Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Гороховатский, Андрей Юрьевич

• Гороховатский, Андрей Юрьевич
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гороховатский, Андрей Юрьевич

Содержание.

Список сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: РЕЗОНАНСНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ.

II. 1. Резонансный перенос энергии флуоресценции.

II.1.1. Основные понятия и термины.

II. 1.2. Ограничения FRET.

11.2. Методы детектирования резонансного переноса энергии.

11.2.1. Равновесная спектроскопия.

11.2.2. Измерения времени жизни возбужденного состояния.

И.2.2.1. Импульсный метод.

II.2.2.2. Фазово-модуляционный метод.

11.2.3. FRET-микроскопия.

11.2.4. Измерения на уровне одиночных донор-акцепторных пар.

11.3. Синтетические хромофоры, используемые в приложениях резонансного переноса энергии.

11.3.1. Органические флуоресцентные метки.

11.3.2. Люминесцентные хелаты лантаноидов.

11.3.3. Полупроводниковые нанокристаллы.

11.4. Зеленый флуоресцентный белок - генетически-кодируемый флуорофор в приложениях FRET.

11.4.1. Спектральные свойства GFP.

11.4.2. Варианты зеленого флуоресцентного белка.

11.4.3. GFP-подобные флуоресцентные белки из других организмов.

11.4.4. Использование FRET между вариантами GFP.

II.4.4.1. Внутримолекулярные FRET-индикаторы.

И.4.4.2. Межмолекулярные FRET-индикаторы.

11.5. Резонансный перенос энергии биолюминесценции.

11.5.1. Люциферазы Renilla reniformis и Aequorea victoria.

11.5.2. Механизм переноса энергии.

11.5.3. Использование BRET.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

III. 1. Материалы и реактивы.

111.2. Генетические конструкции.

111.3. Экспрессия генетических конструкций в клетках Е. coli и очистка рекомбинантных белков.

111.3.1. Акворин, обелин и гибриды GFP/EGFP-Aeq/Ob.

111.3.2. GFP и EGFP.

111.3.3. Гибрид EGFP-RLuc.

111.3.4. Гибрид BCCP-EGFP.

111.3.5. Гибрид SAV-Aeq.

111.3.6. Активация апо-белков целентеразином.

111.3.7. Определение концентрации белков.

111.4. Спектральные методы.

111.4.1. Спектры поглощения и кругового дихроизма.

111.4.2. Спектры флуоресценции.

111.4.3. Спектры биолюминесценции.

111.4.4. Биолюминесцентная активность Са2+-активируемых фотобелков и их гибридов.

111.4.5. Расчет интеграла спектрального перекрывания и Ro.

111.4.6. Определение эффективности BRET.

111.4.6.1. Анализ спектров.

111.4.6.2. Измерение сигнала BRET в двулучевом люминометре.

111.4.7. Кинетические измерения методом остановленного потока.

111.5. Электрофоретические методы.

111.5.1. ДСН-ПААГ электрофорез.

111.5.2. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.

111.6. Иммунологические методы.

111.6.1. Выделение IgG кролика.

111.6.2. Получение поликлональных антител к GFP.

111.6.3. Получение поликлональных антител к акворину.

111.6.4. Обработка нитроцеллюлозных мембран.

III.7. Другие методы.

111.7.1. Трипсинолиз гибридного белка GFP-19-Aeq.

111.7.2. Определение активности каспазы-3 in vitro.

111.7.3. Калибровка сигнала BRET.

111.7.4. Определение Kcat/KM.

111.7.5. Определение активности каспазы-3 в клеточных лизатах.

111.7.6. Биотинилирование EGFP и IgG кролика.

111.7.7. Анализ биотина.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Экспрессия генетических конструкций и очистка гибридных белков.

IV.2. Спектральные характеристики гибридных белков и эффективность внутримолекулярного BRET.

IV.3. Исследование механизмов внутримолекулярного BRET в акворинсодержащих гибридных белках.

IV.4. Характеристика биолюминесцентных субстратов для определения активности каспазы-3 методом внутримолекулярного BRET.

IV.5. Тестирование белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET.

V. ВЫВОДЫ.

VI. БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах»

Резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET, bioluminescence resonance energy transfer) - явление, происходящее при взаимодействии люциферазы и флуоресцентного белка у ряда морских кишечнополостных. При окислении люциферазой своего субстрата энергия возбужденного состояния продукта биолюминесцентной реакции (донора) передается хромофору расположенного рядом флуоресцентного белка (акцептора), вызывая его флуоресценцию и характерное излучение света организмом. Эффективность BRET зависит от спектральных свойств хромофоров донора и акцептора, их взаимной ориентации, а также от расстояния между ними. Зависимость эффективности BRET от расстояния наблюдается в пределах 100 А, что соответствует размерам большинства белков.В последнее время резонансный перенос энергии биолюминесценции находит растущее применение в исследовании белок-белковых взаимодействий. Будучи гомологичным широко используемому резонансному переносу энергии флуоресценции (FRET, fluorescence resonance energy transfer), BRET отличается тем, что донор переводится в возбужденное состояние не под действием облучения, а в результате ферментативного окисления люциферазой. Это обстоятельство позволяет применять BRET в образцах, характеризующихся значительным светорассеянием, автофлуоресценцией, а также в образцах, чувствительных к деградации под действием света - в случаях, когда применение FRET ограничено.Чувствительность методов на основе BRET в значительной степени определяется выбором донор-акцепторной пары. В настоящее время основным белком, используемым в качестве донора, является люцифераза RLuc из морской губки Renilla reniformis. В качестве акцепторов используются варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP, green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria.9-4Высокогомологичные друг другу Са -активируемые фотобелки обелин из гидроидного полипа Obelia longissima и акворин из медузы Aequorea victoria могут явиться альтернативой RLuc в качестве донора BRET. В отличие от RLuc, обелин и акворин представляют собой активированный комплекс апо-белка и прочно связанного с ним целентеразина, который окисляется с испусканием света при связывании этими белками ионов кальция. Обладая меньшим, по сравнению с RLuc, размером и большим квантовым выходом, эти белки могут обеспечить лучшее сближение и ориентацию хромофоров донора и акцептора и более эффективный перенос энергии.В организмах О. longissima и Л. victoria Са -активируемые фотобелки и зеленый флуоресцентный белок совместно локализованы в высокой концентрации в субклеточных структурах, люминосомах. Характер совместной локализации белков в настоящее время неясен. Лизис люмисом при выделении белков приводит к разделению донора и акцептора и прекращению переноса энергии. При этом цвет биолюминесцентной реакции меняется с зеленого (max 510нм) на синий (max 475 нм), что соответствует биолюминесценции Са^^-активируемого фотобелка.Известно, что в растворах акворина и GFP между ними не наблюдается переноса энергии вплоть до концентрации каждого белка 2 мг/мл. В связи с этим, для исследования BRET in vitro возникает задача сблизить белки донора и акцептора на достаточное для переноса энергии расстояние.Например, для сближения акворина и GFP была использована ко-сорбция этих белков на пудре ионообменной смолы. Однако, в этом случае присутствие твердой фазы не позволяет применить большинство спектральных методов.Другим экспериментальным подходом к исследованию BRET является объединение донора и акцептора в составе одного гибридного белка.Опубликованы спектры биолюминесценции гибридов акворин-GFP в живых или лизированных клетках, трансфецированных соответствующими 0 генетическими конструкциями. В настоящее время известно, что, несмотря на схожесть спектров биолюминесценции RLuc и акворина, в гибридных белках акворин-GFP эффективность BRET значительно выше, чем в гибридах RLuc-GFP. Также было показано, что эффективность BRET между акворином и GFP в составе их гибридов друг с другом (внутримолекулярный BRET) зависит от длины линкерного пептида, соединяющего акворин и GFP, и ингибируется при гидролизе линкера протеазами. Однако гибридные белки не были получены в чистом виде, и их другие свойства, в том числе причины зависимости эффективности BRET от длины линкера неизвестны.Успешное распространение в последнее время методов детектирования белок-белковых взаимодействий на основе BRET во многом связано с возможностью получать гибриды исследуемых белков с RLuc или GFP. При этом взаимодействие исследуемых белков, сближает донор-акцепторную пару и приводит к межмолекулярному переносу энергии в составе комплекса ^^ гибридов. Высокая эффективность внутримолекулярного BRET в гибридах акворин-GFP позволяет надеяться на успешное применение Са^ -^активируемых фотобелков в качестве альтернативы RLuc в исследовании белок-белковых взаимодействий в межмолекулярном формате. Тем не менее, такие данные пока отсутствуют.В связи с этим целью настоящей работы явилось создание и исследование систем эффективного внутри- и межмолекулярного BRET с участием Са -активируемых фотобелков в роли доноров. Для этого были получены в чистом виде гибридные белки и их комплексы, демонстрирующие перенос энергии, а также проведено исследование эффективности BRET и других свойств гибридных белков различными физико-химическими методами.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гороховатский, Андрей Юрьевич

V. выводы.

1. Исследован внутримолекулярный перенос энергии биолюминесценции в очищенных гибридных белках, содержащих Са2+-активируемые фотобелки обелин или акворин в качестве доноров и зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria в качестве акцептора. Показано, что наибольшей эффективностью переноса энергии биолюминесценции при прочих равных условиях обладают гибридные белки, содержащие акворин в качестве донорного модуля.

2. Показано, что высокая эффективность переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках, содержащих донор-акцепторную пару из Aequorea victoria (акворин-GFP), обусловлена Са2+-индуцируемым взаимодействием акворина с GFP, которое приводит к длинноволновому сдвигу поглощения GFP и уменьшению расстояния между донорным и акцепторным модулями.

3. Взаимодействие акворина с GFP в гибридных белках является чрезвычайно слабым и исчезает при протеолизе линкера, соединяющего донорный и акцепторный модули, а также при связывании GFP с поликлональными антителами.

4. Гибриды EGFP и акворина, содержащие в линкерной последовательности участок узнавания каспазы-3 являются специфическими биолюминесцентными субстратами этой протеазы и пригодны для количественной оценки протеолитической активности.

5. На примере межмолекулярного взаимодействия стрептавидина и биотинилированного белка, гибридизованных, соответственно, с акворином и зеленым флуоресцентным белком, показана возможность создания на основе этой донор-акцепторной пары метода тестирования белок-белковых взаимодействий и разработан новый метод анализа биотина. а* vi. благодарности

Автор глубоко признателен своему первому научному руководителю покойному профессору Юлию Борисовичу Алахову, под руководством которого в лаборатории были начаты исследования люминесцентных белков. Автор также благодарен научному руководителю диссертационной работы к.х.н. Леониду Михайловичу Винокурову за внимание к работе, поддержку, плодотворное обсуждение результатов и помощь в написании диссертации.

Особую благодарность выражаю Геннадию Васильевичу Семисотнову за ценные консультации в планировании и интерпретации данных спектральных измерений, за участие и написании публикаций и диссертации.

Особую признательность выражаю Виктору Викторовичу Марченкову за неоценимое участие в планировании и проведении спектральных измерений, плодотворное обсуждение и анализ результатов и помощь в написании публикаций по теме работы.

Автор выражает благодарность Руденко Наталье Васильевне за помощь в проведении иммунохимических исследований, за поддержку и помощь в работе и написании диссертации. Благодарю Ксензенко Владимира Николаевича, Ивашину Татьяну Владимировну, Захарова Михаила Владимировича за создание генетических конструкций. Благодарю Шалойко Любовь Анатольевну, Темирова Юрия Витальевича, Скосырева Виталия Сергеевича, Аржанова Максима Александровича за помощь и дружескую поддержку в работе.

Выражаю благодарность всем сотрудникам, в разное время работавшим в лаборатории организации белковых структур за создание творческой обстановки и помощь.

Благодарю Мельника Богдана Степановича за дизайн линкерных пептидов, а также всех сотрудников лаборатории физики белка института белка РАН за помощь в работе.

Выражаю благодарность оппонентам: профессору Виктору Ионовичу Цетлину и Владимиру Васильевичу Филимонову за внимательное прочтение и анализ работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гороховатский, Андрей Юрьевич, 2005 год

1. Weber,G. (1970) in Spectroscopic Appoaches to Biomolecular Conformation, (Uriy.D.W. eds.), American Medical Association, Chicago, Illinois.

2. Lakowicz,J.R. (1999) in Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New York.

3. Forster,T. (1946) Energy transport and fluorescence. Naturwissenschaften 6, pp. 166-175.

4. Forster,T. (1948) Zwischenmolekulare energiewanderung und fluoreszenz. Ann. Phys. 9, pp. 21-33.

5. Stryer,L. and Haugland,R.P. (1967) Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 58(2), pp. 719-726.

6. Stryer,L. (1978) Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, pp. 819-846.

7. Fairclough,R.H. and Cantor,C.R. (1978) The use of singlet-singlet energy transfer to study macromolecular assemblies. Methods Enzymol. 48, pp. 347379.

8. Wu,P. and Brand,L. (1994) Resonance energy transfer: methods and applications. Anal. Biochem. 218(1), pp. 1-13.

9. Forster,T. (1965) Delocalized excitation and excitation energy transfer. In Modern Quantum Chemistry (Sinanoglu, O., ed.), pp. 93-137, Academic Press, New York.

10. Selvin,P.R. (1996) Lanthanide-based resonance energy transfer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics 2(4), pp. 1077-1087.

11. Dale,R.E., Eisinger,J., and Blumberg,W.E. (1979) The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J 26(2), pp. 161-193.

12. Matsumoto,S. and Hammes,G.G. (1975) Fluorescence energy transfer between ligand binding sites on aspartate transcarbamylase. Biochemistry 14(2), pp. 214-224.

13. Hillel,Z. and Wu,C.W. (1976) Statistical interpretation of fluorescence energy transfer measurements in macromolecular systems. Biochemistry 15(10), pp. 2105-2113.

14. Wu,P. and Brand,L. (1992) Orientation factor in steady-state and time-resolved resonance energy transfer measurements. Biochemistry 31(34), pp. 7939-7947.

15. Epe,B., Steinhauser,K.G., and Woolley,P. (1983) Theory of measurement of Forster-type enery transfer in macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, pp. 2579-2583.

16. Clegg,R.M., Murchie,A.I., Zechel,A., Carlberg,C., Diekmann,S., and Lilley,D.M. (1992) Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry 31(20), pp. 48464856.17.18,19,20,21.22,23,24,25,26