Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Евдокимовский, Эдуард Владимирович

• Евдокимовский, Эдуард Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Евдокимовский, Эдуард Владимирович

Список использованных сокращений:.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Митохондрии обладают собственным генетическим аппаратом.

1.2 Структура мтДНК.

1.3 Транскрипция мтДНК.

1.3.1 Продукты транскрипции мтДНК.

1.3.2 Механизм транскрипции и цис-действуюгцие элементы.

1.3.3 Процессинг и созревание РНК.

1.3.4 Факторы транскрипции.

1.4 Репликация мтДНК.

1.4.1 Ферменты репликации.

1.5 Роль митохондрий в апоптозе.

1.5.1 Апоптоз и митохондриальная пора permeability transition pore) - РТР.

1.6 Повышенный уровень повреждения мтДНК в норме и при окислительном стрессе.

1.7 Форменные элементы крови.

1.7.1 Необычная роль митохондрий в процессе жизнедеятельности нейтрофилов и эозинофилов.

2. Материалы и методы.

2.1 Лабораторные животные.

2.2 Рентгеновское облучение.

2.3 Проточная цитометрия.

2.4 Выделение митохондрий из печени мышей.

2.5 Выделение ДНК.

2.5.1 Выделение ДНК из форменных элементов крови.

2.5.2 Выделение ДНК из сыворотки крови сорбция на магнитных сорбентах).

2.5.3 Выделение ДНК из митохондрий.

2.6 Выделение РНК.

2.7 Обработка РНК ДНК-азой.

2.8 Обратная транскрипция.

2.9 ГТЦР в реальном времени.

2.10 Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.11 Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в полйакриламидном геле.

2.12 Визуализация фрагментов ДНК в полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра.

3. Результаты исследований и обсуждение.

3.1 Количественная оценка числа копий мтДНК и ее транскриптов в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.

3.1.1 Определение количества копий мтДНК в ядросодержащих клетках крови контрольных вышей.

3.1.2 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови контрольных мышей.

3.2 Функционирование митохондриального генетического аппарата в ядросодержащих клетках крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

3.2.1 Популяционный состав ядросодержащих клеток крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

3.2.2 Копийность мтДНК в клетках крови контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.2.3 Количество митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке контрольных и облученных в дозе 1 Гр мышей.

3.2.4 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови облученных в дозе 1 Гр мышей.

3.3 Исследование нарушения функционирования митохондриального генома в крови мышей, облученных в дозе 10 Гр.

3.3.1 Радиационно-индуцированное изменение популяций ядросодержащих клеток крови мышей.

3.3.2 Копийность мтДНК в клетках крови облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.3 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.4 Количество митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.5 Отношение мтДНК/яДНК как возможный показатель клеточной гибели.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении»

Два последних десятилетия в молекулярной генетике можно смело назвать «веком митохондриальной ДНК». Это связано с тем, что именно в это время появились сведения о большом числе заболеваний, вызванных дисфункцией митохондрий и, в отдельных случаях, дефектами в митохондриальном геноме (Wallace 2005). В настоящее время установлена структура мтДНК, расположение ее генов на разных цепях, особенности репликации и транскрипции, а также регуляция этих процессов ядерными факторами в условиях физиологической нормы (Fernandez-Silva et al., 2003). В то же время механизмы, лежащие в основе поддержания числа копий мтДНК и уровня транскрипции митохондриальных генов, практически неизвестны. Особый интерес вызывает функционирование мтДНК в условиях окислительного стресса, поскольку сами митохондрии в клетке являются генераторами активных форм кислорода и свободных радикалов. В норме в клетке сохраняется баланс между генерацией АФК и их детоксикацией, однако при воздействии внешнего источника окислительного стресса (например, рентгеновское облучение) этот баланс нарушается, что приводит к повреждению части молекул мтДНК.

Появляющиеся в последнее время новые возможности исследования (ПЦР в реальном времени) позволяют получить количественные данные о копийности мтДНК и ее транскрипции. Эти же методы позволяют исследовать функционирование митохондриального генома в клетках таких тканей, которые никогда не являлись классическими моделями для исследования митохондрий, например в клетках крови. Кроме того, в кровяное русло поступают продукты распада клеток всего организма, в том числе фрагменты ядерной и митохондриальной ДНК. Одной из медицинских задач является поиск маркеров, которые позволяли бы неинвазивными методами оценить генотоксический груз, например, при проведении радиохимиотерапии онкологических больных. То обстоятельство, что в пределах любой ткани копийность мтДНК - относительно постоянная величина, а число копий мтДНК на несколько порядков превосходит число копий ядерных генов, позволяет предположить, что именно фрагменты мтДНК могут потенциально быть искомым маркером.

Поскольку в настоящее время практически отсутствуют представления о нестабильности генетического аппарата митохондрий в условиях окислительного стресса, исследование функционирования мтДНК клеток крови мышей при воздействии внешнего мощного источника окислительного стресса (рентгеновского облучения) может расширить существующие представления о митохондриальном генетическом аппарате, и иметь практическую ценность в медицинской диагностике.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Евдокимовский, Эдуард Владимирович

Выводы

1. Рентгеновское облучение мышей изменяет функционирование митохондриального генетического аппарата клеток крови.

2. При рентгеновском облучении мышей в дозе 1 Гр в два раза уменьшается копийность митохондриальной ДНК в клетках крови.

3. В первые часы после рентгеновского облучения мышей в дозе 1 Гр активизируются процессы транскрипции митохондриальных генов, что рассматривается как компенсаторный ответ клетки на уменьшение нативных молекул мтДНК.

4. При развитии апоптоза, инициированного действием летальной дозы 10 Гр индуцируются процессы репликации и транскрипции митохондриальной ДНК в клетках крови мышей.

5. В условиях массовой клеточной гибели (вторые-третьи сутки после облучения мышей в дозе 10 Гр) практически прекращаются процессы репликации и транскрипции мтДНК.

6. Измененное функционирование митохондриального генома в клетках крови при рентгеновском облучении мышей в разных дозах проявляется в изменении количеств митохондриальных и ядерных фрагментов ДНК.

7. Отношение митохондриальных фрагментов к ядерным (параметр мтДНК/яДНК) рассматривается как возможный показатель гибели клеток всего организма

Заключение

Функционирование митохондрий в любых тканях млекопитающих в значительной степени определяется собственным генетическим аппаратом, существующем в условиях повышенного уровня активных форм кислорода, что создает условия генетической нестабильности. При действии различных генотоксических агентов, таких как цитостатические антибиотики, рентгеновского и гамма-облучения, достаточно полно охарактеризовано повреждение отдельных молекул мтДНК (возникновение мутаций, делеций, одно- и двунитевых разрывов). Все эти повреждения носят вероятностный характер и, например, мутация на уровне любого гена в отдельной молекуле мтДНК ни в коей мере не затрагивает нуклеотидную последовательность этого же гена в любой молекуле мтДНК. По-видимому многокопийность мтДНК — это защита органеллы от высокой повреждаемости молекул, существующих в условиях повышенного окислительного риска — близости электронтранспортной цепи. Можно полагать, что нарушение функционирования митохондриального генетического аппарата связано не столько с повреждением единичных копий мтДНК, сколько с нарушением копийности мтДНК в клетке. Действительно, превышение уровня АФК и свободных радикалов (облучение мышей в дозе 1 Гр) приводит к двукратному снижению копийности мтДНК в ядросодержащих клетках крови. Тем не менее, в этих условиях аппарат транскрипции мтДНК по-видимому не претерпевает серьезных нарушений и уровень митохондриальных транскриптов увеличивается, тем самым компенсируя снижение количества копий мтДНК в клетках крови. Таким образом, при рентгеновском облучении мышей в дозе 1 Гр выявлены нарушения функционирования генетического аппарата митохондрий на уровне копийности мтДНК и транскрипции ее генов. Тем не менее, эти нарушения не являются катастрофическими для клетки.

Все результаты, полученные в настоящем исследовании, представлены в абсолютных значениях количества митохондриальных генов и транскриптов в клетке. Использование количественного метода позволило, неожиданно для нас определить, что механизм транскрипции митохондриальных генов в условиях нормы представляется более сложным, чем можно было бы ожидать из современных представлений. Одним из базовых представлений процессов транскрипции мтДНК являлось наличие единого полицистронного блока и единого промотора для всех генов, расположенных на одной цепи мтДНК. Однако оказалось, что количество транскриптов разных митохондриальных генов, кодирующих различные субъединицы комплексов дыхательной цепи, не эквимолярно и, более того, находится в соответствии с распределением белковых комплексов дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий. Это позволяет предположить о наличии механизма посттранскрипционной регуляции времени жизни молекул мРНК митохондриальных генов.

В условиях развивающегося апоптоза, когда происходит массовая гибель радиочувствительных клеток, в первые часы после облучения индуцируются процессы как репликации, так и транскрипции мтДНК. Известно о роли митохондрий в апоптозе, который является чрезвычайно энергозатратным процессом. Мы полагаем, что индукция репликации и транскрипции мтДНК в первые часы развития программируемой клеточной гибели является одним из важных звеньев реализации этой программы. В более поздние сроки после облучения мышей (сутки-трое) митохондриальный генетический аппарат практически полностью истощен: резко снижено количество копий мтДНК и практически прекращена экспрессия митохондриальных генов, что непосредственно предшествует гибели животных.

Снижение копийности мтДНК в клетке объясняется высокой степенью повреждения молекул мтДНК. Мы предположили, что фрагменты поврежденной мтДНК могут быть зарегистрированы в сыворотке крови наряду с фрагментами деградированной ядерной ДНК. Количественный анализ фрагментов митохондриальной и ядерной ДНК, как в условиях физиологической нормы, так и в условиях рентгеновского облучения мышей, показал, что соотношение митохондриальной и ядерной ДНК в сыворотке крови в значительной степени отражает состояние митохондриального генетического аппарата.

