Исследование пространственной структуры антимикробных пептидов - протегринов (PG-2 - PG-5) в растворе с мицеллами методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.07, кандидат наук Колосова Ольга Андреевна

• Колосова Ольга Андреевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Колосова Ольга Андреевна

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. Основные принципы ЯМР спектроскопии, ее приложений в определении структуры молекул и моделирования структур

1.1. Основные принципы ЯМР спектроскопии

1.2. Двумерная спектроскопия ЯМР

1.3. Гомоядерный эксперимент COSY

1.4. Гомоядерный эксперимент TOCSY

1.5. Ядерный эффект Оверхаузера. Эксперимент NOESY

1.5.1. Определение межпротонных расстояний

1.5.2. Интенсивность кросс-пиков в NOESY эксперименте

1.5.3. Влияние молекулярной массы на интенсивность кросс-пиков

1.6. Расчет структуры белка

2. Объекты и методы исследования

2.1. Антимикробные пептиды

2.2. Свойства антимикробных пептидов

2.3. Классиф икация АП

2.4. Механизм действия АП

2.5. Протегрины

2.6. Мицеллы как модель поверхности клеточной мембраны

2.7. Методика проведения эксперимента

3. Пространственное строение АП протегринов в растворе в комплексе с моделями поверхности биологической мембраны

3.1. Пространственная структура антимикробного пептида протегрина-2 в комплексе с мицеллами ДФХ

3.2. Пространственная структура пептида протегрина-3 в комплексе с мицеллами ДФХ

3.3. Пространственная структура протегрина-4 в комплексе с детергентом CHAPS

3.4. Пространственная структура пептида протегрина-5 в комплексе с мицеллами ДФХ

4. Основные результаты и выводы

5. Публикации по теме диссертации

Список литературы

6. Приложение

ЯМР РСА COSY

TOCSY

HSQC

NOESY

HMBC

АП ССИ XC TMC

м.д.

МД

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ядерный магнитный резонанс рентгеноструктурный анализ

Correlation spectroscopy - двумерная корреляционная спектроскопия

Total correlation spectroscopy - полная корреляционная двумерная спектроскопия

Heteronuclear single-quantum correlation - двумерная гетероядерная корреляционная спектроскопия Nuclear Overhauser effect spectroscopy - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера

Heteronuclear multiple-quantum correlation - двумерная

много-квантовая гетероядерная корреляционная

спектроскопия

антимикробный пептид

спад свободной индукции

химический сдвиг

1

тетраметилсилан, его сигналы в спектрах ЯМР Н и С приняты за 0 м.д.

миллионная доля - единица измерения химических

1

сдвигов в спектрах ЯМР и С молекулярная динамика

ВВЕДЕНИЕ

Среди физико-химических методов исследования пространственной структуры молекул важное место занимает спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Наряду с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) и расчетных методов молекулярной динамики (МД), результаты применения методов ЯМР высокого разрешения являются необходимыми и важными для исследования молекулярной структуры и динамики биологических макромолекул в растворе.

Актуальность исследования. В настоящее время исследование пространственной структуры комплекса пептида с моделью биологической мембраны представляет большой интерес для дальнейшего изучения молекулярных механизмов на поверхности клеток [1-3]. Исследования пространственного строения молекул в растворах основаны на использовании стандартных подходов в ЯМР, таких как двумерная спектроскопия ЯМР NOESY (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, не связанными посредством спин-спинового взаимодействия и отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А [4].

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию пространственной структуры таких белковых молекул, которые имеют антибиотические свойства, а именно антимикробных пептидов (АП). Такой интерес вызван потребностью поиска новых препаратов в связи с развитием устойчивости многих патогенных микроорганизмов к современным антибиотикам. АП - это эволюционно сохраняющиеся компоненты, существующие в истории жизни на Земле, они являются ключевыми молекулами врожденного иммунитета [5-9]. АП найдены во множестве живых организмов, в том числе и в организме человека [6]. Данные пептиды обладают широким спектром действия и могут быть использованы в качестве новых лекарственных препаратов. Было продемонстрировано, что АП убивают бактерии (включая

резистентные штаммы), микобактерии, оболочечные вирусы, грибы и даже раковые клетки [9-11].

Антимикробные пептиды в основном имеют длину 12-50 аминокислотных остатков, но также было открыто несколько больших белков (лизоцимы, лактоферрин и хромогранин), которые обладают антимикробными свойствами [12]. Обычно АП имеют положительный заряд, который может варьироваться в зависимости от количества положительно заряженных аминокислотных остатков (в основном - аргининов и лизинов). Также АП обычно имеют достаточно большие гидрофобные кластеры (около 50% от числа аминокислотных остатков). Уникальный баланс гидрофильных (сродство к воде) и липофильных (сродство к жирам) остатков обеспечивает амфифильный характер АП [6,13-17]. Было установлено, что изменение последовательности и модификация заряженных аминокислот значительно меняет активность пептидов. Также необходимо учитывать, что пространственная структура пептидов имеет большое значение для процессов на клеточном уровне. Выделяют несколько важных характеристик АП: физико-химические свойства, первичная структура, вторичная структура и т.д. [11,16,17].

Определение пространственной структуры и положения элементов вторичной структуры белка/пептида является важным этапом для установления молекулярных процессов в живой клетке.

Вторичная структура может сильно влиять на активность АП. Различают следующие виды вторичных структур: а-спираль, Р-складка и клубок. Обычно образование вторичной структуры АП происходит в присутствии мембран [6,16,18,19].

В данной работе в качестве объектов исследования были выбраны следующие пептиды: протегрин-2 (РО-2), протегрин - 3 (РО-3), протегрин - 4 (РО-4), протегрин - 5 (РО-5) (обозначения аминокислотных остатков в общепринятых буквенных кодах, соответствующих номенклатуре ШРАС/ШВМВ, приведены на рисунке 1, Приложение А).

Данные соединения относятся к классу цитотоксичных (способных вызывать необратимые изменения в клетках) пептидов и играют важную роль в иммунных системах множества организмов.

Протегрин-1

ИЛЗД? I. с у с ц)

Б Б \5)

и 5 V С V с *

Протегрин-2 Я & & К I С У С л

Б Б

V С V С

Протегрин-3

УМ Я; 5 Б * ~

ЯК& У^С V с *

Протегрин-4

МММИМ)

Б Б I* £ У С ¥ С \)

Протегрин-5

5 Б ив)

Рисунок 1 - Пять известных природных протегринов

Олигомеры цитотоксичных пептидов способны вызвать гибель определенных клеток путем образования трансмембранных пор (Рисунок 2).

Рисунок 2 - Модель трансмембранной поры, образованной мономерами РО-1 [39]

Согласно результатам последних исследований пептидов, способных к проникновению в клеточную мембрану, протегрины и ряд других АП с Р-складчатой структурой имеют схожие механизмы действия [21]. Так, антимикробные пептиды протегрины проявляют свою активность в результате взаимодействия с клеточной мембраной, поэтому для понимания молекулярного механизма их действия, необходимо получить информацию о пространственном строении комплекса пептида с модельной мембраной, а также о строении данных пептидов в растворе.

Исследования структуры протегрина PG-1 показали, что он способен образовывать димер в растворе с мицеллами додецилфосфохолина (ДФХ) (PDB: 1ZY6) [22], в дальнейшем ассоциация нескольких димеров образует канал в мембране клетки [23,24], однако молекулярный механизм разрушения клеток не а-спиральными пептидами до сих пор не известен [1].

Некоторые экспериментальные исследования, а также расчеты методом молекулярной динамики [25-27] по данным атомно-силовой микроскопии показали, что протегрины могут ассоциироваться в более крупные молекулы, образуя поры, состоящие из 8 (октамер) или 10 (декамер) мономеров. Согласно расчетам потенциала средней силы (метод PMF) [27], октамеры протегринов являются более стабильными.

Изучение образования димера (ассоциация двух молекул мономеров) протегрина PG-1 является важным этапом для понимания процесса образования пор в липидном бислое, так как димер может являться составной единицей при ассоциации более крупных упорядоченных агрегатов [28]. Несмотря на то, что протегрину PG-1 посвящено большое количество работ, остальные протегрины PG-2 - PG-5 остаются пока мало изученными [29-32].

Исследования активности протегринов показали, что протегрины PG-2, -3, и -5, но не PG-4, обладают схожей эффективностью, как и PG-1 [33]. Согласно этим исследованиям, минимально необходимой структурой в аминокислотной последовательности протегринов для сохранения активности против широкого спектра бактерий являются 12 аминокислотных остатков, и, по крайней мере,

дополнительных остатка необходимы для того, чтобы протегрин обладал мощными противогрибковыми свойствами. Таким образом, протегрин PG-2, состоящий из 16 аминокислотных остатков, представляет собой минимальную структуру пептида обладающей широким спектром противогрибковой и антибактериальной активности [33].

