Исследование проницаемости биологических тканей для иммерсионных агентов и наночастиц методами оптической когерентной томографии и нелинейной микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Трунина Наталья Андреевна

• Трунина Наталья Андреевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Трунина Наталья Андреевна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Оптическая когерентная томография

2.2. Нелинейная микроскопия

2.2.1. Микроскопия с использованием генерации второй 31 гармоники

2.2.2. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным 32 возбуждением

3. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35 3.1. Диффузия химических агентов в биотканях

3.2. Просветление биотканей при диффузии иммерсионных 39 агентов

3.3. Строение тканей зуба и использование ОКТ для их 40 исследования

3.3.1. Основные сведения о строении зуба

3.3.2. Использование ОКТ для исследования тканей зуба

3.4. Строение ногтя пальца человека и применение ОКТ для его 49 исследования

3.5. Строение жировой ткани и проблема разрушения адипоцитов 52 4. ОКТ МОНИТОРИНГ ДИФФУЗИИ ИММЕРСИОННЫХ

АГЕНТОВ В ОБРАЗЦАХ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO

4.1. Подготовка образцов

4.2.Схема экспериментальной установки и методика обработки 57 результатов

4.2.1. Описание экспериментальной установки

4.2.2. Обработка полученных данных. Модель формирования 61 сигнала ОКТ

4.3. Результаты измерений и их обсуждение

4.3.1. Мониторинг проникновения воды и глицерина в ткани 66 зуба методом ОКТ

4.3.2. Исследование изменений дентина под действием 70 глюкозы методом ОКТ

5. ОКТ ИЗМЕРЕНИЯ В ТКАНЯХ НОГТЯ IN VIVO И ОБРАЗЦАХ 74 ЖИРОВОЙ ТКАНИ

5.2. ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой 83 ткани

6. МОДЕЛЬНЫЕ РАСЧЕТЫ ПРОНИЦАЕМОСТИ ДЕНТИНА И

ФОРМИРОВАНИЯ СИГНАЛА ОКТ В ПРОЦЕССЕ

ОПТИЧЕСКОГО ПРОСВЕТЛЕНИЯ

6.1.Модельный расчет проницаемости дентина для химических 92 агентов

6.2.Численное моделирование нестационарного сигнала ОКТ, 98 формирующегося в процессе оптического просветления рассеивающей среды

7. ОПТИЧЕСКИЙ МОНТОРИНГ ПРОНИКНОВЕНИЯ

НАНОЧАСТИЦ В ОБРАЗЦЫ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO

7.1.Изменения формы ОКТ сигнала после ультразвукового 108 воздействия на образцы тканей зуба, погруженные во взвесь наночастиц

7.2. Нелинейная микроскопия проникновения наночастиц в 111 образцы тканей зуба

5.1. ОКТ визуализация тканей пальца человека

74

8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

122

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

126

Список сокращений

БЗ - бриллиантовый зеленый (краситель);

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ГВГ - генерация второй гармоники;

ГРР - гиперрэлеевское рассеяние;

ИЗ - индоцианиновый зеленый (краситель);

ИК - инфракрасный;

ЛКСМ - лазерная конфокальная сканирующая микроскопия; НКИ - низкокогерентная интерферометрия; ОКТ - оптическая когерентная томография; ПЗС - прибор с зарядовой связью;

СОКТ - спектроскопическая оптическая когерентная томография; СЭМ - сканирующий электронный микроскоп; УЗ - ультразвук, ультразвуковой; УЗИ - ультразвуковое изображение;

ФВДП - флуоресценция, возбуждаемая двухфотонным поглощением; ФД/ТМ - фотодинамический/тепловой метод; ФЭУ - фотоэлектронный умножитель;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование проницаемости биологических тканей для иммерсионных агентов и наночастиц методами оптической когерентной томографии и нелинейной микроскопии»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Изучение транспорта химических агентов в биологических тканях, в том числе в твердых тканях, является важной задачей по ряду причин. Первой из них является необходимость изучения метаболических процессов, осуществляемых посредством диффузии. Вторая причина связана с диагностикой биоткани оптическими методами, в частности, с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ). Основным препятствием для проникновения оптического излучения вглубь биологической ткани является рассеяние света на структурных элементах, показатель преломления которых отличается от показателя преломления базового вещества. Уменьшить рассеяние можно путем введения в биоткань химических агентов, выравнивающих указанные показатели преломления (метод оптического просветления).

Исследование проницаемости биотканей человека по отношению к различным агентам и лекарственным препаратам представляет интерес в широком контексте проблем, связанных с их лечением и косметологическим уходом. Одним из возможных методов изучения распространения химических агентов в биотканях является метод ОКТ, который в настоящее время является одним из наиболее перспективных и развивающихся методов неинвазивной диагностики оптически неоднородных сред. Основой метода является интерферометрическая регистрация низкокогерентного оптического излучения, отраженного от различных слоев биоткани. По сравнению с другими распространенными системами визуализации внутренней структуры объекта, такими как рентгеновская, магнитно-резонансная и ультразвуковая томография, ОКТ имеет преимущества по безопасности использования, стоимости оборудования, контрасту и разрешению получаемых изображений. Метод ОКТ исходно предназначен для визуализации, однако, обработка цифровых ОКТ-изображений позволяет извлечь количественные данные об оптических параметрах рассеивающей биоткани и ее морфологическом и функциональном состоянии. Такие исследования уже проводились, но для

ограниченного числа биотканей (кровь, склера глаза, эпителий). Распространение данного подхода на более широкий круг биотканей, к которым относятся эмаль и дентин зуба, ткани ногтя и жировая ткань, является актуальной задачей.

Среди применений ОКТ в стоматологии преобладает визуализация структуры тканей зубов и полости рта in vivo для оценки их состояния по полученным изображениям. Мониторинг проникновения химических агентов в ткани зуба на основе математической обработки цифровых ОКТ изображений - новая и актуальная задача.

Проникновение в ткани зуба наночастиц - не менее важная проблема, чем транспорт химических агентов. С введением наночастиц в тубулы дентина связана разработка методов снижения гиперчувствительности зуба. Внедренные наночастицы могут оказывать бактерицидное действие, усиливать фотодинамическое воздействие, выполнять косметические функции, способствуя отбеливанию. В связи с этим актуальной задачей является развитие оптических методов для простого и неинвазивного контроля доставки наночастиц в ткань зуба. В качестве таковых представляет интерес использовать ОКТ и нелинейную микроскопию, также дающую послойное изображение, но с более высоким разрешением, достаточным для прямой визуализации наночастиц.

В силу доступности и особенностей строения ноготь пальца человека является удобным и популярным объектом ОКТ-визуализации in vivo. Как и в стоматологии, полученные изображения затем используются для дифференциальной диагностики заболеваний ногтя. Актуальной задачей является применить ОКТ для изучения таких внешних воздействий на ткани ногтя in vivo (механическое сжатие, нанесение иммерсионного агента), которые могут вызывать оптическое просветление. Новые возможности можно ожидать от использования как видимых изменений самих ОКТ изображений, так и результатов их цифровой обработки в виде

количественных оценок изменений геометрических и оптических параметров биотканей ногтя.

Действие оптического излучения, усиленное введением в биоткань красителя, в последнее время широко изучается в связи с целым рядом биомедицинских приложений, одно из которых - снижение количества жировых клеток, что представляет собой важную часть медицинских программ по борьбе с ожирением. Значительные размеры адипоцитов позволяют получать ОКТ изображения жировой ткани, на которых отдельные клетки хорошо видны, что открывает уникальную возможность использовать ОКТ для мониторинга последствий фотодинамического воздействия в реальном времени на клеточном уровне. Такое применение ОКТ является актуальной задачей, а полученные ОКТ-изображения могут быть количественно обработаны с целью ответа на важный вопрос о том, что происходит с отдельными адипоцитами при фотодинамическом или ином воздействии.

Цель работы - изучить процессы доставки химических агентов и наночастиц в биоткани путем ОКТ-визуализации с цифровой обработкой изображений для количественного определения диффузионных и оптических свойств биотканей и их изменений под действием внешних факторов, а также с помощью нелинейной микроскопии. Основные объекты - образцы тканей зуба человека и жировой ткани in vitro, а также ткани ногтя пальца человека in vivo. Задачи исследования:

• ОКТ-мониторинг проникновения вызывающих оптическое просветление химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека и оценка коэффициентов проницаемости по скорости изменения среднего наклона А-скана.

• Оценка оптических параметров эпителиальных и фиброзных тканей под ногтем пальца человека in vivo и их изменений под действием

просветляющего агента и механического сжатия с помощью цифровой обработки ОКТ изображений.

• ОКТ-мониторинг последствий фотодинамического воздействия на образцы жировой ткани in vitro в реальном времени на клеточном уровне

• Расчет проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода как функции размеров тубул и плотности их числа на основе простой модели тубулярной структуры.

• Разработка модели и численный расчет пространственно-временного поведения сигнала ОКТ при диффузии иммерсионного агента в макроскопически-неоднородной рассеивающей среде на основе численного решения уравнения диффузии с учетом зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента.

• Определение глубины проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека методами ОКТ и нелинейной микроскопии.

Научная новизна работы:

• Методика оценки коэффициента проницаемости по скорости изменения среднего наклона сигнала ОКТ во времени впервые применена к проникновению оптически просветляющих химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека.

• Оценки коэффициентов ослабления света эпителиальными и фиброзными тканями под ногтем пальца человека in vivo впервые получены по результатам обработки ОКТ-изображений, продемонстрированы и оценены их изменения под действием просветляющего агента (глицерин) и механического сжатия.

• Впервые осуществлен ОКТ-мониторинг долговременных (десятки и сотни минут) последствий совместного воздействия света и красителя на образцы жировой ткани in vitro на клеточном уровне.

• С помощью простой модели тубулярной структуры дентина впервые рассчитаны зависимости коэффициентов проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода от диаметра и плотности числа тубул.

• На основе численного решения уравнения диффузии и известной теории формирования ОКТ сигнала в рассеивающей среде с заданными параметрами построена математическая модель эволюции ОКТ сигнала в процессе диффузии иммерсионного агента. В отличие от известных аналитических решений, модель применима к макроскопически неоднородным средам. Показано, что уменьшение сечения рассеяния назад при оптическом просветлении может приводить к немонотонному поведению сигнала ОКТ даже в макроскопически однородной среде.

• Впервые обнаружены заметные изменения формы усредненного сигнала ОКТ после длительной ультразвуковой обработки образца дентина зуба человека, погруженного во взвесь наночастиц TiO2. Впервые исследовано проникновение наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека методами нелинейной микроскопии.

Научная и практическая значимость результатов работы заключается в следующем:

• Доказана возможность использования серийного портативного оптического когерентного томографа THORLABS Spectral Radar OCT, исходно предназначенного для получения изображений биотканей in vivo в условиях медицинского учреждения, для решения фундаментальной биофизической задачи - мониторинга оптических, диффузионных и морфологических характеристик дентина и эмали зуба человека, тканей ногтя и жировой ткани в реальном времени при воздействии внешних факторов (аппликация иммерсионного агента или взвеси наночастиц, механическое сжатие, фотодинамическое воздействие).

• Исследования диффузии просветляющих агентов в образцах дентина зуба человека подтвердили, что калибровка сигнала ОКТ, существенная для оценки коэффициента ослабления по его наклону, мало сказывается на

характерном времени изменения указанного наклона и, следовательно, на оценке коэффициента проницаемости, которая является достаточно универсальной.

• Исследования тканей ногтя человека показывают, что с помощью ОКТ можно проводить не только визуализацию подобных биотканей in vivo, но и количественно определять относительные изменения оптических характеристик (коэффициента ослабления) под действием просветляющего агента или механического сжатия, что расширяет сферу практического (и в отдаленной перспективе, клинического) применения ОКТ.

• Выполненные автором диссертации ОКТ исследования образцов жировой ткани человека были использованы для получения дополнительной информации о механизмах фотодинамического воздействия на жировую ткань, что важно для медицинских исследований, направленных на борьбу с ожирением.

• Реализованная в виде численного алгоритма и программы модель формирования сигнала ОКТ в среде, испытывающей оптическое просветление в результате диффузии иммерсионного агента, применима к неоднородным средам и может быть полезна как для интерпретации будущих экспериментов, так и для использования в алгоритмах решения обратной задачи извлечения исходных оптических и диффузионных параметров среды из данных ОКТ-измерений.

• Помимо демонстрации возможностей оптического мониторинга проникновения наночастиц в образцы дентина и эмали зуба человека, практическая важность полученных в этом направлении результатов состоит в том, что они указывают на низкую эффективность «спонтанного» внедрения наночастиц в дентин и, тем более, эмаль зуба при погружении во взвесь наночастиц или при нанесении таковой на поверхность зуба и убеждают в необходимости поиска дополнительных мер интенсификации этого процесса.

На защиту выносятся следующие положения:

1. При исследовании плотных сильно рассеивающих биотканей (ткани зуба и ногтя человека) методика обработки цифровых ОКТ изображений, основанная на усреднении сигнала по группе А-сканов, позволяет лучше выявить как структурные элементы биоткани, так и сравнительно небольшие изменения сигнала ОКТ, вызванные внешними воздействиями (аппликация иммерсионного агента, механическое давление) и слабо различимые визуально на исходном ОКТ изображении.

2. Методика обработки цифровых ОКТ-изображений с расчетом усредненного А-скана позволяет проводить мониторинг проникновения химических агентов в образцы тканей зуба человека по изменению среднего наклона сигнала ОКТ в реальном времени. Получаемые в результате постоянная времени насыщения и коэффициент проницаемости значительно менее чувствительны к калибровке сигнала, вкладу многократного рассеяния, а также наличию и характеру макроскопической неоднородности биоткани, чем сам наклон сигнала ОКТ и определяемый по нему коэффициент ослабления света биотканью.

3. Как показывает численное моделирование пространственно-временного поведения сигнала ОКТ в среде, где происходит диффузия иммерсионного агента, учет зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента существенно сказывается на пространственном поведении сигнала ОКТ и может приводить появлению на А-скане максимума, который является индикатором указанного влияния.

4. Длительное (несколько суток) содержание срезов дентина и эмали зуба человека во взвеси наночастиц ТЮ2 с периодическим (несколько раз в сутки) включением ультразвука приводит к заметным (до 5 дБ) изменениям формы усредненного А-скана ОКТ на глубинах, достигающих сотен микрометров. Эти данные свидетельствуют о проникновении наночастиц в образцы, но их недостаточно для оценки глубины проникновения, которая может быть завышена за счет многократного рассеяния. Прямая визуализация внедренных наночастиц методами нелинейной микроскопии показывает, что при

небольших (до 30 минут) длительностях УЗ обработки срезов зуба человека, погруженных в суспензию наночастиц, глубина проникновения наночастиц ZnO в срезы дентина достигает десятков микрометров, а для наночастиц TiO2 на порядок меньше, что можно объяснить большей степенью агрегации последних.