В этом смысле исследование клеток крови представляется перспективным не только возможностью исследовать митохондриальный генетический аппарат ядросодержащих клеток, но и оценкой влияния генотоксических агентов, в результате действия которых в кровяное русло поступают продукты клеточного распада не только форменных элементов крови, но и клеток всех поврежденных тканей.

При лечении онкологических заболеваний самым распространенным неинвазивным методом лечения является радиохимиотерапия. В большинстве случаев средства, применяемые для ее проведения, вызывают повреждения не только опухолевых, но и нормальных тканей, с этим связано множество побочных эффектов и осложнений у пациентов. До сих пор не выработан маркер генотоксического груза при проведении радиохимиотерапии. Нам кажется, что соотношение мтДНК/яДНК в значительной степени отражает уровень повреждения функционирования как митохондриального, так и ядерного генома и, в перспективе, может рассматриваться как показатель гибели клеток при действии генотоксических факторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Евдокимовский, Эдуард Владимирович, 2009 год

1. Adams, J.M. and Cory, S. (1998) The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281, 1322-1326.

2. Albring M., Griffith J., Attardi G. Association of a protein structure of probable membrane derivation with HeLa cell mitochondrial DNA near its origin of replication. Proc Natl Acad Sci USA. 1977. 74. 1348-1352.

3. Amundson S.A., Grace M. B., McLeland C.B., Epperly M.W., Yeager A., Zhan Q., Greenberger J.S., and. Fornace A.J, Jr. Human In vivo Radiation-Induced Biomarkers: Gene Expression Changes in Radiotherapy Patients. Cancer Research. 2004. 64. 6368-6371.

4. Aouida M., Leduc A., Wang H., Ramotar D. Characterization of a transport and detoxification pathway for the antitumor drug bleomycin in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J. 2004(a). 384. 47-58.

5. Aouida, M., Tounekti, O., Leduc, A., Belhadj, O., Mir, L. and Ramotar, D. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants with enhanced resistance to the anticancer drug bleomycin. Curr. Genet. 2004(b). 45. 265-272.

6. Arcari P., Brownlee G.G. The nucleotide sequence of a small (3S) seryl-tRNA (anticodon GCU) from beef heart mitochondria. Nucleic Acids Res. 1980. 8. 5207-5212.

7. Attardi G., Schatz G. Biogenesis of mitochondria. Annu Rev Cell Biol. 1988.4.289-333.

8. Bai Y.D., Attardi G. The mtDNA-encoded ND6 subunit of mitochondrial NADH dehydrogenase is essential for the assembly of the membrane arm and the respiratory function of the enzyme. EMBO J. 1998. 17. 4848-4858.

9. Barja G. and Herrero A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brain of mammals //FASEB J. 2000. Y. 14. P. 312-318.

10. Barry, M. et al. (2000) Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol. Cell. Biol. 20, 3781-3794

11. Bentley D. The mRNA assembly line, transcription and processing machines in the same factory. Curr Opin Cell Biol. 2002. 14. 336-342.

12. Bogenhagen D.F., Applegate E.F., Yoza B.K. Identification of a promoter for transcription of the heavy strand of human mtDNA, in vitro transcription and deletion mutagenesis. Cell. 1984. 36. 1105-1113.

13. Bogenhagen D.F., Clayton D.A. Mouse L cell mitochondrial DNA molecules are selected randomly for replication throughout the cell cycle. Cell. 1977. 11.719-727.

14. Bogenhagen D.F., Pinz K.G., Perez-Jannotti R.M. Enzymology of mitochondrial base excision repair. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001.68.257-271.

15. Borregaard N., Herlin T. Energy metabolism of human neutrophils during phagocytosis. J. Clin. Invest. 1982. 70. 550-557

16. Bredel M. Anticancer drug resistance in primary human brain tumors. Brain research reviews. 2001. 35. 161-204.

17. Brown T.A., Clayton D.A. Release of replication termination controls mitochondrial DNA copy number after depletion with 2,,3,-dideoxycytidine. Nucleic Acids Res. 2002. 30. 2004-2010.

18. Chai J, Du C, Wu JW, Kyin S, Wang X, Shi Y: Structural and bio-chemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO. Nature 2000, 406(6798):855-862.

19. Chance B., Sies H., Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs // Physiol. Rev. 1979. V. 59. P. 527-605.

20. Chandra, D., Liu, J.W., and Tang, D.G. (2002). Early mitochondrial activation and cytochrome c upregulation during apoptosis. J. Biol. Chem. 277, 50842-50854

21. Chang D.D., Clayton D.A. Precise asignment of the heavystrand promoter of mouse mitochondrial DNA: cognate start sites are not required for transcriptional initiation. Mol Cell Biol. 1986b. 6. 3262-3267.

22. Chang D.D., Clayton D.A. Precise asignment of the light strand promoter of mouse mitochondrial DNA: a functional promoter consist of multiple upstream domains. Mol Cell Biol. 1986a. 6. 3253-3261.

