Исследование роли Alu-повторов в старении и долголетии человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Каримов Денис Дмитриевич

• Каримов Денис Дмитриевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Каримов Денис Дмитриевич

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Старение - биологический феномен

1.2. Роль А/и-ретроэлементов в молекулярных механизмах старения

1.2.1 Классификация мобильных генетических элементов

1.2.2 Структура ретротранспозонов семейства А/и

1.2.3 Эффекты активации А/и-ретроэлементов и их влияние на старение организма

1.2.4 А/и-инсерционно-делеционный полиморфизм и его влияние на транскрипционную активность генов человека и формирование сложных признаков

1.2.5 Потенциальные гены-кандидаты старения, полиморфные по инсерции А/и-ретроэлементов

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Характеристика группы исследования

2.2. Молекулярно-генетические методы исследования

2.2.1 Метод выделения тотальной РНК из лейкоцитов периферической

крови человека

2.2.2. Построение первой цепи кДНК реакцией обратной транскрипции

2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

2.2.4. Выделение ДНК из периферической крови человека

2.2.5. Метод полимеразной цепной реакции

2.2.6. Метод электрофореза

2.3. Статистические методы обработки результатов исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ уровня относительной экспрессии транспозонов подсемейств А/иУа5 и А/иУЪ8 у лиц разного возраста

3.2. Анализ А/и-инсерционно-делеционного полиморфизма некоторых

генов-кандидатов старения и долголетия в этнической группе татар

3.3. Анализ ассоциаций Л/и-инсерционно-делеционных полиморфных локусов генов-кандидатов старения и долголетия с возрастом

3.3.1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов Л/и-инсерционно-делеционных полиморфных участков генов-кандидатов старения и долголетия в разных возрастных группах

3.3.2. Мультилокусный анализ ассоциаций Л/и-инсерционно-делеционных полиморфных участков генов-кандидатов старения и долголетия с возрастом

3.3.3. Поиск ассоциаций Л/и-инсерционно-делеционных полиморфных участков генов-кандидатов старения и долголетия с возрастом с помощью ЯОС-анализа и бинарной логистической регрессии

3.4. Анализ распределения частот генотипов и аллелей Л/и-инсерционно-делеционных полиморфных участков генов-кандидатов старения и долголетия в связи со смертностью и выживаемостью лиц старческого возраста и долгожителей

Обсуждение результатов

Заключение

Выводы

Список цитированной литературы

Приложение А

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПЖ — продолжительность жизни

МГЭ — мобильные генетические элементы

— long interspersed nuclear element (класс длинных диспергированных

LINE

повторов)

— short interspersed nuclear element (класс коротких диспергированных

SINE

повторов)

Alu-МГЭ — элемент, относящийся к классу SINE

Alu(I/D) — Alu-инсерционно-делеционных полиморфизм

Alu-РНК — транскрипт последовательности Alu

LTR — long terminal repeat (длинный фланкирующий повтор)

п.н. — пар нуклеотидов

т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов

а.о. — аминокислотных остатков

ACE — ген ангиотензин-превращающего фермента

PLAT — ген активатора плазминогена тканевого типа

TEAD — ген транскрипционного фактора с доменом TEA

LAMA2 — ген а2-цепи ламинина (мерозина)

COL13A1 — ген а1-цепи коллагена 13 типа

EVI5 — ген эктопического сайта интеграции ретровирусов

CDH4 — ген кадгерина 4 типа (R-кадгерина)

HECW1 — ген E3 убиквитинпротеинлигазы

NOTCH2 — ген рецептора NOTCH2

PKHD1L1 — гомолог гена полицистронной болезни печени и почек

PTPRO — ген рецепторной протеинтирозинфосфатазы типа О

SEMA6A — ген семафорина 6А

SOX5 — ген транскрипционного фактора SRY-бокс

STK38L — ген гомолога серин-треониновой киназы

CDC2L2 — ген циклинзависимой киназы 11А

GWAS — Genоme Wide Association Studies (полногеномный анализ ассоциаций)

ССЗ

ИМ

ИБС

РС

ГЭБ

ПЦР

ПЦР-РВ

ОТ-ПЦР

ОЭ

Коэ

ТА

Ct

FDR OR ORR PIC

Н

Не Но ТФ

Р Р

pH-W

sp

СВС

— сердечно-сосудистые заболевания

— инфаркт миокарда

— ишемическая болезнь сердца

— рассеянный склероз

— гематоэнцефалический барьер

— полимеразная цепная реакция

— полимеразная цепная реакция в реальном времени

— полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

— уровень относительной экспрессии

— кратность уровня относительной экспрессии

— транскрипционная активность

— Cycle Threshold (пороговый цикл пересечения кривой амплификации с базовой линией)

