Исследование процессов адресной доставки генетического материала в раковые клетки и в опухоли меланомы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Дурыманов, Михаил Олегович

• Дурыманов, Михаил Олегович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Дурыманов, Михаил Олегович

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Системы доставки НК, их преимущества и недостатки

2.2. Обзор используемых полимеров для доставки генов

2.3. Препятствия на пути полиплексов в организме и возможные подходы для увеличения эффективности доставки НК

2.4. Обзор генов, используемых для терапии рака

2.4.1. Терапия с помощью генов суицида

2.4.2. Корректирующая генная терапия

2.4.3. Иммуномодуляторная генная терапия

2.4.4. Использование транспортирующих молекул в генной терапии и диагностике рака

3. Материалы и методы

3.1. Блок-сополимеры для приготовления полиплексов

3.2. Плазмиды

3.3. Приготовление полиплексов

3.4. Измерение размеров и ^-потенциалов полиплексов

3.5. Получение изображений полиплексов на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии

3.6. Флуоресцентное мечение компонентов полиплексов

3.7. Культивирование клеток

3.8. Определение цитотоксичности полиплексов и ингибиторов эндоцитоза

3.9. Доставка гена £'GFP с помощью полиплексов в клетки и определение доли трансфицированных клеток

3.10. Доставка гена люциферазы с помощью полиплексов в клетки и определение уровня её экспрессии

3.11. Доставка гена НИС с помощью полиплексов в клетки и определение уровня его

125

экспрессии по поглощению радиоизотопа 1

3.12. Обработка клеток ингибиторами эндоцитоза

3.13. Измерение эффективности поглощения полиплексов раковыми клетками в культуре

3.14. Съемка изображений клеток на конфокальном микроскопе при добавлении полиплексов с флуоресцентно меченными ДНК и блок-сополимером

3.15. Внутриклеточная локализация и распаковка полиплексов

3.16. Постановка накожных камер мышам для прижизненной микроскопии и инокуляция опухолевых клеток под камеры

3.17. Прижизненная микроскопии и количественная оценка кинетики накопления и микрораспределения полиплексов в опухоли и в нормальной подкожной соединительной ткани

3.18. Выявление взаимного расположения сосудов и раковых клеток в опухоли с помощью прижизненной микроскопии

3.19. Выявление распределения изотопа 1231 и его накопления в опухолях с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии

4. Результаты

4.1. Физико-химические характеристики полиплексов

4.2. Цитотоксичность полиплексов

4.3. Эффективность поглощения и доставки генов с помощью полиплексов

4.4. Ингибиторный анализ путей эндоцитоза полиплексов

4.5. Изучение кинетики внутриклеточного транспорта и распаковки полиплексов

4.6. Изучение кинетики накопления полиплексов в опухоли и в нормальной подкожной

соединительной ткани

4.7. Детальный анализ микрораспределения полиплексов

4.8. Модельное описание микрораспределения полиплексов

4.9. Влияние наличия лиганда на микрораспределение полиплексов в опухоли

5. Обсуждение

6. Заключение

7. Выводы

Благодарности

Список литературы

Список сокращений

ACM - атомно-силовая микроскопия ДС - динамическое светорассеяние

KJ1CM - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

KT - рентгеновская компьютерная томография

HAT - нарадреналиновый транспортёр

НИС - натрий-йод симпортёр

HK - нуклеиновые кислоты

н.п. - нуклеотидные пары

ОФЭКТ - однофотонная эмиссионная компьютерная томография ПАМАМ - полиамидоамин ПЛ - поли-Ь-лизин

ПСД - поли(метакрилоил сульфодиметоксина)

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭИ - полиэтиленимин

ФС - фотосенсибилизатор

ЯПК - ядерный поровый комплекс

аМСГ - а-меланоцит-стимулирующий гормон

CD - цитозиндезаминаза (cytosine deaminase)

CMV - цитомегаловирусный промотор

EPR - эффект "повышенной проницаемости и удерживания" ("enhanced permeability and retention")

FRET - безызлучательный резонансный перенос энергии по Фёрстеру (Förster resonance energy transfer)

GCV - ганцикловир (ganciclovir)

GFP - зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein) HRP - пероксидаза хрена (horseradish peroxidase)

HSVi& - тимидинкиназа вируса простого герпеса (Heres simplex virus thymidine kinase)

IAA - индолил-уксусная кислота (indolyl acetic acid)

MC1R - меланокортиновые рецепторы 1 типа (melanocortin receptors-1)

MC ISP - пептид, имеющий в своем составе последовательность, связывающуюся с

меланокортиновыми рецепторами первого типа, и минимальную последовательность

ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40

NFkB - транскрипционный фактор (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells)

QD - квантовые точки (quantum dots)

TCR - Т-клеточные рецепторы (T-cell receptors)

TNF-a - фактор некроза опухоли-a (tumor necrosis factor-a)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование процессов адресной доставки генетического материала в раковые клетки и в опухоли меланомы»

1. Введение

Генная терапия - это лечение наследственных, онкологических и других заболеваний путём внесения в клетки пациента необходимого генетического материала с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций [Горбунова и др., 1997]. Одним из направлений генной терапии является терапия рака, в основе которой лежит доставка генов, либо коротких олигонуклеотидов в опухолевые клетки, например, для изменения уровня экспрессии онкогенов, для увеличения экспрессии цитотоксических белков, активизирующих пропрепараты ферментов и т.д. В основе успешности генной терапии лежит эффективная, безопасная и специфичная доставка необходимого генетического материала в раковые клетки.

В условиях in vivo нуклеиновые кислоты (НК) способны подвергаться деградации сывороточными нуклеазами [Boeckle, 2005], поэтому для их транспорта в клетки-мишени используют носители (векторы), которые обеспечивают защиту генетического материала. Кроме того, используемые системы доставки должны облегчать транспорт НК в определённые типы клеток. Существует два типа векторов, предназначенных для доставки НК: вирусные и невирусные. Основным преимуществом вирусных векторов является высокая эффективность трансфекции, то есть доставки ДНК в ядра клеток-мишеней. Однако их применение встречает целый ряд ограничений: во-первых, это малая ёмкость переносимого генетического материала и свойственная вирусам собственная клеточная специфичность, во-вторых, это способность реверсии к дикому типу в результате рекомбинации или мутаций, в-третьих, белки вирусных частиц обладают высокой иммуногенностью, в результате чего повторное их введение вызывает иммунный ответ, в-четвёртых, это способность некоторых вирусов (например, ретровирусов) встраиваться в геном, что может привести к образованию опухолей в результате активации онкогенов, и, наконец, массовое производство вирусных векторов всё ещё достаточно проблематично и требует больших затрат. Невирусные векторы лишены большей части этих недостатков, но в то же время демонстрируют, как правило, более низкую трансфицирующую способность, многие из них обладают токсичностью [Park et al., 2006]. Среди невирусных систем доставки наибольшее распространение получили катионные липиды (их комплексы с переносимой ДНК называются липоплексами), а также катионные полимеры и сополимеры (их комплексы с переносимой ДНК называются полиплексами) [Park et al., 2006].

Полиплексы представляются одними из наиболее перспективных вариантов невирусных векторов благодаря низкой токсичности, простоте синтеза и возможности модификации различными функциональными молекулами. Одной из часто используемых

модификаций полиплексов для направленной доставки является включение в их состав специфического лиганда к рецепторам, сверхэкспрессированным на поверхности раковых клеток [Holgado et al., 2012, Mehra et al., 2013]. Данный подход применялся для доставки генетического материала с помощью полиплексов путём включения в их состав лигандных молекул к а(у)(3(3)-интегриновым рецепторам [Ng et al., 2009], рецепторам эпидермального фактора роста [de Bruin et al., 2007], трансферрина [Kursa et al., 2003], фолата [Cheng et al., 2009] и других, в зависимости от типа опухоли. В частности, в случае опухоли меланомы на роль такого лиганда может претендовать синтетический МСISP-пептид, являющийся агонистом меланокортиновых рецепторов первого типа [Szardenings et al., 2000], которые сверхэкспрессированы на поверхности меланомных клеток в подавляющем большинстве случаев [Salazar-Onfray et al., 2002]. Возможность включения лиганда к меланокортиновым рецепторам в состав полиплексов позволит придать им дополнительный уровень специфичности при доставке в клетки опухоли меланомы, а, следовательно, более выраженный терапевтический эффект.

Кроме того, с целью повышения эффективности доставки ДНК в раковые клетки in vivo с помощью такого рода конструкций актуальной задачей является также изучение транспорта полиплексов на пути в ядра меланомных клеток. При внутривенном введении наночастицам полиплексов нужно преодолеть, во-первых, сосудистый барьер в опухоли, а, во-вторых, внутриклеточные мембранные барьеры, включающие внешний мембранный, эндосомальный и ядерный мембранный барьеры, что является необходимым условием успешной экспрессии переносимого терапевтического гена. Следует отметить, что в настоящее время отсутствуют работы, связанные с комплексным изучением транспорта ДНК в составе наночастиц полиплексов на всём их пути с момента введения в кровь вплоть до переноса в ядра клеток-мишеней, а также сведения о влиянии включения лиганда в состав полиплексов на процессы их транспорта. Комплексные исследования, включающие анализ физико-химических свойств частиц полиплексов и изучение их поведения в организме, крайне необходимы при поиске новых подходов для увеличения эффективности доставки генетического материала.

С учетом всего вышеизложенного, целью настоящей работы было исследование процессов транспорта и эффективности доставки генетического материала с помощью полиплексов с лигандом к меланокортиновым рецепторам первого типа в раковые клетки и в опухоли меланомы.

Для достижения цели работы был поставлен следующий ряд задач:

• Получить полиплексы с лигандом к меланокортиновым рецепторам 1 типа и контрольные полиплексы без лиганда, а также оценить их физико-химические свойства.

• Исследовать процессы внутриклеточного транспорта данных полиплексов и эффективности доставки с их помощью генов в раковые клетки меланомы in vitro.

• Проанализировать процессы накопления и микрораспределания полиплексов в опухоли меланомы и в нормальной подкожной соединительной ткани в качестве контроля.

• Оценить на уровне целого организма эффективность доставки генов в составе лигандированных и контрольных (безлигандных) полиплексов.

2. Обзор литературы

2.1. Системы доставки НК, их преимущества и недостатки

В природе существуют специализированные структуры для доставки генетической информации в клетки - вирусы. Именно поэтому они первыми нашли широкое применение в качестве транспортёров генов.

Несмотря на привлекательность вирусных векторов (например, ретро-, адено-, адено-ассоциированных вирусов) с точки зрения высокой эффективности трансфекции клеток-мишеней, они обладают рядом существенных недостатков, накладывающих ограничения на их использование. К ним относятся малая ёмкость переносимого генетического материала, свойственная вирусам собственная клеточная специфичность, способность реверсии к дикому типу в результате рекомбинации или мутаций, иммуногенность и другие [Hart, 2010, Wang et al., 2012].

Невирусные векторы лишены большей части недостатков вирусных систем доставки, но в то же время демонстрируют, как правило, гораздо более низкую трансфицирующую способность [Pathak et al., 2009], многие из них обладают токсичностью [Glover et al., 2005]. Среди невирусных систем доставки наибольшее распространение получили катионные липиды (их комплексы с переносимой ДНК называются липоплексами), катионные полимеры (их комплексы с переносимой ДНК -полиплексы) на основе полиэтиленимина, поли-Ь-лизина и других синтетических поликатионов, а также полисахаридов (хитозана, циклодекстрина и т.д.) [Park et al., 2006], и прочие гибридные конструкции, включающие, например, липосомы, покрытые полимерным слоем, либо липосомы, нагруженные полиплексными частицами [Channarong et al., 2011]. Связывание ДНК с катионными липидами или полимерами и образование путём спонтанной самосборки наноразмерных комплексов происходит за счёт, главным образом, электростатических взаимодействий и в меньшей степени за счёт водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых сил. В случае липоплексов большой вклад вносят также гидрофобные взаимодействия. Идеи использовать катионные липиды и катионные полимеры появились практически одновременно в 1987 г. [Feigner et al., 1987, Wu et al., 1987]. Данные системы доставки генетического материала обладают низкой иммуногенностью, лишены ограничений по размерами переносимой ДНК, несколько дешевле и проще в производстве относительно вирусных векторов.

2.2. Обзор используемых полимеров для доставки генов

Полиплексы впервые были использованы для доставки генов в 1987 г. [Wu et al., 1987]. С тех пор появилось огромное количество вариантов полимеров для создания полиплексов.

Поли-Ь-лизины (ПЛ) (Рис. 1) были в числе первых полимеров, используемых для невирусной доставки генов [Wu et al., 1987, Розенкранц и др., 1990]. Комплексы ПЛ с ДНК формируют тороиды диаметром 25-50 нм или палочки длиной 40-80 нм [Kang et al., 2005]. ПЛ быстро связываются с белками плазмы и выводятся из циркуляции в крови [Zhang et al., 2004]. Эффективность доставки генов с помощью полиплексов на основе ПЛ несколько ниже, чем, например, на основе полиэтиленимина (ПЭИ), что скорее всего связано с высокой степенью деградации НК в их составе в эндосомах клеток после поглощения [Eliyahu et al., 2005]. Одна из попыток улучшить свойства полиплексов на основе ПЛ привела к созданию производного полимера поли(циклооктен-у-олиголизина), содержащего в своём составе несколько участков олиголизина. В отличие от обычного полилизина, полиплексы на основе олиголизин-содержащих полимеров демонстрировали во много раз превосходящую эффективность трансфекции и низкую цитотоксичность [Parelkaretal., 2011].

Ещё одну группу полимеров для доставки НК составляют хитозаны (Рис. 1), представляющие собой линейные аминополисахариды, производные биополимера хитина, соединенные сшивками из глюкозамина. В зависимости от молекулярного веса и степени дезацетилирования, хитозаны формируют маленькие (менее 100 нм) стабильные комплексы с плазмидной ДНК. Для получения стабильных, трансфицирующих комплексов количество положительно заряженных мономеров в составе полимера должно быть больше 65% [Weecharangsan et al., 2008]. Согласно литературным данным, оптимальными для доставки НК являются полиплексы на основе хитозанов с молекулярным весом 30-170 кД, которые демонстрируют уровень экспрессии репортёрного гена и защиту от ДНКаз, сравнимую с ПЭИ. Лимитирующим фактором для применения хитозанов для создания полиплексов является высокая степень их деградации в закисляемых компартментах клетки. Кроме того, экспрессия репортёрного гена в случае полиплексов на основе хитозанов достигает высокого уровня значительно позже, чем, например, в случае ПЭИ [Koping-Hoggard et al., 2001]. Возможным решением для улучшения эффективности трансфекции клеток полиплексами на основе хитозана может быть увеличение соотношения поликатион/ДНК, известного также как соотношение азот/фосфат или N/P (то есть количество аминогрупп в составе полимера, приходящихся

на одну фосфатную группу ДНК). Выяснилось, что избыточное количество свободного полимера улучшает выход полиплексов из эндосом в цитозоль [Thibault et al., 2011].

si

nh2

Линейный

W полиэтиленимин Разветвлённый

Поли-1_-лизин полиэтиленимин

Хитозан

Рис. 1. Структурные формулы полимеров, используемых для доставки генов.

Одними из самых широко используемых полимеров для доставки НК являются полиэтиленимины. Способность ПЭИ доставлять ДНК была впервые исследована в 1995 году [Boussif et al., 1995]. С тех пор, несмотря на появление большого количества вариантов полимеров для создания полиплексов, ПЭИ остаётся одним из самых эффективных поликатионов, используемых для доставки ДНК. ПЭИ может быть синтезирован в виде линейного полимера и в виде полимера различной степени разветвлённости (Рис. 1). Стабильность полиплексов на основе ПЭИ в растворе зависит от соотношения ПЭИ/ДНК. При соотношении N/P, близком к единице, формируются нейтральные комплексы компактных размеров, склонные к образованию агрегатов. Для образования стабильных комплексов необходимо значение N/P порядка 2-3 [Choosakoonkriang et al., 2003], однако и они с течением времени склонны к агрегированию за счёт гидрофобных взаимодействий и Ван-дер-ваальсовых сил [Ogris et al., 1998]. При увеличении соотношения N/P от 2 до 20 размер комплексов уменьшается от > 1000 нм до 100-200 нм [Erbacher et al., 1999]. При высоких N/P стабильность полиплексов в суспензии возрастает за счёт электростатического отталкивания комплексов, потенциал поверхности которых приобретает достаточно высокие значения.

При высоких значениях N/P достаточно большая доля ПЭИ находится в свободной форме [Clamme et al., 2003]. Оказалось, что уже при значении N/P 6 лишь 58 % 25 кД ПЭИ находится в связанном с ДНК состоянии [Ко et al., 2011]. Очистка различными методами суспензии наночастиц полиплексов от избытка ПЭИ приводила к снижению цитотоксичности, но в то же время уменьшала эффективность трансфекции клеток в культуре [Boekle et al., 2004, Fahrmeir et al., 2007]. Было показано, что избыток свободного ПЭИ в суспензии полиплексов необходим для более эффективной трансфекции, так как он предотвращает нежелательные взаимодействия комплексов с гликозаминогликанами на поверхности трансфицируемых клеток и препятствует преждевременной распаковке ДНК [Hanzlikova et al., 2011]. В составе полиплексов ПЭИ обеспечивают значительно более эффективную трансфекцию и защиту ДНК от деградации нуклеазами, чем другие поликатионы, возможно, из-за высокого заряда данного полимера, а, следовательно, и более эффективного связывания с ДНК. Высокие значения ^-потенциалов получаемых частиц нередко приводят к цитотоксическим эффектам полиплексных нанокомплексов. Механизмы цитотоксичности ПЭИ связаны с нарушением целостности плазматической мембраны, а также наружной мембраны митохондрий, что может привести к запуску апоптоза [Moghimi et al., 2005, Grandinetti et al., 2011]. Как уже отмечалось выше, ПЭИ является одним из самых распространённых полимеров для доставки НК, в связи с чем последние годы появляются новые методы и технологии для упрощения приготовления полиплексов на их основе [Raymond et al., 2011] и их длительного хранения [Kasper et al., 2011].

Ещё одним классом поликатионов для доставки генетического материала являются дендримеры на основе полиамидоамина (ПАМАМ) [Dufes et al., 2005]. Дендримеры (Рис. 2) - это отходящие от одной центральной молекулы (чаще всего - четырёхвалентного этилендиамина) сильно разветвлённые полимерные макромолекулы с высоко упорядоченной структурой [Tomalia et al., 1985]. На рисунке 2 представлены примеры дендримеров на основе ПАМАМ с разным порядком ветвления. Обнаружено, что порядок ветвления дендримеров оказывает влияние на уровень трансфекции: с его увеличением от 5 до 10 происходит возрастание эффективности доставки генов по экспоненте с выходом на плато после 8 [Kukowska-Latallo et al., 1996]. Однако, с увеличением размеров молекул дендримеров, используемых для приготовления полиплексов, их цитотоксичность тоже возрастает [Morgan et al., 1989]. Среди используемых для создания полиплексов дендримерных молекул можно выделить дендримеры на основе близкого к ПАМАМ диамониобутират полипропиленимина. Было показано, что полиплексы на основе полипропилениминовых дендримеров способны с высокой эффективностью и

специфичностью доставлять гены в опухолевые клетки [Chisholm et al., 2009]. Модификация таких полиплексов аминокислотными остатками лизина, аргинина или лейцина приводила к усилению эффективности трансфекции как in vitro, так и in vivo [Aldawsari et al., 2011].

Рис. 2. Структурные формулы дендримеров на основе полиамидоамина второго (А), третьего (Б) и четвёртого (В) порядков, используемых для доставки генов.

Отличительной особенностью ПЭИ и ПАМАМ является наличие в их составе большого числа вторичных и третичных аминогрупп со значением рКа, сравнимым с физиологическим рН или ниже. Благодаря наличию непротонированных вторичных и третичных аминогрупп данные полимеры способны создавать буферный эффект при попадании в эндосомы клеток-мишеней в результате эндоцитоза, в которых значение рН составляет 4.5-5. В результате Н+-АТФаза, транспортирующая протоны в эндосомы, начинает работать активнее. Одновременно с этим за счёт работы Н+/СГ-обменников (CLC-4,5) внутри эндосом происходит аккумуляция анионов хлора [Pusch et al., 2006]. Вследствие этого из-за резкого увеличения осмотического давления происходит набухание и лизис эндосом, что позволяет наночастицам полиплексов на основе ПЭИ, ПАМАМ или их производных выйти в гиалоплазму и избежать ферментативной деградации в закисляемых компертментах. Описанный выше механизм получил название «эффекта протонной губки» ("proton sponge effect"), и впервые был предложен в 1995 году [Boussif et al., 1995]. Впоследствии было показано, что при трансфекции полиплексными нанокомплексами на основе ПАМАМ или ПЭИ наблюдается увеличение концентрации СГ (от 40 до 115 мМ) внутри эндосом и увеличение их объёма (на 140 %). В то же время при трансфекции полиплексами на основе ПЛ, не обладающего буферными свойствами, эти показатели оказались ниже: концентрация СГ внутри эндосом возрастает до 80 мМ, а их объём увеличивается на 20 % [Sonawane et al., 2003]. Возможным объяснением этого явления является отсутствие у ПЛ аминогрупп с рКа 5-7 и, как следствие, слабый лизис

=-C2H4CONHC2H

эндосом и низкий уровень трансгенной экспрессии. С целью усиления трансфекции ПЛ возможны следующие способы модификации: 1) добавление в состав полимера гистидина или других имидазол-содержащих структур (рКа ~ 6, что обеспечивает буферную ёмкость для лизиса эндосом); 2) конъюгация с инактивированными вирусами, обладающими собственными эндосомолизисными механизмами [Read et al., 2005]. Кроме того, для преодоления эндосомального барьера полиплексами на основе ПЛ было предложено покрывать их дополнительно отрицательно заряженным полимером, являющимся производным полиаспартамида, который при закислении среды в эндосомах перезаряжается, выходит из состава полиплекса и вызывает нарушение целостности эндосом [Sanjoh et al., 2010].

В последние годы появляется всё больше вариантов биодеградабельных полимерных конструкций, подвергаемых полному, либо частичному расщеплению ферментативными системами организма до небольших фрагментов, способных проходить фильтрацию в почках. Примером могут послужить различные варианты биодеградабельных ПАМАМ, содержащие в своём скелете -S-S- связи. Полиплексы на их основе показали эффективность трансфекции, сравнимую с линейным ПЭИ, при этом их цитотоксичность оказалась существенно меньше [Zhang et al., 2013]. Ещё одним примером может

послужить использование биодеградабельных линкеров из поли(Е-капролактона) между поликатионной частью из ПЭИ и полиэтиленгликолем (ПЭГ), включаемым в состав полимера для минимизации взаимодействия полиплексов на их основе с белками плазмы и клетками крови. Полиплексы на основе данных полимеров показали высокую эффективность доставки коротких РНК в клетки, а также более быстрое выведение через почки после внутривенного введения [Zheng et al., 2012]. Подобный подход был применён и для полиплексов на основе ПЭГ-ПЛ, что привело к более высокой эффективности доставки коротких РНК в клетки в культуре по сравнению с исходным ПЭГ-ПЛ и ПЭИ, но при этом их цитотоксичность оказалась значительно меньше [Qi et al., 2012]. В качестве биодеградабельного полимера может также служить поликарбонатное производное, содержащее в своём составе участки олигоэтилениминов, сшитых с ПЭГ. Приготовленные на их основе полиплексы также показали меньшую цитотоксичность, чем комплексы на основе ПЭИ, и сравнимую с ними эффективность доставки ДНК [Dong et al., 2011].

2.3. Препятствия на пути полиплексов в организме и возможные подходы для увеличения эффективности доставки НК

Процесс доставки генов с помощью полиплексных нанокомплексов состоит из двух этапов: внеклеточного и внутриклеточного. Первый этап включает в себя перенос полиплексов с током крови в опухоль, связывание с поверхностью стенки сосудов, выход из сосудов и дальнейшую диффузию в межклеточном веществе.

