Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Дьяконова, Галина Вячеславовна

• Дьяконова, Галина Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дьяконова, Галина Вячеславовна

Оглавление.

Введение.

1.1 Протеолитические ферменты высших грибов.

1.2 Практическое применение протеиназ грибов.

1.3 Молокосвертывающие ферменты, применяемые в сыроделии.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Постановка эксперимента.

2.2 Получение биологического материала.

2.3.Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной.

2.4 Методы исследования протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по природным субстратам.

2.4.1 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по молочно-ацетатной смеси.

2.4.2 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по денатурированному гемоглобину.

2.4.3 Определение активности щелочных протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по казеину.

2.5 Методы определения физико-химических свойств.

2.5.2 Определение рН стабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.3 Определение термостабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.4 Определения температурного оптимума активности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.5 Методика изучения действия ингибиторов на молокосвертывающие ферменты экстракта вешенки обыкновенной.

2.6 Определение оптимальных условий экстрагирования молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной сульфатом аммония.

2.8 Осаждение белков, обладающих молокосвертывающей активностью, из экстракта плодовых тел вешенки обыкнолвенной с помощью хлорида натрия.

2.9 Гель-хроматографичекое разделение белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.10 Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.11 Ионообменная хроматография белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.12 Метод получения сырного сгустка.37"

2.13 Статистическая обработка.37"

Глава 3. Результаты и обсуждение.3^

3.1 Сравнительная оценка методов определения концентрации белка в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной.3 ^

3.3 Определение оптимальных условий экстрагирования белков из плодовых тел вешенки обыкновенной.4-1>

3.4 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно^ сульфатом аммония.

3.5 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно^-хлоридом натрия.^^

3.7 Изоэлектрическое фокусирование белковой фракции плодовых тел вешенки обыкновенной, обладающей молокосвертывающей активностью.

3.8 Ионообменная хроматография молокосвертывающих белков плодовых тел вешенки обыкновенной.^НЗ»

3.9 Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белксу^ плодовых тел вешенки обыкновенной.

ЗЛО Сравнительный анализ физико-химических свойств молокосвертывающих протеиназ вешенки обыкновенной с протеиназам^ из грибов, животных и растений.^

3.11 Получение сырного сгустка.^^

3.12 Способ получения ферментного препарата из плодовых тел вешецЕс^ обыкновенной.^^

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной»

В связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности Г1р0 теиназ сычужного действия остается актуальным поиск новых продуцентов таких ферментов, в том числе среди базидиальных грибов. Многочисл<&цные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереводр азру шающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающизс теиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используе;д/1Ь1МИ продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоцоше-ния в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических з^боле ваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактерИаль ными культурами. Установлено, что гриб 1грех lacteus Fr. способен о(5разо вывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного Фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующее ферментного препарата и молочных продуктов с использованием Данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых культивируемых промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате Вещенки обыкновенной {Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumrn.) обнаружены протеиназы способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается гго всему миру, не токсичен. Его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобны^ сырьем для получения ферментных препаратов.

Целью нашей работы являлось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной {Pleurotus ostreatus (Fr.) Китт.), а также возможность использования к ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Исследование возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35-40 кДа, которые находились в состоянии проферментов и имели точки изоэлектрофокусиро-вания 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопро-теиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором КаС1. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка А§апса1ез. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов. ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Исследование возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 — 40 кДа, которые находились в состоянии проферментов и имели точки изоэлектрофокусиро-вания 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопро-теиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором ЫаС1. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка А§апса1ез. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.

Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеиназ. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 2 статьи и 2 патента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дьяконова, Галина Вячеславовна, 2010 год

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983. -624 с.

2. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд-во МГУ, 1988. -227 с.

3. Белова Н.В. Базидиомицеты как источник биологически активных веществ // Растит, ресурсы. 1991. - Т. 26. - № 2. - С. 8 - 12.

4. Белова Н.В. Перспективы использования активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. 2004. - вып. 2. -С. 1-7.

5. Белова Н.В. , Псурцева Н.В., Мнухина А.Я., Алехина И.А.Современные направления экспериментального исследования базидиомицетов // Ми-кол. и фитопатология. 1997. - Т.31. - вып. 6. — С. 64 -75

6. Бойко М.И., Стадничук В.М.Дереворазрушающие грибы активные продуценты протеиназ молокосвертывающего и тромболитического действия // Успехи медицинской микологии. - 2001. - Т.1. - С. 237 - 238.

7. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре— Киев: Наук. Думка. 1988. - 144 с.

8. Гзогян Л.А. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах: дис. . канд. Биол. наук. Краснодар, 2005. - 111 с.

9. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. М.: б.и.. -2003.-288 с.

10. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба кориола опушенного// Биотехнология. 2003. - №2. - С. 45 - 53.

11. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М: Агропромиздат — 1987-35 с.

12. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеиназ базидиальных грибов // Микология и фитопатология. 1984. - Т.18 - №2. - С. 116 - 121.

13. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов. Таксономические и экологические аспекты их изучения: автореф. дис. . докт. биол. наук 1991. — 31 с.

14. Джорджеску П., Пуэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест: Медицинское изд-во. - 1963. - 611 с.

15. Дзигун Л.П. Особенности дереворазрушающего базидиомицета Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr.) Murrill. в культуре // Украинский ботанический журнал. 2004. - Т.61. - № 1. - С. 100 - 105.

16. Дмитриева Т.А., Корчмарева A.B., Шамцян М.М. Изучение молокосвер-тывающих ферментов высших базидиальных грибов / Т.А. Дмитриева, //

17. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.Справочник биохимика. М.: Мир,- 1991.-544 с.

18. Ершова Е.Ю., Ефременкова О.В. Метод очистки мицелиальных грибных культур от бактериального загрязнения // Микология и фитопатология. -2003. Т. 37. - вып. 4. - С. 92 - 95.

19. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. — М.: ДеЛи принт. 2002. - 236 с.

20. Климовский И.И. Биохимические и микробиологические основы производства сыра. М.: Пищевая промышленность. — 1966. - 207 с.

21. Королев С.А. Основы технической микробиологии молочного дела. М.: «Пищевая промышленность». - 1974. - 344 с.

22. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. - 1980.-282 с.

23. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. - 1990. -135 с.

24. Маттисон H.JL, Н.Н.Фалина Протеолитическая активность Афиллофоро-вых грибов в поверхностной культуре // Микология и фитопатология. — 1973. Т.7. - № 5. - С. 394 - 399.

25. Микробиологические и биохимические процессы в сыроделии и маслоделии: Сб. статей. — М.: «Пищевая промышленность». 1973. - 91 с.

26. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука. - 1971. - 414 с.

27. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. М.: Издательство иностранной литературы. - 1950. - 346 с.

28. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. - 1985. - 536 с.

29. Охрименко О.В., Горбатова К.К., Охрименко A.B. Лабораторный практикум по химии и физике молока. СПб.: Гиорд. -2005. — 256 с.

30. Поединок Н.Л., Бисько H.A., Михайлова О.Б., Потемкина Ж.В., НегрийкоA.М.Повышение эффективности промышленного культивирования съедобного гриба вешенки обыкновенной // Биотехнология. — 2004. № 5. — С. 64-66.

31. Производство новых видов сыра / ГОСИНТИ. М: б.и.. - 1962. - 77 с.

32. Производство сыра : технология и качество. М.: ВО " Агропромиздат". — 1989.-496 с.

33. Псурцева Н.В., Мухина А .Я. Культуральная характеристика и активность экзопротеаз базидиомицетов рода Flammulina I. Поверхностное культивирование // Микология и фитопатология. 1996. - Т.30. - №1. - С. 44 — 50.

34. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. Определение активности химотрип-сина по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси // Материалы 17 научной конференции физиологов юга РСФСР. Т.2. Ставрополь.: ставропольское книжное издательство 1969. - С. 80 - 82.

35. Ревин В.В. , Шутова В.В., Лияськина Е.В., Ибрагимова С.А., СамуиловB.Д. Морфологическая и физиолого-биозимическая характеристика бази76диомицета Panus tigrinus II Микология и фитопатология. 2003. - Т. 37. — вып. 4.-С. 72-77.

36. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. М.: Мир. - 1986. - 398 с.

37. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. М.: «Пищевая промышленность». — 1971.-414 с.

38. Ровбель Н.М. , Гончарова И.А., Смирнов Д.А. Оценка сорбционной активности глубинной биомассы высших базидиальных грибов по отношению к ионам меди // Микология и фитопатология. 2004. - Т.38. -вып. 4.-С. 73-77.

39. Руденская Г.Н. , Гайда A.B., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans Fr. 0456 II Биохимия. — 1980. — T.45. вып.З.- С. 561 - 568.

40. Свириденко Ю.Я. ,. Краюшкин В.А Молокосвертывающие ферментные препараты в свете IDF стандартов // Сыроделие. - 2000. - № 3. - С. 29 -30.

41. Скоупс Р. Методы очистки белков М.: Мир. - 1985. - 375 с.

42. Справочник сыродела / под ред. Н.В. Румянцева. М.: Пищепромиздат. -1954.-520 с.

43. Справочник технолога молочного производства / под ред. Г.Г. Шилера. — С-Пб.: Гиорд. 2003. - 320 с.

44. Степанова Е.В. , Золина Е.Д., Маркович H.A., Зиновьев В.В. Протеазы нематотрофных грибов рода Arthrobotrys и Trichoihecium И Биотехнология. 2001. - № 4. - С. 46 - 52.

45. Сухомлин К.Г. , Дмитриенко С.Н. Биохимия молока и мяса. Краснодар: Издательство КГАУ. - 2005. - 402 с.

46. Теплы М, Машек Я., Гавлова Я. Молокосвертывающие ферменты животного и мкробного происхождения. М.: «Пищевая промышленность». - 1980.-270 с.

47. Федорова JI.H. Протеолитическая активность высших грибов в поверхностной и погруженной культуре // Микология и фитопатология. 1973. -Т.7. - вып. 6. - С. 542 - 544.

48. Федорова Л.Н., