Исследование регуляторной зоны гена Notch Drosophila melanogaster методами направленной гомологичной рекомбинации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Андреенков Олег Владимирович

• Андреенков Олег Владимирович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Андреенков Олег Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация политенных хромосом (общие сведения)

1.2. Цитологиче ская организация локус а Notch

1.3 Краткая функциональная характеристика гена Notch

1.4. Структурно-функциональная организация локуса Notch

1.4.1. Цитологическое картирование регуляторной зоны гена Notch

1.4.2. Клонирование ДНК гена Notch

1.4.3. Топологически ассоциированные домены - крупномасштабный

уровень организации интерфазных хромосом

1.4.4. Характеристика функциональных сайтов регуляторной зоны локуса

Notch

1.4.5. Исследования инсуляторных свойств регуляторной зоны локуса

Notch

1.4.6. Применение системы FRT/FLP гомологичной рекомбинации для

исследования регуляторной зоны локуса Notch

1.4.7. Применение системы CRISPR/Cas9 гомологичной рекомбинации для

исследования регуляторной зоны локуса Notch

1.4.8. Методы 3C в исследовании локуса Notch

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Линии дрозофилы и их ведение

2.2 Подготовка компетентных клеток E. coli

2.3 Трансформация плазмидной ДНК в клетки E. coli

2.4 Выделение и очистка нуклеиновых кислот

2.4.1 Выделение плазмидной ДНК для PCR

2.4.2 Выделение геномной ДНК Drosophila melanogaster

2.5 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях

2.6 Элюция ДНК из агарозного геля

2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и олигонуклеотиды

2.8 Приготовление препаратов политенных хромосом для световой микроскопии и гибридизации in situ

2.9 Иммуноокрашивание политенных хромосом

2.10 Мечение ДНК

2.11 Методы гибридизации нуклеиновых кислот

2.11.1 Саузерн-блот гибридизация

2.11.2 Флуоресцентная ДНК/ДНК гибридизация in situ на политенных хромосомах (FISH)

2.12 Выделение клеточных ядер из личинок дрозофилы

2.13 Обработка клеточных ядер ДНКазой I

2.14 Трансформация генома дрозофилы

2.14.1 P-элементная трансформация

2.14.2 Трансформация генома дрозофилы с использованием системы CRISPR/Cas9-индуцированной гомологичной рекомбинации

2.14.3 Трансформация геномв дрозофилы с использованием системы attP/attB фС31 - индуцированной гомологичной рекомбинации

2.15 Перенос междисковых последовательностей в эктопическое генетическое окружение

2.16 Приготовление полутонких срезов глаз Drosophila melanogaster

2.17 Микроскопический анализ

2.18 Статистиче ский анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Автономность декомпактного состояния хроматина последовательностей междиска 3С6/3С7 при переносе их в эктопичское генетическое окружение

3.1.1 Перенос последовательностей из междиска 3С6/3С7 в эктопическое генетическое окружение

3.1.2 Цитологические эффекты переноса последовательностей ДНК из междиска 3С6/3С7 в эктопическое окружение

3.1.3 Изучение нуклеосомной организации района 84F со встройками последовательностей ДНК из района междиска 3С6/С7

3.2 Исследование регуляторной зоны гена Notch методом направленного мутагенеза

3.2.1 Создание базовой линии, содержащей делецию регуляторной

зоны гена Notch

3.2.2 Направленный мутагенез регуляторной зоны гена Notch

3.2.3 Фенотипы мух, несущих направленные делеции в регуляторной зоне гена Notch

3.2.4 Фенотипы трансгетерозигот с базовой делецией

3.2.5 Цитологический анализ мутаций в 5'-районе гена Notch

3.2.6 Фенотип мух с полностью неразвитыми терминалиями

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование регуляторной зоны гена Notch Drosophila melanogaster методами направленной гомологичной рекомбинации»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Функции наследственного аппарата в процессе развития многоклеточного организма включают в себя реализацию важнейших процессов межклеточного взаимодействия, пролиферации и дифференцировки. Ключевые этапы этих процессов тесно связаны с работой ограниченного числа генов. Эти гены стоят в центре особых систем передачи информации - сигнальных каскадов, способных принимать и передавать сигналы между соседними клетками в процессе морфогенеза. Среди них важное место занимает сигнальный путь гена Notch, компоненты которого высококонсервативны среди всех билатеральных многоклеточных, а он сам является синапоморфией у Metazoa (Gazave et al., 2009). Продукт гена Notch является трансмембранным рецептором, который участвует в межклеточных взаимодействиях, на разных этапах развития многоклеточного организма. Активность гена Notch критически важна для выбора судьбы клетки между эпидермальным и нейрональным путями развития. В соответствии с этим, мутации гена приводят к нарушениям развития органов нейро-эктодермального происхождения. У человека мутации Notch приводят к наследственным и соматических заболеваниям, включая онкологические и мультисистемные болезни (Катанаев, Крючков, 2011). На дрозофиле пути передачи клеточного сигнала рецептором Notch изучаются давно и интенсивно, однако регуляция экспрессии самого гена и ее связь с состоянием хроматина изучена крайне слабо. Учитывая высокий консерватизм рецептора Notch, можно ожидать, что данные, полученные на модели дрозофилы, помогут более детально разобраться в механизмах работы Notch у более сложно организованных организмов, включая человека.

Ген Notch (N) в геноме D. melanogaster представлен уникальным локусом, расположенным в X хромосоме. В настоящее время по этому локусу получено огромное количество мутаций, значительная часть которых затрагивает белок-кодирующую часть гена и вызывает нарушения развития глаз, крыльев, щетинок и гонад. Получен и охарактеризован ряд мутаций в интронах гена, влияющих на развитие мухи. Однако к настоящему времени известна только одна мутация, затрагивающая регуляторную область гена. Рецессивная мутация Na'swb, нарушающая развитие глаза, представляет собой делецию 800 пар оснований, локализованную непосредственно перед промотором

гена. Было показано, что фрагмент ДНК, затрагиваемый этой делецией, проявляет инсуляторные свойства - защищает от эффекта положения репортерные трансгены и блокирует энхансер-промоторные взаимодействия (Vazquez, Schedl, 2000).

Регуляторная область гена Notch дрозофилы имеет сложную организацию и находится в декомпактизованном участке X хромосомы 3С6-С7, который на политенных хромосомах слюнных желез соответствует межхромомеру (междиску). Согласно полногеномным данным по распределению белков хроматина в клеточных линиях D. melanogaster (Braunschweig et al., 2009; Filion et al., 2010; Kharchenko et al., 2011), в 5' области гена Notch были выявлены участки, обогащенные инсуляторными белками, а также маркерами открытого хроматина. Несколько независимых Hi-C экспериментов на эмбрионах и культурах клеток дрозофилы показали, что ген Notch локализуется в одном из топологически ассоциированных доменов (TADs), а 5'-регуляторная область гена точно соотносится с границей домена (Hou et al., 2012; Sexton et al., 2012; Stadler et al., 2017; Arzate-Mejia et al., 2020). Эти данные указывают на то, что хроматин промоторной зоны гена Notch находится в "открытом" состоянии и, по-видимому, содержит последовательности, выполняющие барьерные функции. В связи с этим большое значение приобретает исследование конкретных последовательностей регуляторной зоны гена и анализ их функционального значения для регуляции экспрессии гена Notch.

К настоящему времени на дрозофиле разработаны высокоэффективные методы направленного редактирования генома. В частности, использование системы CRISPR/Cas9 в сочетании с методом гомологичной рекомбинации позволяет на несколько порядков повысить эффективность такого редактирования (Gratz et al., 2014). Сочетание самых современных молекулярно-генетических подходов с методами классической генетики, позволяет эффективно исследовать регуляторную зону гена Notch, а цитологическая структура района дает уникальную возможность соотнести функциональную значимость отдельных последовательностей со структурой хроматина.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является выявление функционально значимых последовательностей ДНК регуляторной зоны гена Notch и изучение их связи со структурой хроматина в эктопическом и нативном окружении.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Используя систему интеграции последовательностей ДНК междиска в акцепторный транспозон pICon, исследовать влияние различных последовательностей ДНК 5' регуляторной зоны гена Notch на структуру хроматина в эктопическом генетическом окружении.

2. Создать линию мух с протяженной делецией регуляторной зоны гена Notch в сочетании с attP сайтом методом сайт-специфической гомологичной рекомбинации.

3. Получить направленные делеции функциональных элементов регуляторной зоны гена Notch и проанализировать их фенотипические проявления.

4. Проанализировать структуру хроматина в линиях с полученными делециями и провести иммунофлюоресцентное исследование состава ряда архитектурных белков в районе 3C6/C7.

Научная новизна. Найдена короткая последовательность регуляторной зоны гена Notch, необходимая и достаточная для формирования декомпактного состояния хроматина в эктопическом генетическом окружении. Показано сохранение свойств хроматина междискового района 3C6/C7 в эктопическом генетическом окружении. В регуляторную зону гена Notch впервые введён attP сайт. Впервые получена и апробирована система для проведения направленного мутагенеза регуляторной зоны гена Notch в линиях мух Drosophila. Получены и охарактеризованы линии мух, несущие направленные делеции регуляторной зоны гена Notch.

Положения, выносимые на защиту. Ключевые междисковые последовательности сохраняют автономность в эктопическом генетическом окружении. Минимальная последовательность ДНК из 5' регуляторной зоны гена Notch, длиной 276 п.н., вызывает образование междиска в эктопическом генетическом окружении. Делеции 5' регуляторной зоны гена Notch в сочетании со встройкой в первый интрон вызывают нарушения структуры глаз. Делеция инсуляторного района приводит к изчезновению междиска 3С6-7 и сайтов связывания инсуляторных белков.

Теоретическая и научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о регуляции гена Notch -одного из важнейших генов развития многоклеточных организмов, включая человека. Полученные результаты представляют интерес для всех биологов, занимающимися вопросами развития. Материалы данной диссертационной работы вошли в методические рекомендации по применению инструментов редактирования для модификации геномов животных и культивируемых клеток для специалистов, студентов и аспирантов. Работа является одной из первых, где апробированы новые методы направленной гомологичной рекомбинации в получении мутаций регуляторной области гена Notch дрозофилы. Степень достоверности результатов и апробация работы. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, достоверны, что подтверждается логической обоснованностью выводов и согласованностью с результатами других исследовательских групп. Полученные в ходе работы данные были представлены на Международной конференции «Хромосома», Новосибирск, 2018 и Всероссийской конференции «Дрозофила в генетике и медицине», Гатчина, 2017.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 5, одна глава в книге, тезисов докладов и материалов конференций - 2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Volkova E.I., Andreyenkova N.G., Andreyenkov O.V., Sidorenko D.S., Zhimulev I.F., Demakov S.A. Structural and functional dissection of the 5' region of the Notch gene in Drosophila melanogaster // Genes. 2019. V. 10. P. 1037

Andreyenkov O.V., Volkova E.I., Andreyenkova N.G., Demakov S.A. The study of the regulatory region of the Drosophila melanogaster Notch gene by new methods of directed genome editing. // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2019. Т. 23. с. 199-202.

Андреенков О.В., Волкова Е.И., Семешин В.Ф., Жимулев И.Ф., Демаков С.А. Структурные особенности организации хроматина междиска 3С6/С7 политенных хромосом Drosophila melanogaster // Цитология. 2013. Т.55. с. 198-203.

Андреенков О.В., Волкова Е.И., Демаков С.А., Семешин В.Ф., Жимулев И.Ф. Декомпактное состояние хроматина междиска из района 3С6/С7 политенных хромосом

D. melanogaster определяется короткой последовательностью ДНК // Доклады Академии Наук. 2010. Т. 431. с. 119-122.

Демаков С.А., Андреенков О.В., Беркаева М.Б., Ватолина Т.Ю., Волкова Е.И., Квон

E.З., Семешин В.Ф., Жимулев И.Ф. Функциональная организация междисков политенных хромосом дрозофилы. // Генетика. 2010. Т. 46. с. 1421-1423.

Андреенков О.В., Волкова Е.И., Демаков С.А. Применение CRISPR/Cas9 для получения в геноме Drosophila melanogaster направленных делеций и введения сайта интеграции из системы attP/attB фага фС31. В кн. Методы редактирования генов и геномов (отв. ред. Закиян С.М., Медведев С.П., Дементьева Е.В., Власов В.В.). Новосибирск: Издательство СО РАН, 2020, гл. 8, с. 117-131.

Андреенков О.В., Андреенкова Н.Г., Волкова Е.И., Демаков С.А. Получение направленных делеций в регуляторной зоне гена Notch с использованием CRISPR/Cas-опосредованного метода редактирования геномов // Международная конференция «Хромосома». Россия. Новосибирск. 2018. Материалы. с. 92.

Андреенкова Н.Г., Андреенков О.В., Волкова Е.И., Демаков С.А., Мальцева С.В. Исследование регуляторной зоны гена Notch Drosophila melanogaster методом CRISPR/Cas9-индуцированной гомологичной рекомбинации // Всероссийская конференция «Дрозофила в генетике и медицине». Гатчина. 2017. Сборник тезисов. с. 58.

Вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и обработка полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Электронные микрофотографии препаратов политенных хромосом слюнных желез сделаны В.Ф. Семешиным и С.А. Демаковым. Статистическая обработка данных, отдельные клонирования, трансформация части линий дрозофилы, проводились Н.Г. Андреенковой и Е.И. Волковой.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 3 таблицы и иллюстрирована 31 рисунком. В списке литературы приведен 136 источник.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация политенных хромосом (общие сведения)

Политенные хромосомы были открыты в 1881 г. Э. Бальбиани в ядрах клеток целого ряда тканей и органов личинок Chironomus plumosus. Затем, приблизительно в то же время, они были найдены Карнуа (Camoy, 1884 (цит. по: Cooper, 1938)) у представителей нескольких отрядов насекомых (перепончатокрылые, сетчатокрылые, жесткокрылые и стрекозы) и у моллюсков, однако более поздние исследователи не подтвердили его наблюдения. Образование политенных хромосом происходит в ходе последовательности специфических циклов эндомитоза. Термин эндомитоз впервые был использован Лотаром Гейтлером (Geitler, 1939), описавшим в различных тканях клопов-водомерок Gerris lateralis цикл изменений в хромосомах, сопровождающих их редупликацию и деление. Согласно современным данным, в процессе эндомитоза, в отличие от митоза, не образуется веретена деления, отсутствует стадия экваториальной пластинки, на протяжении всего цикла ядерная стенка остается интактной и таким образом, клеточный цикл содержит лишь S и G фазы. В результате происходит образование хромосом, состоящих из сотен и более (до десятков тысяч) гомологичных нитей - хроматид, которые у некоторых видов оказываются тесно коньюгированы между собой на всем протяжении. Такая тесная конъюгация большого количества отдельных нитей обуславливает гигантские размеры и характерный рисунок поперечной исчерченности «классических» политенных хромосом. Таким образом, политенные хромосомы могут рассматриваться как особый тип интерфазных хромосом, то есть хромосом, находящихся в максимально декомпактизированном, генетически активном состоянии. При этом за счет огромных размеров, они представляют собой уникальную модель интерфазной хромосомы, удобную для изучения цитологическими методами (Sidorenko et al., 2019).

Уже к концу 30-х годов прошлого века было известно большое количество примеров политении, в частности в некоторых тканях двукрылых, включая слюнные железы и питающие клетки ооцитов Drosophila (Cooper, 1938; Painter, Reindorp, 1939). Политенные хромосомы слюнных желез личинок Drosophila melanogaster на

сегодняшний день наиболее исследованны с точки зрения организации хромосом у многоклеточных организмов.

Характерная поперечная исчерченность политенных хромосом определяется порядком расположения конденсированных хроматиновых структур (хромомеров, дисков) и менее плотных межхромомеров (междисков). Наличие характерного стабильно воспроизводящегося в ряду поколений рисунка поперечной исчерченности сделало возможным построение цитологических карт политенных хромосом слюнных желез личинок Drosophila melanogaster (Bridges, 1935). Согласно Бриджесу, каждое большое плечо хромосом было разделено на 20 секций и еще 2 секции приходятся на короткую четвертую хромосому. Таким образом, весь геном дрозофилы разбит на 102 секции, примерно одинаковых по длине, со сквозной нумерацией, начинающейся с теломерного района Х-хромосомы и заканчивающейся теломерой хромосомы 4. Каждая секция начинается с хорошо выявляемого диска и разделена на шесть подсекций. Секции маркируются цифрой и делятся на 6 районов с буквенной маркировкой от A до F.

Нужно отметить, что возможности выявления тонких деталей диск-междисковой структуры политенных хромосом зависят от способа и качества получения цитологических препаратов: применяемых фиксаторов, степени растянутости хромосом на препарате, разрешения микроскопической техники, а также от физиологических особенностей и стадии развития, в ходе которого отдельные диски могут деконденсироваться с образованием пуфов. Это приводит к расхождениям в оценке общего количества дисков в определенном районе в работах разных авторов (Saura et al., 1994, 1996; Semeshin et al., 1982).

Представление о политенных хромосомах, как о материальном носителе наследственной информации, утвердилось ещё к 1930-м годам, но даже после работ Бриджеса по созданию карт политенных хромосом, вопрос о генетическом содержании конкретных структур политенных хромосом очень долгое время оставался предметом для дискуссий. Несмотря на огромный прогресс, многие аспекты до сих пор остаются неисследованными. Так, в связи с малыми размерами и пониженным содержанием ДНК, организация межхромомеров остается наименее изученной.

1.2. Цитологическая организация локуса Notch

Проблема соотнесения хромомерной организации хромосом с расположением генов имеет давнюю историю. Различные модели генетической организации дисков и междисков предлагались, начиная с 1930-х годов (см.: Жимулёв, 1992). Первый пик работ, направленных на установление взаимосвязи между молекулярно-генетической и цитологической картами пришелся на период 1970-х годов. В этот период был сделан ряд работ (Welshons, Keppy 1975; Keppy, Welshons 1977, 1980) по делеционному анализу междиска 3C6/3C7. Наличие нескольких уникальных особенностей района привело к тому, что к настоящему времени молекулярная организация междиска 3C6/3C7 оказалась наиболее хорошо изучена. Было в частности показано, что в диске 3С7 расположен ген Notch. Локус Notch является объектом интенсивного изучения с момента открытия в 1919 (Mohr, 1919). За это время было найдено и охарактеризовано большое число мутаций, влияющих на активность гена. Также на основе экспериментов по созданию искусственных дисков в 3C районе был обоснован общий вывод, что один диск не всегда должен соответствовать одному гену (Keppy, Welshons, 1980).

С междиском 3C6/3C7 связана уникальная ситуация, когда непротяженная (около 880 п.н.) делеция faswb, приводит к характерным цитологическим изменениям, выражающимся в исчезновении междиска и слиянии двух смежных дисков (Keppy, Welshons, 1977). Эти цитологические изменения сопровождаются фенотипическими изменениями на уровне взрослого организма - нарушением упорядоченной структуры организации сложного глаза имаго.

Был сделан вывод, что делеция не захватывает сам ген, а только сдвигает его в чуждое генетическое окружение и тем самым оказывает влияние на его нормальное функционирование (Keppy, Welshons, 1977; Grimwade et al., 1985; Welshons, Welshons, 1985). Такой вывод был основан на существовании целого ряда хромосомных перестроек, которые подавляют проявления делеции в положении in cis. Такие перестройки включают делеции с проксимальной точкой разрыва, расположенной в

дисках 3C6 и 3C3,5 и инверсию (In(1)3A2-3; 3C3-5). В целом, делеционный анализ позволил уточнить положение гена Notch на цитологической карте.

Детальная организация района 3C6/3C7 была исследована в работе Риковски с соавторами (Rykowski et al., 1988). Авторы соотнесли молекулярную карту локуса Notch с цитологической картой политенных хромосом слюнных желёз в районе. В работе использовалась высокоразрешающая гибридизация in situ, основанная на появившихся к тому моменту новых технических возможностях: охлаждаемой ПЗС-матрице и компьютерном анализе изображений. В отдельных случаях удалось добиться разрешающей способности в 3 т.п.н. Авторы считали данное разрешение максимально возможным в связи с тем, что границы дисков зависят от степени растянутости хромосом. Было показано, что кодирующая часть гена Notch полностью входит в состав диска 3С7, а междиск с 5' конца Notch содержит предполагаемые регуляторные последовательности Notch. Степень конденсации хроматина в районе оценивалась исходя из физических размеров хромомеров и межхромомеров, а также из относительного местоположения и размеров (в нуклеотидных парах) использованных для in situ зондов. Полученные данные подтверждают модель, согласно которой хроматин диска конденсирован до уровня 30 нм нитей. Междисковая ДНК представлена 10 нм нуклеосомной нитью, что согласуется с данными работы (Ananiev, Barsky, 1985).

1.3. Краткая функциональная характеристика гена Notch

Ген Notch является центральным звеном эволюционно-консервативной генной сети, управляющей процессами развития у многоклеточных организмов (Fortini, 2009; Kopan, Ilagan, 2009; Tien et al., 2009). Подобно другим передающим каскадам, она определяет судьбу дифференцирующихся клеток в разное время и в разных зачатках развивающегося организма (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Portin, 2002). Сигнальный каскад Notch служит для разделения нейрального и эпидермального зачатков, передавая сигналы от презумптивных нервных клеток, запрещающие соседним клеткам дифференцировку в нервную ткань (Heitzler, Simpson, 1991; Campuzano, Modolell, 1992).

Этот механизм основан на лиганд-рецепторном взаимодействии между соседними клетками. Продукт гена Notch представляет собой трансмембранный рецепторный белок, а его лигандами являются продукты генов комплекса DSL: Delta, Serrate, Lag2, также являющиеся трансмембранными белками. Лиганд-рецепторное взаимодействие в

каскаде происходит при прямом контакте соседних клеток. За связывание с лигандами отвечает N-концевой экстраклеточный домен белка, в состав которого входит 36 EGF-повторов и три lin12/Notch повтора (Wharton et al., 1985). С лигандами взаимодействуют 11-й и 12-й повторы. Также в состав белка входят трансмембранный и C-концевой внутриклеточный домены.

Процессинг рецепторного белка включает в себя несколько стадий, в процессе которых происходит его расщепление специфическими протеазами. Взаимодействие с лигандом запускает необратимое отщепление внутриклеточного домена, который направляется в ядро, где входит в состав комплекса, активирующего транскрипцию генов-мишеней. Таким образом, на каждом этапе передачи сигнала задействовано большое количество белков. Одной из ключевых особенностей системы передачи сигнала является то, что рецептор Notch необратимо расщепляется в процессе передачи сигнала. Поэтому передача сигнала на этом этапе происходит без усиления (см. для обзора Катанаев, Крючков, 2011).

Выбор пути дифференцировки клеток нейроэктодермы осуществляется под контролем Notch через механизм латерального ингибирования. Такое название носят специфические межклеточные взаимодействия. В процессе дифференцировки клеток периферической нервной системы, в пронейрональном кластере выделяются клетки с нейрональным путем развития, они начинают подавлять экспрессию пронейрональных генов в соседних клетках. Это не дает возможности для дифференцировки соседних клеток в нейроны и переключает их на эпидермальный путь развития (Artavanis-Tsakonas et al., 1999).

Сигнальный путь Notch регулирует локальные взаимодействиями между клетками. Обе взаимодействующие клетки несут на клеточной мембране как рецепторы Notch, так и их DSL-лиганды. При взаимодействии наблюдается транс-активация и, соответственно, цис-ингибирование лигандами рецептора. Обратные связи, приводящие к усилению транскрипции Notch и ослаблению синтеза лиганда, происходят в обоих взаимодействующих клетках, но в результате конкурентных взаимодействий, если Notch-каскад одной из клеток получает хотя бы небольшое преимущество, оно быстро перерастает в ситуацию, когда в этой клетке каскад оказывается активирован, а в соседней - подавлен. Такой конкурентный процесс лежит в основе механизма латерального ингибирования (см. для обзора Катанаев, Крючков, 2011). Также

существуют свидетельства того, что функции гена не ограничиваются процессами латерального ингибирования, в частности, ген функционирует и на этапе закладки органов нейронального происхождения (Вгеппаи, 1997).

и и и и

Очень удобной модельной системой для исследования влияния сигнальных путей, включая Notch-каскад, на процессы клеточной дифференцировки является глаз дрозофилы. Глаз взрослого насекомого - это сложно организованный орган фасеточного типа, состоящий из большого количества однотипных единиц - упорядоченных гексагональных структур, омматидиев. В состав каждого из 700-800 омматидиев глаза входят несколько систем. Это диоптрический аппарат, состоящий из роговичной линзы и кристаллического конуса. Диоптрический аппарат имеет неклеточную природу, но в его образовании участвуют две корнеагенные и четыре конусные клетки. Задача диоптрического аппарата - собирание и фокусировка света. Вторая система глаза -экранирующий аппарат, состоящий из пигментных клеток. Две первичные пигментные клетки образуются при дальнейшей дифференцировке корнеагенных, а вторичные и третичные пигментные клетки сосредоточены по граням и вершинам соседствующих омматидиев и, таким образом, входят в состав двух или трёх соседних омматидиев. Задача экранирующего аппарата - не допустить боковую засветку. Третья, наиболее сложная и самая важная система глаза - светочувствительный аппарат, состоящий из восьми удлиненных светочувствительных клеток - фоторецепторов. За световосприятие и генерацию нервного импульса в каждом фоторецепторе отвечает специальная органелла - рабдомер.

Дифференцировка клеток глазо-антенального имагинального диска дрозофилы начинается в третьем личиночном возрасте после завершения деления клеток в образовавшмся к этому времени клеточном эпителиальном монослое. Фронт дифференцировки, так называемая морфогенетическая борозда, последовательно проходит от заднего к переднему краю имагинального диска. Сначала на нейрональный путь развития вступают клетки - будущие фоторецепторы R8, затем, по мере продвижения и удаления фронта морфогенетической борозды, окружающие их клетки специализируются в фоторецепторы затем выделяются будущие фоторецепторы

R1 и R6. Последней из фоторецепторных клеток встаёт на путь дифференцировки предшественник R7. Вслед за фоторецепторными клетками, под влиянием сигналов, приходящих от уже специализировавшихся клеток, происходит выделение и

специализация конусных, пигментных клеток, клеток, образующих щетинки с их механочувствительным аппаратом. Также в процессе дифференцировки проходят две последовательных волны апоптоза, приводящие к гибели недифференцированных клеток, ненужных для дальнейшего развития глаза.