При попадании в кровь полиплексы взаимодействуют с белками плазмы. Так, было показано, что ПЭИ может взаимодействовать с 41 белком плазмы, включая компоненты системы комплемента СЗ, С4А и фактор Н [Zhong et al., 2013]. ПЛ также способен связывать факторы комплемента, а также антитела IgG [Ward et al., 2001]. Опсонизация и последующее поглощение полиплексов фагоцитирующими клетками ретикуло-эндотелиальной системы сильно снижает время их циркуляции в крови, что может привести к существенному уменьшению эффективности доставки генов [Smrekar et al., 2003]. Одной из самых распространённых модификаций полимеров, направленных на снижение подобного рода нежелательных эффектов заключается в присоединении полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПЭГ может быть присоединён к поликатиону ковалентно [Ulasov et al., 2011], либо нековалентно (пост-ПЭГилирование) после приготовления полиплексов [Pirotton et al., 2004]. Такая модификация приводит к образованию оболочки из ПЭГ вокруг полиплекса, прикрывающей положительно заряженную поверхность наночастицы полиплекса. Это ограничивает взаимодействие полиплексов с белками плазмы крови, участвующих в их опсонизации и последующем узнавании клетками иммунной системы, что в конечном счёте увеличивает время жизни полиплексов в крови. Это было продемонстрировано для полиплексов на основе ПЛ [Nomoto et al., 2011], ПЭИ [Neu et al., 2005] и других поликатионов. Кроме того, наличие ПЭГ в составе полиплексов повышает устойчивость полиплексов к распаковке и действию нуклеаз [Kleeman et al., 2005]. Наряду с описанными положительными эффектами, включение ПЭГ имеет и отрицательную сторону, так как затрудняет взаимодействие с клетками-мишенями, в результате чего частицы хуже поглощаются и быстрее деградируют в эндо-/лизосомах, а, следовательно, уменьшается эффективность доставки генов. Этот эффект получил в литературе название «ПЭГ-дилеммы» [Noga et al., 2013]. Возможным выходом для решения данной проблемы может быть, например, рН-зависимое пост-ПЭГилирование полиплексов с помощью сополимера ПЭГ и поли(метакрилоил сульфодиметоксина) (ПСД). В опухоли, где внеклеточный матрикс имеет кислые значения рН, сополимер ПЭГ-ПСД отходит от поверхности частиц полиплексов, в результате чего поверхность комплекса вновь приобретает высокий положительный потенциал, позволяющий

эффективно связываться с поверхностью клеток [БеШигатап е1 а1., 2006]. Ещё одной попыткой решить эту проблему было применение гидроксиэтилированного производного крахмала в качестве альтернативы ПЭГ, который в опухоли деградировал под действием альфа-амилаз. Это приводило к достижению большей эффективности трансфекции т у/'уо, чем при использовании ПЭГ в качестве экранирующего поверхностный заряд компонента [^к^а й аГ, 2013]. Возможным выходом может также быть ковалентное присоединение ПЭГ к поликатиону через пептидные линкеры, узнаваемые и расщепляемые металлопротеиназами в опухоли [1л а1., 2013а].

Следующим препятствием на пути полиплексов к раковым клеткам-мишеням является сосудистый барьер. Несмотря на наличие широких промежутков между эндотелиальными клетками, выстилающими поверхность сосудов опухоли, высокая плотность клеток в самой ткани опухоли, а также высокое жидкостное давление в опухоли препятствуют выходу наночастиц из сосудов в ткань и дальнейшей их диффузии, тем самым снижая демонстрируемый терапевтический эффект [Ьашшегз ег а1., 2012]. Существующие подходы, направленные на преодоление данных барьеров, будут проанализированы в главе «Обсуждение».

Основными этапами внутриклеточного транспорта при доставке ДНК с помощью наночастиц полиплексов являются: 1) адсорбция, либо связывание с рецепторами на поверхности плазматической мембраны; 2) эндоцитоз; 3) выход из эндосом; 4) диссоциация комплекса на катионную составляющую и свободную ДНК; 5) проникновение ДНК в ядро (Рис. 3). Положительный поверхностный заряд полиплексов позволяет им эффективно адсорбироваться на отрицательно заряженной поверхности плазматической мембраны (за счёт заякоренных в ней гликопротеинов и протеогликанов).

С поверхности плазматической мембраны нанокомплексы могут поглощаться путём неспецифического адсорбтивного эндоцитоза. При включении лиганда в состав полиплекса можно добиться интернализации с помощью специфического рецептор-опосредованного эндоцитоза [Бе БтесН: е1 аГ, 2004]. В результате поглощённые частицы оказываются внутри эндосом.

\ - ^ Мииротрубочии Вь ход ,3

_ КатионныС

^Лп полимер

ДНК

Рис. 3. Схема внутриклеточного транспорта полиплексов в клетке.

Одним из самых важных этапов транспортного пути наночастиц полиплексов является их выход из эндосом. Как известно, ранние эндосомы представляют собой систему трубочек и микропузырьков, что необходимо для сортировки поглощённых путём эндоцитоза макромолекул. За счёт Н+-АТФаз У-типа в них понижается рН (около 6,0). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощённых полиплексов наружу, либо по литическому пути. В последнем случае происходит дальнейшее закисление среды в эндосомах и их постепенное превращение в поздние эндосомы (рН около 5,5), а затем в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5 и ниже, и поглощённые молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активируются в кислой среде. Продукты деградации удаляются из клетки путём экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал.

Процесс выхода из эндосом имеет большое значение, так как внутренняя среда эндосомного компартмента обладает низким значением рН и содержит множество гидролитических ферментов, в том числе нуклеаз, способных разрушить переносимую ДНК. Существует несколько подходов, направленных на ускорение выхода наночастиц полиплексов из эндосом. Один из них связан с воздействием на трансфицируемые клетки эндосомотропного агента, например, хлорохина. Было показано увеличение эффективности трансфекции различными типами полиплексов на ряде клеточных линий в присутствии хлорохина [У/аАлаих ег а1., 2000]. Однако, использование эндосомотропных

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дурыманов, Михаил Олегович, 2013 год

Список литературы

Горбунова ВН, Баранов ВС. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Пб., «Специальная литература» 1997;с.287.

Ермолаев ВЛ. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. Москва, «Наука», 1977;с.З-313.

Розенкранц АА, Ячменев СВ, Соболев АС. Использование искусственных конструкций для селективного переноса генетического материала в клетки человека путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Доклады АН СССР 1990;312:493-494.

Ярилин АА. Основы иммунологии. Москва, «Медицина», 1999, разд. 4.3.2.

Ahn ВС. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics 2012;2:392-402.

Akita H, Ito R, Khalil IA, Futaki S, Harashima H. Quantitative three-dimensional analysis of the intracellular trafficking of plasmid DNA transfected by a nonviralgene delivery system using confocal laser scanning microscopy. Mol Ther 2004;9:443-451.

Aldawsari H, Edrada-Ebel R, Blatchford DR, Tate RJ, Tetley L, Dufes C. Enhanced gene expression in tumors after intravenous administration of arginine-, lysine- and leucine-bearing polypropylenimine polyplex. Biomaterials 2011;32:5889-5899.

Alexander S, Koehl GE, Hirschberg M, Geissler EK, Friedl P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol 2008; 130:1147-1154.

Andrade-Rozental AF, Rozental R, Hopperstad MG, Wu JK, Vrionis FD, Spray DC. Gap junctions: the "kiss of death" and the "kiss of life". Brain Res Rev 2000;32:308-315.

Barton KN, Strieker H, Brown SL, Elshaikh M, Aref I, Lu M, Pegg J, Zhang Y, Karvelis КС, Siddiqui F, Kim JH, Freytag SO, Movsas B. Phase I study of noninvasive imaging of adenovirus-mediated gene expression in the human prostate. Mol Ther 2008; 16:1761 -1769.

Barua S, Rege К. The influence of mediators of intracellular trafficking on transgene expression efficacy of polymer-plasmid DNAcomplexes. Biomaterials 2010;31:5894-5902.

Beekman F, van der Have F. The pinhole: gateway to ultra-high-resolution three-dimensional radionuclide imaging. Eur JNucl Med Mol Imaging 2007;34:151-161.

Boeckle S, von Gersdorff K, van der Piepen S, Culmsee C, Wagner E, Ogris M. Purification of polyethylenimine polyplexes highlights the role of free polycations in gene transfer. J Gene Med 2004;6:1102-1110.

Boeckle S. Improved nonviral gene vectors: efficient and non-toxic polyplexes with enhanced endosomolytic activity. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der LudwigMaximilian-Universität München 2005; 1 -101.

Boeckle S, Fahrmeir J, Roedl W, Ogris M, Wagner E. Melittin analogs with high lytic activity at endosomal pH enhance transfection with purified targeted PEI polyplexes. J Control Release 2006; 112,240-248.

Bonsted A, Wagner E, Prasmickaite L, Hegset A, Berg K. Photochemical enhancement of DNA delivery by EGF receptor targeted polyplexes. Methods Mol Biol 2008;434:171-181.

Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:7297-7301.

Breuzard G, Tertil M, Goncalves C, Cheradame H, Geguan P, Pichon C, Midoux P. Nuclear delivery of NF-kB-assisted DNA/polymer complexes: plasmid DNA quantitation by confocal laser scanning microscopy and evidence of nuclear polyplexes by FRET imaging. Nucleic Acids Res 2008;36:1-12.

Brown E, McKee T, diTomaso E, Pluen A, Seed B, Boucher Y, Jain RK. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat Med. 2003;9:796-800.

Brunner S, Sauer T, Carotta S, Cotten M, Saltik M, Wagner E. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Ther 2000;7:401-407.

Capecchi MR. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell 1980;22:479-488.

