Исследование природных модуляторов функциональной активности TRPV1 рецепторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Андреев, Ярослав Алексеевич

• Андреев, Ярослав Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андреев, Ярослав Алексеевич

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

Каналы TRP семейства.

2.1. История открытия TRP каналов.

2.2. Общая характеристика семейства TRP.

2.3. Биологические функции и фармакология.

2.4. TRP каналы и Са + каналы, управляемые кальциевым депо (SOC-Store-Operated

Channels).

2.5 TRP каналы/рецепторы, участвующие в ноцицепции.

2.5.1. Рецептор TRPV1- один из важнейших интеграторов болевых и воспалительных стимулов.

2.5.1.1 Роль TRPV1 в ноцицепци.

2.5.1.2. Структура и функции TRPV1.

2.5.1.3. Сплайсинговые варианты TRPV1.

2.5.1.4. Эндогенные лиганды TRPV1.

2.5.1.5. Сенсибилизация и модуляция TRPV1.

2.5.1.6. Экспрессия TRPV1 в нервной системе.

2.5.1.7. TRPV1, как мишень для создания лекарственных средств.

2.5.2. TRPV2.

2.5.3. TRPV3.

2.5:4. TRPV4.

2.5.5. TRPM8.:.

2.5.6. TRPA1.

2.5.7. TRP каналы- комплексные интеграторы болевой чувствительности.

3. Материалы и методы.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.1.1. Оборудование.

3.1.2. Реактивы и.ферменты.

3.1.3. Маркеры длин ДНК.

3.1.4. Наборы реактивов.

3.1.5. Расходные материалы.

3.1.6. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

3.1.7. Среды.

3.1.8. Буферные растворы.

3.1.9. Праймеры, использованные в работе.

3.2. Методы.

3.2.1. Генноинженерные манипуляции.

3.2.2. Выделение геномной ДНК из морской анемоны Heteractis crispa.

3.2.3. Выделение РНК из морской анемоны Heteractis crispa.

3.2.4. Синтез первой цепи кДНК и 3' и 5' RACE.

3.2.5. Секвенирование ДНК.

3.2.6. Получение РНК кодирующую TRPV1 рецептор.

3.2.7. Получение ооцитов Xenopus laevis экспресиирующих TRPV1 рецептор.

3.2.8. Электофизиологические исследования.

3.2.9. Выделение полипептидов АРНС1-3.

3.2.10. Масс-спектрометрия.

3.2.11. Установление N-Концевой аминокислотной последовательности.

3.2.12. Экспрессия генов в клетках E.coli.

3.2.13. Определение констант ингибирования сериновых протез.

3.2.15. Моделировние простаственных структур полипептидов АРНС1-3.

3.2.16. Исследование анальгетической активности пептидов.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Введение.

4.2. Поиск модуляторов функциональной активности TRPV1.

4.3. Выделение и установление структуры АРНС1.

4.4. Анализ первичной структуры АРНС1.

4.5. Гомологи АРНС1 в экстракте нематоцистов H.crispa.

4.6. Гомологи АРНС1, модулирующие активность TRPV1.

4.7. Получение рекомбинантного АРНС1.

4.8. Ингибирование активности сериновых протеаз.

4.9. Электрофизиологические исследования АРНС1.

4.10. Анальгетическая активность полипептидов АРНС1-3 в моделях болевой чувствительности in vivo.

4.11. Моделирование пространственной структуры полипептидов АРНС1-3 и определение функционально важных остатков.

4.12. Механизм действия АРНС1.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование природных модуляторов функциональной активности TRPV1 рецепторов»

Одной из основных причин обращения людей за врачебной помощью являются болевые синдромы. Боль как неприятное ощущение с негативными эмоциональными переживаниями зачастую выполняет сигнальную функцию, предупреждает организм об опасности и защищает его от возможных нежелательных повреждений. Вместе с тем существует и другой вид боли, который имеет негативное значение для организма. Эта боль (патологическая боль) делает людей нетрудоспособными, снижает их активность, вызывает психо-эмоциональные расстройства, приводит к нарушениям деятельности важнейших систем организма.

Восприятие, проведение и анализ болевых сигналов в организме обеспечивают специальные нейрональные структуры - ноцицепторы, преимущественно чувствительные к патологическим раздражителям или к раздражителям, которые становятся патологическими при продолжительном воздействии. Развитие болевых синдромов связано с активацией ноцицептивных рецепторов при травмах, воспалении, ишемии и др. (соматогенные болевые синдромы) или с повреждением структур периферической или центральной нервной систем, участвующих в проведении ноцицептивных сигналов (нейрогенные болевые синдромы, такие как невралгии, фантомно-болевой синдром и др.