— False Discovery Rate (доля ложных отклонений)

— Odds ratio (показатель соотношения шансов наступления события)

— Odds ratio ratio (показатель отношения отношения шансов)

— polymorphic information content (информационная емкость полиморфизма)

— гетерозиготность

— ожидаемая гетерозиготность —наблюдаемая гетерозиготность

— транскрипционные факторы

— частота генотипа или аллеля

— вероятность события, вероятность соответствия различий распределений сравниваемых групп (уровень значимости различий)

— вероятность соответствия эмпирически наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга равновесному распределению

— стандартная ошибка среднего

— средний возраст наступления смерти

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли Alu-повторов в старении и долголетии человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В современных условиях наблюдается изменение структуры населения развитых стран в пользу лиц преклонного возраста. Поэтому особую актуальность приобретает идентификация биологических факторов, способствующих физической сохранности и умственной активности людей данной возрастной группы. С возрастом наблюдается снижение жизнеспособности организма, причем считается, что развитие процессов старения начинается сразу же после рождения, а темпы развития процессов старения зависят от интенсивности комплексных, частично взаимосвязанных и независимых изменений структурно-функциональной организации всех систем организма с возрастом (Kinzina et э1., 2019). Также процесс старения характеризуется повышением риска развития большого количества заболеваний и ростом вероятности смерти от всех причин (Крутько и др., 2008; Мушкамбаров, 2011). Таким образом, старение рассматривается как совокупность изменений, возникающих в процессе онтогенеза, объективный и неизбежный процесс снижения жизнеспособности, заключительный период возрастного развития.

Успехи в области генетики и, в частности, таких ее разделов, как геномика и транскриптомика, позволили существенно расширить представления о молекулярно-генетических основах старения. При этом основными направлениями исследований данного феномена являются поиск редких и распространенных мутаций в геноме, ассоциированных с вариабельностью продолжительности жизни (ПЖ), выявление возрастных эпигеномных и транскриптомных изменений. В то же время, многофакторный характер природы старения требует комплексной оценки причин, приводящих к старческой деградации организма. Согласно результатам ряда исследований, в качестве основной причины старения организма рассматривается рост геномной нестабильности, абсолютного и относительного количества нарушений в функционировании организма, вызванное повреждениями отдельных молекул, клеток, или даже органов, сопровождающееся снижением функциональной

активности и нарушением гомеостаза как организма в целом, так и его отдельных частей, и невозможность полного восстановления этих нарушений (Мушкамбаров, 2011; Gladyshev, 2012, 2013; Голубев, 2015). Таким образом, участие возраст-зависимого увеличения нестабильности генома в ограничении ПЖ и формировании старческого фенотипа целесообразно рассматривать в рамках изучения причин старения.

Установлено, что одними из важнейших эндогенных факторов нестабильности генома являются мобильные генетические элементы (МГЭ) (Mustafina, 2013; Kim et al., 2016). Из всех семейств МГЭ наиболее распространённым в геноме человека является Alu - количество копий данного элемента составляет более 1 млн., это около 11% всей ДНК (Дадашев и Гришаева, 2008; Kim et al., 2016). Встраиваясь путем ретротранспозиции в различные участки генома, транспозоны семейства Alu (Alu-МГЭ) способны влиять на активность близлежащих генов, участвуя тем самым в формировании патологий, в том числе органичивающих ПЖ (Maxwell, 2016). Установлено, что Alu-МГЭ и их транскрипты участвуют в активации пролиферации, канцерогенезе, стрессовых реакциях, апоптозе (Beere, 2005; Никитина и др., 2009; Кабанов и др., 2015). С другой стороны, способность Alu-МГЭ выполнять функции энхансеров, инсуляторов, участков альтернативного сплайсинга и иные дающие клетке преимущества функции, вероятно, объясняет их широкую распространённость и свидетельствует об эволюционной целесообразности присутствия данных последовательностей ДНК в геноме человека (Никитина и др., 2009; Никитина и Тищенко, 2008).

Таким образом, высокая частота встречаемости Alu-МГЭ в геноме, их небольшие размеры (ок. 300 пар нуклеотидов (п.н.)), разнонаправленное влияние инсерционных событий на экспрессию генов, а также участие в клеточных процессах, ассоциированных с ПЖ, делают представителей этого семейства актуальным объектом молекулярно-генетических исследований старения и долголетия.

Степень разработанности темы исследования. На сегодняшний день выдвинуто более трёхсот гипотез, объясняющих возникновение молекулярных и клеточных признаков старения (da Costa et al., 2016). Основные теории детально

рассмотрены во многих публикациях (Фролькис, 1998; Оловников, 2003; Крутько и Донцов, 2008; Москалев, 2008; Kenyon, 2010; Мушкамбаров, 2011; Gladyshev, 2012, 2013; Голубев, 2015). В качестве ключевых молекулярно-генетических механизмов старения рассматриваются такие процессы, как апоптоз, репликативное и стресс-индуцированное клеточное старение, истощение пула стволовых клеток (Тодоров и Тодоров, 2003; Анисимов, 2008; Vijg and Suh, 2005; 2013). Нестабильность генома, увеличивающаяся с возрастом и вызывающая повреждения структур клеток и органов, также рассматривается в рамках изучения причин старения (Мушкамбаров, 2011; Lopez-Otin et al., 2013; Mustafina, 2013; Шапошников и др., 2015).

Точка зрения о роли активности МГЭ в старении и долголетии обоснована как теоретическими обобщениями (Mustafina, 2013; Sedivy et al., 2013; Maxwell, 2016), так и результатами экспериментальных исследований (Rerkasem et al., 2015; Erichsen et al., 2019; Mumford et al., 2019; De Cecco et al, 2019). Установлено, что инсерции ретротранспозонов, относящихся к классу активных МГЭ, способны вызывать различные мутации, хромосомные перестройки, влиять на эпигенетический ландшафт эукариотического генома, процессы регуляции транскрипции и экспрессию генов (Grover еt а!, 2003; Fedoroff, 2012). Кроме этого, показано участие A/u-ретротранспозонов в регулировании некоторых клеточных процессов -пролиферации, апоптоза (Никитина и др., 2009; Кабанов и др., 2015), что указывает на правомерность исследования МГЭ при изучении механизмов старения. Гипотеза о положительной роли A/u-МГЭ в эволюции генома человека (Никитина и Тищенко, 2008), с другой стороны, может свидетельствовать об их участии в адаптационных процессах, важных для формирования фенотипа долгожителя.

В то же время исследование активности A/u-МГЭ, как одной из основных эндогенных факторов нестабильности генома, сосредоточено на изучении вызванных ими эффектов, затрагивающих физиологию клетки. Количество же работ, посвященных анализу роли A/u-ретротранспозонов в старении и долголетии, крайне ограничено, так же, как и исследований эффектов, вызванных наличием A/u-инсерционно-делеционных (A/u(I/D)) полиморфных участков в функциональных генах.

Цель исследования заключалась в выявлении роли Alu-повторов в вариабельности продолжительности жизни человека с помощью анализа транскрипционной активности ретротранспозонов подсемейств AluYa5 и AluYb8 и их инсерционно-делеционного полиморфизма в некоторых генах-кандидатах старения и долголетия.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ транскрипционной активности ретротранспозонов подсемейств AluYa5 и AluYb8 в лейкоцитах крови в группах лиц разного возраста;

2. Впервые на примере обширной этнической группы татар, проживающих на территории Республики Башкортостан, оценить популяционно-генетический характер распределения частот аллелей и генотипов Alu-инсерционно-делеционных полиморфных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия -ACE, PLAT, TEAD1, LAMA2, COL13A1, EVI5, CDH4, HECW1, NOTCH2, PKHD1L1, PTPRO, SEMA6A, SOX5, STK38L, CDC2L2;

3. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов Alu-инсерционно-делеционных полиморфных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия в группах лиц разного возраста;

4. Провести мультилокусный анализ ассоциаций Alu-инсерционно-делеционных полиморфных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия в группах лиц разного возраста;

5. Выявить возрастные диапазоны, отличные от принятой классификации, на основании различий в частотах аллелей и генотипов Alu-инсерционно-делеционных полиморфных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия;

6. Провести сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей Alu-инсерционно-делеционных полиморфных участков генов-кандидатов старения и долголетия в связи со смертностью и выживаемостью лиц старческого возраста и долгожителей.

Научная новизна работы.

