирования сериновых остатков белка

1.1.4.2. Окислительно-восстановительная регуляция активности NF-кВ в клетке

1.1.5. Специфичность узнавания NF-kB

1.2. Особенности структурной организации NF-кВ и его комплексов с ДНК

1.2.1. Структура р50 субъединицы NF-kB

1.2.2. Структура комплекса р50 субъединицы NF-кВ с ДНК

1.2.2.1. Кристаллическая структура комплекса р50 субъединицы NF-кВ с ДНК

1.2.2.2. Исследование конформационных особенностей комплекса р50 субъединицы NF-кВ с ДНК и механизма связывания белка pSO с ДНК в растворе

II. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСПЕКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ р50 СУБЪЕДИНИЦЫ NF-кВ С ДНК-ДУПЛЕКСАМИ В РАСТВОРЕ

Обсуждение результатов)

11.1. Сравнение физико-химических характеристик рекомбинантных белков

§0-GST и p50-His6 49 Н.1.1. Исследование конформации белков p50-GST и p50-His6 в растворе

11.1.2. Анализ структуры белков p50-GST и p50-His методом кругового дихроизма

11.1.3. Изучение влияния пептидных довесков на ДНК-связывающий центр белков pSO-GST и p50-His

11.2. Структурные аспекты взаимодействия белка р50 NF-kB с ДНК-дуплексами в растворе

11.2.1. Структура комплекса белка р50 с ДНК в растворе

11.2.2. Структура ДНК-связывающего центра белка р50 NF-kB 76 Н.2.2.1. Изучение влияния замены аминокислотных остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке р50 NF-kB на его структуру

11.2.2.2. Изучение влияния замены аминокислотных остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке р50 NF-kB на его комплексообразование с ДНК

11.2.2.3. Изучение влияния замены аминокислотных остатков Cys62, Lysl47 и Lys278 на Ala в белке р50 NF-kB на ДНК-связывающий центр белка

11.3. ПУТИ ИНГИБИРОВАНИЯ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ NF-kB В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

11.3.1. Модифицированные ДНК-дуплексы как потенциальные регуляторы активности NF-кВ в клетке

Н.3.2. Ингибирование NF-кВ с помощью антиракового препарата кобальт-фталоцианинового комплекса

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-дуплексами в растворе»

Одним из наиболее важных и необходимых процессов жизнедеятельности клетки, который обеспечивает начальный этап передачи генетической информации от нуклеиновых кислот к белкам, является транскрипция. Многие биологические процессы регулируются на уровне экспрессии генов. Изучение генетических процессов на молекулярном уровне позволило выявить важнейшую роль белковых факторов в регуляции генной экспрессии на различных ее этапах. Одним из ключевых эукариотических факторов транскрипции является ядерный фактор транскрипции NF-кВ. Этот белок впервые был описан в 1986 году как специфический ядерный фактор В-клеток, ответственный за экспрессию гена к-иммуноглобулина [1].

В клетке NF-кВ участвует в процессах инициации транскрипции генов, кодирующих различные белки, в том числе сигнальные белки и белки иммунного ответа, поэтому главным следствием участия белка NF-кВ в регулировании активности большого числа генов является повышение защитных функций организма.

К настоящему времени известно, что многие вирусы, включая ВИЧ-1, используют NF-кВ для транскрипции собственных генов. Кроме того, предпринятые исследования молекулярных механизмов онкогенеза нормальных клеток в опухолевые, мультилекарственной резистентности опухолевых клеток и программируемой клеточной гибели, позволили установить важнейшую роль транскрипционного фактора NF-кВ в развитии этих явлений. В опухолевых клетках наблюдается высокий уровень экспрессии NF-кВ, который запускает в них целый каскад реакций, ведущих к активации транскрипции онкогенов. В связи с этим в настоящее время уделяется большое внимание поиску эффективных путей модуляции активности NF-кВ в опухолевых клетках человека.

Создание регуляторов активности фактора транскрипции NF-кВ как нуклеотидной, так и белковой природы представляет собой одно из основных направлений фармакотерапии, поэтому актуальной задачей является изучение тонкой структуры комплекса ДНК-NF-kB в растворе при физиологических условиях.