Следует отметить, что в глазу существует передне-задняя ось симметрии или экватор, относительно которого омматидии обладают свойством хиральности. Это обеспечивает различие в расположении фоторецепторов в омматидиях в вентральной и дорсальной половинах глаза.

В процессе дифференцировки клеток глазного имагинального диска Notch-каскад задействован сразу на нескольких этапах развития. На раннем этапе ген Notch активен в клетках, расположенных вблизи экватора и, таким образом, отвечает за хиральность омматидиев. Полная потеря активности гена Notch приводит к потере глаза, избыточная - к перерастанию глазной ткани (Papayannopoulos et al., 1998). На более поздних этапах, сигнальный путь Notch задействован в дифференцировке клетки-предшественника фоторецептора R7 и в развитии щетинки. Notch-каскад в клетке-предшественнице фоторецептора R7 активируется лигандами Delta двух окружающих клеток (будущие фоторецепторы R1 и R6), в то время как сами предшественники R1 и R6 получают активационный сигнал только от R7. В результате, активность Notch-каскада в R7 возрастает, а в соседних клетках уменьшается, и клетка-предшественница фоторецептора R7 первой становится на путь специализации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Андреенков Олег Владимирович, 2022 год

Список литературы

1. Горчаков А.А., Демаков С.А., Шварц Ю.Б. Создание удобного вектора трансформации дрозофилы с функциональными сайтами FRT - pFRT // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. N. 5. С. 820-824.

2. Жимулёв И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. // Новосибирск: Наука. 1992. 480 с.

3. Зимин П.И., Горчаков А.А., Демаков С.А., Жимулев И.Ф. Создание новой конструкции для клонирования ДНК и моделирования структур политенных хромосом дрозофилы // Молекулярная Биология. 2004. Т.38. С.250-255.

4. Катанаев В.Л., Крючков М.В, Глаз Дрозофилы как модельная система для изучения внутриклеточной передачи сигнала при онтогенезе и патогенезе // Успехи биологической химии. 2011. С. 401-458.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // Москва: Мир. 1984. 480 с.

6. Abu-Issa R., Cavicchi S. Genetic interactions among vestigial, hairy, and notch suggest a role of vestigial in the differentiation of epidermal and neural cells of the wing and halter of Drosophila melanogaster // J. Neurogenetics. 1996. V. 10, P. 239-246.

7. Ananiev E.V., Barsky V.E. Elementary structures in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1985 V. 93. P. 104-112.

8. Andrey G., Mundlos S. The three-dimensional genome: regulating gene expression during pluripotency and development // Development. 2017. V. 144, P. 3646-3658.

9. Arkhipova, I.R. Promoter elements in Drosophila melanogaster revealed by sequence analysis // Genetics. 1995. V. 139. P. 1359-1369.

10. Artavanis-Tsakonas S., Matsuno K., Fortini M.E. Notch signaling // Science. 1995. V. 268. P. 225-232.

11. Artavanis-Tsakonas S., Rand M.D., Lake R.J. Notch Signaling: Cell fate control and signal integration in development // Science. 1999. V. 284. P. 770-776.

12. Arzate-Mejia R.G., Cerecedo-Castillo A.J., Guerrero G., Furlan-Magaril M., Recillas-Targa F. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila // Nature Communications. 2020. V. 11. Article number. 894.

13. Atchison M.L. Enhancers: mechanism of action and cell specificity // Annu. Rev.Cell Biol. 1988. V. 4. P. 127-153.

14. Bag I., Chen S., Rosin L.F., Chen Y., Liu C.-Y., Yu G.-Y., Lei E.P. M1BP cooperates with CP190 to activate transcription at TAD borders and promote chromatin insulator activity // Nat. comm. 2021 V. 12. Article number 4170.

15. Basler K., Yen D., Tomlinson A., Hafen E. Reprogramming cell fate in the developing Drosophila retina: transformation of R7 cells by ectopic expression of rough // Genes and Development. 1990. V. 4. P. 728-39.

16. Baonza A., Freeman M. Notch signalling and the initiation of neural development in the Drosophila eye. // Development. 2001. V. 128. P. 3889-3898.

17. Barski A., Cuddapah S., Cui K., Roh T.Y., Schones D.E., Wang Z., Wei G., Chepelev I., and Zhao K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome // Cell. 2007. V. 129. P. 823-837.

18. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene // Nature. 2000. 405. P. 482-485.

19. Benson D.A., Cavanaugh M., Clark K., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Sayers E.W. GenBank // Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41(Database issue): D36-D42.

20. Bowtell D.D., Kimmel B.E., Simon M.A., Rubin G.M. Regulation of the complex pattern of sevenless expression in the developing Drosophila eye // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989. V.86. P. 6245-6249.

21. Braunschweig U., Hogan G.J., Pagie L., van Steensel B. Histone H1 binding is inhibited by histone variant H3.3. // EMBO J. 2009. V. 28 P. 3635-3645.

22. Brennan K. A functional analysis of Notch mutations in Drosophila // Genetics. 1997. V. 147. P. 177-188.

23. Bridges C.B. Salivary chromosome maps with a key to the banding of thechromosomes of Drosophila melanogaster // J. Hered. 1935. V. 26. P. 60-64.

24. Bridges C.B. A revised map of the salivary gland X-chromosome of Drosophila melanogaster // J. Hered. 1938. V. 29. P. 11-13.

25. Burke T.W., Kadonaga J.T. Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box deficient promoters // Genes Dev. 1996. V. 10 P. 711-724.

26. Burke T.W., Kadonaga J. T. The downstream core promoter element, DPE, is

conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 3020-3031.

27. Bushey A.M., Ramos E., Corces V.G. Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions // Genes Dev. 2009. V. 23. P. 133850.

28. Cagan R.L., Ready D.F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 1099-1112.

29. Calvin N.M., Hanawalt P.C. High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 2796-801.

30. Campuzano S., Modolell J. Patterning of the Drosophila nervous system: The achaete-scute system. // Trends Genet. 1992. V. 8. P. 202-208.

31. Celniker S.E., Dillon L.A., Gerstein M.B., Gunsalus K.C., Henikoff S., Karpen G.H., Kellis M., Lai E.C., Lieb J.D., MacAlpine D.M., Micklem G., Piano, F., Snyder M., Stein L., White K.P., Waterston R.H. and modENCODE Consortium. Unlocking the secrets of the genome // Nature. 2009. V. 18. P. 927-930.

32. Cockerill P.N. Structure and function of active chromatin and DNase I hypersensitive sites // FEBS J. 2011 V. 278. P. 2182-210.

33. Cooper K.W. Concerning the origin of the polytene chromosomes of Diptera // PNAS. 1938. V. 24. P. 452-458.

34. Cuddapah S., Jothi R., Schones D.E., Roh T.-Y., Cui K., Zhao K. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains // Genome Res. 2009. V. 1. P. 24-32.