23. Chang D.D., Clayton D.A. Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA. Cell. 1984. 36. 635-643.

24. Chomczynski V, Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987. 162(1): 156-159.

25. Chung H.C., Kim S.H., Lee M.G., Cho C.K., Kim T.H., Lee D.H., Kim S.G., Mitochondrial dysfunction by gamma-irradiation accompanies the induction of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) in rat liver. Toxicology. 2001. 161(l-2):79-91.

26. Clayton D.A. Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs. Int Rev Cytol. 1992. 141.217-232.

27. Cloos CR, Daniels DH, Kalen A, Matthews K, Du J, Goswami PC, Cullen JJ. Mitochondrial DNA depletion induces radioresistance by suppressing G2 checkpoint activation in human pancreatic cancer cells. Radiat Res. 2009 May;171(5):581-7

28. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Linec J. Oxidative DNA damage: mechanism, mutation and disease. FASEB J. 2003. 17. 1195-1214.

29. Cote J. and Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science. 1993. 261. 765-769.

30. Cummings O.W., King T.C., Holden J.A., and Low R.L. Purification and characterization of the protein endonuclease in extract of bovine heart mitochondria. 1987. J. Biol. Chem. 62. 2005-2015.

31. Dix D.J., Lin P.N., McKenzie A.R., Waiden W.E., Theil E.C. The influence of the base-paired flanking region on structure and function of the ferritin mRNA iron regulatory element. J. Mol. Biol. 1993. 231(2). 230-240.

32. Doda J.N., Wright C.T., Clayton D.A. Elongation of displacement-loop strands in human and mouse mitochondrial DNA is arrested near specific template sequences. Proc Natl Acad Sei USA. 1981. 78. 6116-6120.

33. Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X: Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 2000, 102(l):33-42.

34. Dubin D.T., Montoya J., Timko K.D., Attardi G. Sequence analysis and precise mapping of the 3,-ends of HeLa cell mitochondrial ribosomal RNAs. J Mol Biol. 1982. 157. 1-19.

35. Duff R.J., Vroom E., Geluk A., Hecht S.M. Evidence for C-l' abstraction from modified oligonucleotides by Fe-bleomycin. J. Am. Chem. Soc. 1993. 115. 3350-3351.

36. Enriquez J.A., Fernandez-Silva P., Garrido-Perez N., Lopez-Perez M.J., Perez-Martos A., Montoya J. Direct regulation of mitochondrial RNA synthesis by thyroid hormone. Mol Cell Biol. 1999a. 19. 657-670.

37. Enriquez J.A., Fernandez-Silva P., Montoya J. Autonomous regulation in mammalian mitochondrial DNA transcription. Biol Chem. 1999b. 380. 737747.

38. Ephrussi B., Hottinguer H., Tavlitzki J. Action de Pacriflavine sur les levures. II. Etude genetique du mutant "petite colonie". Ann Inst Pasteur 1949. 76. 351-367.

39. Falkenberg M., Gaspari M., Rantanen A., Trifunovic A., Larsson N.G., Gustafsson C.M. Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat Genet. 2002. 31. 289-294.

40. Farr C.L., Wang Y., Kaguni L.S. Functional interactions of mitochondrial DNA polymerase and single-stranded DNAbinding protein. Template-primer DNA binding and initiation and elongation of DNA strand synthesis. J Biol Chem. 1999. 274. 14779-14785.

41. Febres E.D., Pramanik A., Caton M., Doherty K., McKoy J., Garcia E., Alejo W. and Wood Moore C. The novel BLM3 gene encodes a protein that protects against lethal effects of oxidative damage. Cell. Mol. Biol. 2001. 47. 1149-1162.

42. Fernandez-SiIva P., Enriquez J., Montoya J. Replication and transcription of mammalian mitochondrial DNA. Exp. Physiol. 2003. 88.1, 41-56.

43. Fisher R.P., Clayton D.A. A transcription factor required for promoter recognition by human mitochondrial RNA polymerase. J Biol Chem. 1985. 260. 11330-11338.

44. Fisher R.P., Clayton D.A. Purification and characterization of human mitochondrial transcription factor 1. Mol Cell Biol. 1988. 8. 3496-3509.

45. Fisher R.P., Lisowsky T., Parisi M.A., Clayton D.A. DNA wrapping and bending by a mitochondrial high mobility grouplike transcriptional activator protein. J Biol Chem. 1992. 267. 3358-3367.

46. Fisher R.P., Topper J.N., Clayton D.A. Promoter selection in human mitochondria involves binding of a transcription factor to orientation-independent upstream regulatory elements. Cell. 1987. 50. 247-258.

47. Ghivizzani S.C., Madsen C.S., Nelen M.R., Ammini C.V., Hauswirth W.W. In organello footprint analysis of human mitochondrial DNA, human mitochondrial transcription factor A interactions at the origin of replication. Mol Cell Biol. 1994. 14. 7717-7730.

48. Gleyser N., Vercauteren K., Scarpulla R.C. Control of mitochondrial transcription specifity factor (TFB1M and TFB2M) by nuclear respiratory factors (NRF-1 and NRF-2) and PGC-1 family coactivators. Molecular and cellular biology. 2005. 25(4). 1354-1366.

49. Gong B., Chen Q., Almasan A. Ionizing radiation stimulates mitochondrial gene expression and activity // Radiat Res. 1998. V. 150. P. 505-512.

50. Graves S.W., Johnson A.A., Johnson K.A. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase. Biochemistry. 1998. 37. 6050-6058.

51. Gray H., Wong T.W. Purification and identification of subunit structure of the human mitochondrial DNA polymerase. J Biol Chem. 1992. 267. 58355841.

52. Grazievich M.A., Day B.J., Copeland W. The mitochondrial DNA-polymerase as a target of oxidative damage. Nucleic Acid Research. 2002. 30. 2817-2824.

53. Green, D.R., and Evan, G.I. (2002). A matter of life and death. Cancer Cell 1, 19-30.

54. Gross, A. et al. (1999) BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 13, 1899-1911

55. Hamilton M.L., Van Remmen H., Drake J.A. et al. Does oxidative damage to DNA increase with age? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10469-10474.

56. Hecht, S. M. Bleomycin: new perspectives on the mechanism of action. J. Nat. Prod. 2000. 63. 158-168.

57. Hehman G.L., Hauswirth W.W. DNA helicase from mammalian mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89. 8562-8566.

58. Hixson J.E., Wong T.W., Clayton D.A. Both the conserved stem-loop and divergent 5'-flanking sequences are required for initiation at the human mitochondrial origin of light-strand DNA replication. J Biol Chem. 1986. 261. 2384-2390.

59. Hofhaus G., Attardi G. Efficient selection and characterization of mutants of a human cell line which are defective in mitochondrial DNA-encoded subunits of respiratory NADH dehydrogenase. Mol Cell Biol. 1995. 15. 964-974.

60. Holmes C.E., Abraham T.E., Hecht S.M., Florentz C., Giege R. Fe-bleomycin as a probe of RNA conformation. Nucleic Acid Research. 1996. 24(17). 3399-3406.

61. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron(II)-bleomycin-mediated RNA strand scission. Biochemistry. 1993. 32. 42934307.

62. Holt I.J., Harding A.E., Petty R.K.H., Morgan-Hughes J.A. A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy. Am J Hum Genet. 1990. 46. 428-433.

63. Holt I.J., Lorimer H.E., Jacobs H.T. Coupled leading- and lagging-strand synthesis of mammalian mitochondrial DNA. Cell. 200. 100. 515-524.

64. Hudson E.K., Hogue B.A., Souza-Pinto N.C. et al. Age-associated change in mitochondrial DNA damage // Free Radic. Res. 1998. V. 29. P. 573-579.

65. Iborra F.J., Kimura H., Cook P.R. The functional organization of mitochondrial genome in human cells. BMC Biology. 2004. 2:9

66. Inoue M., Sato E.F., Nishikawa M., Park A.M., Kira Y., Imada I., Utsumi K. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic . life. Curr. Med. Chem. 2003. 10. 2495-2505.

67. Jakupciak J.P., Wang W., Markowitz M.E., Ally D., Coble M., Srivastava S., Maitra A.,. Barker P.E, Sidransky D. and O'Connell C.D. Mitochondrial DNA as a Cancer Biomarker. J. Mol. Diagn. 2005. 7. 258-267.

68. Jorde L.B., Watkins W.S., Bamshad M.J., Dixon M.E., Ricker C.E., Seielstad M.T., and Batzer M.A. The Distribution of Human Genetic Diversity: A Comparison of Mitochondrial, Autosomal, and Y-Chromosome Data. Am. J. Hum. Genet. 2000. 66. 979-989.

69. Kadenbach B., Possekel S., Huttemann M., Arnold S. Biochemical defects and genetic abnormalities in cytochrome c oxidase of patients with Leigh syndrome. Biofactors. 1998. 7. 273-276.

70. Kamal M.A., French S.W. Drug-induced increased mitochondrial biogenesis in a liver biopsy. Exp. Mol. Pathol., 2004. 77. 201-204.

71. Kang D., Hamasaki N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Curr. Medic. Chem. 2005. 12. 429-441.

72. Kaufmann, S.H., Hengartner M. O. Programmed cell death: alive and well in the new mallenium. 2001. Trends in cell biol. 11(12), 526-534.

73. Kawano Y., Kumagai T., Muta K., Matoba Y., Davies J., Sugiyama M. The 1.5 A crystal structure of a bleomycin resistance determinant from bleomycin-producing Streptomyces verticillus. J. Mol. Biol. 2000. 295(4). 915-25.

74. Kelly D.P., Scarpulla R.C. Transcriptional regulatory circuits controlling mitochondrial biogenesis and function. Genes & Dev. 2004. 18. 357-368.

75. Kluck, R.M., Bossy-Wetzel, E., Green, D.R., and Newmeyer, D.D. (1997). The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275, 1132-1136.

76. Kosovsky M., Soslau G. Immunological identification of human platelet mitochondrial DNA topoisomerase-I. Biochim Biophys Acta. 1993. 1164. 101-107.

77. Kruse B., Narasimhan N., Attardi G. Termination of transcription in human mitochondria, identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination. Cell. 1989. 58. 391-397.