Па сегодняшний день известно около десяти кристаллических структур фактора транскрипции с различными ДНК и РНК-лигандами, а также ингибирующими белками 1кВа и 1кВр. Для самих белков семейства NF-кВ вне комплекса структуры с высоким разрешением пока не получены. На данный момент закристаллизованы только С-концевые димеризационные домены белков р50 и р65 NF-kB [2]. Поскольку кристаллические структуры являются отражением лишь одного из состояний молекулы в растворе и не полностью отражают функциональные особенности белка, их нельзя использовать для прогнозирования точного поведения фактора транскрипции в клетке. Следовательно, важным элементом при исследовании фактора транскрипции NF-кВ является изучение его физико-химических и биологических характеристик в растворе.

Настоящая работа посвящена исследованию структурных особенностей р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека, ответственной за связывание с ДНК, и ее комплексов с ДНК-дуплексами в растворе.

В данной работе впервые с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния проведено исследование конформации белка р50 NF-кВ в растворе. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния позволяет описать форму молекулы на основе модельных вычислений. Основной вклад в кривую рассеяния вносят общие размеры частицы и их форма. Из кривой рассеяния в этой области можно извлечь информацию об электронном радиусе инерции, молекулярном весе, объеме, площади поверхности, гидратации молекулы и ряде других интегральных характеристик объекта. До настоящего времени исследования структурных особенностей белка р50 в растворе практически не проводилось. Были получены лишь некоторые данные о молекулярной массе образующегося в растворе белкового ассоциата и степени гомогенности белка методом равновесной седиментации [3,4]. Кристаллическая структура для белка р50 вне комплекса с лигандами еще не получена.

Методом малоуглового рентгеновского рассеяния также впервые изучены конформационные изменения в белке р50, происходящие при его комплексообразовании с ДНК.

Для исследования изменений в геометрии центра связывания белка при введении единичных замен как в структуру ДНК-связывающего центра белка р50, так и в структуру участка узнавания белка в ДНК впервые использован метод региоселективного ковалентного связывания [5,6], разработанный в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Метод региоселективного ковалентного связывания базируется на создании с помощью химического лигирования синтетических ДНК-дуплексов, содержащих в одной из цепей вместо природной межнуклеотидной фосфатной группы химически активную тризамещенную пирофосфатную фосфатную группу (ТЗПГ). Такие ДНК-дуплексы являются эффективными фосфорилирующими агентами в водной среде и способны образовывать ковалентную связь с нуклеофильными группами аминокислотных остатков Lys, Туг или His НК-связывающих белков в составе специфического комплекса НК-белок. Необходимым условием образования ковалентной связи между белком и ДНК является стерическая сближенность реагирующих группировок. Ковалентное связывание белка с серией модифицированных ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в одной из позиций участка узнавания, позволило прозондировать Д1 IK-связывающий центр белка. В сочетании с методом сайт-направленного мутагенеза белка в работе исследовано влияние замены ряда ключевых аминокислот в белке р50 NF-kB, участвующих во взаимодействии с фосфатными группами ДНК, на центр связывания белка. Кроме того, с помощью набора ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в различных позициях кВ-участка узнавания белка, проведено сравнение контактов нуклеофильных аминокислотных остатков с фосфатными группами ДНК, реализующихся в составе комплекса белка с ДНК, содержащими участки узнавания из разных генов. Изученная возможность картирования центра связывания белков с помощью метода региоселективного ковалентного связывания может найти применение и для других НК-связывающих белков.

Используемые в работе ТЗПГ-содержащие ДНК-дуплексы могут быть предложены в качестве специфичных ингибиторов NF-кВ благодаря их свойству селективно и необратимо связываться с белком в условиях in vitro. Для анализа специфичности их взаимодействия с NF-кВ в опухолевых клетках в работе проведено ковалентное связывание модифицированных ДНК-дуплексов с клеточным пулом NF-кВ в ядерных и цитоплазматических фракциях лизатов клеток карциномы кишки человека НСТ-116. Показано, что подобные ДНК-реагенты связываются специфично с NF-кВ в лизатах, не затрагивая другие компоненты клетки, что подтверждено иммуноблоттингом с антителами к р50 и р65 субъединицам NF-кВ. Кроме того, сделаны предварительные эксперименты по доставке флуоресцентно-меченного модифицированного ДНК-реагента в опухолевые клетки, и исследована его способность к ковалентному связыванию с NF-кВ в клетке. Методом конфокальной сканирующей микроскопии показано, что такие ДНК-дуплексы проникают через цитоплазматическую мембрану и локализуются, в основном, по периферии клетки. При воздействии на клетки фактора некроза опухоли а (TNF-а), приводящего к запуску сигнальных путей активации NF-кВ, ДНК мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с NF-кВ. Обработка клеток НСТ-116, предварительно инкубированных с родамин-меченным ДНК-реагентом, флуоресцеин-мечеными антителами к р50 субъединице NF-кВ выявила ко-локализацию антител с ДНК-дуплексами. Можно предполагать, что ДНК-дуплексы образуют специфический комплекс с NF-кВ в клетках.

