Исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной Na,K-АТФазой, из почек сусликов Spermophilus undulatus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Басевич, Евгений Викторович

• Басевич, Евгений Викторович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Басевич, Евгений Викторович

I. Введение.

II. Обзор литературы

И. 1. Гибериация млекопитающих

II. 1.1. Отличительные особенности зимней спячки млекопитающих.

II.1.2. Внешние причины, вызывающие зимнюю спячку.

II .1.3. Энергетика зимней спячки млекопитающих.

II. 1.4. Годичный цикл гибернирующих млекопитающих.

II. 1.5. Стадии гибернации млекопитающих.

II. 1.6. Сезонные изменения, происходящие в органах и тканях животных-гибернаторов.

11.1.7. Регуляция активности ферментов при гибернации.

11.2. Ка,К-аденозинтрифосфатаза

11.2.1. Общая характеристика Na,К-АТФазы.

11.2.2. Структурная организация Na,К-АТФазы.

11.2.3. Изоформы субъединиц Na,К-АТФазы.

11.2.4. Na,K-ATOa3a почек: функции, локализация в сегментах нефронов и субпопуляции.

11.2.5. Регуляция активности Na,К-АТФазы.

11.2.6. Регуляция Na,К-АТФазы посредством фосфорилирования.

11.2.1. Глутатионилирование Na,К-АТФазы.

11.2.8. Белки, взаимодействующие с №,К-АТФазой.

11.2.9. Ингибиторы Na,К-АТФазы.

11.2.10. Влияние липидного окружения на функционирование транспортных АТФаз.

11.2.11. Олигомерная организация транспортных АТФаз.

11.2.12. Липидные микродомены (рафты) и локализация Na,K-АТФазы в плазматической мембране.

11.3. Функционирование Na,К-АТФазы в почках животных-гибернаторов (история исследований).

III. Материалы и методы

III. 1. Экспериментальные животные.

III.2. Получение микросомальных фракций.

111.3. Определение концентрации белка.

111.4. Регистрация АТФазной активности в сопряженной системе.

111.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

111.6. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.

111.7. Анализ агрегации микросомалытых белков методом ковалентных сшивок.

III. 8. Определение нативного уровня фосфорилирования белков с использованием флуоресцентного красителя Pro-Q Diamond.

111.9. Авторадиография фосфорилированных эндогенными протеинкиназами белков.

111.10. Идентификация белков методом масс-спектрометрии.

III. 11. Определение жирнокислотного состава липидов и холестерина в микросомах методом масс-спектрометрии.

III. 12. Анализ структурного состояния липидной фазы микросом методом электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов.

III. 13. Анализ свойств микросомальных мембран методом флуоресцентной спектроскопии гидрофобных зондов.

111.14. Материалы.

III. 15. Математическая обработка полученных результатов.

III. 16. Программное обеспечение.

IV. Результаты и их обсуждение

IV. 1. Характеристика микросомальных препаратов из почек сусликов.

IV.2. Сезонные изменения АТФазной активности в препаратах микросом из почек сусликов.

IV.3. Содержание Na,K-ATOa3bi в микросомальных фракциях из почек сусликов.

IV.4. Ингибирование уабаином Na,K-ATOa3bi в препаратах, выделенных из почек сусликов.

IV.5. Посттрансляционные модификации белков микросомальных фракций из почек сусликов.

IV.6. Состав липидной фазы микросомальных мембран из почек сусликов.

IV.7. Структурное состояние липидной фазы микросом из почек сусликов, оцененные с помощью спиновых и флуоресцентных зондов.

IV.8. Олигомерное состояние Na,K-ATOa3bi в микросомах из почек сусликов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Басевич, Евгений Викторович

VI. выводы

1. Проведен сравнительный анализ микросомальных препаратов, обогащенных Ка,К-АТФазой, из почек активных и спящих сусликов.

2. Активность ИаД-АТФазы при гибернации снижается в 1,8-2,0 раза в диапазоне температур от 15 до 37°С. При более низких температурах различия менее выражены.

