Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Комелина, Наталья Павловна

• Комелина, Наталья Павловна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Комелина, Наталья Павловна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1. Роль протонных утечек рассеивающих АцН* на внутренней мембране митохондрий и снижающих эффективность окислительного фосфорилирования.

1.1. Не сопряженное с фосфорилированием, свободное, дыхание в митохондриях и его возможные функции.

1.2. Механизм разобщающего действия жирных кислот.

2. Белки внутренней мембраны митохондрий, принимающие участие в разобщающем действии жирных кислот.

2.1. АТР/АОР антипортер как разобщающий белок.

2.2. Аспартат/глутаматный переносчик как разобщающий белок. 14 2.3 Другие белки, участвующие в транспорте жирных кислот.

3. Разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани (1ГСР1).

3.1. Особенности митохондрий бурой жировой ткани.

3.2. Структура разобщающего белка.

3.3. Модели функционирования разобщающего белка.

4. Тканевые гомологи разобщающего белка(11СР).

4.1. История открытия гомологов иСР.

4.2. Распространение белков семейства иСР в различных тканях.

4.3. Биохимические свойства белков иСР2 и иСРЗ.

4.3.1. Активаторы и ингибиторы 11СР2 и иСРЗ.

4.3.2. Механизм разобщения для иСР2 и иСРЗ. :

4.4. Регуляция экспрессии генов иСР.

4.5. Предполагаемые функции иСР2 и иСРЗ.

4.5.1. иСР2 и ИСРЗ увеличивают термогенез.

4.5.2. иСРЗ участвуют в метаболизме жирных кислот.

4.5.3. ИСР защищают от образования активных форм кислорода.

4.5.4. иСР2 регулирует секрецию инсулина.

4.5.5. иСР2 вовлечен в процесс апоптоза.

4.5.6. иСР2 и ИСРЗ связаны с транспортом Са

4.5.7. иСР2 переключает метаболизм с углеводного на жировой.

4.5.8. иСР2 является маркеров макрофагов.

4.6. Особенности белков ИСР4 и иСР5.

4.7. Эволюция семейства иСР и распространение среди видов.

4.7.1. Распространение ИСР в различных систематических группах живых организмов.

4.7.2. Филогенез семейства иСР.

5. Зимняя спячка (гибернация) млекопитающих. Особенности физиологии и метаболизма^

5.1. Подавление метаболизма в состоянии гибернации.

5.2. Подавление функциональной активности митохондрий гибернирующих животных.

5.3. Активация окислительной активности митохондрий при выходе из состояния гибернации.

5.4. Адаптации на молекулярном уровне.

5.5. Исследования белков UCP у гибернирующих животных.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Выделение митохондрий из бурой жировой ткани, печени и скелетных 54 мышц.

2.3. Полярографический метод определения поглощения кислорода 55 суспензией митохондрий с помощью электрода Кларка.

2.4. Определение трансмембранного потенциала на внутренней мембране 55 митохондрий методом синтетических проникающих ионов с помощью

ТРР+ электрода.

2.5. Метод генерации супероксида с помощью системы ксантин плюс 56 ксантиноксидаза.

2.6. Анализ кинетических параметров конкурентного и неконкурентного 57 ингибирования.

2.7. Определение изменений объема митохондрий по светорассеиванию. •

2.8. Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.9. Экстракция белков с помощью детергентов.

2.10. Разделение белков на колонке с гидроксилапатитом.

2.11. Гель-фильтрация на сефадексе.

2.12. Диск-электрофорез белков в градиенте пористости ПААГ.

2.13. Выделение ДНК методом депротеинизации щелочным фенолом.

2.14. Выделение РНК из тканей.

2.15. Подбор праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа.

2.16. Реакция обратной транскрипции.

2.17. RT-PCR в реальном времени.

2.18. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ.

2.19. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты и их обсуждение. 66 3.1. Участие UCP2, аспартат/глутаматного переносчика и ATP/ADP антипортера в разобщении, индуцированном свободными жирными кислотами, в митохондриях печени зимних активных сусликов.

3.1.1. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на скорость дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов.

3.1.2. Исследование ресопрягающих эффектов GDP, глутамата и cAtr на мембранный потенциал митохондрий печени зимних активных сусликов.

3.1.3. Действие супероксида на параметры дыхания митохондрий печени зимних активных сусликов и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.

3.1.4. Действие супероксида на величину мембранного потенциала митохондрий печени суслика и ресопрягающие эффекты GDP и cAtr.