Для того чтобы выявить структурные различия и сходства между уже изученным протегрином PG-1 и другими протегринами, повысить активность и селективность данных пептидов, необходимо исследовать структуру и функции протегринов PG-2, PG-3, PG-4, PG-5 методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения [34,35]. Для установления вторичной структуры белков, важно исследовать данные пептиды в среде с добавлением модельных мембран, имитирующих поверхность клеток [36-38].

Целью настоящей диссертационной работы являлось установление пространственного строения антимикробных пептидов протегринов PG-2, PG-3,

1

PG-4, PG-5 с нативным содержанием изотопов H, C в комплексе с моделями поверхности биологических мембран в растворе и выявление общих закономерностей олигомеризации.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Регистрация необходимых для исследования одно- и двумерных спектров

1

ЯМР. Их анализ и проведение полного соотнесения сигналов ядер H, C для протегринов PG-2, PG-3, PG-4, PG-5;

2. Расчет пространственной структуры мономеров и димеров для протегринов PG-2, PG-3, PG-4, PG-5 на основе полученных экспериментальных ограничений.

Методы исследования. При решении поставленных задач использовались двумерные гомоядерные и гетероядерные эксперименты ЯМР. Одномерные (1H) и двумерные (1H-1H, 1H-13C) спектры ЯМР были зарегистрированы на спектрометрах AVANCE II-500 (500МГц (1H)) и BRUKER AVANCE III HD (700МГц (1H), с четырехканальным криодатчиком) при температуре 293 K.

Сигналы протонов в спектрах ЯМР были соотнесены с помощью стандартной методики на основе 2D TOCSY и NOESY экспериментов.

13

Соотнесение сигналов ядер углерода C было произведено посредством 2D XH- C

1 1Y

HSQC, H- C HMBC экспериментов. Расчет пространственной структуры пептидов производился методом молекулярной динамики в программах XPLOR-NIH и ARIA с использованием полученных экспериментальных данных (межпротонных расстояний) в качестве ограничений на геометрию молекулы [40,41].

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах. Научная новизна. В данной работе впервые получены пространственные структуры пептидов PG-2, PG-3, PG-5 в растворе с мицеллами ДФХ и пространственная структура пептида PG-4 в растворе с детергентом CHAPS. Методом двумерной спектроскопии ЯМР определены координаты атомов (в формате PDB) данных пептидов. Показано, что данные АП образуют в присутствии с модельными мембранами Р-складку. Также установлено наличие димеризации протегринов и предположена модель о поэтапном образовании трансмембранных тороидальных пор.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается: использованием адекватных задачам методики и техники эксперимента; применением прямых методов измерения межпротонных расстояний; воспроизводимостью данных; соответствием с результатами, полученными другими методами, в том числе путем теоретического моделирования структуры [22]; использованием современного оборудования для проведения ЯМР экспериментов и программного обеспечения.

Научная и практическая ценность заключается в том, что: 1. Установленные спектрально-структурные химические параметры в дальнейшем могут использоваться как справочный материал, который в дальнейшем может быть использован для установления структур других макромолекул.

2. Структуры, полученные в результате данной работы, позволяют строить модели о взаимодействии Р-складчатых антимикробных пептидов с бактериальными, вирусными и другими патогенными мембранами.

Личный вклад автора.

Участие при постановке целей и задач исследования. Регистрация одно- и двумерных спектров ЯМР и их обработка. Анализ и интерпретация полученных результатов. Построение структур методом молекулярной динамики. Написание статей по теме данных исследований.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование пространственной структуры антимикробных пептидов - протегринов (PG-2 - PG-5) в растворе с мицеллами методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения»

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, семинарах и научных школах различного уровня: Двадцать первая Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых ученых (ВНКСФ-21, г. Омск, 2015); Итоговые конференции студентов Казанского (Приволжского) федерального университета (г. Казань, 2015, 2016); VI Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (г. Казань, 2015); 12-ая зимняя школа-конференция Spinus (СПбГУ, г. Санкт-Петербург, 2015); International symposium "Magnetic resonance: from fundamental research to practical application" (г. Казань, 2016); II Международная школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2016); Международная конференция «Трансляционная медицина 2016» (г. Казань, 2016); 13th International Youth school-conference "Magnetic resonance and its applications"(r Санкт-Петербург, 2016); Итоговая научная конференция Казанского университета за 2016 год (г. Казань, 2017); III Международная школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Материалы и технологии XXI века" (г. Казань, 2018); The 2018 ASCB|EMBO Meeting (г. Сан Диего, 2018).

Исследуемые в данной работе объекты были получены в лаборатории пептидного синтеза в Техническом университете (Лулео, Швеция) под руководством доктора физико-математических наук Филиппова А.В.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 5 публикаций в реферируемых научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и Web of Science.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 122 страницах (включая 3 страницы приложения) машинописного текста и содержит 56 рисунков, 13 таблиц; включает введение, три главы, основные результаты и выводы, публикации автора по теме диссертации, список литературы из 117 наименований.

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы, сформулирована цель, приведены методы и объекты исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, представлены выносимые на защиту научные положения.

В первой главе изложены основные положения классической и квантово-механической теории ЯМР Приводится квантово-механическое описание двумерных спектров ЯМР, описаны основные принципы расчёта структуры методом молекулярной динамики. Рассмотрены основы двумерной спектроскопии ЯМР COSY, TOCSY и NOESY, а также подробно рассмотрена методика расчета межпротонных расстояний в органических молекулах, приводится описание экспериментальной части диссертационной работы.

Во второй главе приводится литературный обзор по антимикробным пептидам, описываются их свойства и классификация, а также содержится описание исследуемых в работе объектов: антимикробных пептидов протегринов PG-2, PG-3, PG-4, PG-5.

Третья глава посвящена исследованию пространственного строения антимикробных пептидов протегринов PG-2, PG-3, PG-4 и PG-5 в растворе в комплексе с моделями поверхности клеточной мембраны (ДФХ и CHAPS), а также установлению механизма димеризации и олигомеризации протегринов.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, доктору химических наук, профессору Владимиру Васильевичу Клочкову за руководство, постановку задачи, постоянную поддержку, оказываемую при

проведении работы. Автор благодарит научного консультанта, кандидата физико-математических наук, доцента Константина Сергеевича Усачёва за наставничество, ценные советы и помощь в проведении научной работы. Отдельно хочется поблагодарить доктора химических наук, профессора Аганова Альберта Вартановича за внимание, проявленное к работе. Также автор благодарит доктора физико-математических наук Скирду Владимира Дмитриевича за конструктивную критику и ценные замечания при обсуждении результатов. Большое спасибо кандидату физико-математических наук Хайрутдинову Булату Имамутдиновичу за грамотное рецензирование работы и обсуждение результатов. Автор выражает благодарность доктору физико-математических наук Филиппову Андрею Васильевичу за предоставленные соединения. Спасибо всем сотрудникам кафедры медицинской физики за поддержку и сотрудничество.

1. Основные принципы ЯМР спектроскопии, ее приложений в определении структуры молекул и моделирования структур

1.1. Основные принципы ЯМР спектроскопии

Явление ЯМР было открыто в 1945 г. двумя группами американских физиков под руководством Ф. Блоха и Э. Парселла и по настоящий день находит разнообразное применение в различных областях физики, химии и биологии.

Спектроскопия ЯМР отличается рядом важных аспектов от других форм спектроскопии. Во-первых, для генерации основного и возбужденного состояний необходимо существование внешнего магнитного поля. Во-вторых, время жизни ядерных состояний в 109 раз превышает время жизни возбужденных состояний для электрона. Данная разница непосредственно вытекает из соотношений между коэффициентами Эйнштейна для спонтанного излучения:

т ос Дг, (1.1)

О)6

где время жизни состояния, т, обратно пропорционально вероятности спонтанного перехода на частоте ю.

Для любых видов спектроскопии обязательным условием является наличие нескольких состояний системы, которые отличаются друг от друга величиной энергии. Так, рассматривая двухуровневую систему, уровень с меньшим значением энергии принято называть низкоэнергетическим состоянием, а верхний уровень - высокоэнергетическим. В случае спектроскопии ЯМР переходы между уровнями, расщепленными под действием постоянного магнитного поля, индуцируются с помощью радиочастотного (РЧ) излучения.