78. Kuroda R., Satoh H., Shinomiya M., Watanabe T., Otsuka M. Novel DNA photocleaving agents with high DNA sequence specificity related to the antibiotic bleomycin A2. Nucleic Acid Research. 1995. 23(9). 1524-1530.

79. Kuwana, T., Mackey, M.R., Perkins, G., Ellisman, M.H., Latterich, M., Schneiter, R., Green, D.R., andNewmeyer, D.D. (2002). Bid, bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell 111, 331-342.

80. Lecrenier N., Foury F. New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene. 2000. 246. 37-48.

81. Lee H.C., Yin P.H., Lu C.Y. et al. Increase of mitochondria and mitochondrial DNA in response to oxidative tress in human cells // Biochem. J. 2000. V. 348. P. 425-432.

82. Lee H.C., Yin P.H., Lu C.Y., Chi C.W., Wei Y.H. Increase of mitochondria and mitochondrial DNA in response to oxidative stress in human cells. Biochem. J. 2000. 348 (2). 425-432.

83. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNA damage formed by bleomycin in vivo. Nucleic Acid Research. 1996. 25(5). 885-889.

84. Lim S.E., Longley M.J., Copeland W.C. The mitochondrial p55 accessoryIsubunit of human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance. J Biol Chem. 1999. 274. 38197-38203.

85. Liu C.Y., Takemasa A., Liles W.C., Goodman R.B., Jonas M., Rosen H., Chi E., Winn R.K., Harlan J.M., Chuang P.I. Broad-spectrum caspase inhibition paradoxically augments cell death in TNF-alpha-stimulated neutrophils. Blood. 2003. 101. 295-304

86. Liu, X., Kim, C.N., Yang, J., Jemmerson, R., and Wang, X. (1996). Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and'cytochrome c. Cell 86, 147-157.

87. Longley M.J., Nguyen D., Kunkel T.A., Copeland W.C. The fidelity of human DNA polymerase gamma with and without exonucleolytic proofreading and the p55 accessory subunit. J Biol Chem. 2001. 276. 38555-38562.

88. Maianski N.A., Roos D., Kuijpers T.W. Tumor necrosis factor alpha induces a caspase-independent death pathway in human neutrophils. Blood. 2003. 101. 1987-1995.

89. Marchetti, P., Castedo, M., Susin, S.A., Zamzami, N., Hirsch, F., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996). Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J. Exp. Med. 184, 1155-1160.

90. Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D., Poulton J. Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease. Am J Hum Genet. 1998. 63. 769-775.

91. Masuyama M, Iida R, Takatsuka H, Yasuda T, Matsuki T., Quantitative change in mitochondrial DNA content in various mouse tissues during aging. Biochim. Biophys. Acta. 2005. 1723 (1-3). 302-308.

92. Mayanski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Roos D., Kuijpers T.W. Functional characterisation of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell death and differentiation. 2004. 11. 143153.

93. McCulloch V., Seidel-Rogol B.L., Shadel G.S. A human mitochondrial transcription factor is related to RNA adenine methyltransferases and binds s-adenosylmethionine. Mol Cell Biol. 2002. 22. 1116-1125.

94. McPhail L.C., Henson P.M., Johnston R.B. Jr. Respiratory burst enzyme in human neutrophil. J. Clin. Invest. 1981. 67. 710-717.

95. Montoya J., Christianson T., Levens D., Rabinowitz M., Attardi G. Identification of initiation sites for heavy strand and light strand transcription in human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1982. 79.7195-7199.

96. Montoya J., Gaines G.L., Attardi G. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell. 1983. 34. 151-159.

97. Montoya J., Ojala D., Attardi G. Distinctive features of the 5-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs. Nature. 1981. 290. 465-470.

98. Morgan M.A., Hecht S.M. Iron(II)-bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex. Biochemistry. 1994. 33. 10286-10293.

99. Murphy B.M., O'Neill A.J., Adrain C., Watson R.W., Martin SJ. The apoptosome pathway to caspase activation in primary human neutrophils exhibits dramatically reduced requirements for cytochrome c. J. Exp. Med. 2003. 197. 625-632.

100. Nass M.M.K., Nass S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. J Cell Biol. 1963. 19. 593-629.

101. Newmeyer D.D., Ferguson-Miller S. Mitochondria: Releasing Power for Life and Unleashing the Machineries of Death. Cell. 2003. 112. 481-490.

102. Newmeyer D.D., Fergusson-Miller S. Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries for death. 2003. Cell. 112. 481-490.

103. Newmeyer, D.D., Farschon, D.M., and Reed, J.C. (1994). Cell-free apoptosis in Xenopus egg extracts: inhibition by Bcl-2 and requirement for an organelle fraction enriched in mitochondria. Cell 79, 353-364.

104. Nisoli E., Clementi E., Paolucci C., Cozzi V., Tonelo C., Sciorati C., Bracale R., Valerio A., Francolini M., Moncada S., Carruba M. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Sciense. 2003. 299. 896-899.