Carystinos GD, Katabi MM, Laird DW, Galipeau J, Chan H, Alaoui-Jamali MA, Batist G. Cyclic-AMP induction of gap junctional intercellular communication increases bystander effect in suicide gene therapy. Clin Cancer Res 1999;5:61-68.

Chang YS, di Tomaso E, McDonald DM, Jones R, Jain RK, Munn LL. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:14608-14613.

Channarong S, Chaicumpa W, Sinchaipanid N, Mitrevej A. Development and evaluation of chitosan-coated liposomes for oral DNA vaccine: the improvement of Peyer's patch targeting using a polyplex-loaded liposomes. AAPS Pharm Sci Tech 2011; 12(1): 192-200.

Chen HH, Ho YP, Jiang X, Mao H-Q, Wang T-H, Leong KW. Quantitative Comparison of Intracellular Unpacking Kinetics of Polyplexes by a Model Constructed From Quantum Dot-FRET. Mol Ther 2008;16:324-332.

Cheng H, Zhu JL, Zeng X, Jing Y, Zhang XZ, Zhuo RX. Targeted gene delivery mediated by folate-polyethylenimine-block-poly(ethylene glycol) with receptor selectivity. Bioconjug Chem 2009;20:481-487.

Chisholm EJ, Vassaux G, Martin-Duque P, Chevre R, Lambert O, Pitard B, Merron A, Weeks M, Burnet J, Peerlinck I, Dai MS, Alusi G, Mather SJ, Bolton K, Uchegbu IF, Schatzlein AG, Baril P. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res 2009;69:2655-2662.

Choosakoonkriang S, Lobo BA, Koe GS, Koe JG, Middaugh CR. Biophysical characterization of PEI/DNA complexes. J Pharm Sci 2003;92:1710-1722.

Chung H, Lee JH, Jeong D, Han IO, Oh ES. Melanocortin 1 receptor regulates melanoma cell migration by controlling syndecan-2 expression. J Biol Chem 2012;287:19326-19335.

Clamme JP, Azoulay J, Mely Y. Monitoring of the formation and dissociation of polyethylenimine/DNA complexes by two photon fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J 2003;84:1960-1968.

De Bruin K, Ruthardt N, von Gersdorff K, Bausinger R, Wagner E, Ogris M, Brauchle C. Cellular dynamics of EGF receptor-targeted synthetic viruses. Mol Ther 2007;15:1297-1305.

Dellian M, Yuan F, Trubetskoy VS, Torchilin VP, Jain RK. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer 2000;82:1513-1518.

De Smedt SC, Remaut K, Lucas B, Braeckmans K, Sanders NN, Demeester J. Studying biophysical barriers to DNA delivery by advanced light microscopy. Adv Drug Deliv Rev 2005;57:191-210.

De Smedt SC, Wagner E, Ogris M. The internalization route resulting in successful gene expression depends on both cell line and polyethylenimine polyplex type. Mol Ther 2006;14:745-753.

Domin BA, Mahony WB, Zimmerman TP. Transport of 5-.uorouracil and uracil into human erythrocytes. Biochem Pharmacol 1993;46:503-510.

Dong X, Tian H, Chen L, Chen J, Chen X. Biodegradable mPEG-b-P(MCC-g-OEI) copolymers for efficient gene delivery. J Control Release 2011;152:135-142.

Drosten M, Frilling A, Stiewe T, Putzer BM. A new therapeutic approach in medullary thyroid cancer treatment: Inhibition of oncogenic RET signaling by adenoviral vectormediated expression of a dominant-negative RET mutant. Surgery 2002;132:991-997.

Duarte S, Carle G, Faneca H, de Lima MC, Pierrefite-Carle V. Suicide gene therapy in cancer: where do we stand now? Cancer Lett 2012;324:160-170.

Dufes C, Uchegbu IF, Schatzlein AG. Dendrimers in gene delivery. Adv Drug Deliv Rev 2005;57:2177-2202.

Elisei R, Vivaldi A, Ciampi R, Faviana P, Basolo F, Santini F, Traino C, Pacini F, Pinchera A. Treatment with drugs able to reduce iodine efflux significantly increases the intracellular retention time in thyroid cancer cells stably transfected with sodium iodide symporter complementary deoxyribonucleic acid. J Clin Endocrinol Metab 2006;91:2389-2395.

Eliyahu H, Barenholz Y, Domb AJ. Polymers for DNA Delivery. Molecules 2005;10:34-64.

Erbacher P, Bettinger T, Belguise-Valladier P, Zou S, Coll JL, Behr JP, Remy JS. Transfection and physical properties of various saccharide, poly(ethylene glycol), and antibody-derivatized polyethylenimines (PEI). J Gene Med 1999;1:210-222.

Erten A, Wrasidlo W, Scadeng M, Esener S, Hoffman RM, Bouvet M, Makale M. Magnetic resonance and fluorescence imaging of doxorubicin-loaded nanoparticles using a novel in vivo model. Nanomedicine 2010;6:797-807.

Fahrmeir J, Gunther M, Tietze N, Wagner E, Ogris M. Electrophoretic purification of tumor-targeted polyethylenimine-based polyplexes reduces toxic side effects in vivo. J Control Release 2007;122:236-245.

Feigner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipidmediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA 1987;84:7413-7417.

Fillat C, Carrio M, Cascante A, Sangro B. Suicide gene therapy mediated by the Herpes Simplex virus thymidine kinase gene/Ganciclovir system: fifteen years of application. Curr Gene Ther 2003;3:13-26.

Fischer D, Li Y, Ahlemeyer B, et al. In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis. Biomaterials 2003;24:1121-1131.

Folkes LK, Candeias LP, Wardman P. Towards targeted "oxidation therapy" of cancer: peroxidase-catalyzed cytotoxicity of indole-3-acetic acids. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998;42:917-920.

Freeman SM, Abboud CN, Whartenby KA, Packman CH, Koeplin DS, Moolten FL, Abraham GN. The "bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res 1993;53:5274-5283.

Fuller B, Lebowitz J. Decay of hormone responsiveness in mouse melanoma cells in culture as a function of cell density. J Cell Physiol 1980;103:279-287.

Gao F, Okunieff P, Han Z, Ding I, Wang L, Liu W, Zhang J, Yang S, Chen J, Underhill CB, Kim S, Zhang L. Hypoxia-induced alterations in hyaluronan and hyaluronidase. Adv Exp Med Biol 2005;566:249-256.

Glover DJ, Lipps HJ, Jans DA. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat Rev Genet 2005;6:299-310.

Gon?alves C, Mennesson E, Fuchs R, Gorvel JP, Midoux P, Pichon C. Macropinocytosis of polyplexes and recycling of plasmid via the clathrin-dependent pathway impair the transfection efficiency of human hepatocarcinoma cells. Mol Ther 2004;10:373-385.

Grandinetti G, Ingle NP, Reineke TM. Interaction of poly(ethylenimine)-DNA polyplexes with mitochondria: implications for a mechanism of cytotoxicity. Mol Pharm 2011;8:1709-1719.

Grayson AC, Doody AM, Putnam D. Biophysical and structural characterization of polyethylenimine-mediated siRNA delivery in vitro. Pharm Res 2006;23:1868-1876.

Greco O, Folkes LK, Wardman P, Tozer GM, Dachs GU. Development of a novel enzyme/prodrug combination for gene therapy of cancer: horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid. Cancer Gene Ther 2000;7:1414-1420.

Greco O, Dachs GU. Gene directed enzyme/prodrug therapy of cancer: historical appraisal and future prospectives. J Cell Physiol 2001;187:22-36.

Hanzlikova M, Ruponen M, Galli E, Raasmaja A, Aseyev V, Tenhu H, Urtti A, Yliperttula M. Mechanisms of polyethylenimine-mediated DNA delivery: free carrier helps to overcome the barrier of cell-surface glycosaminoglycans. J Gene Med 2011; 13:402-409.

Hart S. Multifunctional nanocomplexes for gene transfer and gene therapy Cell Biol Toxicol 2010;26:69-81.

Hashizume H, Baluk P, Morikawa S, McLean JW, Thurston G, Roberge S, Jain RK, McDonald DM. Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am J Pathol 2000;156:1363-1380.

Hillaireau H, Couvreur P. Nanocarriers' entry into the cell: relevance to drug delivery. Cell Mol Life Sci 2009;66:2873-2896.

Hingorani M, Spitzweg C, Vassaux G, Newbold K, Melcher A, Pandha H, Vile R, Harrington K. The biology of the sodium iodide symporter and its potential for targeted gene delivery. Curr Cancer Drug Targets 2010;10:242-267.