35. Dekker J., Rippe K., Dekker M., Kleckner N. Capturing chromosome conformation // Science. 2002. V. 295. P. 1306-1311.

36. Demakov S., Gortchakov A., Schwartz Y., Semeshin V., Campuzano S., Modolell J., Zhimulev I. Molecular and genetic organization of Drosophila melanogaster polytene chromosomes: evidence for two types of interband regions // Genetica. 2004. V. 122. P. 311-324.

37. Dower W.J., Miller J.F., Ragsdale C.W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 6127-6145.

38. Fahmy O. G., Fahmy M. J. Report of O.G and M.J. Fahmy // Drosophila Information Service. 1960. V. 34. P. 49.

39. Epper F. The Evagination of the genital imaginal discs of Drosophila melanogaster. I. Morphogenesis of the female genital disc // Roux's Arch. Dev. Biol. 1983. V. 192. P. 275-279.

40. Estrada B., Casares F., Sa'nchez-Herrero E. Development of the genitalia in Drosophila melanogaster // Differentiation. 2003. V. 71. P. 299-310.

41. Filippova G.N., Fagerlie S., Klenova E.M., Myers C., Dehner Y., Goodwin G., Neiman P.E., Collins S.J., Lobanenkov V.V. An exceptionally conserved transcriptional repressor, CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 6. P. 2802-2813.

42. Fogerty F.J., Juang J.-L., Petersen J., Clark M.J., Hoffmann F.M., Mosher D.F. Dominant effects of the bcr-abl oncogene on Drosophila morphogenesis // Oncogene. 1999. V. 18. P. 219-232.

43. Fortini, M.E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation // Dev. Cell. 2009. V. 16. P. 633-647.

44. Garabedian M.J., Hung M.C., Wensink P.C. Independent control elements that determine yolk protein gene expression in alternative Drosophila tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 1396-1400.

45. Garabedian M.J., Shepard B.M., Wensink P. C. A tissue-specific transcription enhancer from the Drosophila yolk protein I gene // Cell. 1986. V. 45 P. 859-867.

46. Gazave E., Lapebie P., Richards G.S., Brunet F., Ereskovsky A.V., Degnan B.M., Borchiellini C., Vervoort M., Renard E. Origin and evolution of the Notch signalling pathway: an overview from eukaryotic genomes // BMC Evol Biol. 2009. V. 9. P. 249.

47. Geitler L. Die Entstehung der polyploiden Somakerne der Heteropteren durch Chromosomenteilung ohne Kernteilung // Chromosoma. 1939. V. 1. P. 1-22.

48. Gerasimova T.I., Lei E.P., Bushey A.M., Corces V.G. Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila // Mol Cell. 2007. V. 28. P. 761-72.

49. Gerhart J. 1998 Warkany lecture: signaling pathways in development // Teratology. 1999. V. 60. P. 226-239.

50. Gho M., Bellaiche Y., Schweisguth F. Revisitingthe Drosophila microchaete lineage: A novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. // Development. 1999. V. 126. P. 3573-3584.

51. Golic M.M., Rong Y.S., Petersen R.B., Lindquist S.L., Golic K.G. FLP-mediated DNA mobilization to specific target sites in Drosophila chromosomes // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3665-3671.

52. Golic K.G., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V. 59. P. 499-509.

53. Gorfinkiel N., Sánchez L., Guerrero I. Drosophila terminaba as an appendage-like structure // Mechanisms of Development. 1999. V. 86. P. 113-123.

54. Gratz S.J., Ukken F.P., Rubinstein C.D., Thiede G., Donohue L.K., Cummings A.M., O'Connor-Giles K.M. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila // Genetics. 2014. V. 196. P. 961-971.

55. Grimwade B.G., Muskavitch M.A., Welshons W.J., Yedvobnick B., Artavanis-Tsakonas S. The molecular genetics of the Notch locus in Drosophila melanogaster // Dev. Biol. 1985. V. 107. P. 503-519.

56. Gross D.S., Garrard W.T. Nuclease hypersensitive sites in chromatin // Ann. Rev. Biochem. 1988. V. 57. P. 159-197.

57. Harmston N., Ing-Simmons E., Tan G., Perry M., Merkenschlager M., Lenhard B. Topologically associating domains are ancient features that coincide with Metazoan clusters of extreme noncoding conservation // Nat. Comm. 2017. V. 8. Article number 441.

58. Heitzler P., Simpson P. The choice of cell fate in the epidermis of Drosophila // Cell. 1991. V. 64. P. 1083-1092.

59. Hing H.K., Sun X., Artavanis-Tsakonas S. Modulation of wingless signaling by Notch in Drosophila // Mechanisms of Development. 1994. V. 47. P. 261-268.

60. Hou C., Li L., Qin Z.S., Corces V.G. Gene density, transcription, and insulators contribute to the partition of the Drosophila genome into physical domains // Mol. Cell 2012. V. 48. P. 471-484.

61. Huang J., Zhou W., Watson A.M., Jan Y.N., Hong Y. Efficient ends-out gene targeting in Drosophila // Genetics. 2008. V. 180. P. 703-707.

62. Inés O. C. Analysis of the determination of testis development in Drosophila melanogaster // Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares. Madrid. 2017

63. Jin C., Zang C., Wei G., Cui K., Peng W., Zhao K., Felsenfeld, G. H3.3/H2A.Z double variant-containing nucleosomes mark 'nucleosome-free regions' of active promoters and other regulatory regions. // Nat. Genet. 2009. V. 41. P. 941-945.

64. Jordan K., Schaeffer V., Fischer K.A., Gray E.E., Ruohola-Baker H. Notch signaling through Tramtrack bypasses the mitosis promoting activity of the JNK pathway in the mitotic-to-endocycle transition of Drosophila follicle cells. // BMC Dev. Biol. 2006. V. 6. P. 16.

65. Keene M.A., Corces V., Lowenhaupt K., Elgin S.C. DNase I hypersensitive sites in Drosophila chromatin occur at the 5' ends of regions of transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 143-146.

66. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay // Molecular and Cellular Biology. 1992. V. 12. P. 2424-2431.

67. Kelley M.R., Kidd S., Deutsch W.A., Young M.W. Mutations altering the structure of epidermal growth factor-like coding sequences at the Drosophila Notch locus // Cell. 1987. V. 51. P. 539-548.

68. Keppy D.O., Welshons W.J. The cytogenetics of a recessive visible mutant associated with a deficiency adjacent to the Notch locus in Drosophila melanogaster // Genetics. 1977. V. 85. P. 497-506.

69. Keppy D.O., Welshons W.J. The Synthesis of Compound Bands in Drosophila melanogaster Salivary Gland Chromosomes // Chromosoma. 1980. V. 76. P. 191-200.