3. В препаратах присутствует только а1-изоформа каталитической субъединицы Ыа,К-АТФазы, содержание которой при гибернации уменьшается на 25%. Чувствительность фермента к уабаину во время спячки не изменяется.

4. Не выявлено глутатионилирования а-субъединицы №,К-АТФазы и сезонного изменения уровня ее фосфорилирования.

5. Содержание холестерина в препаратах увеличивается при гибернации в 1,9 раза. Содержание белка, степень ненасыщенности жирных кислот липидов и структурное состояние липидной фазы мембран во время спячки не изменяются.

6. При гибернации ИаД-АТФаза в мембранах находится в более агрегированном состоянии.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изложенные в настоящей работе результаты оригинальных исследований позволяют сделать несколько заключений и ряд предположений. При попытке разобраться в противоречивых данных литературы по сезонным изменениям активности №,К-АТФазы из почек зимоспящих животных [Fang, Willis, 1974; Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995; McDonald, Storey, 1999] установлено на примере фермента из наружной медуллы почек сусликов, что при гибернации активность Ка,К-АТФазы (при 37°С) падает почти в 2 раза (р<0,00001).

Сезонное снижение активности Ыа,К-АТФазы из почек сусликов не связано с фосфорилированием или глутатионилированием молекул этого фермента и не является следствием изменения свойств и структуры мембран, несмотря на почти двукратное увеличение при гибернации содержания холестерина в микросомах, который, по-видимому, находится в рафтах [Simons, Ikonen, 1997]. Согласно полученным данным, основными причинами сезонного снижения активности натриевого насоса из почек сусликов является его более агрегированное состояние во время зимней спячки наряду с некоторым уменьшением содержания фермента в микросомах.

Иммунохимическое окрашивание а-субъединицы №,К-АТФазы (наиболее доступный и прямой метод сравнительной оценки количества фермента в препаратах) показало, что в микросомальных фракциях из почек сусликов содержание натриевого насоса уменьшается лишь на 25%. Полученный результат не согласуется с данными работ, авторы которых объясняли более чем двукратное падение при гибернации активности Na,K-ATOa3bi (при 37°С) из почек зимоспящих животных именно пропорциональным снижением содержания фермента в препаратах [Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995]. К такому выводу исследователи пришли, установив, что отношение количества связавшегося [3Н]уабаина к активности №,К-АТФазы для препаратов из почек активных и спящих животных достоверно не различается. Однако нужно отметить, что в этих работах не применялись каналообразователи или детергенты, необходимые для обеспечения проницаемости лигандов внутрь замкнутых везикул [Walter, 1975; Jorgensen, Skou, 1971; Besch et al., 1977; Bonnafous et al., 1979], составляющих значительную часть (~75%) микросомальных препаратов плазматических мембран [Walter, 1975]. Применение подобных веществ принципиально важно, поскольку в молекуле ИаД-АТФазы центры связывания АТФ и уабаина расположены по разные стороны мембраны, из-за чего в замкнутых везикулах только один тип центров связывания (субстрата или ингибитора) доступен для присутствующих в среде инкубации лигандов (АТФ, уабаина).

В настоящей работе определение активности Na, К-АТФ азы проводили в присутствии каналообразователя аламетицина. Добавление данного ионофора в установленной оптимальной концентрации увеличивало активность Na,K-АТФазы при 37°С из почек активных сусликов в -3,2 раза. Это означает, что в данных препаратах значительная часть фермента (—70%) была неактивна и, по-видимому, находилась в замкнутых везикулах. Этот результат хорошо согласуется с упоминавшимися выше данными литературы о доле замкнутых везикул (-75%) в микросомальных препаратах, полученных из почек морских свинок, не способных гибернировать [Walter, 1975]. Однако в препаратах из почек спящих сусликов, находящихся в состоянии гипотермии, активность №,К-АТФазы в присутствии аламетицина увеличивалась лишь в 1,9 раза, притом что в отсутствие ионофора базовая активность Na, К-АТФ азы при 37°С в препаратах микросом из почек как активных, так и спящих сусликов не различалась (р=0,2).