Holgado MA, Martin-Banderas L, Alvarez-Fuentes J, Fernandez-Arevalo M, Arias JL. Drug targeting to cancer by nanoparticles surface functionalized with special biomolecules. Curr Med Chem 2012;19:3188-3195.

Hori K, Nishihara M, Yokoyama M. Vital microscopic analysis of polymeric micelle extravasation from tumor vessels: macromolecular delivery according to tumor vascular growth stage. J Pharm Sci 2010;99:549-562.

Huang M, Batra RK, Kogai T, Lin YQ, Hershman JM, Lichtenstein A, Sharma S, Zhu LX, Brent GA, Dubinett SM. Ectopic expression of the thyroperoxidase gene augments radioiodide uptake and retention mediated by the sodium iodide symporter in non-small cell lung cancer. Cancer Gene Ther 2001;8:612-618.

Ichikawa T, Tamiya T, Adachi Y, Ono Y, Matsumoto K, Furuta T, Yoshida Y, Hamada H, Ohmato T. In vivo efficacy and toxicity of 5-fluorocytosine/cytosine deaminase gene therapy for malignant gliomas mediated by adenovirus. Cancer Gene Ther 2000;7:74-82.

Iida T, Mori T, Katayama Y, Niidome T. Overall interaction of cytosolic proteins with the PEI/DNA complex. J Control Release 2007; 118: 364-369.

Iyer AK, Khaled G, Fang J, Maeda H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Discov Today 2006; 11:812-818.

Jia ZY, Deng HF, Huang R, Yang YY, Yang XC, Qi ZZ, Ou XH. In vitro and in vivo studies of adenovirus-mediated human norepinephrine transporter gene transduction to hepatocellular carcinoma. Cancer Gene Ther 2011;18:196-205.

Joyce JM, Swihart A. Thyroid: nuclear medicine update. Radiol Clin North Am 2011;49:425-434.

Kang HC, Lee M, Bae YH. Polymeric Gene Carriers. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2005; 15:317-342.

Kano MR, Bae Y, Iwata C, Morishita Y, Yashiro M, Oka M, Fujii T, Komuro A, Kiyono K, Kaminishi M, Hirakawa K, Ouchi Y, Nishiyama N, Kataoka K, Miyazono K. Improvement of cancer-targeting therapy, using nanocarriers for intractable solid tumors by inhibition of TGF-beta signaling. Proc Natl Acad Sei U S A 2007;104:3460-3465.

Kasper JC, Schaffert D, Ogris M, Wagner E, Friess W. Development of a lyophilized plasmid/LPEI polyplex formulation with long-term stability—A step closer from promising technology to application. J Control Release 2011;151:246-255.

Kievit E, Nyati MK, Ng E, Stegman LD, Parsels J, Ross BD, Rehemtulla A, Lawrence TS. Yeast cytosine deaminase improves radiosensitization and bystander effect by 5-fluorocytosine of human colorectal cancer xenografts. Cancer Res 2000;60:6649-6655.

Kirpotin DB, Drummond DC, Shao Y, Shalaby MR, Hong K, Nielsen UB, Marks JD, Benz CC, Park JW. Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res 2006;66:6732-6740.

Kim SH, Jeong JH, Lee SH, Kim SW, Park TG. Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release 2008;129:107-116.

Kleemann E, Neu M, Jekel N, Fink L, Schmehl T, Gessler T, Seeger W, Kissel T. Nano-carriers for DNA delivery to the lung based upon a TAT-derived peptide covalently coupled to PEG-PEI. J Control Release 2005;109:299-316.

Klutz K, Russ V, Willhauck MJ, Wunderlich N, Zach C, Gildehaus FJ, Goke B, Wagner E, Ogris M, Spitzweg C. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res 2009;15:6079-6086.

Klutz K, Willhauck MJ, Dohmen C, Wunderlich N, Knoop K, Zach C, Senekowitsch-Schmidtke R, Gildehaus FJ, Ziegler S, Fürst S, Göke B, Wagner E, Ogris M, Spitzweg C. Image-guided tumor-selective radioiodine therapy of liver cancer after systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Hum Gene Ther 2011;22:1563-1574.

Ko YT, Bickel U, Huang J. Polyethylenimine/oligonucleotide polyplexes investigated by fluorescence resonance energy transfer and fluorescence anisotropy. Oligonucleotides 2011;21:109-114.

Kogai T, Brent GA. The sodium iodide symporter (NIS): regulation and approaches to targeting for cancer therapeutics. Pharmacol Ther 2012;135:355-370.

Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum KM, Artursson P. Chitosan as a nonviral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 2001;8:1108-1121.

Kukowska-Latallo JF, Bielinska AU, Johnson J, Spindler R, Tomalia DA, Baker JR. Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using starburst polyamidoamine dendrimers. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:4897-4902.

Kuriyama S, Kikukawa M, Masui K, Okada H, Nakatani T, Sakamoto T, Yohiji H, Fukui H, Ikenaka K, Mullen CA, Tsujii T. Cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy can induce efficient anti-tumor effects and protective immunity in immunocompetent mice but not in athymic nude mice. Int J Cancer 1999;81:892-597.

Kursa M, Walker GF, Roessler V, Ogris M, Roedl W, Kircheis R, Wagner E. Novel shielded transferrin-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes for systemic tumor-targeted gene transfer. Bioconjug Chem 2003;14:222-231.

Kwon IK, Lee SC, Han B, Park K. Analysis on the current status of targeted drug delivery to tumors. J Control Release 2012;164:108-114.

Laschke MW, Vollmar B, Menger MD. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mater 2011 ;22:147-164.

Lammers T, Kiessling F, Hennink WE, Storm G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. J Control Release 2012;161:175-187.

Lechardeur D, Verkman AS, Lukacs GL. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. Adv Drug Deliv Rev 2005;57:755-767.

Lee H, Fonge H, Hoang B, Reilly RM, Allen C. The effects of particle size and molecular targeting on the intratumoral and subcellular distribution of polymeric nanoparticles. Mol Pharm 2010;7:1195-1208.

Li J, Ge Z, Liu S. PEG-sheddable polyplex micelles as smart gene carriers based on MMP-cleavable peptide-linked block copolymers. Chem Commun (Camb) 2013;49:6974-6976.

Li L, Wang R, Wilcox D, Zhao X, Song J, Lin X, Kohlbrenner WM, Fesik SW, Shen Y. Tumor vasculature is a key determinant for the efficiency of nanoparticle-mediated siRNA delivery. Gene Ther 2012;19:775-780.

Li L, Ten Hagen TL, Bolkestein M, Gasselhuber A, Yatvin J, van Rhoon GC, Eggermont AM, Haemmerich D, Koning GA. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release 2013;167:130-137.

Lim R, Fahrenkrog B. The nuclear pore complex up close. Curr Opin Cell Biol 2006;18:342-347.

Matthay KK, George RE, Yu AL. Promising therapeutic targets in neuroblastoma. Clin Cancer Res 2012; 18:27402753.

McCormick F. Cancer gene therapy: Fringe or cutting edge. Nat Rev Cancer 2001; 1:130-141.

Mehra NK, Mishra V, Jain NK. Receptor-based targeting of therapeutics. Ther Deliv 2013;4:369-394.

Mennesson E, Erbacher P, Piller V, Kieda C, Midoux P, Pichon C. Transfection efficiency and uptake process of polyplexes in human lung endothelial cells: a comparative study innon-polarized and polarized cells. J Gene Med 2005;7:729-738.

Merron A, Peerlinck I, Martin-Duque P, Burnet J, Quintanilla M, Mather S, Hingorani M, Harrington K, Iggo R, Vassaux G. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther 2007;14:1731-1738.

Mesika A, Grigoreva I, Zohar M, Reich Z. A regulated, NFkB-assisted import of plasmid DNA into mammalian cell nuclei. Mol Ther 2001;3:653-657.

Mesnil M, Yamasaki H. Bystander effect in herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir cancer gene therapy: role of Gap-junctional intercellular communication. Cancer Res 2000;60:3989-3999.

Mickler FM, Vachutinsky Y, Oba M, Nishiyama N, Kataoka K, Brauchle C, Ruthardt N. Effect of integrin targeting and PEG shielding on polyplex micelle internalization studied by live-cell imaging. J Control Release 2011;156:364-373.

Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacol Rev 2001 ;53:283-318.

Moghimi SM, Symonds P, Murray JC, Hunter AC, Debska G, Szewczyk A. A two-stage poly(ethylenimine)-mediated cytotoxicity: implications for genetransfer/therapy. Mol Ther 2005; 11:990-995.