70. Kidd S., Lockett T.J., Young M.W. The Notch locus of Drosophila melanogaster // Cell. 1983. V. 34. P. 421-433.

71. Kim T.H., Abdullaev Z.K., Smith A.D., Ching K.A., Loukinov D.I., Green R.D., Zhang M.Q., Lobanenkov V.V., Ren B. Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in the human genome // Cell. 2007. V. 128. P. 1231-1245.

72. Kidd S., Kelley M.R., Young M.W. Sequence of the Notch locus of Drosophila melanogaster. Relationship of the encoded protein to mammalian clotting and growth factors // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 3094-3108.

73. Kopan R., Ilagan M.X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism // Cell. 2009. V. 137. P. 216-233.

74. Kroeger H. Hypo- and hyperdevelopment of the male genital apparatus and the Bd-M combination in Drosophila melanogaster. // J. Morphol. 1960. V. 107. P. 227-232.

75. Laktionov P.P., White-Cooper H., Maksimov D.A., Belyakin S.N. Transcription factor COMR acts as a direct activator in the genetic program controlling spermatogenesis in D. melanogaster // Mol. Biol. 2014. V. 48. P. 153-165.

76. Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. 190. V. 9. P. 676-679.

77. Lee G., Liang C., Park G., Jang C., Jung J.U., Chung J. UVRAG is required for organ rotation by regulating Notch endocytosis in Drosophila // Developmental Biology. 2011. V. 356. P. 588-597.

78. Lefevre G., Kelley Jr., Kelley J. Strawberry vs. facet-glossy, a locus correction // Drosophila Information Service. 1972. V. 48. P. 146-147.

79. Lefevre G. Jr. A photographic representation and interpretation of the polytene chromosomes of Drosophila melanogaster salivary glands // The genetics and biology of Drosophila/ Eds. M. Ashburner, E. Novitski. - London: Academic Press. 1976. V. 1a. P. 31-66.

80. Li J., Gilmour D.S. Distinct mechanisms of transcriptional pausing orchestrated by GAGA factor and M1BP, a novel transcription factor // EMBO J. 2013. V. 32. P. 18291841.

81. Lieberman-Aiden E., van Berkum N.L., Williams L., Imakaev M., Ragoczy T., Telling A., Amit I., Lajoie B.R., Sabo P.J., Dorschner M.O., Sandstrom R., Bernstein B., Bender M.A., Groudine M., Gnirke A., Stamatoyannopoulos J., Mirny L.A., Lander E.S., Dekker J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome // Science. 2009. V. 326. P. 289-293.

82. Lopez-Schier H., St. Johnston D. Delta signaling from the germ line controls the proliferation and differentiationof the somatic follicle cells during Drosophila oogenesis // Genes Dev. 2001, 15, 1393-1405.

83. Lupiânez D.G., Kraft K., Heinrich V., Krawitz P., Brancati F., Klopocki E., Horn D., Kayserili H., Opitz J.M., Laxova R., Santos-Simarro F., Gilbert-Dussardier B., Wittler L., Borschiwer M., Haas S.A., Osterwalder M., Franke M., Timmermann B., Hecht J., Spielmann M., Visel A., Mundlos S. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions // Cell. 2015. V. 161. P. 10121025.

84. Lyman D., Young M.W. Further evidence for function of the Drosophila Notch protein

as a transmembrane receptor. // Proc. Natl. Acad. Sc.i USA. 1993. V. 90. P, 1039510399.

85. Markopoulou K. Phenotypic and molecular analysis of the facet, a group of intronic mutations at the Notch locus of Drosophila melanogaster which affect postembryonic development // Genetics. 1989. V. 122. P. 417-428.

86. Millau J.-F., Gaudreau L. CTCF, cohesin, and histone variants: connecting the genome // Biochem Cell Biol. 2011. V. 89. P. 505-513.

87. Moffat K.G., Gould J.H., Smith H.K., O'Kane C.J. Inducible cell ablation in Drosophila by cold-sensitive ricin A chain // Development. 1992. V. 114. P. 681-687.

88. Mohan M., Bartkuhn M., Herold M., Philippen A, Heinl N., Bardenhagen I., Leers J., White R.A.H., Renkawitz-Pohl R., Saumweber H., Renkawitz R. // The Drosophila insulator proteins CTCF and CP190 link enhancer blocking to body patterning EMBO J. 2007. V. 26. P. 4203-4214.

89. Mohr O. L. Character changes caused by mutation of an entire region of a chromosome in Drosophila // Genetics. 1919. V. 4. P. 275-282.

90. Nègre N. A Comprehensive map of insulator elements for the Drosophila genome // PLoS Genet. 2010. V. 6. e1000814.

91. Nora E.P., Goloborodko A., Valton A.-L., Gibcus J.H., Uebersohn A., Abdennur N. Dekker J., Mirny L.A., Bruneau B.G. Targeted degradation of CTCF decouples local insulation of chromosome domains from genomic compartmentalization // Cell. 2017. V. 169. P. 930-944.

92. Ohler U., Liao G.-C., Niemann H., Rubin G.M. Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome // Genome Biol. 2002. V.3. Article number: research0087.1.

93. Painter T. S., Reindorp E. Endomitosis in the nurse cells of the ovary of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1939. V 1. P. 276-283.

94. Papayannopoulos V., Tomlinson A., Panin V.M., Rauskolb C., Irvine K.D. Dorsalventral signaling in the Drosophila eye // Science. 1998 V. 281. P. 2031-2034.

95. Pile L.A., Wassarman D.A. Localizing transcription factors on chromatin by immunofluorescence // Methods. 2002. V. 26. P. 3-9.

96. Portin, P. General outlines of the molecular genetics of the Notch signalling pathway in Drosophila melanogaster: A review // Hereditas. 2002. V. 136. P. 89-96.

97. Ramirez F., Bhardwaj V., Arrigoni L., Lam K.C., Grüning B.A., Villaveces J., Habermann B., Akhtar A., Manke T. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies // Nat. Commun. 2018. V. 9. 189.

98. Ramos R.G.P., Grimwade B.G., Wharton K.A., Scottgale T.N., Artavanis-Tsakonas S. Physical and functional defenition of the Drosophila Notch locus by P element transformation // Genetics. 1989. V. 123. P. 337-348.

99. Rauskolb C., Irvine K.D. Notch-mediated segmentation and growth control of the Drosophila leg // Dev.Biol. 1999. V. 210. P. 339-350.

100. Rauskolb C. The establishment of segmentation in the Drosophila leg // Development. 2001. V. 128. P. 4511-4521.

101. Rebay M., Fehon R.G., Artavanis-Tsakonas S. Specific truncations of Drosophila Notch define dominant activated and dominant negative forms of the receptor // Cell. 1993. V. 74. P. 319-329.

102. Rowley, M. J., Nichols M.H., Lyu X., Ando-Kuri M., Rivera I.S.M., Hermetz K., Wang P., Ruan Y., Corces V.G. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization // Mol. Cell. 2017. V. 67. P. 837-852.