Согласно общепринятым представлениям, базовая активность Na,K-АТФазы (в отсутствие активаторов) принадлежит ферменту, находящемуся в «разорванных» (поврежденных) мембранах [Walter, 1975], в которых также может быть нарушена и организация белков. Одинаковый уровень базовой активности в препаратах из почек активных и спящих сусликов может свидетельствовать о том, что микросомы в них повреждены в равной степени. Это неудивительно, так как использовался общий метод выделения.

Латентная» же активность обусловлена АТФазой, находящейся в нормальных неповрежденных мембранах. Однако, как установлено, при гибернации наблюдается агрегация Ка,К-АТФазы, приводящая, по всей видимости, к ингибированию фермента. Поэтому логично предположить, что и при добавлении аламетицина активность таких агрегированных молекул остается скрытой, что выражается в меньшем активационном эффекте ионофора в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами из почек активных животных.

При определении температурной зависимости активности №,К-АТФазы в препаратах из почек сусликов (в присутствии аламетицина) установлено, что активность фермента при гибернации ниже в 1,8-2,0 раза в диапазоне температур от 15° до 37°С (р<0,0005). Однако при более низких температурах различия менее выражены (р<0,05), а при температурах ниже 10°С становятся недостоверными (р>0,5). Это сказывается на характере графиков Аррениуса для активности №,К-АТФазы из почек сусликов при температурах выше и ниже критической (18-20°С), при которой наблюдается перегиб. Аномалии в области 20°С отмечены также на графиках Аррениуса для параметра порядка 5, определенного по ЭПР-спектрам спинового зонда 5-доксилстеарата, и на графиках Аррениуса для степени эксимеризации флуоресцентного зонда пирена в общих и аннулярных липидах мембран микросом из почек сусликов. Это согласуется с общепринятыми взглядами о связи между изменениями свойств интегральных ферментов и структурными перестройками мембранных липидов в критической области температур [СпзЬаш, Вашей, 1973; СЬагпоск й а1., 1973; Клте1Ьег& РараЬафроЫоб, 1974; ВоПугеу а1., 1977; ВоМугеу & а1., 1982].

При температурах выше критической (~20°С) графики Аррениуса практически параллельны, то есть энергия активации №,К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов в этих условиях существенно не различается (11,2— 11,8 ккал/моль). При падении температуры с критической отметки (~20°С) до крайней точки температурной зависимости (2,5°С) сезонные различия в активности №,К-АТФазы становятся менее выраженными. Это находит отражение на характере графиков Аррениуса, наклон которых в данной области температур заметно различается. Рассчитано, что при температурах ниже критической энергия активации №,К-АТФазы в препаратах из почек спящих сусликов примерно на 7 ккал/моль меньше по сравнению с препаратами из почек активных животных (27,9 и 35,0 ккал/моль соответственно). По-видимому, такое изменение свойств фермента позволяет натриевому насосу быстрее включиться в работу почек при повышении температуры тела пробуждающихся сусликов, которым необходимо быстро восстановить гомеостаз.

Установленный вид графиков Аррениуса для активности ]^а,К-АТФазы из почек сусликов можно объяснить температурной зависимостью процесса агрегации натриевого насоса, происходящего в мембранах микросом. Повидимому, в крайней точке температурной зависимости (2,5°С) активность