Morgan DM, Larvin VL, Pearson JD. Biochemical characterisation of polycation induced cytotoxicity to human vascular endothelial cells. J Cell Sci 1989;94:553-559.

Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, Hughes MS, Yang JC, Sherry RM, Royal RE, Topalian SL, Kammula US, Restifo NP, Zheng Z, Nahvi A, de Vries CR, Rogers-Freezer LJ, Mavroukakis SA, Rosenberg SA. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science 2006;314:126-129.

Nagamitsu A, Greish K, Maeda H. Elevating blood pressure as a strategy to increase tumor targeted delivery of macromolecular drug SMANCS: cases of advanced solid tumors. Jpn J Clin Oncol 2009;39:756-766.

Nagayama Y, Shigematsu K, Namba H, Zeki K, Yamashita S, Niwa M. Inhibition of angiogenesis and tumorigenesis, and induction of dormancy by p53 in a p53-null thyroid carcinoma cell line in vivo. Anticancer Res 2000;20:2723-2728.

Neu M, Fischer D, Kissel T. Recent advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and its derivatives. J Gene Med 2005;7:992-1009.

Ng QK, Sutton MK, Soonsawad P, Xing L, Cheng H, Segura T. Engineering clustered ligand binding into nonviral vectors: alphavbeta3 targeting as an example. Mol Ther 2009;17:828-836.

Niculescu-Duvaz I, Spooner R, Marais R, Springer CJ Gene-directed enzyme prodrug therapy. Bioconjug Chem 1998;9:4-22.

Nishikawa M, Huang L. Nonviral vectors in the new millennium: delivery barriers in gene transfer. Hum Gene Ther 2001;12:861-870.

Noga M, Edinger D, Klager R, Wegner SV, Spatz JP, Wagner E, Winter G, Besheer A. The effect of molar mass and degree of hydroxyethylation on the controlled shielding and deshielding of hydroxyethyl starch-coated polyplexes. Biomaterials 2013;34:2530-2538.

Nomoto T, Matsumoto Y, Miyata K, Oba M, Fukushima S, Nishiyama N, Yamasoba T, Kataoka K. In situ quantitative monitoring of polyplexes and polyplex micelles in the blood circulation using intravital real-time confocal laser scanning microscopy. J Control Release 2011; 151:104-109.

Ogris M, Steinlein P, Kursa M, Mechtler K, Kircheis R, Wagner E. The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther 1998;5:1425-1433.

Ogris M, Walker G, Blessing T, Kircheis R, Wolschek M, Wagner E. Tumor-targeted gene therapy: strategies for the preparation of ligand-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes. J Control Release 2003;91: 173181.

Owens DE, Peppas NA. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles. Int J Pharm. 2006;307:93-102.

Parelkar SS, Chan-Seng D, Emrick T. Reconfiguring polylysine architectures for controlling polyplex binding and non-viral transfection. Biomaterials 2011;32:2432-2444.

Park TG, Jeong JH, Kim SW. Current status of polymeric gene delivery systems. Adv Drug Deliv Rev 2006;58,467-486.

Pathak A, Patnaik S, Gupta KC. Recent trends in non-viral vector-mediated gene delivery. Biotechnol J 2009;11:1559-1572.

Petrich T, Helmeke H-J, Meyer G J, Knapp WH, Potter E. Establishment of radioactive astatine and iodine uptake in cancer cell lines expressing the human sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med 2002;29:842-854.

Pirotton S, Muller C, Pantoustier N, Botteman F, Collinet S, Grandfils C, Dandrifosse G, Degée P, Dubois P, Raes M. Enhancement of transfection efficiency through rapid and noncovalent post-PEGylation of poly(dimethylaminoethyl methacrylate)/DNA complexes. Pharm Res 2004;21(8): 1471-1479.

Popovic Z, Liu W, Chauhan VP, Lee J, Wong C, Greytak AB, Insin N, Nocera DG, Fukumura D, Jain RK, Bawendi MG.A nanoparticle size series for in vivo fluorescence imaging. Angew Chem Int Ed Engl 2010;49:8649-8652.

Pusch M., Zifarelli G., Murgia A.R., Picollo A., Babini E. Channel or transporter? The CLC saga continues. Exp Physiol 2006;91:149-152.

Qi R, Liu S, Chen J, Xiao H, Yan L, Huang Y, Jing X. Biodegradable copolymers with identical cationic segments and their performance in siRNA delivery. J Control Release 2012;159:251-260.

Rajecki M, Sarparanta M, Hakkarainen T, Tenhunen M, Diaconu I, Kuhmonen V, Kairemo K, Kanerva A, Airaksinen AJ, Hemminki A. SPECT/CT imaging of hNIS-expression after intravenous delivery of an oncolytic adenovirus and 1311. PLoS One 2012;7:e32871.

Raouane M, Desmaele D, Gilbert-Sirieix M, Gueutin C, Zouhiri F, Bourgaux C, Lepeltier E, Gref R, Ben Salah R, dayman G, Massaad-Massade L, Couvreur P. Synthesis, characterization, and in vivo delivery of siRNA-squalene nanoparticles targeting fusion oncogene inpapillary thyroid carcinoma. J Med Chem 2011;54:4067-4076.

Raymond C, Tom R, Perret S, Moussouami P, L'abbé D, St-Laurent G, Durocher Y. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods 2011;55:44-51.

Read M, Singh S, Ahmed Z, Stevenson M, Briggs S, Oupicky D, Barrett L, Spice R, Kendall M, Logan A, Seymour L. A versatile reducible polycation-based system for efficient delivery of a broad range of nucleic acids. Nuc Acid Res 2005;33:e86.

Ribeiro P, Patocka N. Neurotransmitter transporters in schistosomes: Structure, function and prospects for drug discovery. Parasitol Int 2013: S1383-5769(13)00079-2.

Rigg, A, Sikora K. Genetic prodrug activation therapy. Mol Med Today 1997;3:359-366.

Salazar-Onfray F, López M, Lundqvist A, Aguirre A, Escobar A, Serrano A, Korenblit C, Petersson M, Chhajlani V, Larsson O, Kiessling R. Tissue distribution and differential expression of melanocortin 1 receptor, a malignant melanoma marker. Br J Cancer 2002;87:414-422.

Sanjoh M, Hiki S, Lee Y, Oba M, Miyata K, Ishii T, Kataoka K. pDNA/poly(L-lysine) Polyplexes Functionalized with a pH-Sensitive Charge-Conversional Poly(aspartamide) Derivative for Controlled Gene Delivery to Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Macromol Rapid Commun 2010;31:1181-1186.

Sarin H. Physiologic upper limits of pore size of different blood capillary types and another perspective on the dual pore theory of microvascular permeability. J Angiogenes Res 2010;2:14.

Schwerdt A, Zintchenko A, Concia M, Roesen N, Fisher K, Lindner LH, Issels R, Wagner E, Ogris M. Hyperthermia-induced targeting of thermosensitive gene carriers to tumors. Hum Gene Ther 2008;19:1283-1292.

Sethuraman VA, Na K, Bae YH. pH-responsive sulfonamide/PEI system for tumor specific gene delivery: an in vitro study. Biomacromolecules 2006;7,64-70.

Serganova I, Ponomarev V, Blasberg R. Human reporter genes: potential use in clinical studies. Nucl Med and Biol 2007;34:791-807.

Shen Y, Liu P, Zhang A, Xu LX. Study on tumor microvasculature damage induced by alternate cooling and heating. 2008;36:1409-1419.

Siegrist W, Solea F, Stutz S, Giuffre L, Carrel S, Girard J, Eberle AN. Characterization of receptors for alpha-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cells. Cancer Res 1989;49:6352-6358.

Sirsi SR, Hernandez SL, Zielinski L, Blomback H, Koubaa A, Synder M, Homma S, Kandel JJ, Yamashiro DJ, Borden MA. Polyplex-microbubble hybrids for ultrasound-guided plasmid DNA delivery to solid tumors. J Control Release 2012;157:224-234.

Schlessinger A, Geier E, Fan H, Irwin JJ, Shoichet BK, Giacomini KM, Sali A. Structure-based discovery of prescription drugs that interact with the norepinephrine transporter, NET. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:1581015815.

Schmitt-Sody M, Strieth S, Krasnici S, Sauer B, Schulze B, Teifel M, Michaelis U, Naujoks K, Dellian M. Neovascular targeting therapy: paclitaxel encapsulated in cationic liposomes improves antitumoral efficacy. Clin Cancer Res 2003;9:2335-2341.

Smrekar B, Wightman L, Wolschek MF, Lichtenberger C, Ruzicka R, Ogris M, Rodl W, Kursa M, Wagner E, Kircheis R. Tissue-dependent factors affect gene delivery to tumors in vivo. Gene Ther 2003;10:1079-1088.