Как известно из квантовой механики, спиновый момент 5 квантуется, а

различные квантовые состояния определяются квантовым числом I: 151 =

Ь^7(7+Т). Как правило, нас будет интересовать только компонента параллельная

магнитному полю, 52, причем 52 = — 7, — 7 + 1 ,.. ., + 7. Так, возможные значения 52

11 1

для ядер со спином -: + —-Ь. Они соответствуют спиновым квантовым

1 1

числам тг = + - и тг = —-. В свою очередь магнитный момент ядра, Д,

определяется спиновым моментом, /:

Дп = УМ (1.2)

где у имеет размерность [рад сек-1 Гс-1].

Величина у зависит от типа ядер. Из таблицы 1 нетрудно заметить, что ядра протонов (1Н) и фосфора со спином равным в изобилии присутствуют в природе, в то время как естественное содержание изотопов углерода и азота со спином равным ^ составляет около 1%. По этой причине для увеличения чувствительности метода ЯМР были разработаны специальные методики

13 15

выделения белков с обогащенным по изотопам С и N составом. Необходимо отметить, что большинство ядер, за исключением дейтерия (Н), имеют полуцелую 7-компоненту спинового момента, поэтому дальнейшие рассуждения будут рассмотрены для ядер со спином

Таблица 1 - Свойства некоторых ядер, используемых в ЯМР

Ядро у [рад сек-1 Гс-1] I Естественное содержание

1Н 26,753 1/2 99,980

2Н 4,106 1 0,016

19б 25,179 1/2 100,000

13С 6,728 1/2 1,108

^ -2,712 1/2 0,037

Если на ядра не накладывается внешнее магнитное поле, то возможны все ориентации магнитных диполей в пространстве (Рисунок 3). Однако, в присутствии внешнего магнитного поля направление оси Ъ определяется направлением поля, и магнитные моменты ядер со спином 1/2 принимают две ориентации, либо по направлению внешнего магнитного поля, либо против него.

z г г

ч/2

Рисунок 3 - Ориентации магнитных диполей в отсутствии (А) и в присутствии (Б) магнитного поля В0. Точки на поверхности сферы иллюстрируют различные ориентации магнитных моментов в пространстве. Ориентация одного из диполей представлена темной линией из центра сферы. На рисунке В примерно половина спинов направлена вверх, а другая половина направлена вниз. Магнитные диполи могут принимать любое значение ф, но только два значения 0. Углы ф и 0 представляют ориентацию магнитного диполя в сферических координатах [42]

Энергия состояния зависит от взаимодействия магнитного диполя с приложенным извне магнитным полем. Размер этого взаимодействия можно определить из классической электромагнитной теории. Рассмотрим магнитный диполь в статическом магнитном поле, В, направленном вдоль оси 7, как показано на рисунке 3. Хотя абсолютное значение вектора магнитного момента ядра можно вычислить довольно точно, его положение в пространстве можно задать только проекцией на направление приложенного магнитного поля. Это ограничение вытекает из принципа неопределенности Гейзенберга: положение вектора магнитного момента ядра в пространстве можно задать его проекцией только на одну из координатных осей, тогда как две другие проекции остаются неопределенными. Поэтому максимальное значение проекции вектора на направление В не может быть равно длине вектора, так как в этом случае две другие проекции оказались бы равны нулю, то есть стали бы точно определенными, что противоречит указанному принципу [43].

Энергия, необходимая для изменения угла, 0, равна:

Е = I(ДхВ)йв == \Д\\В\| Бт^йб = — \Д\\В\ СОБ(6) = -^ В. (1.3)

Таким образом, энергия взаимодействия, или Гамильтониан, между полем и магнитным моментом определяется произведением двух векторов: Н = • В.

Магнитное поле, присутствующее на ядре, обычно ослабляется или экранируется присутствием электронов, окружающих это ядро, таким образом, поле на ядре зависит от внешнего окружения:

В = (1-о)В0, (1.4)

где о представляет степень экранирования ядра, а В0 - величина приложенного внешнего магнитного поля.

Предположим, что магнитное поле направлено вдоль оси Ъ, тогда энергия состояния равна:

Н = —М2. (15)

Чтобы связать энергию ядерного спина с его квантовым состоянием, мы используем соотношение между магнитным моментом и Ъ-компонентой спинового момента, д2 = уЬт2. Тогда энергия спина в квантовом состоянии т2:

Н = -уЬт2В2. (1.6)

Последнее выражение часто называют зеемановским гамильтонианом.

Используя это уравнение можно построить энергетическую диаграмму для

1 1

частицы со спином - (т2 = + -) как функцию магнитного поля (Рисунок 4).

Рисунок 4 - Расщепление энергетических уровней частицы со спином 1/2 в магнитном поле. Разность энергии между основным и возбужденным состояниями увеличивается с увеличением магнитного поля

Основное, более низкое энергетическое состояние, называемое а, соответствует т2 = а высокоэнергетическое, обозначаемое р, соответствует

т2 = Тогда энергии двух состояний:

уЪВ уЪВ п

Еа = — — ' ЕР = + ~Г ■ (1.7)

Разница энергий между двумя состояниями также может быть легко вычислена:

АЕ = Ер—Еа = уЪВ, (1.8)

и используя соотношение Е = Ь о) , получаем уравнение Лармора. Здесь о) 5 относится к поглощению или резонансной частоте экранированного ядра:

а)5=уВ. (1.9)

Энергия перехода в ЯМР достаточно мала, для возбуждения спинов

требуются радиоволны. Небольшое значение ДЕ имеет два важных последствия:

1. Разница населенностей между двумя энергетическими уровнями очень

мала, порядка 1 к 106. Фактическую разницу населенностей можно

вычислить, используя соотношение Больцмана:

N0 уЪВ п 1т — = е кт -■ (110)

Ыа кТ

Следствием малой разницы населенностей является то, что спектроскопия ЯМР оказывается низкочувствительным экспериментальным методом. Недостаток чувствительности обычно компенсируется путем накопления сигнала, вследствие чего возрастает отношение сигнал-шум. Кроме того, типичные эксперименты ЯМР требуют концентрации меченного по изотопам белка порядка 1мМ.

2. Время жизни высокоэнергетического состояния может быть достаточно

-3

большим, от 10- с до секунд. Большое время жизни обеспечивает три преимущества: узкие резонансные линии, применение широкого спектра импульсных экспериментов и чувствительность к молекулярному движению в широком масштабе времени.

Итак, помещение ядерного спина в статическое магнитное поле создает расщепление энергетических уровней на низкоэнергетическое и высокоэнергетическое состояния.

Помимо гамильтониана, описывающего взаимодействие с внешним полем, полный ядерный спиновый гамильтониан включает в себя следующие члены (Таблица 2):

Таблица 2 - Члены полного ядерного спинового гамильтониана

Член гамильтониана

Взаимодействие ядерных спинов с

ЬН

внешними постоянными магнитными полями

р - соответственно магнитныи момент 1-го ядра.

ЬНРЧ - —ЬВ^соз^ + ф(0] ^ у^

уП - гиромагнитное отношение 1-го ядра.

внешними РЧ магнитными полями

ЬН

С5

а'В - магнитное поле, индуцированное электронамив точке нахождения 1-го ядра._

индуцированными магнитными

полями, возникающими из-за орбитального движения электрона (электронное экранирование)

ЬН

еф

^ 6Р(2Р — 1)

¡1 уЦ1

градиентами электрического поля

еф1 и I - соответственно ядерный квадрупольный момент, и ядерное спиновое квантовое число 1-го ядра;

V1 - электрический потенциал в месте расположения 1-го ядра._

ЬН5К -

т I

]т - момент количества движения молекулы т; С - тензор спин-вращательного взаимодействия;_

магнитным моментом, связанным с молекулярным моментом количества движения

О^ - компоненты тензора ; а,в - координаты 1-го ядра.

ьн0 - ^(—2УПУПЬ2) £ иЖкр11р]

Кк а,р=1

1к.

друг с другом непосредственно благодаря собственным магнитным дипольным моментам

ЬН; - Ь^11]ш!к

Кк

тензор второго ранга.

Jiк

Друг с другом косвенно через электронные спины (косвенное спин-спиновое взаимодействие)

В изотропных жидкостях имеют место достаточно быстрые поступательные и вращательные движения молекул. Это означает, что любое направление осей молекулярной системы координат, связанной с главными осями тензора инерции молекулы, равновероятно в пространстве, и переориентация системы координат происходит довольно быстро. Это приводит к тому, что усредненные во времени значения энергий диполь-дипольного и квадрупольного взаимодействий равны нулю. В результате этого спектры ЯМР жидкостей определяются, в основном,

тремя гамильтонианами: зеемановским, электронного экранирования и косвенного спин-спинового взаимодействия.