Достоверность результатов вытекает, прежде всего, из корректного использования современных и предварительно апробированных приборов и методик исследования (спектральный оптический когерентный томограф THORLABS Spectral Radar OCT (США); двухфотонный томограф JenLab GmbH (Германия) с титан-сапфировым фемтосекундным лазером Mai Tai XF, Spectra Physics (США), оптические и электронные микроскопы и др.). При обработке результатов использовались пакеты прикладных программ, математические модели, и приближения, апробированные ранее другими авторами на родственных объектах. Там, где позволяли условия эксперимента, измерения проводились многократно с последующим статистическим усреднением. Результаты и выводы согласуются с современными представлениями о механизмах изученных процессов и опубликованными результатами других авторов, полученными с помощью альтернативных методов.

Личный вклад автора диссертации состоит в участии в постановке задач и планировании исследований совместно с научным руководителем проф. Тучиным В.В., в проведении экспериментов и обработке их данных, в проведении расчетов при математическом моделировании процессов, в написании и подготовке текстов статей к публикации.

Исследования по двухфотонной микроскопии проникновения наночастиц в ткани зуба проводились совместно с М.Е. Дарвиным в Центре экспериментальной и прикладной кожной физиологии Медицинского университета «Шарите», Берлин, Германия под руководством профессора Ю. Ладеманна. Изучение жировой ткани проводилось совместно с И.Ю.

Яниной, которая использовала результаты ОКТ-исследований автора диссертации для дальнейшей статистической обработки и интерпретации. Публикации по теме диссертации и апробация результатов. Основные результаты диссертации опубликованы в 16 статьях, из них 13 - в рецензируемых изданиях, удовлетворяющих требованиям пунктов 12 и 13 «Положения о присуждении ученых степеней», а именно: 11 статей в изданиях, включенных в систему цитирования SCOPUS, 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК и включенном в SCOPUS, 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК. SCOPUS

1. Trunina N.A., Derbov V.L., Tuchin V.V., Altshuler G.B. Dentinal permeation modeling//Proc. SPIE. 2008. V. 6791. P. 67910T-1-7.

2. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of clearing agents within tooth dentin //Proc. SPIE. 2009. V. 7443. P. 74432D-1-8.

3. Trunina N.A., Lychagov V.V., Tuchin V.V. OCT monitoring of diffusion of water and glycerol through tooth dentin in different geometry of wetting // Proc. SPIE. 2010. V. 7563. P. 7563OU-1-5.

4. Tuchin V.V., Bashkatov A.N., Genina E.A., Kochubey V.I., Lychagov V.V., Portnov S.A., Trunina N.A., Miller D.R., Cho S., Oh H., Shim B., Kim M., Oh J., Eum H., Ku Y., Kim D., Yang Y. Finger tissue model and blood perfused skin tissue phantom//Proc. SPIE. 2011. V. 7898. P. 78980Z-1-11.

5. Larin K.V., Ghosn M.G., Bashkatov A.N., Genina E.A., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical clearing for OCT image enhancement and in-depth monitoring of molecular diffusion // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 2011. V. 18. No. 3. P. 1244 - 1259.

6. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Temporal change of adipose tissue refractive index at photodynamic treatment: in vitro study using OCT // Proc. SPIE. 2012. V. 8222. P. 82221G-1-6.

7. Trunina N.A., Popov A.P., Lademann J., Tuchin V.V., Myllyla R., Darvin M.E. Two-photon-excited autofluorescence and second-harmonic generation microscopy

for the visualization of penetration of TiO2 and ZnO nanoparticles into human tooth tissue ex vivo // Proc. SPIE. 2012. V. 8427. P. 8427OY-1-6.

8. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical coherence tomography of adipose tissue at photodynamic/phototermal treatment in vitro // J. Innovat. Opt. Health Sci. 2013. V. 6. No. 2. P. 1350010-1-7.

9. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Photo-induced cell morphology alterations quantified within adipose tissues by spectral OCT // J. Biomed. Opt. 2013. V. 18. No. 11. P. 111407-1-10.

10. Trunina N.A., Darvin M.E., Kordas K., Sarkar A., Mikkola J.-P., J. Lademann, Meinke M.C., Myllyla R., Tuchin V.V., Popov A.P. Monitoring of TiO2 and ZnO nanoparticle penetration into enamel and dentine of human tooth in vitro and assessment of their photocatalytic ability // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 2014. V. 20. No. 3. P. 7300108-1-8.

11. Trunina N.A., Derbov V.L., Tuchin V.V. Simple numerical model of OCT signal evolution due to the diffusion of an optical clearing agent // Proc. SPIE. 2014. V. 9031. P. 90310B-1-9.

Перечень ВАК и SCOPUS

12. Трунина Н.А., Лычагов В.В., Тучин В.В. Исследование диффузии воды через дентин зуба человека методом оптической когерентной томографии // Опт. и спектр. 2010. Т. 109. № 2. С. 190 - 196.

Перечень ВАК 2011 года

13. Трунина Н.А. Тучин В.В. Визуализация проникновения наночастиц TiO2 в ткани зуба человека методом оптической когерентной томографии // Изв. Саратовского ун-та. Новая серия. Сер. Физика. 2011. Т. 11. №. 2. С. 5-9. Прочие статьи

14. Кальянов А.Л., Лычагов В.В., Трунина Н.А., Федосов И.В., Лакоди-на Н.А., Тучин В.В., Беликов А.В., Альтшулер Г.Б. Исследование возможности химического отбеливания зубов, используя отверстия в эмали // Проблемы оптической физики (Материалы 11 -ой Международной молодежной научной

школы по оптике, лазерной физике и биофотонике, 25- 28 сентября 2007) Саратов: Новый ветер, 2008. С.44 - 47.

15. Трунина Н.А., Дербов В.Л., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Модель проницаемости дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники (Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике, 23 - 26 сентября 2008). Саратов: Новый ветер, 2009. С. 42 - 47.

16. Герасимова Н.С., Трунина Н.А., Генина Э.А., Башкатов А.Н., Кочубей В.И., Тучин В.В. Исследование оптического просветления дентина // Проблемы оптической физики и биофотоники (Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофотонике 23 - 26 сентября 2008). Саратов: Новый ветер, 2009. С. 47 - 54.

Основные результаты диссертационной работы доложены на конференциях:

• Saratov Fall Meeting 2007 (SFM 2007), September, 25-28, 2007, Saratov, Russia;

• The International Topical Meeting on Optical Sensing and Artificial Vision 2008 (OSAV 2008), May, 12-15, 2008, St.-Petersburg, Russia;

• BIGSS'08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August,29-September,2, 2008, Ireland;

• Scientific Meeting of EC-project "Photonics4Life", November, 18-19, 2008, Brussels, Belgium;

• SPIE Optics+Photonics 2009, August 1 -6, 2009, San Diego, USA;

• Saratov Fall Meeting 2009 (SFM 2009), September, 21-24, 2009, Saratov, Russia;

• Scientific Meeting of EC-project "Photonics4Life", November, 6-18, 2009, Barcelona, Spain;

• SPIE Photonics West 2010, January, 23-28, 2010, San Francisco, USA;

• Научно-практическая конференция Presenting Academic Achievements to the World: 29-30 марта, 2010, Саратов, Россия;

• SPIE Photonics Europe 2010, April, 12-16, 2010, Brussels, Belgium;

• 71-я научно-практическая конференция студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» МУ-ЗР'10: 22-24 апреля, 2010, Саратов, Россия;

• Saratov Fall Meeting 2010 (SFM 2010), October, 5-8, 2010, Saratov, Russia;

• SPIE Photonics West 2011, January, 22-27, 2011, San Francisco, USA;

• Saratov Fall Meeting 2011 (SFM 2011), September, 27-30, 2011, Saratov, Russia;

• SPIE Photonics West 2012, January, 21-26, 2012, San Francisco, USA;

• SPIE Photonics Europe 2012, April, 16-19, 2012, Brussels, Belgium;

• Russian-Chinese Workshop: Biophotonics and Biomedical Optics, SFM 2012, 26-28 September, 2012, Saratov, Russia;

• D:\report\621SFM 2012, 25-28 September, 2012, Saratov, Russia;

• 1st International Biophotonics Meeting in Israel, Conference BPI12, Tel Aviv, Israel, 9-11 December, 2012;

• SPIE Photonics West 2013, San Francisco, USA; February, 2-7, 2013.

Повышение квалификации, проведение совместных исследований по теме

диссертации и обсуждение их результатов осуществлялись соискателем в ходе

стажировок

• A two-week course of professional training in Imaging of living tissues by means of dynamical light scattering, Weizmann Institute, Rehovot, Israel, October 1730,2010;

• A two-week course of professional training in Optical Coherence Tomography as a method for monitoring the diffusion of chemical agents and penetration of nanoparticles into biological tissues, Department of Dermatology, Venerology

and Allergology, Centre of Experimental and Applied Cutanious Physiology, Charite University Medicine, Berlin, August 15-28, 2011;

и международных школ

• BIGSS'08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August,29-September,2, 2008, Ireland;

• 16th CIMO WINTER SCHOOL "Building blocks of life: from biomaterials to living organisms" March 12-17, 2012, Finland.

Работа соискателя и участие в мероприятиях по теме диссертации были поддержаны персональными грантами

• SPIE Travel Grant on participation on Optics + Photonics 2009, August 1-6, 2009, San Diego, USA;

• Travel Gant on participation on BIGSS'08 Biophotonics and Imaging Graduate Summer School, University of Limerick, August, 29-September, 2, 2008, Ireland;

• Н.А.Трунина, «Разработка методов оптического контроля свойств твердых тканей зуба человека под действием химических агентов и наночастиц для косметической и терапевтической стоматологии», Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, программа «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (УМНИК). Контракт на выполнение НИОКР № 8761 p /14002 от 14 января 2011 г.

• Travel Grant on participation on 16th CIMO WINTER SCHOOL Building blocks of life: from biomaterials to living organisms March 12-17, 2012, Finland

• Grant on visiting Oulu University, Finland, February,13-March,1, 2013

Исследования по теме диссертации проводились соискателем в качестве исполнителя ряда проектов, поддержанных грантами:

• Photonics4Life , Network of Excellence for Biophotonics, Seventh Framework

Programme (FP7-ICT-2007-2, грантовое соглашение № 224014)

• Грант Американского Фонда Гражданских Исследований и Развития (CRDF), RUB1-2932-SR-08.

• Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», гос. контракт 02.740.11 0770.

• Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», гос. контракт 02.740.11 0879.

• Грант РФФИ, 10-02-90039_Бел_а.

Достижения соискателя в исследовательской работе по теме диссертации отмечены премиями и наградами

• Премия за 2010год Международной академической издательской компании «Наука» за лучшую публикацию в издаваемых ею журналах (диплом №142, решение комиссии от 22 ноября 2011г., протокол №2).

• SPIE Best Student Paper Award, SPIE Photonics Europe 2012

• Стипендия Президента РФ для аспирантов (приказ Минобрнауки http://www.sgu.ru/node/89120)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения (раздел 1), основной части, содержащей 6 разделов (разделы 2 - 7), заключения (раздел 8) и списка цитируемой литературы, включающего 317 наименований, содержит 45 рисунков и 3 таблицы. Объем диссертации составляет 157 страниц.

Во введении (раздел 1) дается общая характеристика диссертации как квалификационной работы, включающая актуальность темы, цель и задачи работы, новые результаты, их теоретическое и практическое значение, личный вклад соискателя, публикацию и апробацию результатов диссертации, ее структуру и объем. В разделе 2 приводятся необходимые сведения о методах исследования, а в разделе 3 - об объектах исследования. Эти разделы являются обзорными и нужны для характеристики современного состояния

исследований, близких к теме диссертации, а также для определения основных понятий, необходимых для понимания последующего изложения. С раздела 3 начинается описание самостоятельных исследований автора. Здесь приводится описание экспериментов по ОКТ-мониторингу проникновения химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы зубной ткани in vitro. Четвертый раздел посвящен ОКТ-исследованию изменений, вызванных внешними воздействиями, в других плотных тканях. Сначала описаны ОКТ-исследования in vivo тканей пальца человека, позволившие оценить коэффициент ослабления отдельных слоев и его изменения под действием иммерсии и механического сдавливания. Затем излагаются результаты экспериментов по ОКТ визуализации клеток жировой ткани человека в процессе долговременных изменений, вызванных комбинированным воздействием света и красителей, на основании которых был выполнен статистический анализ распределения клеток по размерам и сделаны выводы о механизмах их разрушения. Теоретический раздел 5 содержит описание двух разных моделей. Вначале рассматривается простая модель тубулярной структуры дентина, на основе которой проведен расчет коэффициента проницаемости дентина в зависимости от диаметра и плотности числа тубул. Далее описана математическая модель, основанная на численном решении уравнения диффузии с последующим использованием известной теории формирования сигнала ОКТ в рассеивающей среде с заданными свойствами. В качестве нетривиального примера описан механизм формирования немонотонного А-скана в условиях, когда оптическое просветление влияет не только на коэффициент ослабления, но и на сечения рассеяния назад, определяющее полезный сигнал. Наконец, в седьмом разделе описываются эксперименты по оптическому мониторингу проникновения наночастиц в образцы зубной эмали и дентина. Вначале рассмотрены измерения методом ОКТ-визуализации, а затем - с помощью нелинейной микроскопии с использованием флуоресценции с двухфотонным В заключении (раздел 8) обсуждаются итоги проделанной работы и перспективы ее продолжения.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Оптическая когерентная томография (ОКТ)

Оптическая визуализация биологических тканей - сложная задача, так как даже в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне, где поглощение минимально (так называемое физиологическое окно прозрачности) распространение света затруднено интенсивным рассеянием на неоднородностях показателя преломления, присущих природе биологических тканей [1]. Классическим примером является склера глаза, компоненты которой слабо поглощают видимый свет, но имеют различный показатель преломления, так что из-за рассеяния склера почти непрозрачна.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Трунина Наталья Андреевна, 2016 год

и 55 -

1-

^

О 50-

45 -

40-

-ноготь, ^=556,2 см (0-32мкм) - эпидермис, ц =36см !(48-453мкм) дерма

область1 (0-32мкм) ц=556,2см 1

рбласть2(48-134мкм)

ц=38,4см ^

" область4(323-453мкм}

р=39,8см 1

областьЗ(161-212мкм) ц =41.8см"1

200

—I-1-1-

400 600

глубина, мкм

—I— 800

(б)

(в)

Рис. 5.4 - Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования (усредненный А-скан) для тканей под ногтем мизинца для участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) и рассчитанные значения коэффициента ослабления (рассеяния) для разных слоев ткани.

Участок 2 выбирался ближе к краю ногтя (рис. 5.2б), причем направление В-сканирования не отличалось от такового для участка 1. Рис. 5.3б и 5.4б наглядно показывают, что ближе к краю ногтя толщина и структура лежащего под ним эпидермиса меняются по сравнению с участком 1. Участок 3 был выбран на самом краю ногтя (рис. 5.2в). На рис. 5.3в и 5.4в видно, что с переходом в эту область ногтевая пластинка становится толще, меняются также толщина и структура лежащих под ней слоев. Это, конечно, связано с тем, что часть ногтя была спилена, так как у интактного ногтя середина толще. На рис. 5.4 цветом выделены слои ногтя, эпидермиса и дермы, засечками отмечены границы наблюдаемых слоев и численно указаны глубины их расположения. Матрикс ногтевого ложа не попадает в область наблюдения, которая находится ближе к концу пальца. По наклону спадающих участков А-сканов оценены и указаны на рисунках «локальные коэффициенты ослабления» слоев. Эта оценка является весьма условной и требует комментария, так как наклон сигнала ОКТ равен среднему коэффициенту ослабления только в макроскопически однородном слое. Для фантома из чередующихся макроскопически однородных резко разграниченных слоев с большими и малыми сечениями рассеяния назад А-скан имел бы зубчатую форму (рис. 5.5а), причем наклон вершин зубьев и дна впадин между ними был бы связан с ослаблением сигнала каждым однородным слоем.