Sonawane ND, Szoka FC, Verkman AS. Chloride accumulation and swelling in endosomes enhances DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes. J Biol Chem 2003;278:44826-44831.

Sorensen A, Mairs RJ, Braidwood L, Joyce C, Conner J, Pimlott S, Brown M, Boyd M.In vivo evaluation of a cancer therapy strategy combining HSV1716-mediated oncolysis with gene transfer andtargeted radiotherapy. J Nucl Med 2012;53:647-654.

Spitzweg C, Morris JC. Gene therapy for thyroid cancer: current status and future prospects. Thyroid 2004; 14:424434.

Springer CJ, Niculescu-Duvaz I. Gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT): choice of prodrugs. Adv Drug Deliv Rev 1996;22:351-364.

Springer CJ, Niculescu-Duvaz I. Prodrug-activating systems in suicide gene therapy. J Clin Investig 2000;105:1161-1167.

Stewart M. Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle. Mol Cell Biol 2007;8:195-208.

Stramhaug PE, Berg TO, Gj0en T, Seglen PO. Differences between fluid-phase endocytosis (pinocytosis) and receptor-mediated endocytosis in isolated rat hepatocytes. Eur J Cell Biol 1997;73:28-39.

Stuart AD, Brown TD. Entry of feline calicivirus is dependent on clathrin-mediated endocytosis and acidification in endosomes. J Virol 2006;80:7500-7509.

Szardenings M, Muceniece R, Mutule I, Mutulis F, Wikberg JE. New highly specific agonistic peptides for human melanocortin MC(1) receptor. Peptides 2000;21:239-243.

Ten Hagen TL, Seynhaeve AL, Eggermont AM. Tumor necrosis factor-mediated interactions between inflammatory response and tumor vascular bed. Immunol Rev 2008;222:299-315.

Thibault M, Astolfi M, Tran-Khanh N, Lavertu M, Darras V, Merzouki A, Buschmann MD. Excess polycation mediates efficient chitosan-based gene transfer by promoting lysosomal release of the polyplexes. Biomaterials. 2011;32:4639-4646.

Tomalia DA, Baker H, Dewald J, Hall M, Kallos G, Martin S, Roeck J, Ryder J, Smith P. A new class of polymers: starburst-dendritic macromolecules. Polymer J 1985;17:117-132.

Trinh QT, Austin EA, Murray DM, Knick VC, Huber BE. Enzyme/prodrug gene therapy: comparison of cytosine deaminase/5-.uorocytosine versus thymidine kinase/ganciclovir enzyme/prodrug systems in a human colorectal carcinoma cell line. Cancer Res 1995;55:4808-4812.

Ulasov AV, Khramtsov YV, Trusov GA, Rosenkranz AA, Sverdlov ED, Sobolev AS. Properties of PEI-based polyplex nanoparticles that correlate with their transfection efficacy. Mol Ther 2011;19:103-112.

Uttenthal BJ, Chua I, Morris EC, Stauss HJ. Challenges in T cell receptor gene therapy. J Gene Med 2012;14:386-399.

Van den Berg BM, Nieuwdorp M, Stroes ES, Vink H. Glycocalyx and endothelial (dys) function: from mice to men. Pharmacol Rep 2006;58 Suppl:75-80.

Van Sande J, Massart C, Beauwens R, Schoutens A, Costagliola S, Dumont JE, Wolff J. Anion slectivity by the sodium iodide symporter. Endocrinology 2003;144:247-252.

Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods 2000;243:167-190.

Von Gersdorff K, Ogris M, Wagner E. Cryoconserved shielded and EGF receptor targeted DNA polyplexes: cellular mechanisms. Eur J Pharm Biopharm 2005;60:279-285.

Wagner E, Plank C, Zatloukal K, Cotten M, Birnstiel ML. Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrinpolylysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:7934-7938.

Wang M, Gartel AL. The suppression of FOXM1 and its targets in breast cancer xenograft tumors by siRNA. Oncotarget 2011 ;2:1218-1226.

Wang T, Upponi JR, Torchilin VP. Design of multifunctional non-viral gene vectors to overcome physiological barriers: dilemmas and strategies. Int J Pharm 2012;427:3-20.

Ward CM, Read ML, Seymour LW. Systemic circulation of poly (L-lysine)/DNA vectors is influenced by polycation molecular weight and type of DNA:differential circulation in mice and rats and the implications for human gene therapy. Blood 2001;97:2221e9.

Wattiaux R., Laurent N.,Wattiaux-De Coninck S., Jadot M. Endosome, lysosome: their implification in gene transfer. Adv Drug Deliv Rev 2000;41:201-208.

Weecharangsan W, Opanasopit P, NgawhiruN/Pat T, Apirakaramwong A, Rojanarata T, Ruktanonchai U, Lee RJ. Evaluation of chitosan salts as non-viral gene vectors in CHO-K1 cells. Int J Pharm 2008;348:161-168.

Wolschek MF, Thallinger C, Kursa M, Rossler V, Allen M, Lichtenberger C, Kircheis R, Lucas T, Willheim M, Reinisch W, Gangl A, Wagner E, Jansen B. Specific systemic nonviral gene delivery to human hepatocellular carcinoma xenografts in SCID mice. Hepatology 2002;36:1106-1114.

Wu F, Chen WZ, Bai J, Zou JZ, Wang ZL, Zhu H, Wang ZB. Tumor vessel destruction resulting from high-intensity focused ultrasound in patients with solid malignancies. Ultrasound Med Biol 2002;28:535-542.

Wu GY, Wu CH. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system. J Biol Chem 1987;262:4429-4432.

Xie FJ, Zhao P, Zhang YP, Liu FY, Nie XL, Zhu YH, Yu XM, Zheng QQ, Mao WM, Lu HY, Wei H, Huang W. Adenovirus-mediated interferon-y gene therapy induced human pancreatic carcinoma Capan-2 cell apoptosis in vitro and in vivo. Anat Rec (Hoboken) 2013;296(4):604-610.

Xu G, McLeod HL. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clin Cancer Res 2001 ;7:3314-3324.

Yin D, Li Y, Lin H, Guo B, Du Y, Li X, Jia H, Zhao X, Tang J, Zhang L. Functional graphene oxide as a plasmid-based Stat3 siRNA carrier inhibits mouse malignant melanoma growth in vivo. Nanotechnology 2013;24:105102.

Yoshizawa T, Hattori Y, Hakoshima M, Koga K, Maitani Y. Folate-linked lipid-based nanoparticles for synthetic siRNA delivery in KB tumor xenografts. Eur J Pharm Biopharm 2008;70:718-725.

Yousefi A, Storm G, Schiffelers R, Mastrobattista E. Trends in polymeric delivery of nucleic acids to tumors. J Control Release 2013;170:209-218.

Yuan F, Dellian M, Fukumura D, Leunig M, Berk DA, Torchilin VP, Jain RK. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res 1995;55:3752-3756.

Zanta MA, Belguise-Valladier P, Behr JP. Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:91-96.

Zhang B, Ma X, Murdoch W, Radosz M, Shen Y. Bioreducible poly(amido amine)s with different branching degrees as gene delivery vectors. Biotechnol Bioeng 2013;110:990-998.

Zhang R, Baunoch D, DeGroot LJ. Genetic immunotherapy for medullary thyroid carcinoma: destruction of tumors in mice by in vivo delivery of adenoviral vector transducing the murine interleukin-2 gene. Thyroid 1998;8:1137— 1146.

Zhang R, DeGroot LJ. Genetic immunotherapy of established tumours with adenoviral vectors transducing murine interleukin-12 (mlL12) subunits in a rat medullary thyroid carcinoma model. Clin Endocrinol 2000;52:687-694.

Zhang S, Xu Y, Wang B, Qiao W, Liu D, Li Z. Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery. J Control Release 2004;100:165-180.

Zhang Y, Satterlee A, Huang L. In vivo gene delivery by nonviral vectors: overcoming hurdles? Mol Ther 2012;20:1298-1304.

Zheng M, Librizzi D, K1I19 A, Liu Y, Renz H, Merkel OM, Kissel T. Enhancing in vivo circulation and siRNA delivery with biodegradable polyethylenimine-graft-polycaprolactone-block-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials 2012;33:6551 -6658.

Zhong D, Jiao Y, Zhang Y, Zhang W, Li N, Zuo Q, Wang Q, Xue W, Liu Z. Effects of the gene carrier polyethyleneimines on structure and function of blood components. Biomaterials 2013,34:294-305.