Впервые выполнено исследование роли ретротранспозонов семейства Alu в старении и долголетии человека с использованием анализа ассоциаций

транскрипционной активности и полиморфного состояния генов, содержащих Alu-элементы. Впервые выявлены возрастные различия частот генотипов по Alu(I/D)-полиморфным участкам генов COL13A1, CDH4, LAMA2 и PLAT. Впервые установлены генетические мультилокусные AlufI/D)-полиморфные маркеры долголетия, организованные различными комбинациями из двух генотипов (CDH4*D/D и LAMA2*I/D) и шести аллелей (HECW1*D, LAMA2*D, LAMA2*I, ACE*I, PLAT*I, STK38L*I). Впервые проведен анализ ассоциаций Alu(I/D)-полиморфного состояния генов-кандидатов старения и долголетия со смертностью лиц старческого возраста и обнаружено, что генотип HECW1 *I/D ассоциирован с повышенной смертностью после 90 лет.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования значительно углубляют понимание молекулярно-генетических процессов, происходящих при старении. Полученные результаты важны для разработки эффективных мер профилактики возраст-зависимых заболеваний, подходов адекватной антивозрастной терапии с целью продления здорового периода жизни, создания тестовых систем оценки биологического возраста и потенциального возраста дожития.

Методология и методы исследования. В основе исследования лежит гено-кандидатный подход. Материалом для работы послужила репрезентативная этнически однородная выборка жителей Республики Башкортостан. Особенностью материала исследования является значительный размер выборки (1983 человека) из числа жителей Республики Башкортостан, а также уникальная коллекция ДНК долгожителей в возрасте 1 - 109 лет. От всех участников исследования получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Проведение работы одобрено этическим комитетом ФГБНУ ИБГ УФИЦ РАН. Для проведения молекулярно-генетических исследований выбраны стандартные методы анализа: выделение геномной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции, выделение РНК тризольным методом, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В работе использованы общенаучные эмпирические, теоретические и специальные методы.

Работа частично выполнена на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК».

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень транскрипционной активности ретротранспозонов подсемейств Alu Ya5 и AluYb8, характерный для лиц среднего возраста, сохраняется на поздних этапах онтогенеза.

2. В популяционно-генетических исследованиях правомерно использовать впервые изученные Alu-инсерционно-делеционные полиморфные локусы генов TEAD1, LAMA2, COL13A1, CDH4, HECW1, PKHD1L1, SEMA6A и STK38L.

3. Изменения в распределении частот генотипов и аллелей Alu-инсерционно-делеционных полиморфных вариантов генов-кандидатов старения и долголетия прослеживаются на протяжении старческого возраста и возраста долголетия.

4. Со смертностью среди лиц, достигших возраста долголетия, ассоциирован генотип HECW1*I/D.

5. Наиболее выраженную ассоциацию с долголетием показали аллель CDH4*D, генотипы CDH4*D/D и LAMA2*I/D.

Степень достоверности и апробация результатов. Использование репрезентативной выборки и современных молекулярно-генетических и статистических методов подтверждает степень достоверности полученных результатов. Основные материалы диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях: Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2013» (Москва, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013), 8-м Европейском конгрессе по биогеронтологии (Израиль, 2013), I Международном форуме «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 2013), Конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013), Европейских конференциях по генетике человека (Париж, 2013; Милан, 2014), 3-й международной конференции «Genetics of aging and longevity» (Сочи, 2014), 4-й международной научно-практической конференции

«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической диагностике» (Казань, 2014), 2-й международной школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2014), 12-й международной конференции студентов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук» (Томск, 2015), 6-й международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015), 11-й международной мультиконференции «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology» (Новосибирск, 2018), 11-й Российской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2019).

Личный вклад автора в проведенные исследования. Выбор темы диссертационной работы, определение цели и постановка задач исследования автор провёл совместно с научным руководителем к.б.н. Эрдман В.В. Автор работы изучил литературу по теме, непосредственно участвовал в написании и подготовке материалов к публикациям, написал рукопись работы. Основная часть экспериментальной работы: получение ДНК и РНК, постановка ПЦР, анализ транскрипционной активности ретротранспозонов AluYa5 и AluYb8, анализ результатов генотипирования выполнены автором лично. Общий вклад автора в работу - более 80%.

Публикации. Соискатель имеет 18 опубликованных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, из которых 2 статьи индексируются в международной базе Scopus. Результаты работы представлены на 14 конференциях в виде тезисов, стендовых и устных докладов.