г -

Рис. 5.5. Схематический вид идеализированного А-скана (толстая линия) для фантома, состоящего из однородных резко разграниченных слоев, в которых аъ (7) (тонкая линия) меняется периодически (а) и монотонно увеличивается

ступенями (б).

Если фантом состоит из слоев, у которых сечение рассеяния назад растет с увеличением глубины, то на границах слоев сигнал ОКТ делает скачок вверх,

а затем плавно спадает за счет ослабления. В любом случае должен наблюдаться в целом спадающий ход А-скана, поскольку и формирование полезного сигнала (рассеяние назад), и его ослабление (рассеяние во всех других направлениях плюс поглощение) уменьшают мощность предметной волны по мере углубления в среду.

Реальные А-сканы на рис. 5.4. имеют участки плавного возрастания и убывания. Если причиной возрастания может быть только рост отражающей способности среды, то убывание может быть связано как с уменьшением отражения, так и с ослаблением сигнала по пути до зондируемого слоя и обратно. Оценки на рис. 5.4 далее на рис. 5. 7 и 5.9 проведены в приближении, что участки убывания на А-скане обусловлены именно ослаблением (аналогично фантому, показанному на рис. 5.5 (б)), а отражение от слоя к слою только растет. Это предположение нуждается в дополнительной проверке, поэтому приведенные оценки локального коэффициента ослабления слоев являются условными. В частности, плавный рост отражения назад внутри слоя может уменьшать наклон сигнала ОКТ на соответствующем участке А-скана, что даст заниженное значение /л(. Возможно, что именно в этом заключается причина отличия полученных здесь значений ^ от известных данных для кожи [317].

Следующее ОКТ-зондирование проводилось на участке 1 с надавливанием на поверхность ногтя ОКТ-зондом. Результаты представлены на рис. 5.6 и 5.7.

Рис. 5.6 - ОКТ-изображение тканей под ногтем мизинца при надавливании.

70-

-ноготь,(1=171,8ем"'(0-26м км)

-эпидермис,ц=18,2см "(44-405мкм)

дерма^^Э.Эсм '{415-546мкм) эпидермис+дерма,[1 =15,9см '(44-546мкм)

65-

обпасть1(0-26мкм) ц=171,8см'1

.и.:=22,2см'

"1->-1-■-г-1-1-'-1-■-1-1-1

0 200 400 600 800 1000 1200

глубина,мкм

Рис. 5.7. Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования для тканей под ногтем мизинца при надавливании и рассчитанные значения коэффициента ослабления (рассеяния) для разных слоев ткани.

На следующем этапе исследования на участках, приблизительно совпадающих с участками 1, 2 и 3 на рис. 5.2, проводились измерения с предварительным нанесением на поверхность ногтя глицерина в качестве просветляющего агента. Соответствующие ОКТ-изображения приведены на рис. 5.8, а сигналы ОКТ в зависимости от глубины сканирования - на рис. 5.9.

Оценки среднего коэффициента ослабления в ногтевой пластинке, эпидермисе и дерме по среднему наклону сигнала ОКТ в соответствующих слоях приведены в таблице 5.1. Эти оценки, как и приведенные на рисунках 5.4, 5.7 и 5.9, сделаны в предположении, что средний наклон сигнала ОКТ обусловлен только ослаблением сигнала, то есть без учета возможных изменений сечения рассеяния назад.

Из ОКТ изображений и усредненных А-сканов видно, что толщина эпидермиса и дермы под ногтевой пластинкой сильно зависит от расстояния до ее края. Видно, что и аппликация глицерина, и компрессия существенно влияют на форму А-сканов и коэффициенты ослабления слоев. Более детальное рассмотрение позволяет предположить, что ноготь в глицерине утолщается и набухает, а далее отдает его в кожу, где эпидермис с дермой хорошо просветляются. При компрессии ситуация иная. Ноготь размягчен (так

как счищен верхний твердый слой) и хорошо подвержен компрессии, так же реагирует эпидермис, но реакции дермы не видно. Значит, выдавливания крови нет или его просто не видно на длине волны 930 нм. Надо заметить также, что видимая на А сканах толщина слоев оптическая, то есть может меняться, если в результате надавливания или проникновения глицерина изменился показатель преломления.

(в)

Рис. 5.8 - ОКТ-изображение тканей под ногтем мизинца для исследуемых участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) после 20-минутного нанесения глицерина.

(в)

Рис. 5.9 - Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования для тканей под ногтем мизинца для исследуемых участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) после двадцатиминутного нанесения глицерина.

Таблица 5.1. Оценки коэффициента ослабления для ногтя, эпидермиса и дермы на различных участках интактного ногтя, а также в условиях просветления глицерином и при механическом надавливании.

Участок ЦгСм-1 ^t после 20 минутного применения глицерина, см-1 ^t при надавливании, см-1

ноготь эпидермис дерма ноготь эпидермис дерма ноготь эпидермис дерма

1 431,2 64,8 19,6 613,4 34,6 16,2 343,6 16,4 19,6

2 556,2 36 - 513,6 46 - - - -

3 424 40 9 528,2 32 - - - -

Несмотря на предварительность полученных результатов и отмеченную выше условность оценок коэффициентов ослабления слоев, они могут быть полезны в дальнейших исследованиях, направленных на создание новых типов оптических датчиков для мониторинга содержания глюкозы, гемоглобина и других аналитов в тканях, когда палец является информационным объектом.

5.2 ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани В настоящем разделе показано, что с помощью ОКТ успешно обнаруживаются фотоиндуцированные морфологические изменения жировой ткани in vitro, обусловленные фотовоздействием. В работах [264-266] автором диссертации были получены и исследованы ОКТ-изображения слоев жировой ткани, на основании которых был сделан вывод о том, что наблюдаемые изменения связаны с липолизом жировых клеток и их разрушением за счет фотодинамического эффекта.

Методы неинвазивного или малоинвазивного удаления лишних жировых клеток необходимы для решения важной медицинской проблемы борьбы с ожирением (см. раздел 3.5). Недавно было показано, что фотодинамические/фототермические эффекты в жировой ткани, окрашенной бриллиантовым зеленым (БЗ) или индоцианиновым зеленым (ИЗ) красителями, при облучении светодиодом или полупроводниковым лазером ближнего ИК диапазона приводят к липолизу жировых клеток и их гибели по сценарию апоптоза [267, 268]. Установлено, что в результате

светоиндуцированной перколяции внутриклеточное вещество вытекает в интерстициальное пространство [269], что приближает показатель преломления интерстициальной жидкости, исходно равный n = 1.36, к показателю преломления внутриклеточного вещества жировых клеток na = 1.44 и повышает однородность и прозрачность образца [270, 271]. Применение ОКТ для исследования изменений морфологии жира в ходе фотодинамического воздействия в наших работах [264-266] впервые позволило проследить за указанными процессами во времени на клеточном уровне. Рассмотрим эти эксперименты более подробно.

Постановка эксперимента. Экспериментальная установка включала подробно описанную в разделе 4.2 портативную ОКТ систему THORLABS Spectral Radar OCT System. Образцы представляли собой срезы жировой ткани человека, удаленной в ходе плановых хирургических операций, толщиной 200—600 мкм и площадью 0.5*0.5 см2. Процедура подготовки образцов подробно описана в [266]. Образцы помещались в термостабилизирующий держатель, соединенный с термостатом TJ-TC-01, что позволяло контролировать температуру образца в пределах от +30 до +60°С с точностью of ±0.1°С. После установления температуры начиналось ОКТ исследование, причем первое изображение получалось от интактного образца. Затем каждый срез жировой ткани делился прокладками на 4 зоны. Первая зона была контрольной, где жир не подвергался воздействию ни света, ни красителей. Вторая зона окрашивалась водно-спиртовыми растворами ИЗ и БЗ с концентрацией 1 мг/мл и 6 мг/мл, соответственно. Третья зона подвергалась воздействию света, источниками которого служили либо диодный лазер (LS-2-N-808-10000, длина волны 808 нм, экспозиция 5 мин.), либо стоматологическая диодная лампа (Ultra Lume Led 5, длина волны 442 и 597 нм, экспозиция 15 мин.). Наконец, четвертая зона сначала окрашивалась, а затем подвергалась фотовоздействию. ОКТ-изображение всех четырех зон образца получалось одновременно сразу после фотовоздействия, а затем повторно через каждые 15 минут в течение достаточно длительного времени

(до 300 минут). Во время всей процедуры температура поддерживалась постоянной. Измерения проводились при дневном освещении. Для статистической обработки идентичные измерения повторялись для 10 различных образцов. При другой температуре или при окрашивании другим красителем вся процедура снова повторялась по 10 раз с новыми срезами жировой ткани.

Результаты и их обсуждение. Контрольные части образцов (зона 1), которые не подвергались действию света и красителей, демонстрировали стабильность в отношении окружающих условий в течение длительного времени. На рис. 5.10 приведена серия ОКТ изображений срезов жировой ткани, окрашенных БЗ, до (а) и после (б -г) облучения светом лампы в течение 15 мин. (температура образца комнатная, 25 °С). На рис. 5.10 (б) ткань показана сразу после облучения, а на рис. 5.9 (в) и (г) - через большие промежутки времени 120 и 300 мин., соответственно. Диодная лампа Ultra Lume Led 5 давала излучение на длинах волн 442 и 597 нм с плотностью мощности 75,5 мВт/см2. Спектр излучения лампы перекрывался со спектром поглощения красителя БЗ. Концентрация водно-спиртового (2:3) раствора БЗ составляла 6 мг/мл. Начальная толщина образца, измеренная микрометром несколько раз с последующим усреднением, оказалась равной 533±41 мкм.

Рис. 5.11 отличается от рис. 5.10 тем, что измерения проводились не при комнатной, а при физиологической температуре 37 °С. Второе отличие состоит в том, что ОКТ изображения на рис. 5.11 (в) и (г) получены через меньшее время, а именно, 60 и 120 мин., соответственно. Начальная толщина среза 237±10 мкм. Диодный лазер непрерывного действия LS-2-N-808-10000 генерировал излучение с длиной волны 808 нм и плотностью мощности 250 мВт/см2. Концентрация ИЗ составляла 1 мг/мл, начальная толщина образца 520±13 мкм.

Рис. 5.10. ОКТ-изображения срезов жировой ткани, окрашенных БЗ до облучения диодной лампой (а); через 15 минут после облучения (б); через 120 (в); через 300 минут (г). Температура образца 25°С. Гистограммы наверху показывают распределение жировых клеток по площади изображений (алгоритм изложен в работе [266]). В нижней части показаны А-сканы, усредненные по всей области В-сканирования.

а

Cell area, цт

0 3000 6000 9000 12000 15000

Cell area, ^m2

ll.ll..

Cell area, ^m

3000 6000 9000 12000 15000

Cell area, ^m2

в)

Рис. 5.11. То же, что на рис. 5.10, но при физиологической температуре 37 °С. Изменены также времена получения изображений (в) и (г), теперь они составляют 60 и 120 минут после освещения лампой, соответственно. Остальные условия идентичны случаю, показанному на рис. 5.10

15

15

12

12

Е 9

Такие же особенности наблюдались при окрашивании ткани с помощью ИЗ и освещением диодным лазером ближнего ИК диапазона. Для комнатной температуры 25 °С результаты показаны на рис. 5.12. Лазерное освещение продолжалось 5 минут, а ОКТ-наблюдения, как и на рис. 5.10, проводились до воздействия, сразу после его окончания, а затем через 60 и 120 минут.

Аналогичный эксперимент, но при температуре 37 °С и временах ОКТ-зондирования 60 и 120 минут после воздействия, иллюстрируется рис. 5.13. Начальная толщина образца в этом случае составляла 281±18 мкм.

а)

б)

в)

г)

Рис. 5.12. Эксперимент при комнатной температуре 25°С, аналогичный показанному на рис. 5.10, но с заменой красителя БЗ на ИЗ и лампы на диодный лазер (экспозиция в течение 5 минут). А-сканы, показанные внизу, усреднены по области, ограниченной на ОКТ-изображениях тонкими вертикальными линиями.

.Inn.....

3000 6000 9000 12000 15000

Cell area, цш2

.llll .

Cell area, цш

a)

б)

в)

г)

Рис. 5.13. Эксперимент при физиологической температуре 37 °С, аналогичный показанному на рис. 5.11, с заменой красителя БЗ на ИЗ и лампы на диодный лазер (экспозиция в течение 5 минут). А-сканы, показанные внизу, усреднены по области, ограниченной на ОКТ-изображениях тонкими вертикальными линиями.

Z

Как видно из приведенных рисунков, разрешения ОКТ достаточно для визуализации отдельных адипоцитов, что позволило исследовать влияние облучения на распределение клеток по размерам. На основании проведенных автором диссертации ОКТ исследований соавтор работ [17, 264 - 266] по теме диссертации И.Ю. Янина провела дальнейший статистический анализ распределения клеток по площади их изображений, результаты которого показаны в виде гистограмм в верхней части рис. 5.10 - 5.13. Алгоритм этого статистического анализа подробно описан в статье [266]. Гистограммы показывают, что со временем распределение становится более однородным, так как число мелких клеток увеличивается в результате липолиза, а число крупных клеток - в результате набухания и слияния жировых капель.

Характерное время наступления изменений в структуре клеток после обработки красителем и освещения составило 60—300 мин, что согласуется с ожидаемым биологическим откликом на фотодинамическое воздействие [272]. По прошествии этого времени наиболее значительные изменения видны в приповерхностном слое. После обработки БЗ и освещения лампой толщина этого слоя составила 20-60 мкм при комнатной температуре (25°C, рис. 5.10 б-г) и 80-90 мкм при физиологической температуре (37°C, рис. 5.11 б-г). После обработки ИЗ и освещения лазером при комнатной температуре (25°C) толщина этого слоя была 30—70 мкм (рис. 5.12 б-г), а при физиологической температуре (37°C) достигала 230 мкм (рис. 5.13 б-г). Из полученных ОКТ-изображений средний размер жировых клеток оценивается как 60—70 мкм.

Наблюдаемые изменения ОКТ изображений можно интерпретировать как результат липолиза и разрушения клеток, вызванные фотодинамическим воздействием. Конечными продуктами липолиза клеток являются глицерин и вода [273], которые вызывают оптическое просветление. Вместе с разрушением верхнего слоя клеток это облегчает проникновение света внутрь биоткани для взаимодействия со следующими слоями клеток. Оптическое просветление видно по увеличению отраженного сигнала от нижней границы между жировой тканью и стеклом (рис. 5.10 - 5.13) [261, 274]. Видно также, что при физиологической температуре фотодинамическое воздействие приводит к более быстрым и глубоким морфологическим изменениям жировой ткани, чем при комнатной.

