Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Мишина, Наталия Михайловна

• Мишина, Наталия Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мишина, Наталия Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА, КАК УЧАСТНИКИ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

1.1. История

1.2. Источники АФК в клетке

1.3. Сигнальные функции АФК

1.4. Пероксид водорода как сигнальная молекула

Продукция пероксида водорода

Механизм передачи сигнала с помощью Н

Модификация тиоловых остатков

Деградация Н

И. ИАБРН-ОКСИДАЗЫ: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

II. 1. История открытия КАОРН-оксидаз

2. Строение и активация КАБРН-оксидазы на примере КАБРН- ^ оксидазы фагоцитов (N0x2)

Строение N0x

Активация N0x

П.З. Представители семейства Кох, доменная структура и общие принципы активации

П.4. Физиологическая роль Кох-белков

11.5. Кох-белки и заболевания

III. КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ С УЧАСТИЕМ АФК

III. 1. Компартментализация за счет кинетических и диффузионных ограничений

III. 2. Компартментализация за счет специфической локализации ^ источника: локализация КАБРН-оксидаз

Локализация КАБРН-оксидаз, участвующих в процессе ^ направленного движения клетки

Кавеолы/липидные рафты

Эндосомы

Эндоплазматический ретикулум

IV. МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ Н202 В КЛЕТКАХ

IV. 1. Детекция внутриклеточного Н202 с помощью 5-(и 6-) -хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцииндиацетата (СМ-ОСРН-ОА)

IV.2. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью Регоху Green 1 и Peroxy Crimson

IV.3. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью SKAP-tag

Г/.4. Визуализация Н202 с помощью генетически кодируемых редокс-чувствительных флуоресцентных белков roGFP и roGFP гоСРР-Огр

НуРег

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

ГЛАВА II: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1 МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

II. 1.1. Оборудование

II .1.2. Материалы

Реактивы

Ферменты для молекулярного клонирования и метериалы для ПЦР

Векторы

Буферные растворы

Бактериальные штаммы и среды

Ростовые факторы и микросферы

Ингибиторы Р13-киназы и КАБРН-оксидазы

Клеточные линии и среды

Материалы для конфокальной и флуоресцентной микроскопии

П.2. МЕТОДЫ

П.2.1. Молекулярное клонирование

Амплификация ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Выделение плазмидной ДНК

Рестрикция и лигирование

Очистка ДНК

Направленный мутагенез кодирующей последовательности ДНК

Трансформация компетентных клеток Е. coli

Определение нуклеотидной последовательности ДНК 62 1122. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих белкислияния

И.2.3. Культура эукариотических клеток

Эукариотические клетки

Трансфекция эукариотических клеток

И.2.4. Микроскопия

Подготовка клеток к эксперименту

Конфокальная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия клеток

Обработка полученных изображений

ГЛАВА III: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. ДИНАМИКА ПРОДУКЦИИ Н202 В ОТДЕЛЬНЫХ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КОМПАРТМЕНТАХ В ПРОЦЕССЕ 68 АКТИВАЦИИ ТИРОЗИНКИНАЗНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

III. 1.1. Исследование динамики продукции Н202 вблизи ПМ и эндосом ^ ^ при активации ТКР в живой клетке

Создание сенсора ЕвРІІ-НуРег

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка ЕОРЯ-НуРег в клетках линии НеЬа-КуоШ

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка РООРЯ-НуРег в клетках линии МН-ЗТЗ

III. 1.2. Динамика продукции Н202 вблизи мембраны ЭПР при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и МН-ЗТЗ

Ш.2. СОЗДАНИЕ ИНДИКАТОРА ДЛЯ МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ.

Ш.2.2 Многопараметрическое исследование с помощью биосенсора ЕЙкРН-Е41 К-НуРег в живой клетке

Активация Р1-ЗК и продукция Н202 в клетках МН-ЗТЗ при активации РБОРЯ

Активация Р1-ЗК и продукция Н202 в ТН-лимфоцитах при активации ТСЯ

Создание сенсора РОвРЯ-НуРег

Создание сенсора НуРег-ТА

Ш.2.1. Создание и оптимизирование «двойного» индикатора

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов»

За последние годы представления о роли активных форм кислорода (АФК) в регуляции внутриклеточных процессов существенно расширились. Показано участие АФК в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки и экспрессии генов. АФК играют важную роль в таких процессах, как иммунные реакции, эмбриогенез, разнообразные патологии на организменном уровне.

Основным источником АФК в клетке являются трансмембранные ферментативные комплексы - КАБРН-оксидазы. Так известно, что при стимуляции тирозинкиназных рецепторов происходит активация КАБРН-оксидазы, которая продуцирует супероксид-анион и как следствие пероксид водорода (Н202).