105. O'Farrell P.A., Gonzalez F., Zheng W., Johnston S.A., Joshua-Tor L. Struct. Fold. Des. 1999. 7. 619.

106. Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature. 1981. 290. 470^474.

107. Papa S. Mitochondrial oxidative phosphorylation changes in the life span. Molecular aspects and physiopathological implications // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1276. P. 87-105.

108. Parisi M.A., Clayton D.A. Similarity of human mitochondrial transcription factor 1 to high mobility group proteins. Science. 1991. 252. 965-969.

109. Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich W., Wang X., Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. Elegans. 2001. Nature. 412. 90-94.

110. Pastorino, J.G., Chen, S.T., Tafani, M., Snyder, J.W., and Farber, J.L. (1998). The overexpression of Bax produces cell death upon induction of themitochondrial permeability transition. J. Biol. Chem. 273, 7770-7775.

111. Patrushev M.V., Kasymov V.A, Patrusheva V., Ushakova T.E., Gogvadze V.G. and Gaziev A.I. Mitochondrial permeability transition triggers the release of mtDNA fragments. Cellular and Molecular Life Sciences. 2004. 61. 001-04.

112. Patrushev M.V., Kasymov V.A, Patrusheva V., Ushakova T.E., Gogvadze V.G., and Gaziev A.I. Release of mitochondrial fragments from brain mitochondria of irradiated mice. Mitochondrion. 2006. 6(1). 57-62.

113. Peachman K., Lyles D., Bass D. Mitochondria in eosinophyls: functional role in apoptosis but not respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. 98(4). 1717-1722.

114. Perez-Jannotti R.M., Klein S.M., Bogenhagen D.F. Two forms of mitochondrial DNA ligase III are produced in Xenopus laevis oocytes. J Biol Chem. 2001. 276. 48978-48987.

115. Pinz K.G., Bogenhagen D.F. Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes. Mol Cell Biol. 1998. 18. 1257-1265.

116. Prasanna P.G., Hamel C.J., Escalada N.D., Duffy K.L., Blakely W.F. Biological dosimetry using human interphase peripheral blood lymphocytes. Mil Med. 2002. 167(2 Suppl), 10-13.

117. Prieto-Martin A., Montoya J., Martinez-Azorin F. A study on the human mitochondrial RNA polymerase activity points to existence of a transcription factor B-like protein. FEBS Lett. 2001. 503. 51-55.

118. Pron, G., Belehradek, Jr, J. and Mir, L. M. Identification of a plasma membrane protein that specifically binds bleomycin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 194. 333-337.

119. Pryde J.G., Walker A., Rossi A.G., Hannah S. Haslett C. Temperature dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion intomitochondria at 151C prevents the release of cytochrome c. J. Biol. Chem. 2000. 275. 33574-33584.

120. Pu, Y., and Chang, D.C. (2001). Cytosolic Ca2+ signal is involved in regulating UV-induced apoptosis in hela cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 84-89.

121. Puranam R.S., Attardi G. The RNase P associated with HeLa cell mitochondria contains an essential RNA component identical in sequence to that of the nuclear RNase P. Mol Cell Biol. 2001. 21. 548-561.

122. Richter C., Park J.W. and Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6465-6467.

123. Richter C., Park J.W., Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85. 6465-6467.

124. Roberti M., Musicco C., Polosa P.L., Gadaleta M.N., Cantatorc P. DNA-helicase activity from sea urchin mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 1996. 219. 134-139.

125. Rossa W. K. Chiu, Lisa Y. S. Chan, Nicole Y. L. Lam, Nancy B. Y. Tsui, Enders K. O. Ng, Timothy H. Rainer, and Dennis Lo. Quantitative analysis of circulating mitochondrial DNA in plasma. Clinical Chemistry. 2003.49:5.719-726.

126. Rossmanith W., Tullo A., Potuschak T., Karwan R., Sbisa E. Human mitochondrial tRNA processing. J Biol Chem. 1995. 270. 12885-12891.

127. Santos J., Mandavilli B., Van Houten B. Measurement of oxidative damage and repair in mitochondria using quantitative PCR. Methods Mol. Biol. 2002. 197. 159-176.

128. Sanz, G., Mir, L. and Jacquemin-Sablon, A. Bleomycin resistance in mammalian cells expressing a genetic suppressor element derived from the SRPK1 gene. Cancer Res. 2002. 62. 4453-4458.

129. Scarpulla R.C. Nuclear control of respiratory gene expression in mammalian cells. J. Cell. Biochem. 2006. 97(4). 673-683.

130. Schagger H. and Pfeiffer K. The Ratio of Oxidative Phosphorylation Complexes I-V in Bovine Heart Mitochondria and the Composition of Respiratory Chain Supercomplexes. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(41), 37861-37867.

131. Schwartz M., Vissing J. Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N Engl J Med. 2002. 347. 576-580.

132. Scorrano, L., Ashiya,M., Buttle, K.,Weiler, S.,Oakes, S.A.,Mannella, C.A., and Korsmeyer, S.J. (2002). A distinct pathway remodels mitochondrial cristae andmobilizes cytochrome c during apoptosis.Dev. Cell 2, 55-67.