В описанных здесь экспериментах впервые показано, что с помощью портативного серийного оптического когерентного томографа, разработанного для биомедицинских применений in vivo и обладающего умеренным пространственным разрешением, можно количественно оценивать последствия фотодинамического воздействия на образцы жировой ткани на клеточном уровне. В силу сравнительно большого размера жировых клеток, метод ОКТ пригоден для непосредственного контроля процессов липолиза и разрушения

клеток в результате не только фотодинамического эффекта, но и других воздействии, включая химические препараты [273] и ультразвук [275].

6 МОДЕЛЬНЫЕ РАСЧЕТЫ ПРОНИЦАЕМОСТИ ДЕНТИНА И ФОРМИРОВАНИЯ СИГНАЛА ОКТ В ПРОЦЕССЕ ОПТИЧЕСКОГО ПРОСВЕТЛЕНИЯ

В отличие от остальных экспериментальных разделов диссертации, данный раздел посвящен двум разным математическим моделям. Первая из них -стационарная, она связывает коэффициент проницаемости дентина с его тубулярной структурой. Вторая - нестационарная - описывает формирование сигнала ОКТ в рассеивающей среде в процессе оптического просветления, вызванного диффузией химического агента.

6.1. Модельный расчет проницаемости дентина для химических агентов

Имеются данные о связи тубулярной структуры дентина с различными патологиями как общего характера (остеопороз), так и касающимися непосредственно зуба (кариес, гиперчувствительность), например, в [278] отмечена связь между увеличенным диаметром тубул дентина и кариесом. В работе [279] приводятся данные о том, что при гиперчувствительности средний диаметр тубул дентина примерно вдвое больше, чем в здоровом зубе.

Пространственного разрешения ОКТ недостаточно для визуализации тубул, однако, как показано в предыдущих разделах, по скорости изменения наклона сигнала ОКТ можно неинвазивно определять коэффициент проницаемости образцов дентина. Очевидно, что проницаемость дентина по отношению к химическим агентам зависит как от диаметра тубул, так и от плотности их распределения. При наличии модели, связывающей тубулярное строение с дентина с его проницаемостью относительно различных химических агентов, проницаемость становится косвенным диагностическим признаком структурных изменений дентина, связанных с тем или иным типом патологии.

В нашей упрощенной модели [276, 277] были учтены основные особенности тубулярной структуры дентина, описанные в разделе 3.3.1. и хорошо видимые на электронной микрофотографии (рис. 3.6). Модель

представляет собой плоский слой, вырезанный перпендикулярно направлению тубул, с тремя различными коэффициентами диффузии: внутри тубул, вдоль перитубулярных структур (полых цилиндров из более плотного и менее проницаемого вещества, окружающего тубулы) и в интертубулярном пространстве (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Трехкомпонентная модель дентина.

Среднее расстояние Ь0 между тубулами связано с их числом N, приходящимся на единицу поверхности, выражением

ь0 = . (6.1)

Коэффициент проницаемости образца по отношению к химическому агенту может быть представлен как взвешенная сумма коэффициентов проницаемости р различных областей (тубул, перитубулярного и интертубулярного дентинов)

РВ ~ ^ЫЪриЪ ^ИиЪрЫЪ ^рЫЪРрЫЪ , (6.2)

где весовые коэффициенты пропорциональны площади поперечного сечения каждой из указанных выше областей, а в сумме равны единице. Такую модель описывает ряд очевидных соотношений:

1ыЪ + /ишЪ + 1рЫЪ ~ 1 , (6.3)

P. = ^L j h

D,

(6.4)

D

7Vd2tub

ftub = 4^ Ntub , (65)

%{duutub — dtub ) лг tr r\

Jptub = -4S-Ntub , (6.6)

fitub = 1 — (ftub ^ fptub ) , (6.7)

где индекс j принимает значения tub, itub, и ptub, Dj - коэффициенты диффузии в различных компонентах дентина; hD - толщина дентинного слоя, вырезанного перпендикулярно направлению тубул; dtub - среднее значение диаметра тубул; dptub - среднее значение внешнего диаметра перитубулярной области, представляющей собой полый цилиндр с внутренним диаметром dtub, Ntub - число тубул в пределах площади поверхности образца дентина S, то есть Ntub/S - среднее значение плотности числа тубул.

Проницаемость всего зуба можно определить, используя описанную выше трехкомпонентную модель для дентина и границы раздела «дентин -эмаль», а также одно- или двухкомпонентную (с учетом призматической структуры эмали) модель диффузии через эмаль. В этом случае полный

коэффициент проницаемости PT системы «дентин+пограничный слой+эмаль» будет определяется как

1111

P = P + PD~ V , (6.8)

-1 T 1 D DE 1 E

где PD, PDE и PE - коэффициенты проницаемости дентина, пограничного слоя и эмали, соответственно; PD определяется непосредственно из соотношения (6.2), PDE и PE из аналогичных соотношений с соответствующими структурными элементами и значениями параметров.

В прямой постановке задачи с помощью данной модели можно рассчитать распределение проницаемости по поверхности зуба, учитывая вариации диаметров тубул и плотности их числа. Последние могут быть взяты из данных электронной микроскопии, а коэффициенты диффузии трех различных типов дентина - из независимых измерений in vitro. Искомой величиной является коэффициент проницаемости.

Если же общий коэффициент проницаемости получен экспериментально, например, с помощью ОКТ, то можно поставить две обратные задачи.

1. Коэффициент проницаемости измерен достаточное количество раз на разных образцах, тубулярная структура которых известна из микроскопии. Требуется определить коэффициенты диффузии трех типов дентина.

2. Коэффициент проницаемости измерен достаточное количество раз на одном образце, коэффициенты диффузии трех типов дентина известны, требуется определить структурные параметры дентина.

В качестве примера решения прямой задачи была рассчитана проницаемость модели дентина по отношению к воде и перекиси водорода. Вода играет основную роль в естественном обмене веществ в зубной ткани,

ОКТ мониторинг проникновения воды в образцы дентина описан в предыдущих разделах диссертации. Перекись водорода - распространенный отбеливатель. По техническим причинам для нее нам не удалось провести ОКТ измерений, расчет носит прогнозирующий характер. Использовались следующие значения параметров:ОииЬ = 3,6х10-7 см2/с, выъ = 3,6х10-6 см2/с, Брыъ = 3,6х10"8 см2/с для перекиси водорода; Вгыъ = 1,74х10-6 см2/с [280]; Выъ = 1,74х10"5 см2/с; в ршЬ 1,74х10"7 см2/с для воды. Толщина слоя полагалась равной 1 мм. Диаметр тубул варьировался от 0,5 до 4 мкм, а плотность числа тубул - от 10000 до 90000 мм-2. Как видно из приведенных данных, наиболее важную роль в формировании полного коэффициента проницаемости играет толщина перитубулярного слоя. На рис. 3.6 толщина перитубулярного слоя приблизительно равна диаметру тубулы. Однако, в литературе имеются свидетельства вариабельности этой толщины, например, при воздействии кислот [281, 282]. В наших расчетах мы рассматривали два случая. В первом из них мы предполагали, что толщина слоя перитубулярного дентина постоянна и равна наименьшему диаметру тубулы. Для этого случая на рисунках 6.2 (а) и (б) показана рассчитанная зависимость проницаемости дентина от диаметра тубул и плотности их числа для перекиси водорода и воды, соответственно. В допустимых пределах изменения диаметра и числа тубул значение проницаемости меняется почти на порядок величины, причем, естественно, зависимость от диаметра квадратичная, а от числа тубул линейная. Во втором случае мы предположили, что отношение толщины перитубулярного слоя к диаметру тубулы является постоянной величиной, то есть геометрия тубулы меняется подобным образом. В этом случае изменения проницаемости малы и поэтому здесь не показаны. Очевидно, что в этом случае увеличение проницаемости за счет сечения тубул компенсируется уменьшением проницаемости за счет пропорционального увеличения толщины стенок, для вещества которых коэффициент диффузии наименьший. Наши экспериментальные оценки коэффициента проницаемости Р для воды

(таблица 4.1) попадают в интервал рассчитанных значений этой величины (рис. 6.2 (а)). Проведенные расчеты подтверждают естественное предположение о том, что значительный разброс (на порядок величины) экспериментальных значений Р для разных образцов (таблица 4.1) связан с различиями в тубулярной структуре, так как образцы вырезались из разных частей зубов, удаленных у разных пациентов.

Таким образом, измеряя полную проницаемость слоя дентина и сравнивая результат с теоретическими оценками, можно судить об отношении толщины стенок тубулы к ее диаметру.

а б

Рис. 6.2 Проницаемость слоя дентина в зависимости от диаметра тубул и плотности их числа (а) - для перекиси водорода, (б) - для воды

Дальнейшее использование модели может быть связано с решением обратных задач на основе экспериментально измеренной проницаемости дентина в целом. Например, пусть из данных микроскопии известна тубулярная структура (диаметры и плотность числа тубул, толщина перитубулярной стенки) для трех образцов. Тогда из (6.2) и (6.4) получаем три уравнения для определения трех коэффициентов диффузии различных типов дентина

3 П

р»=т./?)П • '=1-2'3

7=1 ПП

Здесь /=1,2,3 нумерует образцы с различной тубулярной структурой,

Л')

учитываемой весовыми коэффициентами /7 , а 7=1,2,3 - номер образца. Для уточнения процедуры можно взять большее, чем 3, число образцов, а параметры П7 находить по методу наименьших квадратов.

Альтернативная постановка обратной задачи предполагает знание коэффициентов диффузии различных типов дентина. Тогда

экспериментальное определение проницаемости РП для данного участка исследуемого зуба даст линию равной высоты на рисунке типа 6.2 (а) и (б). Можно воспользоваться тем, что, как известно из литературы [170], плотность числа тубул не сильно зависит от состояния зуба, а определяется в основном выбором его участка. Зная, на каком участке произведено зондирование, можно оценить плотность числа тубул, тогда их средний диаметр можно найти из градуировочных графиков типа 6.2 (а) и (б). Для практической реализации такого подхода, конечно, потребуется выяснение наличия и характера связи между диаметром тубул и толщиной перитубулярной стенки, без которого число неизвестных становится равным трем, и для определения диаметра тубул требуется дополнительная информация.

6.2 Численное моделирование нестационарного сигнала ОКТ, формирующегося в процессе оптического просветления рассеивающей среды

Формирование сигнала ОКТ в условиях проникновения просветляющего агента в рассеивающую биоткань включает ряд механизмов, которые сложно отделить друг от друга в натурном эксперименте. Так, например, в разделе 5.1 отмечалось, что в слоистой среде локальный наклон сигнала ОКТ может быть связан как с ослаблением при прохождении однородного слоя, так и с плавным уменьшением сечения рассеяния назад, если слой неоднородный. В разделе

4.3.1) отмечалось, при оптическом просветлении рассеивающей среды иммерсионным агентом наряду с коэффициентом ослабления /л( может уменьшаться и сечение рассеяния назад аь, то есть условия распространения сигнала улучшаются, но сам формируемый сигнал что сказывается на форме А-скана. Для более полного анализа механизмов формирования сигнала ОКТ нами была построена модель [283] на основе численного решения уравнения диффузии с последующим расчетом формы А-скана по найденному распределению концентрации диффундирующего агента.

Рассмотрим плоский слой рассеивающей среды, на обеих поверхностях которого концентрация диффундирующего агента поддерживается постоянной. Это соответствует образцу, погруженному в раствор, постоянство концентрации которого поддерживается перемешиванием. Модель применима к плоской пластине конечных размеров, если толщина пластины много меньше ее длины и ширины.

Запишем уравнение диффузии (3.3) в одномерном случае дС (г, г) а2 С (г, г)

—^ = , (6.9)

дг дг

где С (г, г) - концентрация химического агента, зависящая от поперечной по отношению к пластине координаты х и времени г, Б(гж, г) - коэффициент диффузии, заданный как функция координаты и времени. Для однородного слоя уравнение диффузии имеет известное решение (3.4). Предлагаемая программа численного решения не требует однородности или стационарности диффузионных свойств среды. Граничные и начальные условия имеют вид:

( )_/ 0, 0 < г <

С (2,0 )_[С0, г _ 0, г _ /; (6.10)

С ( 0, г)_ С (/, г)_ С0

где / - толщина образца, С0 - постоянная концентрация агента, поддерживаемая на границах образца.

Численное решение задачи (6.9), (6.10), производилось с помощью пакета МаШетайса. Программа численного решения дифференциальных

уравнений, входящая в состав этого пакета, требует непрерывности решения во все моменты времени, включая начальный, поэтому разрывная функция в (6.10) заменялась на непрерывную, но быстро спадающую от границ вглубь образца.

С(2,0) = С0 |>аг + еа -г)] (6.11)

Эмпирически было установлено, что оптимальным является а ~ 102 при 1 ~ 1, а дальнейшее увеличение приводит появлению артефактов (ложных осцилляций).

Для расчета изменения рассеивающих свойств биоткани в результате диффузии мы использовали широко распространенную модель [149, 284], в которой рассеивающими элементами являются тонкие длинные прозрачные диэлектрические цилиндры, описываемые теорией рассеяния Ми в приближении Ганса-Рэлея. В рамках этой модели коэффициент рассеяния зависит от отношения т = пс / п1 показателей преломления рассеивающих

частиц пс и окружающей среды п1 как

(

ц, = Ко, = N^0 (т2 -1)2

1 + 2

(6.12)

(т2 +1)

где о, - сечение рассеяния, К - плотность числа рассеивающих частиц, коэффициент о0° определяется длиной волны света и размерами частиц [285, 286]. Из (6.12) видно, что при полном выравнивании показателей преломления т = 1 и коэффициент рассеяния обращается в нуль. Воспользуемся формулой (3.12) раздела 3.2, чтобы связать коэффициент рассеяния с концентрацией диффундирующего агента, определяемой путем численного решения уравнения диффузии,

щ ( 1) = (1 - С ( 1)) пьше + С (1) , (6.13)

где пЪа,е, по,т - показатели преломления основного вещества и диффундирующего агента, соответственно. Модель формирования сигнала ОКТ в среде с известным распределением коэффициента рассеяния сформулирована выше в

разделе 4.2 (формулы (4.1) - (4.7)). Таким образом, реализованный нами алгоритм включает следующие шаги:

• численное решение уравнения диффузии (6.9) с граничными и начальными условиями (6.10), аппроксимированными с помощью функции (6.11);

• вычисление п1 по формуле (6.13) и ^ по формуле (6.12);

• вычисление сигнала ОКТ по формулам (4.1) - (4.7) раздела 4.2.

Рассмотрим вначале модель среды, в которой эффективное сечение отражения назад оь не зависит от концентрации иммерсионного агента. На

рисунке 6.3 приведены примеры тестового расчета с помощью разработанного алгоритма для модельной среды с показателем преломления рассеивающих частиц 1.6, базового вещества 1.3 и иммерсионного агента 1.5. Для простоты рассмотрен случай пренебрежимо малой зависимости радиуса предметного пучка от глубины зондирования ! ^ -1. Такое приближение справедливо, когда глубина зондирования много меньше фокусного расстояния оптической системы, направляющей предметный пучков в образец. Заметим при этом, что предложенный алгоритм позволяет проводить моделирование для различных конструкций томографов, в которых указанные параметры меняются в широких пределах. По вертикальной оси отложена величина (г2} при {г_ 1 (см. формулу (4.1)). В формуле (6.12) полагали _ 1. На рисунке видно, что по мере диффузии иммерсионного

агента за счет оптического просветления уменьшается наклон сигнала ОКТ и увеличивается глубина проникновения зондирующего излучения в образец. Этот вывод качественно согласуется с экспериментальными результатами раздела 4. Случай, показанный на рис. 6.3(а), соответствует началу процесса диффузии вблизи зондируемой границы, когда диффузия агента с противоположной стороны образца практически не влияет на сигнал ОКТ. На рис. 6.3(б) то же самое показано при насыщении более тонкого образца

с обеих сторон. Эффект увеличения глубины проникновения и уменьшения наклона А-скана выражен значительно сильнее.