Из всех АФК только Н202 обладает всеми необходимыми свойствами для выполнения функции вторичного мессенджера. Так, Н202 относительно стабилен по сравнению с другими АФК, благодаря маленьким размерам и отсутствию полярности Н202 способен легко диффундировать во внутриклеточной среде, в том числе сквозь липидные бислои. Н202 играет роль внутриклеточного вторичного мессенджера, действуя путем специфичного обратимого окисления небольшого числа активных тиоловых групп в остатках цистеинов тирозиновых фосфатаз и других белков-регуляторов процессов внутриклеточной передачи сигнала.

Предполагают, что внутриклеточные сигнальные эффекты Н202 осуществляются в соответствии с моделью компартментализованной окислительно-восстановительной передачи сигнала, когда белок-мишень и источник Н202 находятся в непосредственной близости друг от друга. Действительно, в настоящий момент известны специфические сайты локализации ИАОРН-оксидаз и их регуляторных белков в различных внутриклеточных компартментах, а также важное значение таких сайтов для процессов клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки. Однако до сих пор не удавалось визуализировать локальную продукцию Н202 в клетке и выявить внутриклеточные мембранные компартменты, ответственные за продукцию Н202 при активации сигнальных каскадов.

Изучение динамики и локализации продукции Н202 в ходе разнообразных клеточных процессов представлялось невозможным до недавнего времени. Благодаря появлению в арсенале генетически кодируемых сенсоров на основе флуоресцентных белков стало возможным проводить исследования сигнальной роли Н202 на уровне индивидуальных живых клеток. По сравнению с химически синтезированными флуоресцентными красителями, генетически кодируемые сенсоры имеют ряд преимуществ. Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции; использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить подобные индикаторы в различные компартменты живой клетки; также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие генетически кодируемые сенсоры в определенных тканях в определенный период времени. Особый научно-практический интерес представляет собой возможность использования таких индикаторов для изучения внутриклеточной локальной продукции и динамики изменения концентрации Н202, что не удавалось исследовать с помощью химических индикаторов.

Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием Н202 разработка новых подходов использования генетически кодируемых индикаторов представляется актуальной задачей. Не менее важным является изучение базовых принципов организации окислительно-восстановительной передачи сигнала в клетке.

Продукция Н202 специализированными ферментативными системами является частью сложных сигнальных каскадов, в которых задействовано множество ферментов и вторичных мессенджеров. Так, например, окислительно-восстановительная передача сигнала тесно взаимосвязана с продукцией липидных мессенджеров - фосфорилированных форм фосфатидилинозитола. Поэтому важной задачей является разработка методов одновременной регистрации активностей нескольких сигнальных систем в одной клетке.

Нарушения нормальной внутриклеточной продукции Н202 связаны с тяжелыми нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, с патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного Н202 в клеточных процессах важно как для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала, так и для биомедицинских исследований.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мишина, Наталия Михайловна

Выводы

1. На основе биосенсора НуРег созданы локализованные флуоресцентные индикаторы РБСРЯ-НуРег, ЕвРЯ-НуРег и НуРег-ТА для детекции Н2О2 в близком окружении рецепторов РБОРЯ и ЕвРЯ, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума.

2. С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н2О2 в клетке в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов. Установлено, что в клетках эпителиальной линии НеЬа-Куо1о продукция Н2О2 происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии МН-ЗТЗ продукция Н202 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н202.

3. Диффузия Н2Ог в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1-2 МКМ, ТО есть мишенью Н2О2 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

4. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор В1кРН-Е41К-НуРег для одновременной детекции Н202 и активности фосфатидилинозитол-З'-киназы. На клетках линии ШН-ЗТЗ продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием В1кРН-Е41 К-НуРег впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукция Н2О2 в области иммунологического синапса в СБ4+ Тн-лимфоцитах.

Заключение

В настоящей работе предложен новый подход к исследованию распределения и динамики изменения концентрации Н202 в различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки с помощью локализованных вариантов белка-индикатора НуРег.

С помощью индикатора ЕОРЯ-НуРег в стимулированных эпидермальным ростовым фактором клетках НеЬа-КуоШ впервые было показано, что значительная продукция Н202 происходит на эндосомах, а не на плазматической мембране. Таким образом, эндосомы, содержащие интернализованный ЕвРЯ и продуцирующие Н202, играют важную роль в поддержании каскада фосфорилирования: активный рецептор фосфорилирует субстраты, а продуцирующийся здесь же Н202 ингибирует РТР, создавая, таким образом, петлю положительной обратной связи. Кроме того, использование ЕОРЯ-НуРег позволило определить, что в цитоплазме клеток свободная диффузия Н202 в значительной степени ограничена (до 1-2 мкм).

В фибробластах линии МН-ЗТЗ с помощью индикатора РБОРЯ-НуРег была показана продукция Н202, локализованная преимущественно на плазматической мембране. В отличие от клеток НеЬа-КуоШ, активация ЫА1)РН-оксидаз на плазматической мембране в фибробластах свидетельствует о возможных внеклеточных мишенях Н202, продуцируемого в ответ на активацию РБвРЯ.