Таким образом, используемые в работе ДПК-реагенты могут служить основой для разработки противоопухолевых препаратов, базирующихся на модуляции активности NF-кВ в клетке, а также в диагностических целях для определения наличия активного NF-kB в клетке, что позволит выявить онкологические заболевания на ранних этапах.

Кроме того, в работе исследована способность антиракового препарата -фталоцианинового комплекса кобальта - ингибировать ДНК-связывающую активность NF-kB. Препараты на основе фталоцианинов широко используются в фотодинамической терапии рака благодаря способности избирательно накапливаться в опухолях и вызывать их деструкцию под действием фотоиндуцируемой генерации активных форм кислорода [7]. В работе показано, что кобальт-фталоцианиновый комплекс, содержащий восемь карбоксильных групп по периферии лиганда, конкурентно связывается с участком узнавания NF-kB в ДНК-дуплексе, препятствуя комплексообразованию белка с ДНК. Кроме того, в присутствии аскорбиновой кислоты он расщепляет ДНК-дуплекс за счет генерации активных форм кислорода. Таким образом, кобальт-фталоцианиновый комплекс является эффективным ингибитором активности NF-kB. Однако, высокое сродство фталоцианинов к любым последовательностям ДНК и подавление активности широкого спектра белков (NF-kB, РНКаза Н, эндонуклеаза рестрикции SsoII) делает его действие неспецифичным. Специфичность может быть достигнута введением металлокомплекса в структуру модифицированных олигонуклеотидов для адресной доставки к генам-мишеням. Такие конъюгаты могут заложить основу для создания новых противоопухолевых агентов.

Проведенные в работе исследования представляют интерес с точки зрения анализа структурных особенностей белка р50 NF-kB и его комплексов с ДПК-дуплексами в растворе и для разработок регуляторов активности фактора транскрипции NF-kB в клетке.

I. РОЛЬ NF-кВ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА (Литературный обзор)

1.1. РОЛЬ NF-KB В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ

Ядерный фактор транскрипции эукариот NF-kB является ключевым элементом в системе регуляции большого числа генов, которая позволяет клеткам млекопитающих быстро приспосабливать свою транскрипционную программу к воздействиям окружающей среды. Он участвует в про воспалительном и иммунном ответе организма, регулируя экспрессию генов цитокинов, хемокинов, интерлейкинов и интерферонов.

К настоящему времени исследование молекулярных механизмов трансформации клеток в опухолевые, эффекта мультилекарственной резистентности опухолевых клеток и программируемой клеточной гибели позволило установить важнейшую роль транскрипционного фактора NF-kB в развитии этих явлений. В опухолевых клетках наблюдается высокий уровень экспрессии NF-kB, который запускает в них целый каскад реакций, ведущих к активации транскрипции онкогенов. В связи с этим, изучение структурно-функциональных аспектов взаимодействия NF-kB с ДНК и поиск эффективных путей модуляции активности NF-kB в опухолевых клетках человека является одним из важных направлений современной молекулярной биологии и фармакотерапии.

1.1.1. СЕМЕЙСТВО NF-кВ

Название "NF-кВ" представляет собой собирательное название комплексов, образованных белками, входящими в семейство Rel/NF-кВ [8]. В эукариотических клетках присутствуют пять белков этого семейства: р50-р105 (или NF-kB1), р65 (RelA), р52-р100 (или NF-kB2 или Lyt-10), RelB и c-Rel. Все белки этого Rel-семейства имеют в N-концевой части участок высокой гомологии из 300 аминокислот с белком - продуктом онкогена rel, называемый RIIR (от англ. Rel Homology Region). Этот участок отвечает за связывание с ДНК, димеризацию и транспорт активных белков из цитоплазмы в ядро. Интересно, что для связывания с ДНК белкам семейства Rel требуется весь участок высокой гомологии RJIR, в то время как для большинства факторов транскрипции можно выделить небольшой полипептидный фрагмент, обладающий практически такой же специфичностью и сродством к ДНК, как и исходный белок. Данный факт говорит о том, что способ связывания с ДНК у белков семейства NF-кВ отличается от традиционных способов связывания в ДНК-белковых комплексах. Аминокислотная последовательность полипептидов семейства Rel/NF-кВ имеет более 75% гомологии и на 38% идентична.

