Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.18, кандидат биологических наук Марушкина, Екатерина Викторовна

• Марушкина, Екатерина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Марушкина, Екатерина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Методы исследования состояния популяций водорослей в норме и при экстремальных воздействиях.

1.1. Интегральные методы.

1.1.1. Определение общей численность клеток и анализ полученных результатов.

1.1.2. Интегральные методы оценки состояния культуры водоросли по люминесценции и флуоресценции хлорофилла.

1.2. Методы изучения гетерогенности популяции.

1.2.1. Основные подходы к объяснению гетерогенности популяции микроводорослей.

1.2.2. Изучение морфологических характеристик отдельных клеток.

1.2.3. Изучение размерной гетерогенности культур микроводорослей.

1.2.4. Изучение флуоресцентных характеристик отдельных клеток.

1.2.5. Изучение полярных характеристик клеток.

1.2.6. Дифференциальное окрашивание и плазмолитический методы.

1.2.7. Методы микро и макроколоний (методы подращивания).

1.2.8. Технические методы отбора отдельных клеток.

2. Водоросли, как тест - объект при оценках качества водной среды.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Объект исследования.

2. Техника культивирования.

3. Исследуемые показатели.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли

Scenedesmus quadricauda

1.1 Развитие культур водоросли Scenedesmus quadricauda.

1.2 Получение микрокультур водорослей.

1.3 Сопоставление развития макро- и микрокультур.

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водоросли Scenedesmns qaadricanda по выживаемости и способности клеток к делению.

2.1 Исследование методом микрокультур фракционного состава макрокультур в разные периоды роста.

2.2 Оценка наследуемости структуры микрокультур.

2.3 Исследование флуоресценции хлорофилла водорослей.

2.4. Исследование линейных размеров клеток водорослей.

3. Исследование влияния хлорида меди на выживаемость и размножение Scenedesmns quadricanda.

3.1 Влияние внесения меди на лаг-фазе роста макрокультуры.

3.2 Влияние внесения меди на экспоненциальной фазе роста макрокультуры.

3.3 Влияние внесения меди на стационарной фазе роста макрокультуры.

3.4 Влияние меди на флуоресценцию хлорофилла водорослей.

3.5 Влияние меди на линейные размеры клеток водорослей.

4. Определение времени лизиса отмирающих клеток Scenedesmus quadricauda и оценка влияния на скорость процесса присутствия токсиканта.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур»

Токсичные вещества оказывают влияние на самые разные компоненты водных биоценозов: бактерии, водоросли, простейшие, ракообразные, моллюски, рыбы и др. При этом их влияние сказывается как на уровне отдельного организма или клетки, так и на уровне всей популяции и экосистемы вцелом.

Удобным объектом изучения влияния токсичных веществ на популяционном уровне являются культуры микроводорослей. Главным образом, это связано с коротким жизненным циклом отдельных клеток, что позволяет в ходе одного опыта проследить влияние неблагоприятного фактора на нескольких поколений. Кроме того, высокая численность клеток в опыте позволяет получать массовый материал для статистических сравнений.

Особый интерес к процессам, происходящим в популяции культивируемых одноклеточных организмов, появился в 50-х годах прошлого века, когда были опубликованы работы, в которых популяцию (в первую очередь, микроорганизмов) стали рассматривать как единую систему со многими разнообразными связями; систему, которая нередко ведет себя как целостный организм. В частности, в работах Иерусалимского И.Д. (1952) отмечается, что популяции микроорганизмов даже в пределах лабораторных культур характеризуются:

1) фенотипической гетерогенностью составляющих ее клеток как основой для дифференциации клеток по социальным ролям; 2) наличием внутри популяции (например, колонии микроорганизмов) в той или иной мере обособленных микроколоний; 3) целостностью популяции в процессе развития, наличием у нее интегральных свойств, отсутствующих у индивидуальных клеток; 4) способностью популяции влиять на характеристики окружающей среды при достаточной плотности клеток в ней.

Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток (Олескин, 2001). Так в популяции микроорганизмов отмечают наличие активно делящихся, покоящихся и спонтанно автолизирующихся клеток (Уголев, 1987). Особенно четким разделение клеток на эти группы становится в стационарной фазе роста (Ждан-Пушкина, Хасанова, 1991). Гетерогенность (разнородность) клеток в популяции обеспечивает устойчивость культуры к меняющимся внешним условиям (Greenberg, 2003).

По сравнению с микроорганизмами культуры водорослей изучены слабее, но имеющиеся данные позволяют предположить наличие сложных связей и в их популяциях.

Так в культурах водорослей предполагается появление резерва покоящихся клеток, обеспечивающего выживание популяции в целом при неблагоприятном воздействии (Гапочка, 1981; Саакян, 1987). Кроме того, у водорослей была обнаружена программируемая клеточная смерть, ранее описываемая только у микроорганизмов (Segovia, 2003). Этот феномен является ярким примером социального контроля, когда в интересах популяции в целом происходит гибель отдельных клеток.

Другим примером сложности процессов, происходящих в популяции микроводорослей, является наличие у них сложной коммуникативной системы. Информация между клетками культуры может передаваться с помощью различных химических агентов, на уровне метаболитоввыделяемых клетками в среду (Кажлаева, Плеханов, Максимова, 1991); путем контактного ингибирования (Costas et al, 1993). Одним из средств передачи информации может являться кальций, входящий в состав оболочки клетки (Sanders, Brownlee, Harper, 1999). Установлена возможность передачи информации из поколения в поколение путем записи ее в клеточную мембрану (Costas, Rodas. Lopez, 1991).

Вместе с тем, малоизученными остаются вопросы о роли гетерогенности культуры в процессах ее роста и развития. Не известно, какая часть клеток в популяции участвует в процессах размножения.

Целью настоящей работы являлась исследование структурных перестроек модельной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при токсическом воздействии.

Задачами работы служило следующее:

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Scenedesmus quadricauda и наблюдения за микрокультурами;

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водорослей по выживаемости и способности отдельных клеток к делению;

3. Изучение влияния токсического воздействия на выживаемость и размножение водорослей в лабораторных популяциях;

4. Определение временив лизиса отмирающих клеток водорослей и оценка влияния на скорость лизиса присутствия токсиканта.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Гидробиология», Марушкина, Екатерина Викторовна

выводы

1. Прием раздельного культивирования клеток водоросли Scenedesmus quadricauda, называемый нами методом микрокультур, позволил оценить жизнеспособность и активность клеток в макрокультуре водоросли. В частности в культуре удалось определить относительное и абсолютное число размножающихся, покоящихся и погибающих клеток.

2. Основную часть культуры составляли клетки, находящиеся в покоящемся состоянии, особенно увеличивалась их численность в стационарной фазе роста культуры.

3. В контроле доля размножающихся клеток была сравнительно невелика, их абсолютное количество возрастало первые недели, достигая максимума к 18 суткам, с последующим снижением, в результате чего уровни размножающихся и погибающих клеток становились близкими. Фракция погибающих клеток была меньше фракции размножающихся в период с 5 по 20 сутки. Изменение скорости прироста числа клеток в ходе развития культуры происходило за счет изменения показателей рождаемости на фоне относительно постоянной смертности.

4. Внесение меди на лаг - фазе и фазе экспоненциального роста оказывало угнетающее воздействие на общую численность клеток, в целом усиливающееся с увеличением концентрацией токсиканта. При внесении меди на стационарной фазе роста эффект угнетения отмечался при концентрациях меди 0,1 и 1,0 мгСи/л. При средних концентрациях- 0,001 и 0,01 мгСи/л, напротив, происходила стимуляция процессов размножения, так что снижения общей численности клеток в культуре не происходило.