С помощью индикатора НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и ШН-ЗТЗ была показана продукция Н202, быстро активирующаяся на эндоплазматическом ретикулуме в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов. Такой быстрый рост концентрации Н202 на эндоплазматическом ретикулуме сразу после стимуляции клеток может быть необходим для немедленного ингибирования фосфатазы РТР-1В на мембране эндоплазматического ретикулума. Окисление НуРег-ТА после активации и ЕвРЯ и РБОРЯ может служить моделью для изучения роли ингибирования РТР-1В пероксидом водорода.

Таким образом, используя данный подход, удалось впервые визуализировать локальную продукцию Н202 в индивидуальных живых клетках в ответ на физиологическую стимуляцию ростовыми факторами. Полученные данные подтверждают гипотезу о компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации, а также позволяют лучше понять роль Н202 в клетках в нормальном физиологическом состоянии.

Для исследования взаимосвязи продукции Н202 и активации Р1-ЗК был создан «двойной» индикатор В1кРН-Е41К-НуРег, позволяющий одновременно следить за изменением концентраций Н202 и фосфатидилинозитол-3,4,5-фосфата. Тестирование работы индикатора в фибробластах МН-ЗТЗ в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов показало возможность одновременной детекции продукции Н2О2 и Р1Р3. В СБ4+ Тн-лимфоцитах с помощью В1кРН-Е41 К-НуРег удалось впервые показать локальную активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукцию Н2О2 в области иммунологического синапса. Важно заметить, что преимуществом «двойного» индикатора является возможность использования всего одной экспрессионной конструкции для детекции двух параметров в клетке. Другим очевидным преимуществом является то, что спектральные свойства В1кРН-Е41 К-Нурег позволяют одновременно независимо наблюдать также за другими флуоресцентными белками, которые имеют спектр, неперекрывающийся со спектром белка НуРег, что позволяет добавить еще один параметр для исследования в той же клетке.

Полученный индикатор В1кРН-Е41 К-НуРег может быть использован как прототип для создания других подобных индикаторов с комбинированными свойствами. Подобные многопараметрические генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы могут быть востребованы в широком круге задач системной биологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мишина, Наталия Михайловна, 2011 год

1. Commoner B, Townsend J & Pake GE (1954) Free radicals in biological materials. Nature174,689-91.

2. Boveris A & Chance B (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Generalproperties and effect of hyperbaric oxygen. The Biochemical journal 134,707-16.

3. Mills GC (1957) Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzymewhich protects hemoglobin from oxidative breakdown. The Journal of biological chemistry 229, 189-97.

4. McCord JM & Fridovich I (1969) Superoxide dismutase. An enzymic function forerythrocuprein (hemocuprein). The Journal of biological chemistry 244,6049-55.

5. Sbarra AJ & Karnovsky ML (1959) The biochemical basis of phagocytosis. I. Metabolicchanges during the ingestion of particles by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of biological chemistry 234,1355-62.

6. Rossi F & Zatti M (1964) Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclearleucocytes. NADH and NADPH oxidation by the granules of resting and phagocytizing cells. Experientia 20,21-3.

7. Klebanoff SJ (1970) Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intactleukocytes. Science (New York, N.Y.) 169,1095-7.

8. Quie PG, White JG, Holmes B & Good RA (1967) In vitro bactericidal capacity of humanpolymorphonuclear leukocytes: diminished activity in chronic granulomatous disease of childhood. The Journal of clinical investigation 46,668-79.

9. Holmes B, Page AR & Good RA (1967) Studies of the metabolic activity of leukocytes frompatients with a genetic abnormality of phagocytic function. The Journal of clinical investigation 46,1422-32.

10. Segal AW, Jones OT, Webster D & Allison AC (1978) Absence of a newly describedcytochrome b from neutrophils of patients with chronic granulomatous disease. Lancet 2, 446-9.

11. Segal AW & Jones OT (1978) Novel cytochrome b system in phagocytic vacuoles of humangranulocytes. Nature 276, 515-7.

12. Royer-Pokora B, Kunkel LM, Monaco AP, Goff SC, Newburger PE, Baehner RL, Cole FS,

13. Curnutte JT & Orkin SH (1986) Cloning the gene for an inherited human disorder-chronic granulomatous disease-on the basis of its chromosomal location. Nature 322,32-8.

14. Czech MP (1976) Differential effects of sulfhydryl reagents on activation and deactivation ofthe fat cell hexose transport system. The Journal of biological chemistry 251,1164-70.

15. Mukherjee SP, Lane RH & Lynn WS (1978) Endogenous hydrogen peroxide andperoxidative metabolism in adipocytes in response to insulin and sulfhydryl reagents. Biochemical pharmacology 27, 2589-94.15