Рис. 6.3. Изменение со временем формы сигнала ОКТ в процессе диффузии иммерсионного агента. Эффективное сечение рассеяния назад не зависит от концентрации иммерсионного агента. (а) - начало процесса диффузии в толстый образец, l = 5 ; (б) - то же самое при полном насыщении более тонкого образца с l = 1 за более длительное время. Все величины приведены в относительных единицах.

Теперь поставим задачу выяснить, как сказывается на форме сигнала ОКТ возможное влияние просветляющего агента на сечение рассеяния назад аь, входящее в (4.2) и являющееся источником сигнала ОКТ. Как правило (см., например, [149, 284]) считается, что при просветлении уменьшается только коэффициент ослабления ¡¡t. Это приближение использовано нами в обработке экспериментов, описанных в разделе 4. Такой подход оправдан, когда с помощью ОКТ производится визуализация диффузно отражающей структурной неоднородности, которая обнаруживается сквозь слой ослабляющей свет

среды. Диффузия агента просветляет этот слой, но пренебрежимо мало влияет на объект визуализации. Если же сам объект в основном состоит из непогло-щающих рассеивателей в прозрачном окружении, то по крайней мере часть сигнала ОКТ порождается той же причиной, что и его ослабление - рассеянием, которое обусловлено перепадом показателя преломления между прозрачной средой и рассеивателями, поэтому интересно промоделировать просветление оЬ вместе с о, . Для образцов твердых биотканей со сложным составом и структурой, например, для образцов дентина зуба человека, разумно допустить, что часть отраженного назад излучения порождается структурными элементами, не подверженными просветлению. Это приводит к феноменологической формуле

°ь (С(г,г)) _ о"ь0 + ко, (С(г,г)). (6.14)

Здесь к - постоянная, а оЬ0 - часть сечения диффузного отражения, связанная с другими механизмами и не зависящая от концентрации агента.

На рис. 6.4 показана эволюция формы сигнала ОКТ в процессе диффузии при тех же параметрах, что и на рис. 6.3а, но в предположении, что сечение обратного рассеяния частично испытывает влияние оптического просветления оЬ0 _ 1, к _ 0,25. Видно, что в этом случае в начальной части А-скана появляется максимум, который в дальнейшем сглаживается. По мере того, как агент диффундирует вглубь среды, максимум исчезает, наклон сигнала ОКТ уменьшается, а глубина проникновения растет, что типично для упрощенной модели, использованной в разделе 4 для обработки экспериментальных данных. На врезке к рис. 6.4 воспроизведен рисунок из нашей экспериментальной работы [253], на котором просматривается небольшой максимум на А-скане вблизи входа в образец. Немонотонное поведение А-сканов наблюдалось нами и в некоторых других случаях, однако, для определения наклона сигнала ОКТ и его временной зависимости брались монотонно спадающие части А-сканов. Результаты проведенного здесь моделирования качественно описывают лишь

один из возможных механизмов появления немонотонности А-сканов, не связанный с макроскопической неоднородностью исходного образца.

Рис. 6.4. Форма А-скана при тех же параметрах, что и на рис. 4а, но с учетом соотношения (6.14) приаю = 1, к = 0,25. Справа в рамке форма экспериментального А-скана из [253].

В заключение данного раздела сделаем ряд замечаний. Во-первых, полученные результаты следует рассматривать как качественные. Для того, чтобы предпринять попытку их количественного сопоставления с экспериментом требуется значительное число неизвестных параметров. Во-вторых, нужно отметить, что реальный процесс проникновения химических агентов в пористую твердую биоткань (дентин, эмаль зуба) достаточно сложен и может представлять собой сочетание диффузии, просачивания и капиллярного смачивания. Дентин имеет тубулярную структуру, в нормальном состоянии зуба in vivo ту-булы заполнены жидкостью - зубным ликвором [170]. В наших экспериментах in vitro [252 - 254] вырезанные пластинки зубного дентина хранились в физиологическом растворе, перед проведением измерений высушивались, после чего помещались в кювету с раствором и периодически подвергались ОКТ-сканированию. При помещении образцов дентина в растворы таких химических агентов, как глюкоза и глицерин, наблюдались длительные (несколько часов) процессы изменения рассеивающих свойств ткани, отражающиеся на

форме сигнала ОКТ и интерпретированные как проявления диффузии указанных агентов, приводящей к оптическому просветлению образца. В этих случаях предложенная в данном разделе модель может быть применима, когда смачивание образца дентина водой, имитирующей зубной ликвор, уже произошло, после чего в воде, заполнившей тубулы и их боковые ответвления, медленно происходит диффузия химического агента с достаточно большим молекулярным весом (глюкоза, глицерин). Наконец, отметим, что разработанный алгоритм применим к более сложным задачам, когда среда макроскопически неоднородна и нестационарна как по отношению к диффузии (коэффициент диффузии зависит от координаты и времени), так и по своим оптическим свойствам (заданными функциями координаты и времени являются сечение рассеяния назад, плотность числа рассеивающих частиц и показатели преломления компонентов среды, в которой происходит диффузия). Решение таких задач, как и количественное сравнение результатов с экспериментами на фантомах и биотканях, является предметом будущих исследований.

7 ОПТИЧЕСКИЙ МОНТОРИНГ ПРОНИКНОВЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ В ОБРАЗЦЫ ЗУБНОЙ ТКАНИ IN VITRO

Проникновение наночастиц в эмаль и дентин зуба представляет значительный интерес в связи с решением проблем чувствительности зуба, укрепления эмали, дезинфекции, восстановления, а также косметического отбеливания. Проблемам и перспективам применения наночастиц и нанотехнологий в медицине и, в частности, в стоматологии посвящено несколько обзорных статей [287 - 289]. Потенциальные применения нанотехнологий в медицине очень широки [289]. Это визуализация и диагностика, целевая доставка лекарственных препаратов, терапия и инженерия тканей. Наиболее разработанным и уже широко используемым направлением использования наночастиц в стоматологии на сегодняшний день является их добавление в составы, применяемые для восстановления поврежденной зубной ткани [289]. Другие направления находятся еще в стадии экспериментального исследования. Одна из актуальных задач стоматологии - снижение гиперчувствительности зубов, механизм которой связан с тубулярной структурой дентина [290]. Чувствительные зубы имеют большее число открытых тубул увеличенного диаметра, для закрытия которых использовались наночастицы золота с последующим лазерным воздействием [291]. В перспективе ожидается создание нано-роботов на базе природных биоматериалов, которые могли бы избирательно и точно осуществлять окклюзию специфических тубул, обеспечивая больному быстрое и постоянное лечение [291, 292].

Наночастицы можно использовать для управления формированием биопленок в полости рта. Биоцидные, антиадгезивные и транспортные свойства позволяют использовать их в составе покрытий при протезировании, для местного применения, а также в составе стоматологических материалов [293].

Бактерии являются причиной большинства эндодонтических инфекций. Их присутствие в тубулах дентина связано с постоянной инфекцией корневого канала [294]. Исследования показали возможность проникновения бактерий в

тубулы на глубину до 150 мкм [295]. Внедрение антибактериальных наноча-стиц в тубулы может использоваться как способ их доставки для улучшения дезинфекции корневого канала. Авторы [296] показали, что эффективность такого внедрения можно повысить с помощью высокоинтенсивного ультразвукового воздействия, приводящего к коллапсу кавитационных пузырьков. На поверхности зуба бактерии образуют биопленки, стратегия борьбы с которыми включает создание антиадгезивных поверхностей, включение антимикробных агентов в полимеры медицинских устройств и доставку антибиотиков [297]. В этой связи наночастицы оксида цинка (ZnO) прошли тестирование in vitro на специальных культурах биопленок и продемонстрировали способность существенно замедлять рост биопленки S. sobrinus в течение трехдневного периода [293]. Kishen и др. [298] продемонстрировали снижение числа E. faecalis , прилипших к поверхности дентина на поверхности корневого канала после обработки катионными антибактериальными наночастицами, такими как ZnO в чистом виде или в комбинации с хитозаном. Есть основания полагать, что такая обработка поверхности способна предотвращать формирование бактериальных биопленок in vivo.

Наночастицы диоксида титана (TiO2) обладают фотохимической активностью и могут служить ингибиторами бактерий [299]. Их фототоксичность может быть модифицирована с помощью примесей или покрытия, и в таком виде они широко применяются в потребительских товарах (краски, солнцезащитные кремы, зубные пасты) для отбеливания или защиты от ультрафиолетового излучения [300, 301]. Показано, что бактерицидная эффективность на-ночастиц ZnO и фотохимическая активность наночастиц TiO2 усиливаются с уменьшением размера частиц [302, 303]. С целью отбеливания дентина в работе [304] использовался раствор 3.5% перекиси водорода с взвесью наночастиц диоксида титана. Отбеливающий агент применялся на срезах дентина с последующим воздействием 405 нм диодным лазером или галогеновой лампой. С помощью спектрофотометрических измерений был продемонстрирован

значительный эффект отбеливания в результате указанного комбинированного воздействия. Наконец, в работе [305] исследовалось восстановление эмали зуба с помощью наночастиц гидроксиапатита и было обнаружено принципиальное значение их размера. Частицы с размером 20-40 нм, типичным для собственных структурных элементов эмали, обеспечивали создание прочного покрытия на ее поверхности, устойчивого к кислотным агентам, в то время как частицы большего размера таким эффектом не обладали.

В данном разделе излагаются результаты наших работ по изучению проникновения наночастиц в образцы эмали и дентина с помощью ОКТ и нелинейной оптической микроскопии.

7.1 Изменения формы ОКТ сигнала после ультразвукового воздействия на образцы дентина, погруженные во взвесь наночастиц Во всех указанных выше задачах в большей или меньшей степени возникает необходимость неразрушающего мониторинга проникновения наночастиц вглубь ткани зуба. Одним из перспективных средств такого мониторинга является ОКТ. В разделе 4 нами продемонстрирована эффективность метода ОКТ при мониторинге проникновения химических агентов в образцы дентина зуба человека. В настоящем разделе описана впервые предпринятая нами попытка распространения указанной методики на исследование проникновения наночастиц диоксида титана в эмаль и дентин образцов зуба человека in vitro [109, 306].

Исследовались образцы дентина и эмали зуба человека, подготовленные по технологии, описанной выше в разделе 4.1. Для обработки образцов использовалась суспензия наночастиц двуокиси титана TiO2 (размер частиц <100нм, Aldrich, USA) в Poly(Sodium4-Styrene-Sulfonate) с концентрацией наночастиц 10 мг/мл.

В начале эксперимента проводилось контрольное ОКТ-сканирование образцов, еще не обработанных наночастицами. Суспензия наночастиц TiO2 предварительно помещалась в УЗ ванну на 15 минут. Ультразвук с частотой 43-45 кГц предназначался для предотвращения седиментации наночастиц.

Затем образцы погружались в кювету с суспензией наночастиц ТЮ2, а кювета помещалась в УЗ ванну на 15 минут для стимуляции проникновения наночастиц в толщу зубной ткани. Затем поверхность образца промывалась водой и просушивалась в воздушном потоке в течение 30 минут для удаления остатков взвеси с поверхности образца. После этого производилось его ОКТ-сканирование. Подобная процедура повторялась несколько раз, после чего образцы снова помещались в кювету с суспензией ТЮ2 и оставлялись в ней до следующего дня. Полная продолжительность эксперимента с одним образцом составляла 10 дней.

(б)

Рис. 7.1. ОКТ-изображение среза зуба человека до обработки (а) и после обработки наночастицами ТЮ2 в течение 5 суток (б).

На рис. 7.1(а) показано ОКТ-изображение среза зуба человека до обработки частицами диоксида титана, а на рис. 7.1(б) - после обработки. Левая часть образца - эмаль (светлая горизонтальная полоса - структурный дефект, возможно, трещина), правая - дентин. На первый взгляд изображения одинаковы, однако при очень внимательном сравнении можно заметить некоторое увеличение яркости изображения на глубине порядка сотен

микрометров после длительной обработки взвесью наночастиц диоксида титана.

(а) (б)

Рис. 7.2. Усредненные А-сканы, полученные в различные моменты времени в процессе обработки дентина (а) и эмали (б) взвесью наночастиц ТЮ2

Для более четкого выявления отмеченных изменений были построены усредненные А-сканы, полученные в различные моменты времени в процессе обработки образца наночастицами диоксида титана (рис. 7.2). Видно, что с течением времени вид А-скана постепенно меняется, причем наибольшее увеличение сигнала ОКТ (до 5 дБ) наблюдается непосредственно вблизи поверхности и на глубинах 300-600 мкм от поверхности образца. Пики на А-сканах соответствуют светлым полосам на ОКТ изображениях рис. 7.1 и отображают структурные особенности (дефекты) образца, по мере обработки взвесью наночастиц они меняются вместе со всем А-сканом. Изменения, происходящие в образцах, можно связать с проникновением наночастиц диоксида титана в эмаль и дентин среза зуба человека. Однако, на основании полученных результатов о глубине проникновения наночастиц судить сложно, так как наночастицы, внедренные в приповерхностные слои, могут значительно увеличить кратность рассеяния фотонов и, соответственно, время их задержки. В терминах однократного рассеяния это выглядит как проникновение наночастиц на большую глубину. Проникновение в образец

агента, в котором взвешены наночастицы, также может влиять на вид ОКТ-изображения (см. раздел 4).

Таким образом, результаты ОКТ-сканирования и обработки полученных изображений показали, что в результате многодневной обработки образца зубной ткани суспензией наночастиц двуокиси титана наблюдается достигающее 5 дБ увеличение сигнала ОКТ вблизи поверхности образцов и с глубин 300-600 мкм, которое можно связать с проникновением наночастиц в образец. Однако, количественная интерпретация этих результатов затруднительна, что является стимулом для использования методов оптической томографии высокого пространственного разрешения, позволяющих визуализировать наночастицы непосредственно.

7.2Нелинейная микроскопия проникновения наночастиц Поскольку разрешающая способность ОКТ недостаточна для непосредственной визуализации отдельных наночастиц, возникает потребность в оптическом мониторинге их проникновения с помощью методов многофотонной микроскопии (см. раздел 2.2), сочетающей большее, чем у ОКТ, разрешение с возможностью получения послойных томографических изображений на разной глубине.