Соответствие диссертации паспорту научной деятельности. Диссертационная работа «Исследование роли Alu-повторов в старении и долголетии человека» соответствует формуле специальности 03.02.07 - "Генетика". В диссертационной работе исследовано участие экспрессии ретротранспозонов, принадлежащих к молодым подсемействам Alu, и А1и(1Ю)-полиморфизмов в некоторых генах-кандидатах старения и долголетия, в вариабельности ПЖ человека.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 198 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 344 работы, содержит список сокращений и условных обозначений, приложение, 37 таблиц и 7 рисунков в основной части работы и 39 таблиц и 1 рисунка в приложении.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Поволжье №14-04-97094.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Старение - биологический феномен

Старение принято рассматривать как биологический процесс возрастного снижения жизнеспособности организма. Фенотипические проявления старения в наибольшей мере охарактеризованы у человека и некоторых видов млекопитающих животных. Данный комплексный феномен обусловлен множеством частично взаимосвязанных и независимых механизмов (Голубев, 2015), и рассматривается как результат комбинированного действия генетических и средовых факторов. Разными исследователями формулировались определения феномена старения, которые схожи в том, что в них старение характеризуется как объективная закономерность жизни, неизбежно наступающий заключительный период возрастного развития, совокупность изменений, возникающих в процессе онтогенеза и приводящих к снижению адаптивных возможностей организма, сложный необратимый процесс, неизбежно приводящий к состоянию старости и затем к смерти (Москалёв, 2008). При этом постулируется, что время наступления состояния старости зависит от интенсивности процессов, происходящих при старении; фенотипические признаки старения отражают сложные взаимодействия многообразных возрастных изменений различных систем организма; с возрастом по мере старения повышается вероятность смерти от всех причин (Крутько и др., 2008; Голубев, 2015). Такого рода определения не опираются на знание причин и механизмов старения.

Наиболее содержательное определение старению дано Н.Н. Мушкамбаровым: «Старение - процесс появления и последующего нарастания в организме возрастных изменений (отклонений параметров от их значений в период максимальной жизнеспособности). Причём, эти изменения характеризуются следующими свойствами:

а) неизбежность - изменения развиваются даже при самых благоприятных условиях существования у особей биологических видов, которым свойствен феномен старения;

б) двойственная природа - возникают под влиянием внешних и внутренних факторов спонтанного старения, эффективность действия которых определяется генетическим статусом организма, в т.ч., возможно, специальной генетической программой;

в) иерархический механизм - вначале появляются на уровне молекул и органелл в разных клетках организма и лишь потом - на более высоких уровнях;

г) раннее проявление - начинают обнаруживаться ещё в репродуктивном периоде или даже раньше;

д) вариабельность скорости - прогрессируют с переменной, но ограниченной снизу, скоростью, зависящей от многих факторов - в том числе вида ткани (органа), индивидуальных особенностей организма (состояния здоровья и т.п.), условий внешней среды;

е) деструктивность - в большинстве своём имеют деструктивный характер, реже -компенсаторный; в силу же деструктивности со временем:

- способствуют развитию многих болезней,

- приводят в целом к понижению жизненного потенциала (а с определённого периода, и жизнеспособности) организма и через некий, ограниченный видовым пределом, срок - к смерти» (Мушкамбаров, 2011).

Глобальной, фундаментальной причиной старения, по мнению ряда исследователей, является «повышение степени хаоса на всех структурных уровнях» организации живой системы как дискретной, сложной, самообновляющейся, открытой (обменивающейся с внешней средой веществом, энергией и информацией) системы (Крутько и др., 1998). Согласно установившейся точке зрения, основной причиной старения является накопление нарушений в функционировании организма, вызванное увеличением количества повреждений отдельных молекул, клеток, или даже органов, сопровождающееся снижением функциональной активности и нарушением гомеостаза как организма в целом, так и его отдельных частей, и невозможность полного восстановления этих нарушений (ИаёувИеу, 2012; Голубев, 2015). Высказывается точка зрения о биологической целесообразности как

исчерпывающей причине старения (Москалёв, 2010). Подразумевается необходимость смены поколений для приспособления выживания вида в меняющихся условиях среды обитания. Эти концепции, также как и мнение об эволюционной значимости старения, реализации программы саморазрушения в пострепродуктивном периоде, носят некий неопределенный «философский» характер, который не аргументируется конкретными знаниями.