3.1.5. Исследование параметров дыхания митохондрий легких, выделенных из зимних активных сусликов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)»

Установлено, что разобщение дыхания и синтеза АТР является одним из главных механизмов срочного образования тепла у теплокровных животных. В бурой жировой ткани (БЖТ), специализированной на продукции тепла, такое терморегуляторное разобщение опосредовано разобщающим белком - 1 (UCP1-), ранее именовавшимся термогенином (см., Skulachev, 1988; Nedergaard et al., 2001; Klingenberg, 2001). Долгие годы термогенин считался уникальным белком, присутствующим исключительно в БЖТ. Предполагалось, что в остальных тканях такое разобщение дыхания, приводящее к дополнительному поглощению кислорода и выделению тепла при низких температурах, помимо своей основной транспортной функции, могут осуществлять другие митохондриальные белки - анионные переносчики, такие как ATP/ADP антипортер (ANT) и аспатрат/глутаматный переносчик, для функционирования которых в этом случае, как и для UCP1, требуется присутствие свободных жирных кислот (Skulachev, 1998).

Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по своей аминокислотной последовательности, - UCP 2, был обнаружен во всех тканях млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3, который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным артефактом.

В настоящее время спектр обнаруженных UGP стал еще шире, и соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций, отличных от функций термогенина бурой жировой ткани, большинство авторов по-прежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях. Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.

У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT - карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика и UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не исследовалось.

Цель работы: изучить вклад UCP и других белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в механизм разобщающего действия жирных кислот и реализацию терморегуляторного разобщения в митохондриях печени и скелетных мышц гибернирующих животных в различных физиологических состояниях.

В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и скелетных мышц сусликов Spermophilas imdulatus и дифференцировать предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих ингибиторов.

2. Используя описанную в литературе способность UCP-2 и UCP-3 активироваться супероксидом, исследовать ресопрягающее действие GDP в условиях вызванного супероксидом разобщения.

3. С помощью ингибиторов аспартат/глутаматного переносчика, ANT и разобщающих белков (UCP) выявить вклад каждого из них в терморегуляторное разобщение в митохондриях печени и скелетных мышц выходящих из состояния гибернации сусликов.

4. Опираясь на описанные в литературе свойства белков UCP, обнаружить их присутствие и функциональную активность в тканях печени и скелетных мышц гибернирующих сусликов.

Научная новизна работы. Впервые в эксперименте, направленном на выявление активности UCP, для исключения вклада других митохондриальных белков, способных участвовать в транспорте анионов жирных кислот, использованы последовательные добавки специфических ингибиторов. Впервые показано, что ресопрягающий эффект GDP не может служить объективным тестом для выявления функционирования UCP, и представлены доказательства конкурентного взаимодействия GDP с ANT. Впервые в экспериментах на интактных митохондриях печени и мышц показано отсутствие в них проводимости для ионов хлора, характерной для митохондрий БЖТ, содержащих UCP1. Установлено, что cAtr не способен ингибировать UCP1 из БЖТ. На основании этих результатов сделано заключение, что гомологи UCP в печени и скелетных мышцах не участвуют в терморегуляторном разобщении дыхания при пробуждении животных из состояния гибернации, а также в разобщении, активируемом супероксидом. Также нами проведены измерения уровня экспрессии мРНК UCP2 в печени и UCP3 мышцах якутского суслика в различных сезонных состояниях.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Комелина, Наталья Павловна

выводы

GDP' в условиях ингибирования ANT не оказывает заметного ресопрягающего действия на. разобщенное в присутствии; жирных кислот дыхание митохондрий печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus в различных физиологических состояниях, и в условиях воздействия на. митохондрии супероксида, которое могло бы, быть интерпретировано как функциональное проявление UCP2 и UCP3. Обнаружено, что аспартат/глутаматный переносчик, так же, как и» ANT, участвует в терморегуляторном разобщении в митохондриях печени просыпающихся сусликов.

Ресопрягающее действие GDP на митохондрии печени и мышц сусликов связано с конкурентным ингибированием ANT, как переносчика анионов жирных кислот, а не с присутствием в митохондриях печени и мышц белков UCP2 и UCP3.

В митохондриях печени и скелетных мышц сусликов отсутствует заметная проницаемость для ионов хлора, характерная для содержащих UCP1 митохондрий бурого жира, что свидетельствует о низком содержании либо полном отсутствии в этих тканях функционально-активных белков UCP2 и UCP3.

Обнаружено, что, cAtr в концентрации до 250 мкМ не влияет на проводимость для ионов хлора, обусловленную присутствием UCP1 в митохондриях БЖТ, что опровергает возможность ингибирования других разобщающих белков в присутствии сAtr.