В настоящем разделе представлены результаты наших экспериментов [307, 308], показывающих, что нелинейная оптическая микроскопия на основе флуоресценции с двухфотонным возбуждением, генерации второй гармоники и гиперрэлеевского рассеяния может быть использована для мониторинга проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы тканей зуба. Эксперименты проводились в Центре экспериментальной и прикладной кожной физиологии Медицинского университета «Шарите», Берлин, Германия под руководством профессора Ю. Ладеманна. Для измерений использовался двухфотонный томограф (JenLab GmbH, Германия) с компактным перестраиваемым титан-сапфировым фемтосекундным лазером ближнего ИК диапазона (Mai Tai XF, Spectra Physics, США), модулем сканирования пучка с гальваносканерами и пьезоприводной оптикой, приемным модулем с быстродействующим

фотоумножителем (ФЭУ), а также управляющим блоком, включающим программный пакет JenLab и служащим для построения изображений. Лазер имел длительность импульса 100 фс, частоту следования импульсов 80 МГц, максимальную выходную мощность вблизи образца 50 мВт, диапазон доступных длин волн 710-920 нм. Высокая числовая апертура (NA=1,3) объектива с пьезоприводом (Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/1.3 oil) обеспечивала высокое пространственное разрешение, достигающее 0,5 мкм в латеральном и 2 мкм в аксиальном направлении [309]. Типичный размер поля сканирования 200 мкм х 200 мкм, время сканирования составляло 13,4 с.

Нелинейная оптическая микроскопия дает возможность визуализировать биоткани через посредство множества флуоресцирующих биомолекул, таких как NAD(P)H, флавины, порфирины, эластин и меланин [310]. Коллаген внеклеточного матрикса можно идентифицировать по генерации второй гармоники (ГВГ). Наночастицы ZnO генерируют когерентное (ГВГ) и некогерентное (ги-перрэлеевское рассеяние (ГРР)) излучение на удвоенной частоте возбуждающего света [311] в дополнение к флуоресценции, возбуждаемой двухфотон-ным поглощением (ФВДП), в то время как наночастицы TiO2 генерируют только ФВДП. Сигналы ФВДП и ГВГ/ГРР одновременно регистрировались в двух каналах быстродействующими ФЭУ приемниками с чувствительностью на уровне единичных фотонов, в режиме, при котором регистрируемое излучение ФВДП/ГВГ/ГРР не проходило через сканирующую оптику. Сигналы ФВДП и ГВГ/ГРР отделялись друг от друга посредством оптических фильтров, расположенных перед ФЭУ приемниками. Для измерения сигнала ФВДП использовался широкополосный фильтр (400-700 нм), а для детектирования сигнала ГВГ/ГРР - узкополосный фильтр на 380±5 нм. Применяемая методика нелинейной оптической микроскопии была ранее подробно описана в работе [312].

Образцы тканей зуба и наночастицы. Процедура приготовления образцов тканей зуба была аналогична описанной в разделе 4.1. В зависимости

от расстояния от оси зуба, пластинки образовывали различные углы с направлением тубул дентина. На основании результатов микроскопии было получено распределение по размерам для тубул, расположенных почти перпендикулярно к поверхности среза (рис. 7.3).

16 14

-чр

О4-

£ 12

ю ■

о 10

с;

и

3 л

=г 8 6 4 2 0

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Диаметр тубул, мкм

Рис. 7.3. Распределение тубул по размерам в исследованных образцах дентина

Исходными были беспримесные наночастицы ТЮ2 (анатаз) и 7п0 (Sigma-АМпЛ, Германия). Модифицированные анатазные наночастицы ТЮ2 получались из исходных путем отжига либо в 2% КН3 в атмосфере N при 600 °С в течение 4 часов (ТЮ2/КН3), либо в атмосфере чистого N при 600 °С в течение 4 часов (ТЮ2/К2). Легированные азотом наночастицы представляют интерес для изучения фототоксичности [313]. В результате обработки изображений (рис. 7.4), полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), было построено распределение наночастиц по размерам (рис. 7.5). Как видно из гистограмм, размеры исходных частиц в порошке для ТЮ2 намного меньше, чем для 7п0 (30 нм и 310 нм, соответственно). Однако, в суспензии (см. ниже) частицы образуют агрегаты и агломераты, размеры и устойчивость которых к внешним воздействиям фактически определяют проникающую способность частиц. Поэтому делать выводы о скорости и глубине проникновения

частиц в образцы на основании приведенных данных преждевременно, что подтверждают описанные ниже эксперименты.

(а) (б)

Рис. 7.4. Наночастицы TiO2, легированные азотом (а), и беспримесные нано-частицы ZnO (б). Сканирующий электронный микроскоп Zeiss Sigma, Германия (а) и JCM-5000, JEOL, Япония (б)

ТЮ2 диаметр, нм znO диаметр, мкм

Рис. 7.5. Распределение по размерам для исходных наночастиц TiO2 (а) и ZnO (б), построенное по данным электронной сканирующей микроскопии.

Перед нанесением наночастиц была выполнена нелинейная оптическая микроскопия интактных образцов. Оптимальная для этого длина волны оказалась равной 760 нм [311].

Для обработки образцов ткани зуба использовались суспензии наночастиц ТО2 и ZnO, для приготовления которых 24 мг наночастиц смешивались с 1 мл 0.8% 3-карбокси-2,2,5,5-тетраметилпирролидин -1-оксила (Sigma-Aldrich, Германия). Затем образцы помещались в кюветы с суспензией наночастиц. В течение 15 минут образцы, погруженные в суспензию наночастиц,

обрабатывались в ультразвуковой ванне Bandelin SONOREX SUPER RK 102 H, 35 кГц, 240 Вт с целью разрушения агрегатов и стимуляции проникновения частиц. Несмотря на частичное разрушение агрегатов, реальный средний размер частиц в суспензии мог быть больше, чем обнаруженный с помощью СЭМ в порошке. Тубулы дентина в суспензии располагались горизонтально. После УЗ обработки образцы споласкивались водой и записывались сканы нелинейной оптической микроскопии. После окончания записи образы снова помещались в кювету с суспензией наночастиц и обрабатывались ультразвуком в течение 15 минут. Такая процедура повторялась 3 раза.

Результаты и их обсуждение. Проникновение частиц в образцы регистрировалось путем получения послойных изображений на различной глубине. На рис. 7.6 показаны изображения, полученные с помощью флуоресценции, возбуждаемой двухфотонным поглощением и генерации второй гармоники для дентина после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии TiO2 на глубине z = 0 мкм (а, б) и z = 5 мкм (в, г). В отличие от ОКТ-изображений, хорошо видна тубулярная структура дентина, видно даже расположение разных типов дентина: перитубулярный дентин окружает тубулы, образуя кольца (рис. 7.6 (а, в)), а интертубулярный дентин заполняет значительное более обширное пространство между тубулами.

(а) (б) (в) (г)

Рис. 7.6. Изображения дентина, полученные с помощью ФВДП (а, в) и ГВГ/ГРР (б, д) после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии ТЮ2 на глубине z = 0 мкм (а, б) и z = 5 мкм (в, г). Яркие белые пятна - наночастицы ТЮ2.

Коллаген, заполняющий тубулы дентина (интертубулярный дентин) дает сильный сигнал ГВГ, о чем ранее сообщалось в [314]. Более плотный, однородный и минерализованный перитубулярный дентин производит и ГВГ, и ФДФВ-сигналы, причем последний обусловлен входящими в состав дентина протеинами [315]. Светлые пятна - агрегаты наночастиц, проникших в структуру дентина.

На рис. 7.7 показаны ГВГ/ГРР-изображения дентина зуба на различных глубинах после 30-минутной обработки ультразвуком в суспензии ZnO. На ФВДП-изображениях дентина после такой обработки не было обнаружено признаков проникновения наночастиц ZnO. Приведенные на рис. 7.6. и 7.7 изображения показывают, что максимальная наблюдаемая глубина проникновения составляет 45 мкм для наночастиц ZnO и 5 мкм для ТЮ2. Такую разницу можно объяснить различием размера агрегатов, который у ZnO значительно меньше, а также возможным различием чувствительности обнаружения для различных наночастиц. Хотя для уменьшения агломерации наночастиц и усиления их проникновения в структуру образца зубной ткани и проводилась ультразвуковая обработка, полностью исключить агломерацию наночастиц невозможно, а ведь именно форма, размеры и способность к агрегации частиц играют решающую роль в их проникновении в образец.

(а) (б) (в) (г)

Рис. 7.7. ГВГ/ГРР-изображения дентина после 30 минут ультразвуковой обработки в суспензии наночастиц ZnO, z = 0 мкм (а), z = 5 мкм (б), z = 10 мкм (в), z = 45 мкм (г). Белые пятна - изображения наночастиц ZnO. Более слабый, чем при ФВДП, сигнал от самого дентина, вообще говоря, тоже присут-

ствующий на изображениях, был специально исключен путем снижения интенсивности лазерного излучения, что позволило повысить контраст изображения наночастиц.

На рис. 7.8 показаны ГВГ/ГРР-изображения зубной эмали до и после 45-минутной обработки ультразвуком в суспензии наночастиц ZnO на различной глубине. Эмаль производит сильный сигнал ФВДП (не показанный на рисунке), ясно выявляющий структуру эмалевых призм, и не дает сигнала ГВГ/ГРР. В отличие от ТЮ2, наночастицы ZnO создают сильный сигнал ГВГ/ГРР [311], так как они обладают необходимой для этого значительной оптической нелинейностью второго порядка. Компонента амплитуды электрического поля второй гармоники Е2со связана с компонентами амплитуды электрического поля первой гармоники Е® соотношением

Е? ~ Е dl¡kEJE:.

] ,к

По симметрии для наночастиц ZnO отличны от нуля коэффициенты dззз и dз11 [311, 314]. Для наностержней ZnO с отношением толщины к длине от 5,7 до 10,8 оценка этих коэффициентов [316] дала от -7,8 до -18,0 пм/В для d333 и от 0,14 до 2,88 пм/В для d311. Что касается наночастиц ТЮ2, то они обнаруживаются только по сигналу ФВДП, так что ZnO можно считать более подходящим материалом для нелинейной микроскопии.

Рис. 7.8. ГВГ/ГРР-изображения эмали до (а) и после (б-г ) 45-минутной ультразвуковой обработки в суспензии наночастиц ZnO: z = 0 мкм (б), z = 2 мкм (в), z = 12 мкм (г). Белые пятна - сигнал от наночастиц ZnO.

На рис. 7.7 и 7.8 также видны преобладающие направления структур, формирующих исследуемую зубную ткань: тубулы дентина направлены от нижнего левого угла к правому верхнему (рис. 7.7), а призмы эмали вытянуты от правого нижнего угла к левому верхнему (рис. 7.8.).

Смещение положения наночастиц в горизонтальной плоскости (перпендикулярно направлению Z-сканирования) от одного изображения к другому мы считаем артефактом, причина которого - либо неодинаковое расположение образца по отношению к фокальной плоскости падающего света, либо шероховатость поверхности образца (перепад высоты). Измерения профиля поверхности образцов дентина и эмали с помощью оптического профилометра Contour GT-K0 (Bruker, США), выполненные для выяснения этого вопроса (рис.7.9), выявили изменения высоты поверхности в пределах нескольких мкм, что сравнимо с шагом сканирования по глубине (1, 2 или 5 мкм в зависимости от ситуации).

Рис. 7.9. Изображения поверхности одного из образцов дентина (а) и эмали (б), полученные с помощью оптической про-филометрии.

Рассматривая сложный процесс проникновения наночастиц в пористую ткань зуба по аналогии с диффузией, можно грубо оценить нижнюю границу соотвествующего «коэффициента диффузии» D по глубине d и времени т проникновения как D = ё2/т. Для наночастиц 7п0 глубина проникновения в дентин составила 45 мкм после 30 минут ультразвуковой обработки, тогда как для эмали глубина 10 мкм была достигнута после 15 минут обработки (соответствующие изображения не показаны). Отсюда получаем D=2.5x10"8 см2/с и В=10"9 см2/с для эмали. Для наночастиц ТЮ2 глубина 5 мкм была достигнута после ультразвуковой обработки в течение 30 минут, что дает D= 2.8х10"10 см2/с. В этих вычислениях не учитывалась кривизна тубул и промежутков

между призмами эмали, поскольку образцы полностью покрывались взвесью наночастиц. Видно, что: а) дентин более проницаем для частиц ZnO, чем эмаль; б) «коэффициент диффузии» наночастиц ZnO примерно в 2 раза выше, чем ТЮ2. Можно предположить, что это вызвано различными размерами их агрегатов (рис. 7.4), которые могут не полностью разрушаться при ультразвуковой обработке. При исследовании проницаемости для каждого типа наноча-стиц бралось по четыре образца, все полученные данные находились в согласии друг с другом. В принципе, многофотонная микроскопия способна визуализировать агрегаты наночастиц в тубулах до глубины около 200 мкм, которая, однако, в описанных выше экспериментах частицами не достигалась.

В заключение суммируем результаты данного раздела. С помощью нелинейной оптической микроскопии наблюдалось проникновение наночастиц ТЮ2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека. Наночастицы ТЮ2 обнаруживались только по флуоресценции, возбуждаемой двухфотонным поглощением, тогда как ZnO - только по сигналу генерации второй гармоники и гиперрэлеевского рассеяния. Оба типа сигналов - ГВГ/ГРР для наночастиц ZnO и ФВДП для ТЮ2 папорагйс^ - превышают слабый ГВГ и ФВДП фоновый сигнал от самих тканей зуба, что и делает возможным обнаружение нано-частиц.

В условиях данного эксперимента для использованных в нем образцов наночастицы ZnO наблюдались на глубине до 12 мкм и 45 мкм в образцах эмали и дентина зуба человека, соответственно, а наночастицы ТЮ2 на глубине 5 мкм в дентине. Проникновение наночастиц ТЮ2 в эмаль не удалось визуализировать, так как сигнал от них был слабым по сравнению с фоновым сигналом от самой эмали. Размер и форма наночастиц, а также их способность к агрегации играют важную роль в процессе проникновения. Для частиц ZnO проницаемость дентина оказалась примерно на порядок величины больше, чем у эмали. За одно и то же время глубина проникновения оказалась выше у частиц ZnO,

чем у исходно более мелких частиц ТЮ2, что можно объяснить большей степенью агрегации последних. Проверка данной гипотезы требует дополнительного исследования независимыми методами.

8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе, насколько показал проведенный нами анализ литературы, впервые предпринята попытка применить метод оптической когерентной томографии к исследованию изменений тканей зуба человека в процессе проникновения в них химических агентов и взвесей наночастиц. Эта попытка оказалась успешной. Несмотря на трудности, связанные с характерными особенностями дентина и эмали и, прежде всего, с сильным рассеянием, удалось получить ОКТ-изображения образцов дентина и эмали толщиной порядка 1 мм и провести в реальном времени мониторинг изменений, происходящих в ткани в процессе проникновения агента. Как следует из наших экспериментов, основной причиной видимых на ОКТ изменений в случае проникновения химических агентов является эффект оптического просветления, а в случае проникновения наночастиц - рассеяние света частицами. Эксперименты проводились на срезах ткани зуба в течение длительного времени, так как заметное проникновение большинства исследованных агентов в образцы занимало до нескольких часов. В качестве просветляющих агентов использовались вода, глицерин и растворы глюкозы в воде. Для этих веществ по временной динамике среднего наклона сигнала ОКТ были определены постоянные времени, характеризующие процесс стабилизации оптических свойств образца, а по ним найдены значения коэффициента проницаемости. Продемонстрирована значительная зависимость найденных параметров от структурных особенностей образца, прежде всего связанных с различием в плотности и среднем диаметре тубул дентина. Использовать средний наклон сигнала ОКТ как диагностический параметр было предложено ранее [105-109] для таких тканей, как роговица, склера, кожа. Для тканей зуба данный подход применен нами впервые. Если отражение происходит от непросветляемого объекта (неоднородности), находящегося в рассеивающей просветляемой среде, то использованный нами метод позволяет определить непосредственно коэффициент ослабления

среды. Но при оптическом просветлении может меняться не только коэффициент ослабления, но и сечение рассеяние назад, создающее полезный сигнал. Простое соотношение между средним наклоном сигнала ОКТ и коэффициентом ослабления среды может нарушаться и в силу ее макроскопической неоднородности, так что для извлечения количественных значений коэффициента ослабления (рассеяния) из наклона сигнала ОКТ требуется тщательная калибровка установки с использованием фантомов. Однако, это не обязательно при определении времени стабилизации наклона сигнала ОКТ, значения которого затем были использованы нами для вычисления коэффициента проницаемости.

В экспериментах с глюкозой было обнаружено, что проникновение раствора глюкозы в образец зубной ткани происходит намного медленнее, чем для воды и глицерина. Этот результат очевиден, если учесть размеры и массу молекул глюкозы, которые намного больше молекул воды и глицерина. Однако, в этой части работы более важная задача состояла в том, чтобы выяснить возможность необратимых последствий длительного воздействия раствора глюкозы на ткани зуба. Такая задача связана с глобальной проблемой профилактики и лечения сахарного диабета и его последствий в организме человека. Длительное вымачивание образцов ткани зуба в растворе глюкозы в какой-то степени имитировало процессы, происходящие в организме больного диабетом. Обнаружено, что после такого вымачивания в образцах происходили необратимые изменения, проявлением которых было значительное изменение скорости проникновения воды.

Проникновение наночастиц в дентин и эмаль зуба человека исследовалось с целью последующего использования эффекта при восстановлении зубной ткани (гидроксиапатит) и косметическом отбеливании (двуокись титана). Внедрение части производилось из взвеси и стимулировалось ультразвуком, а его мониторирование осуществлялось по ОКТ изображениям. В этом эксперименте было наглядно продемонстрировано преимущество использования обработанного путем усреднения сигнала ОКТ

перед непосредственно ОКТ-изображением, как таковым. На полученных кривых ОКТ-сигнала отчетливо видны изменения, достигающие 5 дБ и усиливающиеся в процессе внедрения наночастиц. Однако, оценка глубины проникновения частиц оказалась затруднительной из-за возможного влияния многократного рассеяния и растворителя на образцы, что требует дополнительных исследований.

В дополнение к ОКТ-исследованиям, не позволяющим разрешить отдельные наночастицы и фактически дающим лишь косвенное подтверждение их проникновения в образцы тканей зуба, были проведены эксперименты по мониторингу проникновения наночастиц в образцы дентина и эмали зуба человека с использованием многофотонной микроскопии. Наночастицы ZnO проникали в эмаль и дентин зуба человека на глубину 12 мкм и 45 мкм, соответственно, а наночастицы ТЮ2 на глубину 5 мкм. Проникновение преимущественно происходит вдоль направления призм эмали или тубул дентина. Обнаружено, что проницаемость дентина для наночастиц ZnO на порядок выше проницаемости эмали и что скорость проникновения существенно зависит от размера частиц: она выше для субмикронных частиц ZnO, чем для агрегатов микронного размера из исходно более мелких частиц ТЮ2.

Основное внимание в работе было сосредоточено на тканях зуба человека, однако, возможности мониторинга процессов, протекающих в твердых и плотных тканях гораздо шире. Иллюстрацией данного утверждения могут служить выполненные нами исследования процессов, происходящих в тканях ногтя пальца человека и образцах жировой ткани. В тканях ногтя наблюдались хорошо заметные изменения ОКТ изображений и усредненных А-сканов при совместном воздействии глицерина (иммерсионное просветление) и механического сжатия. В данном случае мониторинг происходящих изменений был выполнен в условиях визуализации структурных элементов ногтя и подстилающих тканей, вплоть до дермы. Высокое разрешение ОКТ позволило исследовать долговременные процессы

разрушения образцов жировой ткани после комбинированного воздействия красителей и источников света на клеточном уровне. Эти результаты являются еще одним свидетельством информативности и перспективности применения ОКТ как неинвазивного средства мониторинга процессов, протекающих в биологических тканях, в реальном времени.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Cheong W.F., Prahl S.A., Welch A.J. A review of the optical properties of biological tissues // IEEE J. Quant. Elect. 1990. V. QE-26. P. 2166—2185

2. Троицкий И.Н. Статистическая теория томографии. М.: Радио и связь, 1989. 240 с.

3. Наттерер Ф. Математические аспекты компьютерной томографии. Пер. С англ. - М.: Мир, 1990. 280 с.

4. Медофф Б.П. Реконструкция изображений по ограниченным данным: теория и применения в компьютерной томографии, в кн.: Реконструкция изображений/ Под ред. Г. Старка. М.: Мир, 1992. Гл. 9. С. 385-436.

5. Галайдин П.А., Замятин А.И., Иванов В.А. Основы магниторезонансной томографии. СПб: Изд-во ИТМО, 1998. 24 с.

6. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. М.: Мир, 1990. - 709с.

7. Марусина М.Я. Казначеева А.О. Современные виды томографии. Учебное пособие - СПб.: СПбГУ ИТМО, 2006. - 152 с

8. Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham: SPIE, 1993. V. IS11.

9. Selected papers on tissues optics: applications in medical diagnostics and therapy/ Ed. V.V. Tuchin. Bellingham: SPIE, 1994. V. MS102

10. Rinneberg H. Scattering of laser light in turbid media, optical tomography for medical diagnostics. // The inverse problem / Ed. H. Lübbig. Berlin, Academia Verlag, 1995. P. 107-141.

11. Coherence-domain method in biomedical optics / Ed. V.V. Tuchin. Bellingham, SPIE, 1996. Vol. 2732.

12. Fercher A.F. Optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 1996. V. 1. P. 157-173.

13. Inaba H. Coherent detection imaging for medical laser tomography // Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham WA, SPIE Institute Series. 1993. V. IS11. P. 317-347.

14. Dörschel K., Messer B., Minet O., Müller G. High resolution coherent tomography // Medical optical tomography: functional imaging and monitoring / Eds G. Müller, B. Chance, R. Alfano et.al. Bellingham WA, SPIE Institute Series. 1993. V. IS11.P. 348-354.

15. Poupinet L., Jarry G. Heterodyne detection for measuring extinction coefficient in mammalian tissue // J. Optics (Paris). 1993. V. 24. P. 279-285.

16. Jones R., Hyde S.W.C., Lynn M.J. et.al. Holographic storage and high background imaging using photorefractive multiple quantum wells // Appl. Phys. Lett. 1996. V. 69. P. 1837-1839.

17. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K. Ocular partial-coherence interferometry//Proc. SPIE, 1996. V. 2732. P. 210-228.

18. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K. Ocular partial-coherence tomography//Proc. SPIE, 1996. V. 2732. P. 229-241.

19. Izatt J. A., Kulkarni M. D., Kobayashi K., Sivak M.V., Barton J.K., Welsh A.J. Optical coherence tomography for biodiagnostics // Opt. Photon. News. 1997. V. 8. P. 41-47.

20. Schmitt J.M. Array detection for speckle reduction in optical coherence microscopy//Phys. Med. Biol. 1997. Vol. 42. P. 1427-1439.

21. Rajadhyashka M., Anderson R.R., Webb R.H. Video-rate confocal scanning laser microscope for imaging human tissues in vivo // Appl. Opt. 1999. V. 38. P. 2105-2115.

22. Hee M.R., Izatt J.A., Jacobson J.M., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Femtosecond transillumination optical coherence tomography // Opt. Lett. 1993. V. 18. P. 950952.

23. Fujimoto J.G., De Silvestri S., Ippen E.P., Margolis R., Oseroff A. Femtosecond optical ranging in biological systems // Opt. Lett. 1986. V. 11. P. 150-152.

24. Rudolph W., Kempe M. Trends in optical biomedical imaging // J. Mod. Opt. 1997. V. 44. P. 1617-1642.

25. Fercher A.F., Mengedoht K., Werner W. Eye-length measurement by interferometry with partially coherent light // Opt. Lett. 1988. V. 13. P. 186-188.

26. Гуров И.П. Оптическая когерентная томография: принципы, проблемы и перспективы. В кн.: Проблемы когерентной и нелинейной оптики / Под ред. И.П. Гурова и С.А. Козлова. СПб: СПбГУ ИТМО, 2004. С. 6-30.

27. Izatt J.A., Hee M.R., Owen G.A., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Optical coherence microscopy in scattering media// Opt. Lett. 1994. V. 19. P. 590-592.

28. Leith E.N., Chen C., Chen H., Chen Y., Dilworth D., Lopez J., Rudd J., Sun P.C., Valdmanis J., Vossler G. Imaging through scattering media with holography // J. Opt. Soc. Am. 1992. V. 9. P. 1148-1153.

29. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. М.: Физматлит, 2010.

30. Fercher A.F., Drexler W., Hitzenberger C.K., Lasser T. Optical coherence tomography - principles and applications // Rep. Prog. Phys. 2003. V. 66. No. 2. P. 239-303.

31. Зимняков Д.А., Тучин В.В. Оптическая томография тканей // Квант. электрон. 2002. Т. 32. № 10. С. 849-867.

32. Vo-Dinh T. Biomedical Photonics Handbook, capitolul 13: Optical Coherence Tomography Imaging, CRC PRESS Boca Raton, London, New York Washington, D.C. 2003. P. 22-24.

33. Drexler W., Liu M., Kumar A., Kamali T., Unterhuber A., Leitgeb R.A. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality // J. Biomed. Opt. 2014. V. 19. No. 7. P. 071412.

34. Schimitt J.M., Xiang S.H., Yung K.M. Speckle in optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 1999. V. 4. P. 95-105.

35. Huang D., SwansonE.A., Lin C.P., Schuman J.S., Stinson W.G., Chang W., Hee M.R., Flotte T., Gregory K., Puliafito C.A., Fujimoto J.G. Optical coherence tomography// Science. 1991. V. 254. P. 1178-1181.

36. Puliafito C.A., Hee M.R., Lin C.P., Reichel E., Schuman J.S., Duker J.S., Izatt J.A., Swanson E.A., Fujimoto J.G. Imaging of macular diseases with optical coherence tomography // Ophthalmology. 1995. V. 102. No. 2. P. 217-229.

37. Drexler W., Morgner U., Ghanta R.K., Kartner F.X., Schuman J.S., Fujimoto J.G. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography // Nat. Med. 2001. V. 7. No. 4. P. 502-507.

38. Schuman S.G., Hertzmark E., Fujimoto J.G., Schuman J.S. Wavelength independence and interdevice variability of optical coherence tomography // Ophthal Surg. Las. Im. 2004. V. 35. No. 4. P. 316-320.

39. Srinivasan V.J., Monson B.K., Wojtkowski M., Bilonick R.A., Gorczynska I., Chen R., Duker J.S., Schuman J.S., Fujimoto J.G. Characterization of outer retinal morphology with high-speed, ultrahigh-resolution optical coherence tomography // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008. V. 49. No. 4. P. 1571-1579.

40. Pircher M., Baumann B., Gotzinger E., Hitzenberger C.K. Retinal cone mosaicimaged with transverse scanning optical coherence tomography // Opt. Lett. 2006. V. 31. No. 12. P. 1821-1823.

41. Gotzinger E., Pircher M., Geitzenauer W., Ahlers C., Baumann B., Michels S., Schmidt-Erfurth U., Hitzenberger C.K. Retinal pigment epithelium segmentation by polarization sensitive optical coherence tomography // Opt. Express. 2008. V. 16. No. 21. P. 16410-16422.

42. Chen Y., de Bruin D.M., Kerbage C., de Boer J.F. Spectrally balanced detection for optical frequency domain imaging // Opt. Express 2007. V. 15. No. 25. P. 1639016399.

43. Ho J., Witkin A.J., Liu J., Chen Y., Fujimoto J.G., Schuman J.S., Duker J.S. Documentation of intraretinal retinal pigment epithelium migration via highspeed ultrahigh-resolution optical coherence tomography // Ophthalmology 2011. V. 118. No. 4. P. 687-693.

44. Chen Y., Vuong L.N., Liu J., Ho J., Srinivasan V.J., Gorczynska I., Witkin A.J., Duker J.S., Schuman J., Fujimoto J.G. Three-dimensional ultrahigh resolution

optical coherence tomography imaging of age-related macular degeneration // Opt. Express 2009. V. 17. No. 5. P. 4046-4060.

45. Srinivasan V.J., Chen Y., Duker J.S., Fujimoto J.G. In vivo functional imaging of intrinsic scattering changes in the human retina with high-speed ultrahigh resolution OCT // Opt. Express. 2009. V. 17. No. 5. P. 3861-3877.

46. Chia S., Raffel O.C., Takano M., Tearney G.J., Bouma B.E., Jang I.K. In-vivo comparison of coronary plaque characteristics using optical coherence tomography in women vs. men with acute coronary syndrome // Coron. Artery Dis. 2007. V. 18. No. 6. P. 423-427.

47. Kawasaki M., Bouma B.E., Bressner J., Houser S.L., Nadkarni S.K., MacNeill B.D., Jang I.K., Fujiwara H., Tearney G.J. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography and integrated backscatter intravascular ultrasound images for tissue characterization of human coronary plaques // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. V. 48. No. 1.P. 81-88.

48. BoumaB.E., Tearney G.J., YabushitaH., ShishkovM., Kauffman C.R., Gauthier D.D., MacNeill B.D., Houser S.L., Aretz H.T., Halpern E.F., Jang I.K. Evaluation of intracoronary stenting by intravascular optical coherence tomography // Heart 2003. V. 89. No. 3.P. 317-320.

49. Kubo T., Imanishi T., Takarada S., Kuroi A., Ueno S., Yamano T., Tanimoto T., Matsuo Y., Masho T., Kitabata H., Tsuda K., Tomobuchi Y., Akasaka T. Assessment of culprit lesion morphology in acute myocardial infarction - Abilityof optical coherence tomography compared with intravascular ultrasound and coronary angioscopy // J. Am. Coll. Cardiol. 2007. V. 50. No. 10. P. 933-939.

50. Sawada T., Shite J., Shinke T., Watanabe S., Otake H., Matsumoto D., Imuro Y., Ogasawara D., Paredes O.L., Yokoyama M. Persistent malapposition after implantation of sirolimus-eluting stent into intramural coronary hematoma -Optical coherence tomography observations // Circulation J. 2006. V. 70. No. 11. P. 1515-1519.

51. Kume T., Akasaka T., Kawamoto T., Watanabe N., Toyota E., Neishi Y., Sukmawan R., Sadahira Y., Yoshida K. Assessment of coronary arterial plaque by optical coherence tomography // Am. J. Cardiol. 2006. V. 97. No. 8. P. 1172-1175.

52. Brezinski M.E. Optical coherence tomography for identifying unstable coronary plaque // Int. J. Cardiol. 2006. V. 107. No. 2. P. 154-165.

53. Tearney G.J., Jang I.K., Kang D.H., Aretz H.T., Houser S.L., Brady T.J., Schlendorf K., Shishkov M., Bouma B.E. Porcine coronary imaging in vivo by optical coherence tomography // Acta cardiologica 2000. V. 55. No. 4. P. 233-237.

54. Yasuno Y., Endo T., Makita S., Aoki G., Itoh M., Yatagai T. Three-dimensional line-field Fourier domain optical coherence tomography for in vivo dermatological investigation // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. P. 014014-014020.

55. Weissman J., Hancewicz T., Kaplan P. Optical coherence tomography of skin for measurement of epidermal thickness by shapelet-based image analysis // Opt. Express. 2004. V. 12. No. 23. P. 5760-5769.

56. Pierce M.C., Strasswimmer J., Park B.H., Cense B., de Boer J.F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2004. V. 9. No. 2. P. 287-291.

57. Zhao Y.H., Chen Z.P., Saxer C., Xiang S.H., de Boer J.F., Nelson J.S. Phase-resolved optical coherence tomography and optical Doppler tomography for imaging blood flow in human skin with fast scanning speed and high velocity sensitivity // Opt. Lett. 2000. V. 25. No. 2. P. 114-116.

58. Welzel J., Lankenau E., Birngruber R., Engelhardt R. Optical coherence tomography of the skin // Curr. Probl. Dermatol. 1998. V. 26. P. 27-37.

59. Baumgartner A., Dichtl S., Hitzenberger C.K., Sattmann H., Robl B., Moritz A., Fercher A.F., Sperr W. Polarization-sensitive optical coherence tomography of dental structures // Caries Res. 2000. V. 34. No. 1. P. 59-69.

60. Colston B.W., Jr., Everett M.J., Sathyam U.S., DaSilva L.B., Otis L.L. Imaging of the oral cavity using optical coherence tomography // Monogr. Oral Sci. 2000. V. 17. P. 32-55.

61. Otis L.L., Colston B.W., Jr., Everett M.J., Nathel H. Dental optical coherence tomography: a comparison of two in vitro systems // Dentomaxillofac. Radiol. 2000. V. 29. No. 2. P. 85-89.

62. Otis L.L., Everett M.J., Sathyam U.S., Colston B.W., Jr. Optical coherence tomography: a new imaging technology for dentistry // J. Am. Dental Assoc. 2000. V. 131. No. 4. P. 511-514.

63. FriedD., Xie J., Shafi S., Featherstone J.D.B., Breunig T.M., Charles L. Imaging caries lesions and lesion progression with polarization sensitive optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2002. V. 7. No. 4. P. 618-627.

64. Otis L.L., al-Sadhan R.I., Meiers J., Redford-Badwal D. Identification of occlusal sealants using optical coherence tomography // J. Clin. Dent. 2003. V. 14. No. 1.P. 7-10.

65. Ko A.C.-T., Choo-Smith L.-P., Hewko M., Leonardi L., Sowa M.G., Dong C.C.S., Williams P., Cleghorn B. Ex vivo detection and characterization of early dental caries by optical coherence tomography and Raman spectroscopy // J. Biomed. Opt. 2005. V. 10. No. 3.P. 031118.

66. Jones R.S., Darling C.L., Featherstone J.D.B., Fried D. Remineralization of in vitro dental caries assessed with polarization-sensitive optical coherence tomography//J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 1. P. 014016.

67. Jones R.S., Darling C.L., Featherstone J.D.B., Fried D. Imaging artificial caries on the occlusal surfaces with polarization-sensitive optical coherence tomography // Caries Res. 2006. V. 40. No. 2. P. 81-89.

68. Chen Y.L., Otis L., Zhu Q. Polarization memory effect in optical coherence tomography and dental imaging application // J. Biomed. Opt. 2011. V. 16. No. 8. P.086005.

69. Chen Y., Otis L., Zhu Q. Polarization memory effect in the polarization-sensitive optical coherence tomography system // Proc. SPIE. 2007. V. 6429. P. 6429K.

70. Chen Y., Otis L., Piao D., Zhu Q. Characterization of dentin, enamel, and carious lesions by a polarization-sensitive optical coherence tomography system // Appl. Opt. 2005. V. 44. No. 11. P. 2041-2048.

71. Su J.P., Zhang J., Yu L.F., Chen Z.P. In vivo three-dimensional microelectromechanical endoscopic swept source optical coherence tomography // Opt. Express. 2007. V. 15. No. 16. P. 10390-10396.

72. Yaqoob Z., Wu J.G., McDowell E.J., Heng X., Yang C.H. Methods and application areas of endoscopic optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 6. P. 063001.

73. Данильченко Д., Закс М., Ланкенау Е., Кениг Ф., Хютман Г., Шнор Д., Алъ-Шукри С., Ленинг Ш. Оптическая когерентная томография мочевого пузыря: потенциал высокоразрешающего визуального исследования для эндоскопической диагностики // Опт. и спектр. 2006. Т. 101. №1. С. 44-49.

74. Mashimo H., Desai S., Pedrosa M., Wagh M., Chen Y., Herz P., Hsiung P.L., Aguirre A., Koski A., Schmitt J., Fujimoto J.G. Ultrahigh resolution endoscopic optical coherence tomography: a novel technology for gastrointestinal imaging // Gastroenterology 2005. V. 128. No. 4. P. A251-A251.

75. Chen Y., Herz P.R., Hsiung P.-L., Aguirre A.D., Schneider K., Fujimoto J.G., Mashimo H., Desai S., Pedrosa M., Schmitt J.M., Koski A. Ultrahigh resolution endoscopic optical coherence tomography for gastrointestinal imaging // Proc. SPIE. 2005. V. 5690. doi:10.1117/12.592609.

76. Tearney G.J., Brezinski M.E., Bouma B.E., Boppart S.A., Pitvis C., Southern J.F., Fujimoto J.G. In vivo endoscopic optical biopsy with optical coherence tomography// Science. 1997. V. 276. No. 5321. P. 2037-2039.

77. Handbook of Optical Coherence Tomography / Eds. B.E. Bouma, G.J. Tearney. New York: Marcel-Dekker, 2002.

78. Maheshwari A., Choma M.A., Izatt J.A. Heterodyne swept-source optical coherence tomography for complete complex conjugate ambiguity removal // Proc. SPIE. 2005. V. 5690. P. 91-95.

79. Jung E.J., Park J.-S., Jeong M.Y. et al. Spectrally sampled OCT for sensitivity improvement from limited optical power // Opt. Express. 2008. V. 16. No. 22. P. 17457-17467.

80. ChomaM.A., Sarunic M.V., Yang C. et al. Sensitivity advantage of swept source and Fourier domain optical coherence tomography, Opt. Express. 2003. V.11. No. 18. P. 2183-2189.

81. Chen Z. Optical Doppler tomography. In: Coherent-Domain Optical Methods: Biomedical Diagnostics, Environmental and Material Science / ed. V.V. Tuchin. Boston: Kluwer Academic Publishers, 2004. V. 2. P. 315-342.

82. Chen Z., Milner T., Srinivas S., et al. Noninvasive imaging of in-vivo blood flow velocity using optical Doppler tomography // Opt. Lett. 1997. V. 22. P. 1119-1121.

83. Sinescu C., Negrutiu M.L., Todea C. et al. Quality assessment of dental treatments using en-face optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2008. V. 13. No. 5. P. 054065.

84. De Boer J., Milner T., van Gemert M., Nelson J. Two dimensional birefringence imaging in biological tissue by polarisation sensitive optical coherence tomography // Opt. Lett. 1997. V. 22. P. 934-936.

85. Schmitt J.M., Xiang S.H. Cross-polarized backscatter in optical coherence tomography of biological tissue // Opt. Lett. 1998. V. 23. No. 13. P. 1060-1062.

86. Morgner U., Drexler W., Kartner F.C., Li X.D., Pitris C., Ippen E.P., Fujimoto J.G. Spectroscopic optical coherence tomography// Opt. Lett. 2000. V. 25. P. 111113.

87. Hermann B., Bizheva K., Unterhuber A., Povazay B., Sattmann H., Schmetterer L., Fercher A.F., Drexler W. Precision of extracting absorption profiles from weakly scattering media with spectroscopic time-domain optical coherence tomography // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 1677-1688.

88. Schmitt J., Xiang S., Yung K. Differential absorption imaging with optical coherence tomography // J. Opt. Soc. Am. A. 1998. V. 15. P. 2288-2296.

89. Stören T., Royset A., Svaasand L.O., Lindmo T. Functional imaging of dye concentration in tissue phantoms by spectroscopic optical coherence tomography // J. Biomed. Opt. 2005. V. 10. P. 024037.

90. Faber D.J., Mik E.G., Aalders M.C.G., van Leuven T.G. Light absorption of (oxy-)hemoglobin assessed by spectroscopic optical coherence tomography // Opt. Lett. 2003. V. 28. P. 1436-1438.

91. Jobsis F.F. Non-invasive, infrared monitoring of cerebral and myocardial oxygen sufficiency and circulatory parameters // Science. 1977. V. 198. P. 1264-1267.

92. Xu C., Ye J., Marks D.L., Boppart S.A. Near-infrared dyes as contrast-enhancing agents for spectroscopic optical coherence tomography // Opt. Lett. 2004. 29. P. 1647-1649.

93. Backman V., Wallace M.B., Perelman L.T., Arendt J.T., Gurjar R., Muller M.G., Zhang Q., Zonios G., Kline E., Mcgillican T., Shapshay S., Valdez T., Badizadegan K., Crawford J.M., Fitzmaurice M., Kabani S., Levin H.S., Seiler M., Dasari R.R., Itzkan I., Van Dam J., Feld M.S. Detection of preinvasive cancer cells // Nature. 2000. 406. P. 35-36.

94. Yang C., McGuckin L.E., Simon J.D., Choma M.A., Applegate B.E., Izatt J.A. Spectral triangulation molecular contrast optical coherence tomography with indo-cyanine green as the contrast agent // Opt. Lett. 2004. V. 29. P. 2016-2018.

95. Xu C., Boppart S.A. Comparative performance analysis of time-frequency distributions for spectroscopic optical coherence tomography // Appl. Opt. 2005. V. 44. No. 10. P. 1813-1822.

96. Xu C., Marks D.L., Do M.N. Boppart S.A. A least-squares fitting algorithm for separating absorption and scattering profiles in spectroscopic optical coherence tomography//Proc. SPIE. 2005. V. 5690. P. 201-208.

97. Schmitt J.M., Knüttel A., Bonner R.F. Measurement of optical properties of biological tissues by low-coherence interferometry // Appl. Opt. 1993. V. 32. P. 60326042.

98. Pan Y., Birngruber R., Rosperich J., Engelhardt R. Low coherence optical tomography in turbid tissue: theoretical analysis // Appl. Opt. 1995. V. 34. P. 65646574.

99. Thurber S.R., Brodsky A.M., Burgess L.W. Characterization of random media by low-coherence interferometry// Appl. Spectrosc. 2000. V. 54. P. 1506-1514.

100. Faber D.J., van der Meer F.J., Aalders M.C.G., van Leeuwen T.G. Quantitative measurement of attenuation coefficients of weakly scattering media using optical coherence tomography // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 4353-4365.

101. Xu C., Marks D.L., Do M.N., Boppart S.A. Separation of absorption and scattering profiles in spectroscopic optical coherence tomography using a least-squares algorithm // Opt. Express. 2004. V. 12. P. 4790-4803.

102. Kholodnykh A.I., Petrova I.Y., Larin K.V., Motamedi M., Esenaliev R.O. Precision of measurement of tissue optical properties with optical coherence tomography // Appl. Opt. 2003. V. 42. P. 3027-3037.

103. Pircher M., Götzinger E., Leitgeb R., Fercher A.F., Hitzenberger C.K. Speckle reduction in optical coherence tomography by frequency compounding // J. Biomed. Opt. 2003. V. 8. P. 565-569.

104. Stören T., Royset A., Svaasand L.O., Lindmo T. Measurement of dye diffusion in scattering tissue phantoms using dual-wavelength low-coherence interfer-ometry // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. No. 1. P. 014017.

105. Ghosn M.G., Tuchin V.V., Larin K.V. Nondestructive quantification of analyte diffusion in cornea and sclera using optical coherence tomography // Invest. Ophthalmol .Vis. Sci. 2007. V. 48. No. 6. P. 2726-2733.

106. Ларин К.В., Тучин В.В. Функциональная визуализация и оценка скорости диффузии глюкозы в эпителиальных тканях с помощью оптической когерентной томографии // Квант. электрон. 2008. T. 38, № 6. С. 551-556.

107. Ghosn M.G., Carbajal E.F., Befrui N.A., Tuchin V.V., Larin K.V. Differential permeability rate and percent clearing of glucose in different regions in rabbit sclera //J. Biomed. Opt. 2008. V. 13. No. 2. P. 021110.

108. Ghosn M.G., Sudheendran N., Wendt M., Glasser A., Tuchin V.V., Larin K.V. Monitoring of glucose permeability in monkey skin in vivo using Optical Coherence Tomography // J. Biophoton. 2010. V. 3. No. 1-2. P. 25-33.

109. Larin K.V., Ghosn M.G., Bashkatov A.N., Genina E.A., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical clearing for OCT image enhancement and in-depth monitoring of

molecular diffusion // IEEE J. Select. Topics in Quantum Electron. 2011. V. 18. No. 3,P. 1244-1259.

110. Ghosn M., Tuchin V.V., Larin K.V. Depth-resolved monitoring of glucose diffusion in tissues by using optical coherence tomography // Opt. Lett. 2006. V. 31. P. 2314-2316.

111. Franken P.A., Hill A.E., Peters C.W., Weinreich G. Generation of optical harmonics //Phys. Rev. Lett, 1961, V. 7, P. 118-119.

112. Fine S., Hansen W.P. Optical second harmonic generation in biological systems //Appl. Opt. 1971. V. 10. P. 2350-2353.

113. Freund I., Deutsch M., Sprecher A. Connective tissue polarity, optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon // Biophys. J. 1986. V. 50. P. 693-712.

114. Campagnola P.J., Clark H.A., Mohler W.A., Lewis A., Loew L.M. Second harmonic imaging microscopy of living cells // J. Biomed. Opt. (SPIE). 2001. V. 6. No. 3.P. 277-286.

115. Campagnola P.J., Loew L.M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1356-1360.

116. Stoller P., Reiser K.M., Celliers P.M., Rubenchik A.M. Polarization-modulated second harmonic generation in collagen // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 3330-3342.

117. Han M., Giese G., Bille J.F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera// Opt. Express. 2005. V. 13. P. 579-5797.

118. Cohen B.E. Biological imaging: beyond fluorescence // Nature. 2010. V. 467. No. 7314. P. 407-408.

119. Pantazis P., Maloney J., Wu D., Fraser S. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. V. 107. No. 33. P. 14535-14540.

120. Boyd R.W. Nonlinear Optics. San Diego, CA: Academic Press, 1992.

121. Ярив А. Квантовая электроника и нелинейная оптика. М.: Советское радио,1973.456 C.