В течение последних 20 лет достижения иммуногистохимии, нейрофармакологии и нейрофизиологии позволили совершить грандиозные открытия в области анатомии и патофизиологии боли. Идентификация рецепторов и процессов, участвующих в формировании и передаче болевых сигналов открывают пути для применения новых средств и методов, обеспечивающих более эффективный контроль над болью. Одним из современных подходов для лечения болевых состояний является использование высокоселективных агентов, способных специфично блокировать рецепторы, которые непосредственно воспринимают болевые стимулы и/или медиаторы воспаления. К таким рецепторам относится ваниллоидный рецептор TRPV1.

Ваниллоидный рецептор 1, TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1), играет важную роль в ряде патологических состояний: при болях воспалительного характера, раке, нейропатических и висцеральных болях, заболеваниях дыхательных путей, панкреатитах и мигренях. TRPV1 является катион-селективным ионным каналом, который отвечает на присутствие капсаицина кратковременным деполяризующим входящим током и активируется повышенной температурой и низким значением рН. Современные данные, полученные в in vivo и in vitro экспериментах, позволяют считать TRPV1 важным полимодальным рецептором, который объединяет множественные сигналы о физических и химических стимулах во время воспаления или повреждения тканей в один ноцицептивный ответ.

TRPV1 является важнейшими интегратором болевых и воспалительных стимулов, что позволяет рассматривать его как перспективную терапевтическую мишень в лечении болевых состояний. Считается, что, в отличие от традиционных анальгетических средств, которые подавляют либо воспалительные процессы, либо передачу болевых сигналов, антагонисты TRPV1 предотвращают боль, блокируя важный рецептор и интегратор болевых стимулов на чувствительных нейронах.

Поэтому поиск модуляторов активности TRPV1 рецептора является одним из приоритетных направлений работы научно-исследовательских лабораторий во всем мире.

2. Обзор литературы. Каналы TRP семейства

Семейство ионных каналов TRP (transient receptor potential) было последним из открытых семейств ионных каналов. Первый представитель семейства (dTRP) был обнаружен генетическими исследованиями дрозофилы, где он является передающим каналом в фоторецепции. В настоящее время у позвоночных найдено 29 изоформ TRP каналов, которые разделены на 7 семейств (TRPC, TRPV, TRPM, TRPML, TRPP, TRPA, TRPN) (1). Эти каналы осуществляют широкий диапазон функций. Они открываются в ответ на множество стимулов, таких как холод или высокие температуры, природные химические вещества (ментол, камфора, капсаицин), механические стимулы и изменения состава липидного бислоя. TRP каналы участвуют в различных физиологических процессах-фоторецепции, восприятии феромонов, ощущении вкуса, боли, химических агентов, механорецепции, тонуса гладких мышц и регуляции кровяного давления. (2). Однако, следует отметить, что их физиологическая роль, механизмы активации и регуляции пока установлены лишь частично.

В данном обзоре литературы представлена общая характеристика семейства TRP и отдельно описаны каналы-рецепторы, принимающие участие в ноцицепции. Наиболее подробно описан рецептор TRPV1, так как он является наиболее изученным и считается перспективной мишенью для создания новых анальгетических препаратов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Андреев, Ярослав Алексеевич

5. Выводы.

1. В экстракте нематоцистов морской анемоны Heteractis crispa обнаружен первый полипептидный модулятор ванилоидного рецептора, названный АРНС1. Идентифицированы его структурные гомологи — полипептиды АРНС2 и АРНСЗ. Комбинацией методов белковой химии и генной инженерии установлена первичная структура трех найденных полипептидов.

2. Определена биологическая активность АРНС1 и показано, что он ингибирует капсаицин-индуцируемые токи TRPV1 с ЕС5о=54±4 нМ и является слабым ингибитором сериновых протеаз.

3. Разработан метод получения рекомбинантных АРНС1, АРНС2, АРНСЗ. Выход целевых полипептидов с 1 литра культуры клеток E.coli составлял для АРНС1 - 3,3 мг; для АРНС2 и АРНСЗ около 8 мг.

4. Выявлены анальгетические свойства полипептидов АРНС1-3. Показано, что АРНС1 значительно ослабляет болевой эффект, вызываемый введением мышам капсаицина - селективного агониста TRPV1. Полипептиды АРНС1-3 в дозе 0.1 мг/кг проявляют анальгетический эффект в in vivo моделях тепловой стимуляции боли и воспалительной гиперчувствительности, вызванной CFA.

4.13. Заключение.