Семейство Rel белков можно разделить на два класса: к первому относятся белки р50 и р52, получающиеся в результате протеолитического расщепления белков р105 и рЮО, соответственно, и проявляющие только ДНК-связывающую активность, а ко второму - белки р65, RelB и c-Rel, содержащие в своем составе негомологичный трансактивационный домен и отвечающие в составе белкового комплекса за транскрипцию различных генов, в том числе и самого фактора (рис. 1.1).

NF tBI

NF-kBZ

RHD C

СГ

ANK П [a I pics/ p5C *

N T

ЛГИ®C!©S5£3lQI p"

HdB N

ЛИ-. c-Rel htB.i ■kSM IkB<

КВт

C lermlnu» crt NF-kB1/ СЮ51

1квА

1С terminus of NF-kB2^b100; Bc*-3 I- IvI'. I MM I

I I Ж .I-1*1 I

S9 •wbel - ■ I I - 3

•

ЖМДОЫ I I

1 1

L L: I I

1

1 к I I I

Рис. 1.1. Семейство белков Rel/NF-кВ и 1кВ [8].

Между собой Rel белки способны образовывать гомо- и гетеродимеры. Однако не все субъединицы димеризуются между собой. Так, RelB не способен образовывать гетеродимеры с р65 и c-Rei. В клетках преимущественно встречается гетеродимер р50-р65, регулирующий транскрипцию генов цитокинов, хемокинов, интерлейкинов, цитокиновых- и иммунорецепторов, молекул клеточной адгезии, белков острой фазы, стресс-респонсивных генов, вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) и т.д., и гомодимер р50-р50, обычно выступающий в качестве репрессора NF-кВ-зависимой транскрипции

9]

В здоровых клетках млекопитающих, за исключением В-клеток и клеток плазмы крови, NF-kB находится в цитоплазме в неактивном состоянии в виде комплекса с ингибирующим белком 1кВ.

Семейство белков 1кВ включает белки 1кВа, 1кВр, 1кВе и 1кВу. Для этого семейства характерно наличие на С-конце анкириновых повторов (рис. 1.1), которые необходимы для взаимодействия этих белков с NF-kB. Известно, что различные 1кВ белки по-разному взаимодействуют с индивидуальными гомо- и гетеродимерами NF-kB, тем самым тонко регулируя активность NF-kB. Ранее в литературе высказывалось предположение, что NF-kB удерживается в неактивном состоянии в цитоплазме за счет экранирования ингибирующим белком 1кВ последовательности сигнала транспорта в ядро (NLS (от англ. nucleic localization signal)) в NF-kB. Однако структурные исследования комплексов NF-kB с 1кВ [10-13] показали, что 1кВа закрывает сигнал ядерного транспорта только у р65 субъединицы NF-kB, оставляя NLS р50 субъединицы открытым, вследствие чего такой комплекс р50-р65-1кВа может мигрировать в ядро. В то же время, у 1кВа на N-конце имеется лейцино-богатая последовательность ядерного экспорта (NES), которая взаимодействует с рецептором ядерного экспорта Crmlp, что приводит к обратной миграции комплекса в цитоплазму. Доминирующее нахождение комплекса IkB(x-NF-kB в цитоплазме может быть обусловлено преимущественно цитоплазматической локализацией 1кВа. В то же время, 1кВа способна выводить уже активный NF-kB из ядра после деацетилирования р65 субъединицы с помощью гистондеацетилазы 3 (HDAC3) и, следовательно, 1кВа регулирует NF-kB как на цитоплазматическом, так и на ядерном уровне. Для другого белка семейства 1кВ - 1кВр известно, что он обладает способностью связываться с обеими доступными последовательностями NLS, таким образом, обеспечивая прочное удержание комплекса IkBP-NF-kB в цитоплазме. У белка 1кВу имеется семь анкириновых повторов, и он взаимодействует с NF-kB через аминокислотные остатки, участвующие в связывании с ДНК, тем самым ингибируя ДНК-связывающую активность NF-kB. Кроме того, белок р105 из семейства Rel/NF-кВ также может выступать в роли ингибиторного белка в комплексе с белками р50, c-Rel и RelA за счет наличия анкириновых повторов в С-концевой части, а сама С-концевая часть в результате альтернативного сплайсинга гена NFkBI превращается в отдельный ингибиторный белок 1кВ5.