103. Rubin G.M., Spradling A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. V. 218. P. 348-353.

104. Rykowski M.C., Parmelee S.J., Agard D.A., Sedat J.W. Precise determination of the molecular limits of a polytene chromosome band: regulatory sequences for the Notch gene are in the interband // Cell. 1988. V. 54. P. 461-472.

105. Saura A.O., Heino T.I., Sorsa V. Electron micrograph map of the Drosophila melanogaster polytene chromosome 3R divisions 81 through 90 // Hereditas. 1994. V. 121. P. 1-20.

106. Saura A.O., Heino T.I., Sorsa V. Electron micrograph map of the Drosophila melanogaster polytene chromosome 3R divisions 91 through 100 // Hereditas. 1996. V. 124. P. 71-90.

107. Schwartz Y.B., Linder-Basso D., Kharchenko P.V., Tolstorukov M.Y., Kim M., Li H.-B., Gorchakov A.A., Minoda A., Shanower G., Alekseyenko A.A., Riddle N.C., Jung Y.L., Gu T., Plachetka A., Elgin S.C.R., Kuroda M.I., Park P.J., Savitsky M., Karpen G.H., Pirrotta V. Nature and function of insulator protein binding sites in the Drosophila genome // Genome Res. 2012. V. 11. P. 2188-2198.

1G8. Semeshin V.F., Baricheva E.M., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene chromosomes. I. Mapping of the 87A and 87C heat shock puffs in development // Chromosoma. 1982. V. 87. P. 229-237.

1G9. Semeshin V.F., Demakov S.A., Shloma V.V., Vatolina T.Yu., Gorchakov A.A., Zhimulev I.F. Interbands behave as decompacted autonomous units in Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Genetica. 2008. V. 132. P. 267-279.

11G. Sexton T., Yaffe E., Kenigsberg E., Bantignies F., Leblanc B., Hoichman M., Parrinello H., Tanay A., Cavalli G. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome // Cell. 2012. V. 148 P. 458-472.

111. Shaffer C.D., Wuller J.M., Elgin S.C.R. Preparation of Drosophila nuclei // Methods. Cell Biol. 1994. V.44. P. 185-189.

112. Shellenbarger D.L., Mohler J.D. Temperature sensitive mutations of the Notch locus of Drosophila melanogaster // Genetics. 1975. V. 81. P. 143-162.

113. Simón R., Aparicio R., Housden B.E., Bray S., Busturia A. Drosophila p53 controls Notch expression and balances apoptosis and proliferation // Apoptosis. 2014. V. 10. P. 1430-1443.

114. Sidorenko D.S., Zykova T.Yu., Khoroshko V.A., Pokholkova G.V., Demakov S.A., Larsson J., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Polytene chromosomes reflect functional organization of the Drosophila genome // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2019. Т. 23. с. 148-153.

115. Szabo Q., Bantignies F., Cavalli G. Principles of genome folding into topologically associating domains // Sci. Adv. 2019. V. 5. 1668.

116. Tien A.C., Rajan A., Bellen H.J. A Notch updated. J. Cell Biol. 2009 184: 621629.

117. Tomlinson A., Bowtell D.D.L., Hafen E., Rubin G.M. Localization of the sevenless protein, a putative receptor for positional information, in the eye imaginal disc of Drosophila // Cell. 1987. V. 51. P. 143-150.

118. Tomlinson A., Kimmel B.E., Rubin G.M. Rough, a Drosophila homeobox gene required in photoreceptors R2 and R5 for inductive interactions in the developing eye // Cell. 1988. V. 55. P. 771-784.

119. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of

higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. V. 185. P. 341-355.

120. Van Bortle K., Nichols M.H., Li L., Ong C.-T., Takenaka N., Qin Z.S., Corces V.G. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy // Genome Biol. 2014. V. 15. R82

121. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster // Genetics. 2000. V. 155. P. 1297-1311.

122. Vostrov A.A., Quitschke W.W. The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 33353-33359.

123. Wassarman D.A., Therrien M., Rubin G.M. The Ras signaling pathway in Drosophila // Current Opinion in Genetics & Development. 1995. V. 5. P. 44-50.

124. Welshons W. J., Keppy D. O. Intragenic deletions and salivary band relationships in Drosophila // Genetics. 1975. V. 80. P. 143-155.

125. Welshons W. J., Welshons H.J. Suppression of the facet-strawberry position effect in Drosophila by lesions adjacent to Notch // Genetics. 1985. V. 110. P. 465-477.

126. Welshons W. J., Welshons H.J. Enhancement and suppression of a euchromatic position effect at Notch in Drosophila // Genetics. 1986. V. 113. P. 337-354.

127. Wesley C.S., Saez L. Notch responds differently to Delta and Wingless in cultured Drosophila cells. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 9099-9101.

128. Wharton K.A., Johansen K.M., Xu T., Artavanis-Tsakonas S. Nucleotide sequence from the neurogenic locus notch implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF-like repeats // Cell. 1985. V. 43. P. 567-581.

129. Witcher M., Emerson B.M. Epigenetic silencing of the p16(INK4a) tumor suppressor is associated with loss of CTCF binding and a chromatin boundary // Mol. Cell. 2009. V. 34. P. 271-284.

130. Wolff T. Histological techniques for the Drosophila eye. Part II: Adult // Drosophila protocols / edited by Sullivan W., Ashburner M., Hawley R.S. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 2000. 728 p.

131. Wu C., Bingham P.M., Livak K.J., Holmgren R., Elgin S.C.R. The chromatin structure of specific genes: I. Evidence for higher order domains of defined DNA sequence // Cell. 1979. V. 16. P. 797-806.

132. Wutz G., Varnai C., Nagasaka K., Cisneros D.A., Stocsits R.R., Tang W.,

Schoenfelder S., Jessberger G., Muhar M., Hossain M.J., Walther N., Koch B., Kueblbeck M., Ellenberg J., Zuber J., Fraser P., Peters J.-M. Topologically associating domains and chromatin loops depend on cohesin and are regulated by CTCF, WAPL, and PDS5 proteins // EMBO J. 2017. V. 36. P. 3573-3599.

133. Xu T., Rebay I., Fleming R.J., Scottgale T.N., and Artavanis-Tsakonas S. The Notch locus and the genetic circuitry involved in early Drosophila neurogenesis // Genes and Development. 1990. V. 4. P. 464-475.

134. Quick Fly Genomic DNA Prep. BDGP Berkeley Drosophila Genome Project // http://www.fruitfly.org/about/methods/inverse.pcr.html

135. flyCRISPR Optimal Target Finder tool // http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/

136. Протокол реакции для секвенирования по Сенгеру: https://www.nimagen.com/media/1349/brightdye-protocol-v20.pdf