Рассмотрим взаимодействие ядерного спина с внешним переменным магнитным полем. Облучение образца РЧ волнами соответствующей частоты, = уВ, будет возбуждать переходы из основного в высокоэнергетическое состояние. Это радиочастотное поле В± должно быть ортогонально направлению магнитного момента, так что X д Ф 0, чтобы генерировать переходы между энергетическими уровнями. Ориентация постоянного и переменного полей показана на рисунке 5.

Рисунок 5 - Геометрия магнитных полей вокруг образца. Образец находится в стеклянной пробирке (стандартный диаметр пробирки 5 мм). Показаны направления постоянного магнитного поля и переменного. Поле В! обычно создается двумя катушками Гельмгольца (изображены темно-серым цветом). Эти катушки также используются для регистрации сигнала, создаваемого возбужденными спинами [42]

Существует несколько способов регистрации спектров ядерного магнитного резонанса. В настоящее время используется импульсный метод регистрации сигнала ЯМР. Данная методика имеет два главных преимущества: многократное сокращение времени наблюдения сигнала ЯМР и возможность управления

динамикой ядерных спинов, то есть возможность исключения тех или иных взаимодействий.

Рассмотрим классическое описание движения магнитного момента в магнитном поле при подаче РЧ импульса. Как уже отмечалось выше, населенности магнитных ядер, помещенных в постоянное внешнее магнитное поле, различны. В классическом представлении это означает, что возникает результирующая макроскопическая намагниченность М. Фиксируя начало воздействия РЧ возбуждения на резонансной частоте и изменяя его длительность, мы можем поворачивать намагниченность в плоскости перпендикулярной вектору ВОтклонение М от направления ъ приводит к появлению Мх и Му компонент намагниченности. После отключения РЧ поля вектор намагниченности будет стремиться вернуться в положение равновесия, причем его компоненты восстанавливаются с разными характеристическими временами, Т1 и Т2, называемыми временами релаксации (Рисунок 6) [117].

Мг = М0(1 -е'/'О

Рисунок 6 - Поведение компонент намагниченности после выключения РЧ поля [117]

Релаксация Т соответствует восстановлению равновесной заселенности уровней, а Т2 релаксация - полной расфазировке х,у компонент ядерных спинов. Поведение вектора М± представляет совокупный эффект расфазировки ядерных спинов, так называемый спад свободной индукции (ССИ).

Простейший импульсный ЯМР эксперимент включает в себя короткий РЧ импульс (на частоте V « у0), за которым следует детектирование сигнала. Импульсная последовательность представлена на рисунке 7.

РЧ импульс

\ Сигнал (ССИ)

Время

Рисунок 7 - Простой одноимпульсный ЯМР эксперимент начинается с короткого (« 10мкс) РЧ импульса. Детектирование сигнала происходит по мере его эволюции с течением времени [42]

В соответствии с теоремой Фурье действие РЧ импульса означает

1

одновременное воздействие в диапазоне V + —, где - длительность импульса.

tp

Угол поворота вычисляется из соотношения: в = уВ^ [117]. Далее с помощью преобразования Фурье (уравнение 1.11) сигнал спада свободной индукции из временной области трансформируется в частотную, таким образом, формируется спектр ЯМР:

г+ 00

f{v) = I F(t)

У —00

(1.11)

1.2. Двумерная спектроскопия ЯМР

Значимый прогресс в определении пространственной структуры молекул был достигнут с использованием двумерных методик ЯМР спектроскопии. Однако вместе с этим происходило значительное увеличение сложности задач, решаемых с помощью многомерных методик спектроскопии ЯМР. Так, впервые появилась возможность определения пространственной структуры различных биомолекул в растворе, таких как белки, ДНК и РНК. До появления многомерных методик ЯМР-спектроскопии физические исследования таких крупных молекул были невозможны.

Впервые схема эксперимента, которая послужила началом двумерной ЯМР-спектроскопии, была предложена Джорджем Джинером в 1971 году [44]. Двумерный ЯМР эксперимент в отличие от одномерного (Рисунок 8) является уже функцией двух временных переменных, ^ и 12. Далее преобразование Фурье по этим двум величинам (согласно формуле 1.11) дает спектр, являющийся функцией двух частот.

Рисунок 8 - Схематическое представление одномерного спектра ЯМР [42]

Итак, положение сигнала, получаемого в двумерном спектре ЯМР будет определяться двумя частотами (шА, шв). Наличие такого пика будет указывать на наличие взаимодействия в спиновой системе, например, скалярного

взаимодействия (через химическую связь) или диполь-дипольного взаимодействия (через пространство).

Импульсная последовательность для двумерных экспериментов схематично представлена на рисунке 9. Обычно двумерный ЯМР эксперимент состоит из четырех основных временных промежутков: подготовительный период, период эволюции, время смешивания и регистрация сигнала.

Рисунок 9 - Схематичное представление импульсной последовательности для двумерных

экспериментов ЯМР [42]

В любом двумерном эксперименте ЯМР в начале происходит возбуждение системы спинов с помощью одного или нескольких РЧ импульсов. Далее за время 11 происходит эволюция суммарной намагниченности. Затем следует временной промежуток, называемый периодом смешивания, в течение которого осуществляется перенос намагниченности между различными ядрами спиновой системы. Сразу после периода смешивания детектируется сигнал спада свободной индукции, который является функцией времени, 12. В течение времени ^ регистрация сигнала не происходит.

Подготовительный период используется для полной релаксации спинов, то есть для возвращения системы к состоянию термодинамического равновесия. Его длина обычно фиксирована и для белковых молекул в растворе составляет примерно 1,5-2 секунды. Этот период обычно заканчивается 90° импульсом, который воздействует на первый спин А.

Период эволюции часто называется периодом «косвенного измерения». Эволюция системы детектируется в цифровом виде, то есть ^ изначально равно нулю и в дальнейшем постоянно увеличивается на константу ДЭь и ССИ детектируется каждый раз при новом значении 1^.

Во время периода смешивания осуществляется перенос информации о химическом сдвиге между взаимодействующими спинами (А и В). Спины могут быть связаны посредством скалярного или диполь-дипольного взаимодействия. Величина перенесенной намагниченности от спина А к спину В будет пропорциональна собш^ или зт^г^. Следовательно, магнитный момент ядра В будет содержать информацию о резонансной частоте ядра А ( шА).

В течение периода регистрации прецессирующая намагниченность детектируется приемными катушками в плоскости (х,у). Сигнал также регистрируется в цифровом виде, изменяясь, каждый раз на константу ДЭ2, называемую временем парализации.

Получение двумерного спектра ЯМР происходит в несколько этапов: изначально продолжительность времени ^ устанавливается равной нулю, далее идет импульсная последовательность (ИП) и записывается результирующий сигнал. Затем возбужденная система спинов приходит в состояние термодинамического равновесия. После полной релаксации происходит увеличение времени ^ на дискретную величину ДЭ1, и повторение импульсного эксперимента, в конце которого снова регистрируется сигнал ССИ, отличный от первоначального сигнала. Такая последовательность действий повторяется для значений времен 11+2ДЭ1, 11+ЗДЭ1, 11+4ДЭ1 и т.д. В результате получается набор ССИ, который является функцией 12, для каждого значения ^

Для более наглядного представления на рисунке 10 показана схема получения двумерного ЯМР спектра на примере системы двух взаимодействующих спинов с частотами резонанса 190 и 250 Гц.

На рисунке 10А показана серия импульсных последовательностей, которые используются для того, чтобы вызвать эволюцию суммарной намагниченности в течение времени ^ Спад свободной индукции, полученный для каждого значения

^ показан на рисунке 10А справа. Каждый сигнал ССИ соответствует одному значению ^

Л Ь П Г

Рисунок 10 - Генерация двумерного спектра ЯМР: А) Серия импульсных последовательностей с разным временем Э1;Ъ) Фурье преобразование по вертикальной оси; В) Фурье преобразование по горизонтальной оси; Г) кросс-пик в двумерном спектре ЯМР [42]

Фурье преобразование каждого ССИ представлено на рисунке 10Б. Горизонтальная ось преобразуется из временной области в частотную. Вертикальная ось на данном этапе по-прежнему остается во временных единицах.

Результат Фурье преобразования по времени ^ показан на рисунке 10В. Для каждой частоты \2 сделано Фурье преобразование по времени ^ Таким образом, получен один сигнал на частотах \А = 190 Гц и ув = 250 Гц.

На рисунке 10Г представлен полученный в результате Фурье преобразований двумерный ЯМР спектр.

В настоящее время существует большое количество двумерных ЯМР экспериментов, которые различаются по предназначению и импульсной программе.

1.3. Гомоядерный эксперимент COSY

Эксперимент COSY был предложен Джинером в 1971 году [44]. На рисунке 11 изображена импульсная последовательность для данного эксперимента. По сравнению с другими двумерными экспериментами ЯМР эксперимент COSY является наиболее простым. Он включает в себя следующие периоды: возбуждающий импульс, период эволюции и второй импульс, который обеспечивает перенос намагниченности от одного спина к другому.

Рисунок 11 - Импульсная последовательность эксперимента COSY [42]

Этот эксперимент обычно используется для анализа протонных спектров. Из спектров, полученных в результате эксперимента COSY, можно определить химические сдвиги спинов, связанных между собой спин-спиновым взаимодействием.

Импульсная последовательность эксперимента COSY состоит из двух 90° импульсов, которые разделены периодом эволюции. Фаза этих импульсов, а также фаза приемника, меняется циклически. Второй импульс служит для переноса намагниченности от одного спина к другому.

Здесь необходимо отметить, что волновая функция существует не во всех состояниях, а только находящихся в так называемых «чистых» состояниях,

которые в случае ансамблей частиц практически не встречаются. В подобных случаях для описания системы используется матрица плотности. В чистом состоянии матрица плотности и волновая функция связаны соотношением

Из нестационарного уравнения Шредингера можно получить соответствующее уравнение для матрицы плотности:

0 —_0<р( 0] - данное уравнение описывает эволюцию матрицы

плотности в системе с гамильтонианом Н.

Матрица плотности различна в разных точках импульсной последовательности и обозначается р¿.

После второго импульса матрица плотности сразу же принимает значение р з и эволюционирует в течение регистрации ССИ, давая зависимость р3(

Для определения понятия матрицы плотности рассмотрим ее матричные элементы в ортонормированием базисе, в котором они являются просто произведениями коэффициентов разложения функции состояния |ф(1:)). Рассмотрим элементы матрицы плотности в базисе собственных функций гамильтониана В этом случае диагональный элемент равен вероятности того, что спиновая система находится в собственном состоянии |г ). Таким образом, этот элемент соответствует населенности состояния |г ), а недиагональный элемент соответствует «когерентной суперпозиции» собственных состояний с Г(1:)|г) + с 5(1:)|5 ), в том смысле, что зависимость от времени и фаза различных членов ансамбля коррелированы по отношению к |г ) и |5 ) [45].

Вычислим последовательное изменение вектора намагниченности в формализме матрицы плотности. Пусть исходная матрица имеет вид:

р о — 4 + (1.12)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Колосова Ольга Андреевна, 2019 год

Список литературы

1. Bechinger, B. Understanding peptide interactions with the lipid bilayer: a guide to membrane protein engineering [Text] / B. Bechinger // Current Opinion in Chemical Biology. - 2000. - V.4. - pp. 639-644.

2. Antimicrobial and conformational studies of the active and inactive analogues of the protegrin-1 peptide [Text] / S. Rodziewicz-Motowidlo, B. Mickiewicz, K. Greber, E. Sikorska et al. // FEBS Journal. - 2010. - V. 277. - pp. 1010-1022.

3. Use of a combination of the RDC method and NOESY NMR spectroscopy to determine the structure of Alzheimer's amyloid A beta(10-35) peptide in solution and in SDS micelles [Text] / K.S. Usachev, A.V. Filippov, O.N. Antzutkin, V.V. Klochkov // European Biophysical Journal. - 2013. - V.42. - pp. 803-810.

4. Blokhin, D.S. NOE Effect of Sodium Dodecyl Sulfate in Monomeric and Micellar Systems by NMR Spectroscopy [Text] / D.S. Blokhin, E.A. Filippova, V.V. Klochkov // Appl. Magn. Reson. - 2014. - V. 15. - pp. 715-721.

5. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity [Text] / T. Ganz // Nature reviews, immunology. - 2003. - V.3(9). - pp. 710-720.

6. Advances in antimicrobial peptide immunobiology [Text] / N.Y. Yount, A.S. Bayer, Y.Q. Xiong, M.R. Yeaman // Biopolymers. - 2006. - V.84(5). - pp. 435-458.

7. Zasloff, M Antibiotic peptides as mediators of innate immunity [Text] / M. Zasloff // Current opinion in immunology. - 1992. - V.4(1). - pp. 3-7.

8. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms [Text] / M. Zasloff // Nature. - 2002. - V.415. - pp. 389-395.

9. Auvynet, C. Multifunctional host defense peptides: antimicrobial peptides, the small yet big players in innate and adaptive immunity [Text] / C. Auvynet, Y. Rosenstein // The FEBS journal and Rosenstein - 2009. - V.276(22). - pp. 6497-6508.

10. Hancock, R.E. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies [Text] / R.E. Hancock, H.G. Sahl // Nature biotechnology -2006. - V.24(12). - pp. 1551-1571.

11. Izadpanah, A. Antimicribials peptides [Text] / A. Izadpanah,R.L. Gallo // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2005. - V.52. - pp. 381-390.

12. Antibacterial activity of glycosylated and phosphorylated chromogranin A-derived peptide 173-194 from bovine adrenal medullary chromaffin granules [Text] / J.M. Strub, Y. Goumon, K. Lugardon et al. // The Journal of biological chemistry. -1996a. - V.271(45). - pp. 28533-28540.

13. Hancock, R.E. Peptide antibiotics [Text] / R.E. Hancock, D.S. Chapple // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1999. - V.43(6). - pp. 1317-1323.

14. Yeaman, M.R. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance [Text] / M.R. Yeaman, N.Y. Yount // Pharmacological reviews. - 2003. - V.55(1). - pp. 2755.

15. Hancock, R.E. Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides [Text] / R.E. Hancock, A. Rozek // FEMS Microbiology letters. - 2002. -V.206(2). - pp. 143-149.

16. Jenssen, H. Peptide antimicrobial agents [Text] / H. Jenssen, P. Hamill, R.E. Hancock // Clinical microbiology reviews. - 2006. - V.19(3). - pp. 491-511.

17. Phosphorylation and O-glycosylation sites of bovine chromogranin A from adrenal medullary chromaffin granules and their relationship with biological activities [Text] / J.M. Strub, O. Sorokine, A. Van Dorsselaer et al. // The Journal of biological chemistry. - 1997. - V.272(18). - pp. 11928-11936.

18. Hsu, Y. Molecular Dynamics Simulations of Indolicidin Association with Model Lipid Bilayers [Text] / Y. Hsu, C.M. Yip // Biophysical Journal. - 2007. - V.92(12). -pp. 100-102.

19. Structure- function analysis of tritrpticin analogs: potential relationships between antimicrobial activities, model membrane interactions, and their micelle-bound NMR structures [Text] / D.J. Schibli, L.T. Nguyen, S.D. Kernaghan et al. // Biophysical Journal . - 2006. - V.91. - pp. 4413-4426.

20. Molecular Cell Biology [Text], 7th ed. / H. Lodish, A. Berk, C.A. Kaizer, M. Krieger et al. - W. H. Freeman and company, N.Y., 2000. . - P.1154.

21. Brogden, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? [Text] / K.A. Brogden // Nature Review Microbiology. - V.3. - pp. 238250.

22. Synthesis and solution structure of the antimicrobial peptide protegrin-1 [Text] / A. Aumelas, M. Mangoni, C. Roumestand, L. Chiche et al. // European Journal of Biochemistry. - 1996. - V.237. - pp. 575-583.

23. Membrane-bound dimer structure of a beta-hairpin antimicrobial peptide from rotational-echo double-resonance solid-state NMR [Text] / R. Mani, M. Tang, X. Wu, J.J. Buffy et al. // Biochemistry. - 2006. - V.45. - pp. 8341-8349.

24. Langham, A.A. On the nature of antimicrobial activity: a model for protegrin-1 pores [Text] / A.A. Langham, A.S. Ahmad, Y.N. Kaznessis // J. Am. Chem. Soc. -2008. - V.130. - pp. 4338-4346.

25. Bolintineanu, D.S. Computational studies of protegrin antimicrobial peptides: a review [Text] / D.S. Bolintineanu, Y.N. Kaznessis // Peptides. - 2011. - V.32(1). -pp. 188-201.

26. Truncated ß-amyloid peptide channels provide an alternative mechanism for Alzheimer's Disease and Down syndrome [Text] / H. Jang, F.T. Arce, S. Ramachandran et al. // PNAS. - 2010. - V.107(14). - pp. 6538-6543.

27. Lazaridis, T. Activity Determinants of Helical Antimicrobial Peptides: A Large-Scale Computational Study [Text] / T. Lazaridis, Y. He // PLOS One. - 2013. - V. 2013. - pp. 1-13.

28. Jang, H. Conformational study of the protegrin-I (PG-I) dimer interaction with lipid bilayers and its effect [Text] / H. Jang, B.Y. Ma, R. Nussinov // BMC Structural Biology. - 2007 . - V.7. - pp. 21-35.

29. Defining the genetic relationship of protegrins-related sequences and the in vivo expression of protegrins [Text] / M.K. Choi, M.T. Le, H. Cho, N. Soundrarajan et al. // FEBS J. - 2014. - V.281. - pp. 5420-5431.

30. Protegrins—leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins [Text] / V.N. Kokryakov, S.S.Harwig, E.A.Panyutich, A.A. Shevchenko et al. // FEBS Lett. - 1993. - V.327. - pp. 231-236.

31. Zhao, C.Q. Identification of a new member of the protegrin family by cdna cloning [Text] / C.Q. Zhao, L.D. Liu, R.I. Lehrer // FEBS Lett. - 1994. - V.346. - pp. 285288.

32. Zhao, C.Q. The structure of porcine protegrin genes [Text] / C.Q. Zhao, T. Ganz, R.I. Lehrer // FEBS Lett. - 1995. - V.368. - pp. 197-202.

33. Cho, Y. Activity of protegrins against yeast-phase Candida albicans [Text] / Y. Cho, J.S. Turner, N.N. Dinh, R.I. Lehrer // Infection and Immunity. - 1998. - V. 66. - pp. 2486-2493.

34. NMR structure of the cathelicidin-derived human antimicrobial peptide LL-37 in dodecylphosphocholine micelles [Text] / F.Porcelli, R. Verardi, L. Shi, K.A. Henzler-Wildman et al. // Biochemistry - 2008. - V.47. - pp. 5565-5572.

35. Ramamoorthy, A. Beyond NMR spectra of antimicrobial peptides: dynamical images at atomic resolution and functional insights [Text] / A.Ramamoorthy // Solid State Nucl. Magn. Reson. - 2009. - V.35. - pp. 201-207.

36. Nitrogen-14 solid-state NMR spectroscopy of aligned phospholipid bilayers to probe peptide-lipid interaction and oligomerization of membrane associated peptides [Text] / A. Ramamoorthy, D.K. Lee, J.S.Santos, K.A. Henzler-Wildman // J. Am. Chem. Soc. - 2008. - V.130. - pp. 11023-11029.

37. Antimicrobial peptide protegrin-3 adopt an antiparallel dimer in the presence of DPC micelles. A high-resolution NMR study [Text] / K.S. Usachev, S.V. Efimov, O.A. Kolosova, E.A. Klochkova et al. // Journal of Biomolecular NMR. - 2015. - V.62. -pp. 71-79.

38. Antimicrobial Peptide Protegrins Interact with DPC Micelles by Apolar Hydrophobic Cluster: Structural Studies by High-Resolution NMR Spectroscopy [Text] / O.A. Kolosova, K.S. Usachev, A.V. Aganov, V.V. Klochkov // BioNanoScience. - 2016. - V.6. - pp. 317-319.

39. Antimicrobial properties of amyloid peptides [Text] / B.L. Kagan, H, Jang, R. Capone, F.T. Arce et al. // Mol.Pharmaceutics. - 2012. - V.9. - P.708-717.

40. The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package [Text] / C.D. Schwieters, J.J. Kuszewski, N. Tjandra, G.M. Clore // Journal of Magnetic Resonance . - 2003. - V.160. - pp. 65-73.

41. ARIA: automated NOE assignment and NMR structure calculation / J.P.Linge, M.Habeck, W. Rieping, M. Nilges // Bioinformatics. -2003. - V.19. - pp. 315-316.

42. Rule, G.S. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy [Text] / G.S. Rule, T.K. Hitchens. - Dordrecht: Springer, 2006. - P.530.

43. Корнилов, М.Ю. Ядерный магнитный резонанс в химии: Учебное пособие [Текст] / М.Ю. Корнилов, Г.П. Кутров. - К.: Вища школа. Головное издательство, 1985. - C.199.

44. Jeener, J. Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscopy [Text] / J. Jeener, B.H. Meier, P. Bachmann, R.R. Ernst // The Journal of Chemical Physics. - 1979. - V. 71. - pp.4546-4553

45. Ernst, R.R. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions [Text] / R.R. Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaun. - Oxford: Oxford University Press, 1990. - P.610.

46. Charmm - a Program for Macromolecular Energy, Minimization and Dynamics Calculations [Text] / B.R. Brooks, R.E. Bruccoleri, B.D. Olafson et al. // Journal of Computional Chaemistry. - 1983. - V.4, №2. - pp. 187-217.

47. Purisima, E.O. An Approach to the Multiple-Minima Problem in Protein Folding by Relaxing Dimensionality - Tests on Enkephalin [Text] / E.O.Purisima, H.A. Scheraga // Journal of Molecular Biology. - 1987. - V.196, №3. - pp. 697-709.

48. Schaumann, T. The Program Fantom for Energy Refinement of Polypeptides and Proteins Using a Newton-Raphson Minimizer in Torsion Angle Space [Text] / T. Schaumann, W. Braun, K. Wutrich // Biopolymers. - 1990. - V.29, №4-5. - pp. 679694.

49. Brunger, A.T. X-PLOR (Version 3.1). A system for X-ray Crystallografhy and NMR [электронный ресурс] / A.T. Brunger - The Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale Universit, 2016. -Режим доступа: https://nmr.cit.nih.gov/xplor-nih/doc/current/xplor, свободный. (дата обращения 05.04.17)

50. Burkert, U. Molecular Mechanics [Text] / U. Burkert, N.L. Allinger // ACS Monograph №177, American Chemical Society. - Washington, 1982.

51. Лопатин, А. Метод отжига [Текст] / А. Лопатин. - Санкт-Петербург: Издательство СПбГУ, 2005. - С. 149.

52. Equation of State Calculationsby Fast Computer Machines [Text] / N. Metropolis, W. Rosenbluth, M.N. Rosenbluth, A.H. Teller // J. Chemical Physics. - 1953. - V.21, №6. - .pp. 1087-1092.

53. Antibacterial activity of secretolytin, a chromogranin B-derived peptide (614-626), is correlated with peptide structure [Text] / J.M. Strub, P. Hubert, G. Nullans // Federation of European Biochemical Society Letteres. - 1996b. - V.379(3). - pp. 273-278.

54. Fleming, A. Observations on a Bacteriolytic Substance ("Lysozyme") Found in Secretions and Tissues [Text] / A. Fleming, V.D. Allison // British Journal of Experimental Pathology. - 1922. - V.3(5). - pp. 252-260.

55. Ridley, F. Lysozyme: An Antibacterial Body present in Great Concentration in Tears, and its Relation to Infection of the Human Eye [Text] / F. Ridley // Proceedings of the Royal Society of Medicine. - 1928. - V.21(9). - pp. 1495-1506.

56. Corone, A. Lysopain in transtympanic aerosols / A. Corone // Ann Otolaryngol Chir Cervicofac. - 1964. - V.81. - pp. 367-368.

57. Dubos, R.J. Studies on a bactericidal agent extracted from a soil bacillus. III. Preparation and activity of a protein-free fraction [Text] / R.J. Dubos, C. Catteneo // Journal of Experimental Medicine. - 1939. - V.70. - P.249.

58. Gratia, A. Sur un remarquable example d'antagonisme entre deux souches de colibacille [Text] / A. Gratia // Compt. Rend. Soc. Biol. - 1925. - V.93. - pp. 10401042.

59. Gardner, E.J. Cancer of the lower digestive tract in one family group [Text] / E.J. Gardner // American Journal of Human Genetics. - 1950. - V.3(2). - pp. 41-48.

60. Wang, G. The updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design [Text] / G. Wang, X. Li, Z. Wang // Nucleic Acids Research. - 2009. - V.37. -pp. 933-937.

61. Wang Z. APD: The antimicrobial peptide database [Text] / Z. Wang, G.Wang // Nucleic Acids Research. - 2004. - V.32. - pp. 590-592.

62. The endocrine role for chromogranin A: a prohormone for peptides with regulatory properties [Text] / K.B. Helle, A. Corti, M.H. Metz-Boutigue, B. Tota // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2007. - V.64(22). - pp. 2863-2886.

63. Antimicrobial activities and structures of two linear cationic peptide families with various amphipathic beta-sheet and alpha-helical potentials [Text] / Y. Jin, J. Hammer, M. Pate et al // Antimicrob Agents Chemother. - 2005. - V.49. - pp. 49574964.

64. Tuning the biological properties of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides: rational use of minimal amino acid substitutions [Text] / I. Zelezetsky, U. Pag, H.G. Sahl, A Tossi // Peptides. - 2005. - V.26. - pp. 2368-2376.

65. Brock Biology of Microorganisms [Text],11th ed. / M. Madigan, J. Martinko. -Prentice Hall, USA, 2005.

66. Inorganic cations mediate plant PR5 protein antifungal activity through fungal Mnn1- and Mnn4-regulated cell surface glycans [Text] / R.A. Salzman, H. Koiwa, J.I. Ibeas et al. // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2004. - V.17. - pp. 780-788.

67. Cellular distribution of anionic antimicrobial peptide in normal lung and during acute pulmonary inflammation [Text] / A.J. Fales-Williams, K.A. Brogden, E. Huffman, J.M. Gallup, M.R. Ackermann // (2002).Veterinary Pathology. - 2002. -V.39. - pp. 706-711.

68. Characterization of antibacterial COOH-terminal proenkephalin-A-derived peptides (PEAP) in infectious fluids. Importance of enkelytin, the antibacterial PEAP209-237 secreted by stimulated chromaffin cells [Text] / Y. Goumon, K. Lugardon, B. Kieffer et al. // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - V.273. - pp. 29847-29856.

69. Solution conformation of the synthetic bovine proenkephalin-A209-237 by 1H NMR spectroscopy [Text] / B. Kieffer, B. Dillmann, J.F. Lefevre // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - V.273. - pp. 33517-33523.

70. Interactions of an anionic antimicrobial peptide with Staphylococcus aureus membranes [Text] / S.R. Dennison, J. Howe, L.H. Morton // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2006. - V.347. - pp. 1006-1010.

71. Lins, L. Tilted peptides: a structural motif involved in protein membrane insertion? [Text] / L. Lins, R. Brasseur // Journal of Peptide Science. - 2008. - V.14. - pp. 416422.

72. Important structural features of 15-residue lactoferricin derivatives and methods for improvement of antimicrobial activity [Text] / M.B. Strom, B.E. Haug, O. Rekdal et al. // Biochemistry and Cell Biology. - 2002. - V.80. - pp. 65-74.

73. Tryptophan end-tagging of antimicrobial peptides for increased potency against Pseudomonas aeruginosa [Text] / M. Pasupuleti, A. Chalupka, M. Morgelin et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 2009a. - V.1790. - pp. 800-808.

74. End-tagging of ultra-short antimicrobial peptides by W/F stretches to facilitate bacterial killing [Text] / M. Pasupuleti, A. Schmidtchen, A. Chalupka et al. // PLOS ONE. - 2009b. - V.4. - P.5285.

75. Boosting antimicrobial peptides by hydrophobic oligopeptide end tags [Text] / A. Schmidtchen, M. Pasupuleti, M. Morgelin et al. // Journal of Biological Chemistry. -2009. - V.284. - pp. 17584-17594.

76. Orders of protein structure [Электронный ресурс] / OpenStax. - 2018. - Режим доступа: https://www.khanacademy.org/science/biology/ macromolecules/proteins-and-amino-acids/a/orders-of-protein-structure.

77. Essentials of Glycobiology. — 2nd. — Cold Spring Harbor Laboratories Press, 2009. — ISBN 978-087969770-9.

78. Mukhopadhyay, D. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling [Text] / D. Mukhopadhyay, H. Riezman //Science. - 2007. -V.315(5809). - pp. 201-205.

79. Processing of proenkephalin-A in bovine chromaffin cells. Identification of natural derived fragments by N-terminal sequencing and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry [Text] / Y. Goumon, K. Lugardon, P. Gadroy et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V.275. - pp. 38355-38362.

80. Devine, D.A. Antimicrobial peptides in defence of the oral and respiratory tracts [Text] // D.A. Devine // Molecular Immunology. - 2003.V.40. - pp. 431-443.

81. Levy, O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes [Text] / O. Levy // Journal of Leukocyte Biology. - 2004. -V.76. - pp. 909-925.

82. Kleinkauf, H. (1988)Peptide antibiotics, beta-lactams, and related compounds [Text] / H. Kleinkauf, H. von Dohren // Critical Reviews in Biotechnology. - 1988. - V.8. -pp. 1-32.

83. Perlman, D. Biosynthesis of peptide antibiotics [Text] / D. Perlman, M. Bodanszky // Annual Review of Biochemistry. - 1971. - V.40. - pp. 449-464.

84. Tossi, A. Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides [Text] / A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero // Biopolymers. - 2000. - V.55. - pp. 4-30.

85. Ctenidins: antimicrobial glycine-rich peptides from the hemocytes of the spider Cupiennius salei [Text] / T. Baumann, U. Kampfer, S. Schurch, J. Schaller, C. Largiader, W. Nentwig, L. Kuhn- Nentwig // Cellular and Molecular Life Sciences. -2010. - V.67. - pp. 2787-2798.

86. Antimicrobial peptides in insects; structure and function [Text] / P. Bulet, C. Hetru, J.L. Dimarcq, D. Hoffmann // Developmental & Comparative Immunology. - 1999. -V.23. - pp. 329-344.

87. Kichler, A. Cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery [Text] / A. Kichler, A.J. Mason, B. Bechinger // Biochimica et Biophysica Acta. - 2006. -V.1758. - pp. 301-307.

88. Scocchi, M. Proline-rich antimicrobial peptides: converging to a non-lytic mechanism of action [Text] / M. Scocchi, A. Tossi, R. Gennaro // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2011. - V.68. - pp. 2317-2330.

89. Rational design of tryptophan-rich antimicrobial peptides with enhanced antimicrobial activities and specificities [Text] / H.Y. Yu, K.C. Huang, B.S. Yip et al. // ChemBioChem. - 2010. - V.11. - pp. 2273-2282.

90. Boman, H.G. Antibacterial peptides: key components needed in immunity [Text] / H.G. Boman // Cell. - 1991. - V.65. - pp. 205-207.

91. Zaiou, M. Antimicrobial and protease inhibitory functions of the human cathelicidin (hCAP18/LL-37) prosequence [Text] / M. Zaiou, V. Nizet, R.L. Gallo // Journal of Investigative Dermatology. - 2003. - V.120. - pp.810- 816.

92. An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima [Text] / R. Lai, H. Liu, W. Hui Lee, Y. Zhang // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2002. - V.295. - pp. 796-799.

93. Cysteine-rich antimicrobial peptides in invertebrates [Text] / J.L. Dimarcq, P. Bulet, C. Hetru, J. Hoffmann // Biopolymers. - 1998. - V.47. - pp. 465-477.

94. Insect immunity: expression of the two major inducible antibacterial peptides, defensin and diptericin, in Phormia terranovae [Text] / J.L. Dimarcq, D. Zachary, J.A. Hoffmann et al. // The EMBO Journal. - 1990. - V.9. - pp. 2507-2515.

95. Lehrer, R.I. Endogenous vertebrate antibiotics. Defensins, protegrins, and other cysteine-rich antimicrobial peptides [Text] / R.I. Lehrer, T. Ganz // Annals of the New York Academy of Sciences. - 1996. - V.797. - pp. 228-239.

96. New antimicrobial activity for the catecholamine release-inhibitory peptide from chromogranin A [Text] / J. Briolat, S.D. Wu, S.K. Mahata et al. // Cell Mol. Life Sci. - 2005. - V.62. - pp. 377-385.

97. Structural and biological characterization of chromofungin, the antifungal chromogranin A-(47-66)-derived peptide [Text] / K. Lugardon, S. Chasserot-Golaz, A.E. Kieffer et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V.276. - pp. 3587535882.

98. Processing of chromogranin B in bovine adrenal medulla. Identification of secretolytin, the endogenous C-terminal fragment of residues 614-626 with antibacterial activity [Text] / J.M. Strub, P. Garcia-Sablone, K. Lonning et al. // European Journal of Biochemistry. - 1995. - V.229. - pp. 356-368.

99. Isolation and characterization of opioid antagonist peptides derived from human lactoferrin [Text] / F. Tani, K. Iio, H. Chiba, M. Yoshikawa // Agricultural and Biological Chemistry. - 1990. - V.54. - pp. 1803-1810.

100. Cochrane, C.G. The derivation of two distinct anaphylatoxin activities from the third and fifth components of human complement [Text] / C.G. Cochrane,H.J. MullerEberhard // The Journal of Experimental Medicine. - 1968. - V.127. - pp. 371-386.

101. Hugli, T.E. Human anaphylatoxin (C3a) from the third component of complement. Primary structure [Text] / T.E. Hugli // Journal of Biological Chemistry. - 1975. -V.250. - pp. 8293-8301.

102. The N- and C-terminal fragments of ubiquitin are important for the antimicrobial activities [Text] / A.E. Kieffer, Y. Goumon, O. Ruh et al. // The FASEB Journal. -2003. - V.17. - pp. 776-778.

103. The roles of antimicrobial peptides in innate host defense [Text] / G. Diamond, N. Beckloff, A. Weinberg, K.O. Kisich // Current Pharmaceutical Design. - 2009. -V.15. - pp. 2377-2392.

104. Nguyen, L.T. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action [Text] / L.T. Nguyen, E.F. Haney, H.J. Vogel // Trends in Biotechnolog. - 2011. - V.29. - pp. 464-472.

105. Shai, Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides [Text] / Y.Shai // Biopolymers. - 2002. - V.66. - pp. 236-248.

106. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores [Text] / L. Yang, T.A. Harroun, T.M. Weiss et al. // Biophysical Journal. - 2001. - V.81. - pp. 1475-1485.

107. Bechinger, B. The structure, dynamics and orientation of antimicrobial peptides in membranes by multidimensional solid-state NMR spectroscopy [Text] / B. Bechinger // Biochimica et Biophysica Acta. - 1999. - V.1462. - pp. 157-183.

108. North, C.L. Membrane orientation of the N- terminal segment of alamethicin determined by solid-state 15N NMR [Text] / C.L. North, M. Barranger-Mathys, D.S. Cafiso // Biophysical Journal. - 1995. - V.69. - pp. 2392-2397.

109. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation [Text] / K. Matsuzaki, O. Murase, N. Fujii, K. Miyajima // Biochemistry. - 1996. - V.35. - pp. 11361-11368.

110. Membrane pores induced by magainin [Text] / S.J. Ludtke, K. He, W.T. Heller et al. // Biocmestry. - 1996. - V.35(43). - pp. 13723-13728.

111. Tang, M. Structure and mechanism of beta-hairpin antimicrobial peptides in lipid bilayers from solid-state NMR spectroscopy [Text] / M. Tang, M. Hong // Molecular BioSystems. - 2009. - V.5(4). - pp. 317-322.

112. Solution structure of protegrin-1, a broad-spectrum antimicrobial peptide from porcine leukocytes [Text] / R.L. Fahner, T. Dieckmann, S. Harwig, R.I. Lehrer // Chemistry & Biology. - 1996. - V.3(7). - pp. 543-550.

113. Kallick, D.A. The Use of Dodecylphosphocholine Micelles in Solution NMR [Text] / D.A. Kallick, M.R. Tessmer, C.R. Watts, C.Y. Li // Journal of Magnetic Resonance, 1995. - V.109(1). - pp. 60-65.

114. Concentration-dependent aggregation of CHAPS investigated by NMR spectroscopy [Text] / X. Qin, M. Liu, D.Yang, X.Zhang // Journal of Physical Chemistry B. - 2010. - V.114 (11). - pp. 3863-3868.

115. Kirkpatrick, S. Optimization by Simulated Annealing: Quantitative Studies [Text] / S. Kirkpatrick // Journal of Statistical Physics. - 1984. - V.34(5). - pp. 975-986.

116. Brünger, T.A. Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures [Text] / T.A. Brünger // Nature. - 1992. - V.355. - pp. 472-475.

117. Аганов, А. Введение в магнитно-резонансную томографию [Текст] / А. Аганов. - Казань: Издательство Казан.Ун.-та., 2014. - С. 64.

6. Приложение

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Общепринятые сокращения названий аминокислотных

остатков и их некоторые свойства

Аминокислоты Принятые сокращенные обозначения и однобуквенные символы М/р1 Среднее содержание в белках

Англ. Символ Русск.

Глицин а1у а Тли 75/5,97 7,5

Алании А1а А Ала 89/6,01 9,0

Валин Уа1 V Вал 117/5,96 6,9

Лейцин Ьеи ь Лей 131/5,98 7,5

Изолейцин 11е I Иле 131/6,02 4,6

Пролин Рго Р Про 115/6,3 4,6

Серии Бег Б Сер 105/5,68 7,1

Треонин ТИг Т Тре 119/6,16 6,0

Цистеин СуБ С Цис 121/5,02 2,8

Аспарагин абп N Асн 132/5,41 4,4

Глутамин а1п О Глн 146/5,65 3,9

Фенилаланин РИе Б Фен 165/5,48 3,5

Тирозин Туг У Тир 181/5,66 3,5

Триптофан Тгр W Трп 204/5,89 1,1

Аспарагиновая кислота АБр В Асп 133/2,77 5,5

Глутаминовая кислота а1и Е Глу 147/3,24 6,2

Лизин ЬуБ К Лиз 146/9,82 7,0

Аргинин А^ Я Арг 174/10,76 4,7

Гистидин н1б Н Гис 155/7,59 2,1

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Алгоритм метода отжига

Целью данного метода является поиск глобального минимума оптимизируемой функции ^х), заданной для х из некоторого пространства Б, дискретного или непрерывного. Элементы множества Б представляют собой состояния воображаемой физической системы («энергетические уровни»), а значение функции f в этих точках используется как энергия системы Е = ^х). В каждый момент предполагается заданной температура системы Г, как правило, уменьшающаяся с течением времени. После попадания в состояние х при температуре Г, следующее состояние системы выбирается в соответствии с заданным порождающим семейством вероятностных распределений С(х, Г), которое, при фиксированных х и Г, задает случайный элемент £(х, Г) со значениями в пространстве Б. После генерации нового состояния х' = £(х, Г), система с вероятностью Я(ДЕ, Г) переходит к следующему шагу в состояние х', в противном случае процесс генерации х' повторяется. Здесь ДЕ обозначает приращение функции энергии ^х') — ^х). Величина Я(ДЕ, Г) называется вероятностью принятия нового состояния.

Как правило, в качестве функции Я(ДЕ, Г) выбирается либо точное значение соответствующей физической величины:

КДЕ,Г)=^ж, (2.1)

1+е т

либо приближенное значение

АЕ

КДЕ,Г) = е" (2.2)

Вторая формула используется наиболее часто. При ее использовании Ь(ДЕ, Т) оказывается больше единицы в случае ДЕ < 0, и тогда соответствующая вероятность считается равной 1. Таким образом, если новое состояние дает лучшее значение оптимизируемой функции, то переход в это состояние произойдет в любом случае.

Итак, схема метода отжига задается следующими параметрами: 1) Выбором закона изменения температуры Г (к), где к - номер шага.

2) Выбором порождающего семейства распределений С1(х, Г).

3) Выбором функции вероятности принятия к (Л Е, Г).

Алгоритм:

1) Случайным образом выбирается начальная точка х = х0 д £5. Текущее значение энергии Е устанавливается в значение ^х 0 ).

2) /с-я итерация основного цикла состоит из следующих шагов:

a) Сравнить энергию системы Е в состоянии х с найденным на текущий момент глобальным минимумом. Если Е = ^х) меньше, то изменить значение глобального минимума.

b) Сгенерировать новую точку х' = £(х, Г(/с)).

c) Вычислить значение функции в ней Е' = ^х ' ).

ё) Сгенерировать случайное число а из интервала [0;1].

е) Если а < Е ' — Е, Г(/с)), то установить х х ' , Е Е' и перейти к следующей итерации. Иначе повторить шаг (Ь), пока не будет найдена подходящая точка х ' .

Исторически первой схемой метода отжига является схема Больцмановского отжига. В данной схеме закон изменения температуры задается следующим образом:

Г« = ысЙ1)'*>0 ■ (23)

В схеме Больцмановского отжига семейство распределений 0(х,Т) выбирается как семейство нормальных распределений с математическим ожиданием х и дисперсией Т, то есть задается плотностью:

£) _ |х' — х|2

#(х' ; х ; Г) = ( 2 ттГ)_2 е 27 , (24)

где Б - размерность пространства состояний. Пространство состояний предполагается метрическим.

Для Больцмановской схемы доказано [52],что при достаточно больших Т0 и общем количестве шагов К, выбор такого семейства распределений гарантирует нахождение глобального минимума.