Для активации NF-kB и его транспорта в ядро необходимым процессом является фосфорилирование 1кВ белков с помощью комплекса 1кВ киназ (IKK) (IKKa, IKKp и регулирующая субъединица IKKy (или необходимый модулятор NF-кВ (NEMO)). Комплекс IKK активируется под влиянием внешних стимулов и фосфорилирует Ser в N-концевом участке 1кВ. В таком виде 1кВ разрушается с помощью убиквитина и 26S протеасомы. Это так называемый классический сигнальный путь активации NF-kB [14]. После диссоциации комплекса (р50-р65)-(1кВ) активный NF-kB транслоцируется в ядро, где участвует в процессах инициации транскрипции генов, кодирующих сигнальные и защитные белки (рис. 1.2).

TNFu. IL-1, CD40L, LPS. <JV 1ЩМ

IJbiqultlneUng

Fniyme* *

Pro tea lam* Degradation p p P *>>'

T\ к В Degradation J t if» I>M>

UB-x 1кв-|1. pi00, pIQS

IL-1, M.-2, IL-4. IL-8. TMF w

IFN-p.G CSF, M CSF

XmXGGGAATTCCCXXXJC VCAH-1, СМИ. e «ЧииИп

INOS

IL-2fti. Jg-*-LC HIV-1, CMV

Рис. 1.2. Общая схема активации NF-кВ в клетке [8].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Тимченко, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1. Методами скоростной седиментации и ЯМР показано, что белок р50 в растворе имеет глобулярную конформацию.

2. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния в невозмущающих условиях обнаружено, что белок р50 в растворе глобулярен и находится, преимущественно, в виде димера. Также было найдено, что связывание ДНК приводит к уменьшению размеров белка и разрушению ассоциатов. В комплексе с ДНК белок находится в виде димера и имеет глобулярную конформацию.

3. Методом КД в сочетании с методом скоростной седиментации показано, что замена Cys62 и Lysl47 белка р50 на Ala приводит к существенным изменениям во вторичной структуре и в окружении ароматических групп белка без сильного нарушения компактности белковой глобулы.

4. Зондирование ДНК-связывающего центра белка р50 с использованием ТЗПГ-содержащих ДНК-дуплексов выявило, что замена Cys62 и Lysl47 на Ala приводит к нарушению связывания белка с ДНК, вероятно, из-за изменений в пространственной организации ДНК-связывающего участка белка.

5. Впервые показано, что 17/19-звенные ТЗПГ-содержащие ДНК-дуплексы, содержащие на З'-конце остаток родамина, способны проникать в опухолевые клетки НСТ-116 через цитоплазматическую мембрану без дополнительных систем доставки и ко-локализоваться с NF-кВ. При этом в

TNF-a-стимулированных клетках ДПК-реагент мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с NF-kB.

6. Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли с последующим иммуноблотгингом выявлена селективность коваленгного связывания ТЗПГ-содержащего ДНК-дуплекса с NF-kB в присутствии остальных компонентов клетки.

7. Методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях показано, что кобальт-фталоцианиновый комплекс, используемый в терапии рака, ингибирует связывание р50 субъединицы NF-kB с ДНК, однако действие его неспецифично.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тимченко, Мария Александровна, 2005 год

1. Sen R., Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences//Cell.- 1986.- v.46.- №5.- P.705-716.

2. Huang, D.B., Huxford, Т., Chen, Y.Q., Ghosh, G. The role of DNA in the mechanism of NF-кВ dimer formation: crystal structures of dimerization domains of the p50 and p65 subunits//Structure.- 1997.- v.5.- №11.- P.1427-1436.

3. Sengchanthalangsy, L.L., Datta, S., Huang, D.B., Anderson, E., Braswell, E.H., Ghosh, G. Characterization of the dimer interface of transcription factor NF-кВ p50 homodimer//J.Mol.Biol.- 1999.- v.289.- №4.- P. 1029-1040.

4. Smolle, M., Hay, R.T., Byron, O. Hydrodynamic bead modeling of the 2:1 p50-1кВу complex//Biophys.Chem.- 2004. -v. 108.- №1-3.- P.259-271.

5. Кузнецова C.A., Ивановская, М.Г., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. IX. Направленное введение замещенных пирофосфатных связей в структуру ДНК//Биоорган. химия.-1990.- v. 16.- № 2.- С.219-225.

6. Козлов И.А., Ивановская М.Г., Кубарева Е.А., Волков Е.М., Шабарова З.А. Определение положения контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания//Мол. Биол.- 1997.-v.31.- №1.- С.65-75.

7. Соколов В.В., Странадко Е.Ф., Жаркова Н.Н., Якубовская Р.И., Филоненко Е.В., Астраханкина Т.А. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс// Вопросы онкологии.- 1995.- v.41.-№2.- С.134-138.