Несмотря на то, что за последние годы изучено довольно много низкомолекулярных агонистов и антагонистов TRPV1, некоторые из которых уже используются в клинической практике, до сих пор не было обнаружено пептидных молекул, проявляющих выраженную ингибиторную активность в отношении этого рецептора. Исключение составляют синтетичекие аргинин-богатые пептиды и малые пептидные молекулы, сходные с ними по структуре. Вместе с тем, ингибиторы TRPV1 пептидной природы могут иметь важное значение для разработки новых анальгетических средств. По сравнению с низкомолекулярными аналогами они могут оказывать более специфичное терапевтическое воздействие и вызывать меньшее количество системных побочных эффектов. Кроме того, на их основе открывается возможность оптимизации структуры и, следовательно, фармакологических свойств молекулы путем мутагенеза.

Тот факт, что в экспериментах на гетерологически экспрессированных ТКРУ1 рецепторах полипептиды АРНС1-3 не вызывали полного блокирования ионного тока через канал, позволяет считать, что эти полипептиды являются в большей степени модуляторами, чем ингибиторами канала. Молекулы, модулирующие работу ионных каналов, вызывают особенный интерес, так как с их помощью возможно преимущественно воздействовать на конкретные кинетические или функциональные параметры канала. Так, например, избирательное подавление чувствительности ТКРУ1 к закислению внешней среды могло бы позволить нормализовать активность рецептора в условиях воспалительного процесса и устранить вызванные им болевые эффекты. Механизм ингибирующего влияния полипептидов АРНС1-3 на Т11РУ1 рецептор остается предметом будущих исследований.

Помимо вероятной практической значимости, полученные нами результаты, могут внести ценный вклад в решение ряда фундаментальных проблем, таких как изучение молекулярных основ функционирования рецептора ТКРУ1, поиск новых природных модуляторов активности каналов ТКРУ1, изучение влияния активности ТЛРУ1 рецепторов на развитие ряда патологических процессов в организме.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андреев, Ярослав Алексеевич, 2009 год

1. Levine, J.D. and Alessandri-Haber, N. (2007) TRP channels: targets for the relief of pain. Biochim Biophys Acta, 1772, 989-1003.

2. Voets, T., Droogmans, G., Wissenbach, U., Janssens, A., Flockerzi, V. and Nilius, B. (2004) The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature, 430, 748-754.

3. Montell, C. and Rubin, G.M. (1989) Molecular characterization of the Drosophila trp locus: a putative integral membrane protein required for phototransduction. Neuron, 2, 1313-1323.

4. Cosens, D.J. and Manning, A. (1969) Abnormal electroretinogram from a Drosophila mutant. Nature, 224, 285-287.

5. Minke, B., Wu, C. and Pak, W.L. (1975) Induction of photoreceptor voltage noise in the dark in Drosophila mutant. Nature, 258, 84-87.

6. Hardie, R.C., Voss, D., Pongs, O. and Laughlin, S.B. (1991) Novel potassium channels encoded by the Shaker locus in Drosophila photoreceptors. Neuron, 6, 477486.

7. Phillips, A.M., Bull, A. and Kelly, L.E. (1992) Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron, 8, 631-642.

8. Niemeyer, B.A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K. and Zuker, C.S. (1996) The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell, 85, 651-659.

9. Reuss, H., Mojet, M.H., Chyb, S. and Hardie, R.C. (1997) In vivo analysis of the drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron, 19, 1249-1259.

10. Agam, K., von Campenhausen, M., Levy, S., Ben-Ami, H.C., Cook, B., Kirschfeld, K. and Minke, B. (2000) Metabolic stress reversibly activates the Drosophila lightsensitive channels TRP and TRPL in vivo. JNeurosci, 20, 5748-5755.

11. Vaca, L., Sinkins, W.G., Hu, Y., Kunze, D.L. and Schilling, W.P. (1994) Activation of recombinant trp by thapsigargin in Sf9 insect cells. Am J Physiol, 267, CI 5011505.

12. Xu, X.Z., Li, H.S., Guggino, W.B. and Montell, C. (1997) Coassembly of TRP and TRPL produces a distinct store-operated conductance. Cell, 89, 1155-1164.

13. Minke and Hardie. (2000) Genetic dissection of Drosophila phototransduction. Elsevier, the Netherlands.

14. Montell, C. (1999) Visual transduction in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol, 15, 231-268.

15. Hardie, R.C., Raghu, P., Moore, S., Juusola, M., Baines, R.A. and Sweeney, S.T. (2001) Calcium influx via TRP channels is required to maintain PIP2 levels in Drosophila photoreceptors. Neuron, 30, 149-159.18.