Иа,К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов находится на минимальном уровне, поскольку почти все молекулы фермента агрегированы и заингибированы в результате латерального разделения и кластеризации липидов, индуцированных низкой температурой [Ивков, Берестовский, 1982; Болдырев и др., 1985; Гулевский и др., 1990]. С повышением температуры до ~20°С влияние температуры на организацию липидов и белков в мембране, вероятно, снижается. Однако с ростом температуры в препаратах из почек спящих сусликов степень олигомеризации, видимо, снижается не так интенсивно, как в препаратах из почек активных сусликов. Вероятно, часть молекул натриевого насоса при гибернации организуется в особо прочные агрегаты (сохраняющие такую структуру в процессе выделения) [Skriver et al., 1980]. Скорее всего, такое состояние молекул фермента особым образом закрепляется, в чем может принимать участие примембранный цитоскелет, с которым посредством ряда белков способна взаимодействовать Na,K-ATOa3a [Kraemer et al., 1990; Devarajan et al., 1994; Manunta et al., 1998; Zhang et al., 1998; Батрукова и др., 2000; Lee et al., 2001; Kraemer et al., 2003]. Такое предположение о стабильной агрегации фермента при гибернации подтверждается полученными в настоящей работе данными, согласно которым №,К-АТФаза из почек спящих сусликов находится в более агрегированном состоянии по сравнению с препаратами из почек активных животных. Достижение температурной отметки в ~20°С сопровождается изменениями в организации мембран (например, распадаются кластеры и нарушается латеральное разделение лигсидов), в результате чего исчезает влияние со стороны липидного бислоя на организацию молекул натриевого насоса. Подтверждением этого служит характер графиков Аррениуса при температурах выше критической, линии которых в таких условиях параллельны.

Таким образом, основной причиной падения активности №,К-АТФазы из почек сусликов при гибернации является, по-видимому, более агрегированное состояние фермента в мембранах микросом наряду с некоторым уменьшением его содержания в препаратах во время зимней спячки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Басевич, Евгений Викторович, 2010 год

1. Абатуров Б.Д., Магомедов М.-Р.Д. (1982) Зависимость смертности малых сусликов (С i te I ¿us pygmaeus) от плотности популяции и обеспеченности кормом. Зоол. журн., 61, 123-127.

2. Ануфриев А.И. (2002) Динамика массы тела у сусликов (Citelhis undiilatus) в спячке. Экология, 33, 73-76.

3. Ануфриев А.И. (2008) Механизмы зимней спячки мелких млекопитающих Якутии (Соломонов Н.Г., ред.), Изд-во СО РАН, Новосибирск.

4. Ануфриев А.И., Архипов Г.Г. (2004) Влияние размеров и массы тела на характер перезимовки у зимоспящих семейства Sciuridae северо-востока России. Экология, 35, 189-194.

5. Ануфриев А.И., Ахременко А.К. (1990) Энергетическая стоимость зимней спячки длиннохвостого суслика. Экология, 21, 68-72.

6. Батрукова М.А., Бетин B.JL, Рубцов А.М., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65, 469-484.

7. Белоусов А.Б. (1993) Роль центральной нервной системы в контроле зимней спячки. Успехи физиол. наук, 24, 109-127.

8. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. (2002) Биологическая химия, Медицина, Москва.

9. Блюдзин Ю.А., Осадчая Л.М., Болдырев A.A. (1986) Жирнокислотный состав суммарных липидов и фосфолипидов мембранных препаратов транспортных АТРаз. Биохимия, 51, 1499-1505.

10. Болдырев A.A. (1982) Na, K-зависимая АТФаза как олигомерная система. В сб. Итоги науки и техники. Биологическая химия (Кретович В.Л., ред.), 17, ПИК ВИНИТИ, Москва, 75-146.

11. Болдырев A.A. (1983) Роль межбелковых взаимодействий в регуляции Са-насоса саркоплазматического ретикулума. Укр. биохим. журн., 55, 677-688.

12. Болдырев A.A. (1985) Биологические мембраны и транспорт ионов, Изд-во МГУ, Москва, 208.

13. Болдырев A.A. (1988) Характеристика температурной зависимости Na,K-АТФазы. Укр. биохим. журн., 60, 107-113.

14. Болдырев A.A. (1998) Na/K-АТФаза свойства и биологическая роль. Сорос, обр. журн., 4,2-9.

15. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Прокопьева В.Д. (1985) Мембранные липиды как регуляторы межбелковых взаимодействий. Нейрохимия, 4, 80-95.

16. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Рубцов A.M., Свинухова И.А. (1983) Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы, Изд-во Московского университета, Москва, 46-59.17,18,19