8. Caamano, J., Hunter, С.А. NF-кВ family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions//Clin. Microbiol. Rev.- 2002.-v.15.- №3.- P.414-429.

9. Guan, II., Hou, S., Ricciardi, R.P. DNA binding of NF-кВ repressor p50/p50 depends on phosphorylation of Ser337 by PKAc//J.Biol.Chem.- 2005.- v.280.-№11.- P.9957-9962.

10. Malek, S., Chen, Y., Huxford, Т., Ghosh, G. IkBP, but not 1кВа, functions as a classical cytoplasmic inhibitor of NF-кВ dimers by masking both NF-кВ nuclear localization sequences in resting cells//J.Biol.Chem.- 2001.- v.276.- №48.-P.45225-45235.

11. Bell, S., Matthews, J.R., Jaffray, E., Hay, R.T. 1кВу inhibits DNA binding of NF-кВ p50 homodimers by interacting with residues that contact DNA//Mol.Cell.Biol.- 1996.- v. 16.- №11.- P.6477-6485.

12. Viatour, P., Merville, M.-P., Bours, V., Chariot A. Phosphorylation of NF-кВ and IkB proteins: implications in cancer and inflammation//TRENDS in Biochemical Sciences.- 2005.- v.30.- №1.- P.43-51.

13. Li, Q., Verma, I.M. NF-кВ regulation in the immune system//Nat.Rev.Immunol.-2002.- v.2.- №10.- P.725-734.

14. Perkins, N.D. The Rel/NF-кВ family: friend and foe//TIBS.- 2000.- v.25.- №9.-P.434-440.

15. Bentires-Alj, M., Barbu, V., Fillet, M., Chariot, A., Relic, В., Jacobs, N., Gielen, J., Merville, M.P., Bours, V. NF-кВ transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells//Oncogene.- 2003.- v.22.- №1.- P.90-97.

16. Karin, M., Ben-neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control oft

17. NF-кВ activity//Annu. Rev. Immunol.- 2000.- v.18.- P.621-663.

18. Hsu, II. Xiong, J, Goeddel, D.V. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-кВ activation//Cell.- 1995.- v.81.- №4.- P.495-504.

19. Devin, A., Cook, A., Lin, Y., Rodriguez, Y., Kelliher, M., Liu, Z. The distinct roles of TRAF2 and RIP in IKJC activation by TNF-R1: TRAF2 recruits IKJC to

20. TNF-R1 while RIP mediates IKK activation//Immunity.- 2000.- v.12.- №4.-P.419-429.

21. Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J., Israel, A. Complementation cloning of NEMO, a component ofthe IkB kinase complex essential for NF-кВ activation//Cell.- 1998.- v.93.- №7.1. P.1231-1240.

22. Zandi, E., Rothwarf, D.M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKa and IkB(3, necessary for IkB phosphorylation and NF-кВ activation//Cell.- 1997.- v.91.- №2.- P.243-252.

23. Dejardin, E., Droin, N.M., Delhase, M., Haas, E., Cao, Y., Makris, C., Li, Z.W., Karin, M., Ware, C.F., Green, D.R. The lymphotoxin-р receptor induces different patterns of gene expression via two NF-кВ pathways//Immunity.- 2002.- v.17.-№4.- P.525-535.

24. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO* independent processing of NF-kB2 in maturating В cells//Nat. Immunol.- 2002.v.3.- №10.- P.958-965.

25. Coope, II.J., Atkinson, P.G., Huhse, В., Belich, M., Janzen, J., Ilolman, M.J., Klaus, G.G., Johnston, L.I I., Ley, S.C. CD40 regulates the processing of NF-kB2 pi00 to p52//EMBO J.- 2002.- v.21.- №20.- P.5375-5385.

26. Xiao, G., Cvijic, M.E., Fong, A., Harhaj, E.W., Uhlik, M.T., Waterfield, M., Sun, S.C. Retroviral oncoprotein Tax induces processing of NF-icB2/plOO in T cells: evidence for the involvement of IKKa//EMBO J.- 2001.-v.20.- №23.- P.6805-6815.

27. Xiao, G., Harhaj, E.W., Sun, S.C. NF-kb-inducing kinase regulates the processing of NF-KB2 pl00//Mol. Cell.- 2001.- v.7.- №2.- P.401-409.

28. Senftleben, U., Cao, Y., Xiao, G., Greten, F.R., Krahn, G., Bonizzi, G., Chen, Y., IIu, Y., Fong, A., Sun, S.C., Karin, M. Activation by IKKa of a second, evolutionary conserved, NF-кВ signaling pathway//Science.- 2001.- v.293.-№5534.- P. 1495-1499.