5. Наиболее сильное влияние на фракционный состав культур медь оказывала при внесении ее на экспоненциальной фазе, когда в популяции был велик процент более чувствительных размножающихся клеток. В начале эксперимента при всех концентрациях здесь происходила полная остановка процессов размножения и некоторое усиление процессов отмирания и только через 2 недели было отмечено некоторое восстановление культуры.

6. При внесении меди на лаг-фазе и фазе стационарного роста хлорид меди, главным образом, оказывал угнетающее воздействие на процессы размножения клеток, а начиная с концентрации 0,001 мгСи/л происходило еще и увеличение смертности клеток.

7. Время лизиса клеток в контроле оказалось малым по сравнению с длительностью жизненного цикла клеток (2-3 часа), а при добавлении меди в концентрации 1,0 мгСи/л возрастало до 3-6 суток. Таким образом, высокие концентрации токсиканта вызывали накопление мертвых клеток в культуре, а высокая доля мертвых клеток в макрокультуре, определенная с помощью люминесцентных методов, была связана не только с возрастанием смертности клеток, но и с замедлением процессов их лизиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования продемонстрировали важную роль покоящихся клеток в жизни популяции Scenedesmus quadricauda. Оказалось, что в разные моменты существования культуры их доля составляет от 40 до 80 %. Таким образом, рост и развитие культуры определяются достаточно небольшим количеством клеток ответственных за размножение, остальная же часть только поддерживает существование популяции. В отличие от бактерий и синезеленых водорослей, где покоящиеся клетки являются особыми устойчивыми формами с пониженной физиологической активностью и служат, главным образом, для выживания при наступлении неблагоприятных условий, у Scenedesmus quadricauda покоящиеся клетки достаточно активно фотосинтезируют. Это позволяет предположить, что их существование в культуре не связано исключительно с задачей выживания, а необходимо для развития культуры в нормальных условиях.

По мере роста культуры и перехода ее в стационарную фазу доля покоящихся клеток в ней возрастает. При этом при пересадке ценобия в камеру количество среды и света, приходящееся на один ценобий, увеличивается, однако, это не приводит к усилению размножения. Это свидетельствует о том, что торможение процессов деления клеток в этот момент связано не с автозатенением, а с какими-то метаболическими процессами в самих клетках или накоплением метаболитов в среде. Следует отметить, что в опытах с микроколониями хлореллы (Аникеева, Ваулина, Шевченко, 1964), где при переносе клеток на агар полностью снималось влияние накопленных в среде метаболитов, доля покоящихся клеток не превышала 5%. Это может являться косвенным свидетельством важной роли веществ, накапливаемых в среде, в переходе клеток к состоянию покоя.

Покоящиеся клетки не являются глубоко законсервированной системой. При слабых неблагоприятных воздействиях, когда возможность восстановление культуры зависит от скорости нарастания численности клеток в ней, они способны перейти к размножению. Примером такой ситуации может служить двукратное увеличение доли размножающихся клеток по сравнению с контролем в стационарной фазе при внесении средних концентраций хлорида меди (0,001 и 0,01 мгСи/л).

Существование культуры и ее рост при небольшой доле размножающихся клеток возможны только на фоне медленно текущих процессов отмирания. В экспериментах было продемонстрировано, что в контроле количество отмирающих клеток не превышает 10% в сутки (в периоды активного роста культуры около этот показатель опускается до 3%).

Метод микрокультур позволил разделить и рассмотреть отдельно три процесса, которые определяют общую численность клеток в культуре в конкретный момент времени: размножение, отмирание и лизис отмерших клеток.

Оказалось, что в контроле смертность клеток остается примерно на одном уровне в ходе всего роста культуры. Это означает, что главным процессом, определяющим динамику развития популяции, является размножение, а изменение скорости прироста популяции связано с изменениями в процессах рождаемости. В стационарной фазе, когда рост культуры замедляется, происходит ослабление процессов размножения, а не усиление гибели клеток.

Возможность раздельного рассмотрения процессов размножения и отмирания клеток особо важна при оценках токсичности загрязняющих веществ. Дело в том, что угнетение культуры и более низкая численность клеток по сравнению с контролем может быть связана, как с усилением процесса гибели клеток, так и с подавлением размножения.

Исследования показали, что первой реакцией культуры на токсикант является, обычно, снижение доли размножающихся клеток и их переход в покоящееся состояние. И лишь при усилении уровня токсического воздействия происходит возрастание смертности клеток. В опытах с длительной экспозицией показано, что при восстановлении культуры, в первую очередь, таюке происходит снижение смертности клеток и лишь при низких концентрациях токсичных веществ идет некоторое восстановление процессов размножения. Это свидетельствует о том, что размножение является наиболее чувствительным к неблагоприятным воздействиям процессом. Вероятно, именно с этим связана более низкая устойчивость культуры в фазе экспоненциального роста, отмеченная в наших экспериментах, когда процесс размножения в момент внесения токсиканта шел наиболее активно.

При оценке смертности клеток в культуре встает вопрос о времени лизиса отмерших клеток. Дело в том, что количество погибших клеток, оцениваемое с помощью люминесцентной микроскопии, зависит от того за какой период проходит их разрушение. При условии высокой скорости лизиса (порядка нескольких часов), которое наблюдается в контроле и при низких дозах хлорида меди, процессы отмирания и разрушения клеток оказываются сбалансированными и доля мертвых клеток остается на одном невысоком уровне. При замедлении лизиса в присутствии высоких доз хлорида меди (1 мгСи/л) количество погибших клеток в культуре постоянно возрастает, достигая к концу эксперимента 65% от общей численности клеток. При этом реальная смертность клеток в культуре не увеличивается, и к концу эксперимента соответствует контрольным значениям. Причиной замедления лизиса может быть ингибирование процесса автолизиса, так и угнетение активности сопутствующей микрофлоры, обеспечивающей утилизацию погибших клеток.

Таким образом, метод микрокультур позволил рассмотреть популяционные процессы связанные с гибелью и размножением клеток в процессе роста культуры в норме и при воздействии хлорида меди.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Марушкина, Екатерина Викторовна, 2005 год

1. Аль-Сальман И.М. (1988). Исследование влияния Zn, Cd, Со и сульфатного засоления на зеленые водоросли. -Дисс. . канд. биол. наук. М.- 74с.

2. Андреева В.М. (1975). Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. Л.: Наука. - 110 с.

3. Аникеева И.Д., Ваулина Э.Н., Шевченко В.А. (1964). Действие УФ лучей на хлореллу// Радиобиология. 4, N 6.- С. 883—892.

4. Артюхова В.И., Дмитриева А.Г., Филенко О.Ф., Чжао Цзюнь (1996). Влияние бихромата калия на динамику культуры и размеры клеток Scenedesmus quadricauda (Тигр.) в различные сезоны года// Альгология. 6, N 1.- С. 26—35.

5. Багоцкий С.В., Санин М.В., Эйнор Л.О. (1992). Пестициды и их воздействие на водные экосистемы: Обзорная информация. М.: ВНИИТЭИагропром. 48 с.

6. Барашков Г.К., Киристаева Н.М. (1977). Токсичность соединений меди для Chlorella pirenoidosa// Гидробиолог, журнал. 13, N 4.- С. 92—94.

7. Белевич Т. А. Динамика биомассы и функциональные характеристики морских планктонных водорослей при воздействии кадмия. Дисс. . канд. биол. наук. М. -106с.

8. Белянин В.Н., Сидько Ф.Я., Тренкенису А.П. (1980) Энергетика фотосинтезтирующей культуры микроводорослей. Новосибирск: Наука. 136 с.

9. Бигон М., Харпер Дж., Таундсенд К. (1989). Экология. Особи, популяции и сообщества (в 2-х томах).- М.: Мир.-. 477 с.

10. Божков А.И. (1997). К вопросу о факторах, влияющих на токсичность сернокислой меди для Dunaliella vulgaris// Альгология. 7, N 3,- С. 251—261.

11. Брагинский Л.П., Величко И.М., Щербань Э.П. (1987). Пресноводный планктон в токсической среде.- Киев.: Наукова думка,- 180 с.

12. Васильев И.Р., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. (1988). Метод биотестирования природных вод по замедленной флуоресценции микроводорослей//Методы биотестирования вод. Черноголовка. С.23—26.

13. Васильева Т.В. (1988). Токсико-генетическая оценка качества водной среды с использованием альготестов (на хлорелле). Дисс. . канд. биол. наук.- Одесса.- 149с.

14. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Власенко В.В. (1990). Вариабильность как тест перехода клетки в состояние стресса в условиях интоксикации// Физиология растений. 37, N 4,- С. 733—738.

15. Веселовский В.А. (1990). Структурно-функциональные изменения мембран растительной клетки при адаптации к повреждающим воздействиям. Дисс. . докт. биол. наук.- М.- 155с.

16. Веселовский В.А., Веселова Т.В. (1990). Люминесценция растений,- М.: Наука,- 201с.

17. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Дмитриева А.Г., Маренков B.C. (1987) Биотестирование природных вод при помощи полевого портативного флуориметра//Методы биоиндикации и биотестирования природных вод.-Л.:Гидрометеоиздат,- С.58-63.

18. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1962). Интенсивная культура одноклеточных водорослей.- М.: Изд-во АН СССР.- 59 с.

19. Водоросли. Справочник (1989)/Вассер С.П., Кондратьева Н.В., Масюк Н.П. и др.- Киев: Наукова думка.- 608 с.

20. Гаврилова О.В., Рудакова Е.Е. (2001). Влияние спектрального состава света на морфогенез коккоидных зеленых водорослей (Chlorophyta)// Альгология. И, N 2.- С. 165—175.

21. Тапочка JI.Д. (1981). Об адаптации водорослей,- М.: Изд-во МГУ.- 80 с.

22. Галочка Л.Д. (1994). Популяционные аспекты устойчивости цианобактерий и микроводорослей к токсичечкому фактору. Дисс. . докт. биол. наук.- М.- 155с.

23. Герасименко Л.М. (1974) Специфика морфологических изменений некоторых водорослей в процессе их роста и развития в синхронных культурах. Автореф. дисс. . канд. биол. наук,- М,- 21с.

24. Гильяно Н.Я., Малиновский О. В. (1980). Go-фаза в клеточном цикл/Надежность клеток и тканей.- Киев: Наукова думка.- С.99—106.

25. Горовец В.К. (1976) Зеленые водоросли.- Минск: Изд-во БГУ.- 80 с.

26. Горюнова С.В. (1952). Применение метода люминесцентной микроскопии для распознания живых и мертвых клеток водорослей// Труды ин-та микробиологии АН СССР. вып. 2.- С. 64—78.

27. Горюнова С.В. (1956). Техника применения метода люминесцентной микроскопии для гидробиологических исследований// Жизнь пресных вод СССР.- М.-Л.:Изд-во АН СССР,- 101 с.

28. Горюнова С.В., Герасименко Л.М., Пушева М.А. (1980). Роль нуклеопептидов в клеточном делении водорослей.-. М.: Наука.- 198 с.

29. Гродзинский Д.М. (1983). Надежность растительных систем.- Киев: Наукова думка.- 365 с.

30. Гудков И.Н. (1977). Гетерогенность образовательных тканей высших растений и ее роль в радиочувствительности/Системы надежности клетки. -ЬСиев.: Наукова думка.- С. 118—136.

31. Дмитриева А.Г. (1988). Метод биотестирования по определению живых и мертвых клеток водорослей с помощью люминесцентной микроскопии//Методы биотестирования вод. Черноголовка. С.85—89.35,3637,3839,40