За многие годы изучения феномена старения были предложены десятки гипотез, изложенные во многих монографиях и обзорных статьях (Фролькис, 1998; Анисимов, 2008; Крутько и др., 2008; Москалев, 2008, Kenyon, 2010; Мушкамбаров, 2011; Gladyshev, 2012, 2013; Голубев, 2015). Выдвинутые гипотезы опираются на интерпретацию одного или нескольких предполагаемых механизмов старения. По итогам проведения многочисленных экспериментальных исследований, к важнейшим механизмам старения относят накопление мутаций, снижение способности к регенерации и репарации, накопление недорепарированных повреждений генома в митотических линиях клеток, нарушения разных сторон метаболизма. Полагают, что в основе процесса старения лежат такие молекулярно-генетические явления, как нестабильность генома, приводящаяя к репликативному и стресс-индуцированному клеточному старению и апоптозу (Тодоров и Тодоров, 2003; Анисимов, 2008; Vijg and Suh, 2005; 2013). Нестабильность генома рассматривается как один из центральных элементов старения (Мушкамбаров, 2011; Lopez-Otin et al., 2013; Шапошников и др., 2015; Maxwell, 2016).

В рамках предложенной Н. Мушкамбаровым концепции «АНЕРЕМ» (автокатализ, нестабильность, репарация, мейоз) развиваются представления о том, что «возникновение жизни связано с появлением нуклеиновых кислот, а старение - с их нестабильностью» (Мушкамбаров, 2011). Митотические и постмитотические клетки стареют, как и весь организм; старение потенциально неотвратимо. Ряд авторов рассматривает половой процесс как, в первую очередь, механизм репарации мутаций, зачастую вызывающих нарушения структуры и функций генома. Эти мутации, вызываемые как различными факторами окружающей среды, так и образующимися побочными продуктами нормального метаболизма, хромосомными

перестройками и активностью транспозонов, являются причинами генетической нестабильности.

В настоящее время среди многочисленных исследований феномена старения анализ молекулярно-генетических основ старения и долголетия человека признан одной из приоритетных фундаментальных задач. В связи с этим проводится научный поиск, ориентированный на познание широкого спектра вопросов, совокупный ответ на которые, предположительно, позволил бы во многом раскрыть причины и механизмы, лежащие в основе старения и ассоциированных с возрастом заболеваний человека, и обозначить факторы, обуславливающие внутри- и межпопуляционную вариабельность ПЖ. Основными направлениями таких исследований является изучение роли полиморфизма ядерного и митохондриального геномов в детерминации ПЖ в популяциях разных народов мира; оценка влияния эффекта накопления с возрастом соматических мутаций на темпы старения; выявление возрастных эпигеномных и транскриптомных изменений, идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся на разных этапах онтогенеза, исследование роли мобильных генетических элементов.

Таким образом, состояние исследований в этой области в настоящее время можно охарактеризовать как бурный этап накопления фактического материала, обобщений и выдвижения гипотез. Несмотря на большое количество исследований, природа и причины старения остаются до конца невыясненными. В целом, результаты многочисленных исследований содержат общую идею потери устойчивости и снижении жизнеспособности с возрастом. Геномная нестабильность, таким образом, рассматривается как одна из ведущих причин старения, тогда как поддержание стабильности генома, наоборот, выступает в качестве главной причины сохранения жизнеспособности и увеличения ПЖ.

1.2. Роль Л/и-ретроэлементов в молекулярных механизмах старения

Мобильные генетические элементы (МГЭ) или транспозоны - умеренно повторяющиеся последовательности эукариотического генома, способные копировать и/или перемещать свои копии по геному. Они обнаружены в геноме одноклеточных и многоклеточных организмов разных таксономических групп.

МГЭ могут играть важную роль в разворачивании молекулярных механизмов, приводящих к развитию процессов старения. Эта точка зрения обосновывается как теоретическими обобщениями (Mustafina, 2013; Sedivy et al., 2013; Maxwell, 2016), так и результатами экспериментальных исследований (Van Meter et al., 2014; Rerkasem et al., 2015; Erichsen et al., 2019; Mumford et al., 2019; De Cecco et al., 2019). Существует точка зрения, что активность МГЭ является обычным явлением функционирования генома и развития биологической системы (Cosby et al., 2019; Todd et al., 2019). МГЭ являются основным фактором нестабильности генома, обеспечивают его пластичность и, тем самым, обеспечивают разнообразие генома, играя важную роль в филогенезе и эволюции организмов (Патрушев и Коваленко, 2014; Kim et al., 2016; Platt et al., 2018). Инсерции ретроэлементов могут вызывать различные мутации, хромосомные перестройки, влиять на эпигенетический ландшафт эукариотического генома, процессы регуляции транскрипции и экспрессию генов (Grover еt а!, 2003; Fedoroff, 2012, Kim et al., 2016).

Активация МГЭ при старении присуща организмам разного уровня организации (табл. 1); увеличение активности транспозонов с возрастом показано в исследованиях на различных модельных организмах: мышах (Barbot et al., 2002, de Cecco et al., 2013b), термитах (Elsner et al., 2018), плодовых мушках (Li et al., 2013; Chen H. et al., 2016; Wood et al., 2016), нематодах (Dennis еt а!, 2012) и дрожжах (Maxwell а!., 2011, Hu, 2014; Patterson а!., 2015).

Таблица 1

- Транспозоны, имеющие повышенный уровень экспрессии у стареющих

модельных организмов

Модельный организм Транспозон модельного организма Семейство Уровень экспрессии у старых животных Ссылка

Mus musculus intracisternal A-particle LTR Повышен в 5-8 раз Barbot еt al., 2002

L1 LINE Повышен в 2.5-3 раза de Cecco еt al., 2013b

MusD Эндогенный ретровирус Повышен в 2-2.5 раза

Macrotermes bellicosus Mariner Mos 1 DNA-transposone У рабочих особей повышен в ~ 1.5 раза Elsner еt al., 2018

BovB SINE У рабочих особей повышен в ~ 2 раза

Drosophila melanogaster R1 LINE Повышен в 1.5-3 раза Li еt al., 2013

R2 LINE

Gypsy LTR Повышен в 1.5-6 раз

Caenorhabditis elegans Cerl LTR Кодируемый белок накапливается в тканях при старении, скорость накопления зависит от температуры. Dennis еt al., 2012

Saccharomyces cerevisiae Tyl LTR Повышен в 24-77 раз Maxwell еt al., 2011

В материнских клетках повышен по сравнению с дочерними в 2.5-3 раза Patterson еt al., 2015

1.2.1 Классификация мобильных генетических элементов

Выделяют два типа транспозонов: ДНК-траспозоны и РНК-транспозоны, или ретротранспозоны (рис. 1). ДНК-транспозоны состоят из нескольких групп, различающихся по механизму транспозиции, в геноме человека они неактивны (Kim et al., 2016). Ретротранспозоны, в свою очередь, делятся на LTR-транспозоны (содержащие длинный фланкирующий повтор, long terminal repeat) и non-LTR-транспозоны (не содержащие последовательности LTR). Среди non-LTR выделяют две больших группы - длинные (Long Interspersed Nucleotide Element, LINE) и короткие (Short Interspersed Nucleotide Element, SINE) ретротранспозоны. Транспозоны LINE в свою очередь включают семейства L1, L2 и L3. SINE элементы включают семейства MIR (Mammalian Interspersed Repeat, распределённый повтор млекопитающих) и Alu. Название семейства Alu связано с наличием в последовательности членов семейства сайта рестрикции для рестриктазы AluI. Связь со старением человека показана для LINE1 и «зависимых» от них Alu-повторов (Rerkasem et al., 2015; Erichsen et al., 2019; Mumford et al., 2019; De Cecco et al., 2019).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каримов Денис Дмитриевич, 2021 год

чО и>

связи со смертностью лиц старческого возраста и долгожителей

№ Группа N Частота генотипа, % (п) Частота аллеля, % (п) Р и-ш *(Ргвк ) Рх2

*1/*1 *0/*0 *1

1 Умершие в возрасте до 90 лет 45 26.67 (12) 44.44 (20) 28.89 (13) 48.89 (44) 51.11 (46) 0.458 —

2 Оставшиеся в живых за период наблюдения старики 113 27.43 (31) 42.48 (48) 30.09 (34) 48.67 (110) 51.33 (116) — —

Р (1-2) 0.999 0.860 0.999 0.999 0.111 0.999

3 Дожившие до 90 лет и старше 166 30.72 (51) 44.58 (74) 24.7 (41) 53.01 (176) 46.99 (156) — —

Р (1-3) 0.714 0.999 0.579 0.552 — 0.818

4 Умершие в возрасте 90 лет и старше 34 29.41 (10) 41.18 (14) 29.41 (10) 50.0 (34) 50.0 (34) 0.303 —

Р (3-4) 0.999 0.850 0.666 0.690 — 0.852

Р (1-4) 0.805 0.821 0.999 0.999 — 0.970

чО 4

связи со смертностью лиц старческого возраста и долгожителей

№ Группа N Частота генотипа, % (п) Частота аллеля, % (п) Р и-ш *(Ргвк ) Рх2

*1/*1 *0/*0 *1

1 Умершие в возрасте до 90 лет 58 3.45 (2) 17.24 (10) 79.31 (46) 12.07 (14) 87.93 (102) 0.153 —

2 Оставшиеся в живых за период наблюдения старики 155 0.65 (1) 20.0 (31) 79.35 (123) 10.65 (33) 89.35 (277) 0.523 —

Р (1-2) 0.564 0.701 0.999 0.728 — 0.300

3 Дожившие до 90 лет и старше 171 1.17 (2) 21.64 (37) 77.19 (132) 11.99 (41) 88.01 (301) 9.740 —

Р (1-3) 0.266 0.574 0.855 0.999 — 0.430

4 Умершие в возрасте 90 лет и старше 36 0 22.22 (8) 77.78 (28) 11.11 (8) 88.89 (64) 0.453 —

Р (3-4) 0.999 0.999 0.999 0.999 — 0.999

Р (1-4) 0.522 0.596 0.999 0.999 — 0.518

чО

М

связи со смертностью лиц старческого возраста и долгожителей

№ Группа N Частота генотипа, % (n) Частота аллеля, % (n) P H-W *(Pfdr ) Px2

*I/*I *I/*D *D/*D *I *D

1 Умершие в возрасте до 90 лет 60 25.0 (15) 50.0 (30) 25.0 (15) 50.0 (60) 50.0 (60) 0.999 —

2 Оставшиеся в живых за период наблюдения старики 162 26.54 (43) 40.74 (66) 32.72 (53) 46.91 (152) 53.09 (172) 0.020 *(0.195) —

P (1-2) 0.865 0.226 0.326 0.593 — 0.778

3 Дожившие до 90 лет и старше 207 24.15 (50) 51.21 (106) 24.64 (51) 49.76 (206) 50.24 (208) 0.727 —

P (1-3) 0.866 0.884 0.999 0.999 — 0.999

4 Умершие в возрасте 90 лет и старше 32 21.88 (7) 37.5 (12) 40.62 (13) 40.62 (26) 59.38 (38) 0.207 —

P (3-4) 0.999 0.184 0.084 0.181 — 0.161

P (1-4) 0.802 0.279 0.155 0.277 — 0.307

чО 6

связи со смертностью лиц старческого возраста и долгожителей

№ Группа N Частота генотипа, % (n) Частота аллеля, % (n) P H-W *(Pfdr ) Px2

*I/*I *I/*D *D/*D *I *D

1 Умершие в возрасте до 90 лет 61 26.23 (16) 55.74 (34) 18.03 (11) 54.1 (66) 45.9 (56) 0.339 —

2 Оставшиеся в живых за период наблюдения старики 169 19.53 (33) 44.97 (76) 35.5 (60) 42.01 (142) 57.99 (196) 0.316 —

P (1-2) *(Pfdr) 0.278 0.179 0.015 *(0.098) 0.026 *(0.135) — 0.041

3 Дожившие до 90 лет и старше 204 26.47 (54) 40.69 (83) 32.84 (67) 46.81 (191) 53.19 (217) 0.009 *(0.116) —

P (1-3) *(Pfdr) 0.999 0.041 *(0.171) 0.026 *(0.130) 0.180 — 0.049

4 Умершие в возрасте 90 лет и старше 36 30.56 (11) 41.67 (15) 27.78 (10) 51.39 (37) 48.61 (35) 0.319 —

P(3-4) 0.684 0.999 0.698 0.522 — 0.708

P (1-4) 0.648 0.211 0.311 0.515 — 0.382

чО 7

в связи со смертностью лиц старческого возраста и долгожителей

№ Группа N Частота генотипа, % (п) Частота аллеля, % (п) Р и-ш *(Ргвк ) Рх2

*1/*1 *0/*0 *1

1 Умершие в возрасте до 90 лет 60 26.67 (16) 51.67 (31) 21.67 (13) 52.5 (63) 47.5 (57) 0.780 —

2 Оставшиеся в живых за период наблюдения старики 167 23.95 (40) 43.11 (72) 32.93 (55) 45.51 (152) 54.49 (182) 0.091 —

Р (1-2) 0.728 0.291 0.139 0.202 — 0.279

3 Дожившие до 90 лет и старше 195 20.51 (40) 49.74 (97) 29.74 (58) 45.38 (177) 54.62 (213) 0.961 —

Р (1-3) 0.372 0.882 0.251 0.175 — 0.405

4 Умершие в возрасте 90 лет и старше 36 25.0 (9) 33.33 (12) 41.67 (15) 52.5 (63) 47.5 (57) 0.059 —

Р (3-4) 0.514 0.101 0.174 0.607 — 0.181

Р (1-4) 0.999 0.093 0.062 0.180 — 0.09

чО 00