Сорбционная хроматография на гидроксилапатите, в условиях, оптимизированных для выделения UCP1 из БЖТ,. и в условиях, когда UCP1 совыделяется с другими белками - анионными переносчиками внутренней мембраны митохондрий; не позволяет обнаружить, UGP2 и - UCP3 в митохондриях печени и скелетных мышц суслика, что; свидетельствует об их относительно низком содержании в митохондриях этих тканей. У якутских сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации экспрессия мРНК UCP3 в мышцах увеличивается в три раза-по сравнению с летним периодом, а экспрессия мРНК UCP2 в мышечной ткани достоверно не изменяется и вероятно связана с присутствием в мышечной ткани примеси клеток иммунной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что более 10 лет прошло с момента открытия гомологов UCP, до сих пор нет единого мнения среди исследователей о функциях этих белков, более того, предметом споров является даже тот факт, что эти белки обладают физиологически значимой разобщающей активностью. Они изначально были описаны как разобщающие белки, поэтому в ранних исследованиях не уделяли внимания поиску альтернативных функций гомологов UCP1. Некоторые проводимые сейчас исследования выявляют недостатки и артефакты проводимых ранее экспериментов, например, на реконструированных системах (Azzu et al., 2008; Harper et al., 2002; Stuart et al., 2001), в работах, выполненных с использованием антител (см. Nedergaard, Cannon, 2003).

В представленной работе показано, что все свойства белков UCP2 и UCP3, описанные в литературе (ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов и активация супероксидом), исходя из которых обычно делаются выводы об их функциональной активности в препаратах митохондрий, могут быть полностью объяснены участием ANT в разобщении под действием жирных кислот. Полученные результаты позволяют заключить, что распространенные к настоящему моменту представления о механизмах функционирования UCP в клетке и их значении в организме животных, в частности, в процессах хладоадаптации, термогенеза, на примере зимней спячки млекопитающих, не подтверждаются, и могут быть ошибочными.

Для объяснения противоречия между разобщающей функцией, следующей из гомологии белков семейства UCP, и отсутствием достоверных данных о выявлении соответствующей активности в экспериментах на препаратах митохондрий может быть выдвинуто несколько предположений, не исключающих друг друга, которые частично уже нашли-» отражение в литературе. Возможно, эти белки выполняют иную, не связанную непосредственно с разобщением функцию. Например, участвуют в транспорте жирных кислот, или пирувата (Pecqueur et al., 2009).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Комелина, Наталья Павловна, 2011 год

1. Амерханов З.Г., Кашапова И.Ю., Попов В.Н. Роль UCP2 и АДФ/АТФ-антипортера в разобщающем действии супероксид-радикала на препараты митохондрий почек// Доклады Академии наук. 2008. - Т. 423. - №2.- с. 264-267.

2. Брустовецкий H.H., Гогвадзе В.Г., Маевский Е.И. Биохимические основы торможения и активации дыхания митохондрий печени гибернирующего суслика//Биологические науки. 1988. Т.4. С.14-20

3. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г. Ингибирование транспорта сукцината, в-оксибутарата и глутамата в митохондриях печени гибернирующего суслика//Журнал Эвол. Биохим. Физиол. 1989. Т.25. С.718-723

4. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г., Егорова М.В., Мохова E.H., Скулачев

5. B.П. Участие ATP/ADP антипортера и жирных кислот в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондрях печени сусликов при зимней спячке и пробуждении// Биохимия. 1991. Т.56, вып.5. С.947-953.

6. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Маевский Е.И. Окислительная активность и AVF митохондрий печени активного и гибернирующего суслика при различных условиях инкубации// Биохимия. 1991а. Т.58.1. C. 1522-1527

7. Гааггь Э., Медыш Г., Верецкей JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул.- М.: Мир, 1982. 448 с.

8. Даудова Г.М. Окислительное фосфорилирование в печени и скелетных мышц суслика при различных физиологических состояниях// Биохимия. 1968. Т.ЗЗ. С.148-152

9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика.-М.: Мир, 1991. 543 с.

10. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М.: Наука, 1985. 210 с.

11. Колаева С.Г. Роль эндогенных и экзогенных компонентов в формировании сезонных ритмов у зимоспящих. Экологическая физиология животных. Л: Наука, 1979, 4.1. с. 247-254.

12. Миронова Г.Д., Маслова Г.И., Федотчева М.А., Миронов Г.П. Участие митохондриальных систем транспорта калия в термогенезе теплокровных животных.- В сб. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. Наука. 1986. С. 64-68

13. Мохова E.H., Старков A.A., Бобылева В.А. Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях печени и мышц// Биохимия. 1993. Т.58, вып. 10. С.1513-1522.

14. Николе Д.Дж. Биоэнергетика: введение в хемиосмотическую теорию. М.: Мир, 1985. 190 с.15