29. Xiao, G., Fong, A., Sun, S.C. Induction of pi00 processing by NF-kb-inducing kinase involves docking IkB kinase a (IKKa) to pi00 and IKKa-mediated phosphorylation/^. Biol. Chem.- 2004.- v.279.- №29.- P.30099-30105.

30. Kato, T. Jr., Delhase, M., Hoffmann, A., Karin, M. CK2 is a C-terminal IkB kinase responsible for NF-кВ activation during the UV response//Mol. Ccll.-2003.- v. 12.- №4.- P.829-839.

31. Tergaonkar, V., Bottero, V., Ikawa, M., Li, Q., Verma, I.M. IkB kinase independent 1кВа degradation pathway: functional NF-кВ activity and implications for cancer therapy//Mol. Cell. Biol.- 2003.- v.23.- №22.- P.8070-8083.

32. Zhong, II., Voll, R.R., Ghosh, S. Phosphorylation of NF-кВ p65 by PKA stimulates transcriptional activity by promoting a novel bivalent interaction ewith coactivator CBP/p300//Mol. Cell.- 1998.- v.l.- №5.- P.661-671.

33. Zhong, II., May, M.J., Jimi, В., Ghosh, S. The phosphorylation status of nuclear NF-кВ determines its association with CBP/рЗОО or HDAC-l//Mol. Cell.- 2002.-v.9.-№3.- P.625-636.

34. Pineda-Molina E., Klatt P., Vazquez A., Marina A., Lacoba M., Perez-Sala D., Lamas S. Glutathionylation of the p50 subunit of NF-кВ: mechanism for redox-induced inhibition of DNA binding//Biochemistry.- 2001.- v.40.- №47.- P.14134-14142.

35. Toledano, M.B., Ghosh, D., Trinh, F., Leonard, W.J. N-terminal DNA-binding domains contribute to differential DNA-binding specifities of NF-кВ p50 and p65//Mol.Cell.Biol.- 1993.- v.13.- №2.- P.852-860.

36. Matthews J.R., Kaszubska W., Turcatti G., Wells Т., Hay R.T. Role of cysteine 62 in DNA recognition by the p50 subunit ofNF-KB//Nucl. Acids Res.- 1993.- v.21.-№19.- P. 1727-1734.

37. Ghosh, G., Duyne, G., Ghosh, S., Sigler, P. Structure of NF-кВ p50 homodimer bound to kB site//Nature.- 1995.- v.373.- №6512.- P.303-310.

38. Muller, C.W., Harrison, S.C. The structure of nf-kappa В p50:DNA-complex: a starting point for analyzing the rel family//FEBS Letters.- 1995.-v.369.- №1.-P.113-117.

39. Chen, F.E., Huang, D.B., Chen, Y.Q., Ghosh, G. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor nf-kappaB bound to DNA//Nature.- 1998.-v.391.- №6665.- P.410-413.

40. Chen, Y.Q., Ghosh, S., Ghosh, G. A novel DNA recognition mode by the nf-kappa b p65 homodimer//Nature Struct. Biol.- 1998.- v.5.- №1.- P.67-73.

41. Cramer, P., Larson, C.J., Verdine, G.L., Muller, C.W. Structure of human nf-kappab p52 homodimer-DNA complex at 2.1 A resolution//EMBO J.- 1997.-v.16.- №23.- P.7078-7090.

42. Huang, D.B., Chen, Y.Q., Ruetsche, M., Phelps, C.B., Ghosh, G. X-ray crystal structure of proto-oncogene product c-Rel bound to the CD28 response element of IL-2//Structure (Camb).- 2001.- v.9.- №8.- P.669-678.

43. Parry, G.C., Mackman, N. A set of inducible genes expressed by activated human monocytic and endothelial cells contain kappa b like sites that specifically bind c-Rel-p65 heterodimers//J. Biol. Chem.- 1994.- v.269.-№33.- P.20823-20825.

44. Chen, Y.Q., Sengchanthalangsy, L.L., Hackett, A., Ghosh, G. Nf-kappab p65 (relA) homodimer uses distinct mechanisms to recognize DNA targets//Struct. Fold. Des.- 2000.- v.8.- №4.- P.419-428.

45. Chen-Park, F.E., Huang, D.B., Noro, В., Thanos, D., Ghosh, G. The kappa В DNA sequence from the HIV long terminal repeat functions as an allosteric regulator of IIIV transcription//J. Biol. Chem.- 2002.- v. 277.- №27.- P.24701-24709.

46. Leung, Т.Н., Hoffmann, A., Baltimore, D. One nucleotide in a kappaB site can determine cofactor specificity for NF-kappaB dimmers//Cell.- 2004.- v.l 18.- №4.-P.453-464.

47. IIuang, D.B., Phelps, C.B., Fusco A.J., Ghosh, G. Crystal structure of a free kB DNA: insights into DNA recognition by transcription factor NF-kB//J. Mol. Biol.-2005.- v.346.-№l.- P.147-160.

48. Siebenlist, U., Franzoso, G., Brown, K. Structure, regulation and function of NF-kappa B//Annu.Rev.Cell.Biol.- 1994.- v.10.- P.405-455.

49. Yamamoto, Y., Gaynor, R.B. IkB kinases: key regulators of the NF-kB pathway//TRENDS in Biochemical Sciences.- 2004.- v.29.- №2.- P.72-79.

50. Verma, I.M., Stevenson, J.K.,- Schwarz, E.M., Van Antweф, D., Miyamoko, S. Rel/NF-кВЛкВ family: intimate tales of association and dissociation//Genes Dev.-1995.- v.9.- №22.- P.2723-2735.

51. Matthews, J.R., Nicholson, J., Jaffray, E., Kelly, S.M., Price, N.C., Hay, R.T. Conformational changes induced by DNA binding of NF-kB//Nuc1. Acids Res.-1995.- v.23.- №17.- P.3393-3402.

52. Muller, C.W., Rey, F.A., Sodeoka, M., Verdine, G.L., Harrison, S.C. Structure of the NF-кВ p50 homodimer bound to DNA//Nature.- 1995.- v.373.- №6512.-P.311-317.

53. Tisne, C., Delepierre, M., Hartmann, B. How NF-кВ can be attracted by its cognate DNA//J. Mol. Biol.- 1999.- v.293.- №1.- P.39-150.

54. Tisne, C., Hartmann, В., Delepierre, M. NF-kappa В binding mechanism: a nuclear magnetic resonance and modeling of a GGG—CTC mutation//Biochemistry.- 1999.- v.38.- №13.- P.3883-3894.

55. Phelps, C., Scngchanthalangsy, L.L., Malck, S., Ghosh, G. Mechanism of kB DNA binding by Rel/NF-кВ dimers//J. Biol.Chem.- 2000.- v.275.- №32.-P.24392-24399.

56. Wiithrich, K. NMR of Proteins and Nucleic Acids.- N.Y.: Wiley Interscience, 1986.-320 p.

57. Krieger, E., Dardcn, Т., Nabuurs, S.B., Finkelstein. A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: force-field parameterization in crystal space//Proteins.- 2004.- v.57.- №4.- P.678-683.

58. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями.- М.: Книжный дом "Университет", 2002.- 376 с.

59. Ivanova, T.V., Ivanov, V.N., Nadezhdina E.S. Transcription factors NF-kappaB and AP-l/c-fos in cell response to nocodazole//Membr. Cell Biol.- 2001.-v.14.-№6.- P.727-741.

60. Yanze, M.F., Lee, W.-S., Poon, K., Piquette-Miller, M., Macgregor, R.B.Jr. Cellular uptake and metabolism of DNA frayed wires//Biochemistry.- 2003.-v.42.- №39.- P.l 1427-11433.

61. Neyfakh, A.A. The membrane transport system responsible for multidrug resistance is operating in nonresistant cells//Exp. Cell. Res.- 1988.- v. 174.- №1.-P.168-178.

62. Крынецкая Н.Ф., Кубарева E.A., Тимченко M.A., Белков В.М., Шабарова З.А. Комплексы переходных металлов как ингибиторы белков, узнающих двутяжевые фрагменты нуклеиновых кислот//Биохимия.- 1998.- v.63.- №9.-С.1251-1257.

63. Laemmli, U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature.- 1970.- v.227.- №5259.- P.680-685.71.0стерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.- М.: Паука, 1981.-288 с.

64. Smith, D.B., Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione-S-transferase//Gene.- 1988.- v.67.-№1.- P.31-40.

65. Ljungquist, C., Breitholtz, A., Brink-Nilsson, II., Moks, Т., Uhlen, M., Nilsson, B. Immobilization and affinity purification of recombinant proteins using histidine peptide fusions//Eur. J. Biochem.- 1989.- v. 186.- №3.- P.563-569.

66. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal. Biochem.- 1976.- v.72.- P.248-254.