133. Shadel G. S., Clayton D. A. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Annu. Rev. Biochem. 1997. 66. 409-435.

134. Shang J., Clayton D.A. Human mitochondrial transcription termination exhibits RNA polymerase independence and biased bipolarity in vitro. J Biol Chem. 1994. 269. 29112-29120.

135. Shuster R.C., Rubenstein A.J., Wallace D.C. Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells. Biochem Biophys Res Commun 1988. 155. 1360-1365.

136. Skulachev V.P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". IUBMB Life, 2000; 49(5):365-73.

137. Steighner R.J., Povirk L.F. Bleomycin-induced DNA lesions at mutational hot spots: implications for the mechanism of double strand damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. 87. 8350-8354.

138. Sutovsky P., Moreno R.D., Ramalho-Santos J., Dominko T., Simerly C., Schatten G. Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the regulation of itochondrial inheritance in mammalian embryos. Biol Reprod. 2000. 63. 582-590.

139. Takeshita M., Grollman A., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. 75. 5983-5987.

140. Tang J.T., Yamazaki H., Inoue T. et al. Mitochondrial DNA influences radiation sensitivity and induction of apoptosis in human fibroblasts // Anticancer Res. 1999. V. 19. P. 4959-4964

141. Taylor R.W., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat. Rev. Genet. 2005. 6(5). 389-402.

142. Van Dyck E., Foury F., Stillman B., Brill S.J. A single-stranded DNA binding protein required for mitochondrial DNA replication in S. cerevisiae is homologous to E. coli SSB. EMBO J. 1992. 11. 3421-3430.

143. Van Loo G., Saelens X., van Gurp M., MacFarlane M., Martin S.J.and Vandenabeele P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a

144. Russian roulette with more than one bullet. 2002. Cell Death and Differentiation. 9. 1031-1042.

145. Walberg M.W., Clayton D.A. In vitro transcription of human mitochondrial DNA, identification of specific light strand transcripts from the displacement loop region. J Biol Chem. 1983. 258. 1268-1275.

146. Walberg M.W., Clayton D.A. Sequence and properties of the human KB cell and mouse L cell D-loop regions of mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 1981. 9. 5411-5421.

147. Wallace D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu. Rev. Genet. 2005. 39. 359-407.

148. Wang J., Silva J.P., Gustafsson C.M., Rustin P., Larsson N-G. Increased in vivo apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA gene expression. PNAS (2001), 98(7), 4038-4043.

149. Wardell T.M., Ferguson E., Chinnery P.F., Bortwiek G.M. Changes in the human mitochondrial genome after treatment of malignant disease. Mutat. Res. 2003. 525(1-2). 19-27.

150. Wei Y.H., Lee C.F., Lee H.C. et al. Increases of mitochondrial mass and mitochondrial genome in association with enhanced oxidative stress in human cells harboring 4,977 BP-deleted mitochondrial DNA // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 928. P. 97-112.

151. Widlalc P., Garrad W.T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and Endonuclease G. 2005. Journal of cellular biochemistry. 94. 1078-1087.

152. Wilding, C. S., Cadwell, K., Tawn, E. J., Relton, C. L., Taylor, G. A., Chinnery, P. F. and Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA Mutations in Individuals Occupationally Exposed to Ionizing Radiation. Radiat. Res. 2006. 165,202-207.

153. Wong T.W., Clayton D.A. DNA primase of human mitochondria is associated with structural RNA that is essential for enzymatic activity. Cell. 1986. 45. 817-825.

154. Wong T.W., Clayton D.A. In vitro replication of human mitochondrial DNA, accurate initiation at the origin of lightstrand synthesis. Cell. 1985. 42. 952-958.

155. Yamaguchi Y., Hayashi Y., Sugama Y., Miura Y., Kasahara T., Kitamura S., Torisu M., Mita S., Tominaga A., Takatsu K., Suda T. J. Exp. Med. 1988. 167. 1737-1742.

156. Yamaguchi Y., Suda T., Ohta S., Tominaga K., Miura Y., Kasahara T. Blood. 1991. 78. 2542-2547.

157. Yang, J., Liu, X., Bhalla, K., Kim, C.N., Ibrado, A.M., Cai, J., Peng, T.-I., Jones, D.P., and Wang, X. (1997). Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275, 11291132.

158. Yoshida К., Yamazaki H., Ozeki S. et al. Role of mitochondrial DNA in radiation exposure // Radiat. Medicine. 2000. V. 18. P. 87-91.

159. Yoza B.K., Bogenhagen D.F. Identification and in vitro capping of a primary transcript of human mitochondrial DNA. J Biol Chem. 1984. 259. 3909-3915.

160. Zorov D.B., Bannikova S.Y., Belousov V.V., Vyssokikh M.Y., Zorova L.D., Isaev N.K., Krasnikov B.F., and Plotnikov E.Y. Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Friends or Foes? Biochemistry (Moscow), 2005. 70(2), 215-221.

161. Газиев А. И., Подлуцкий А. Я. Низкая эффективность систем репарации в митохондриях. Цитология. 2003. 45 (4). 403-417.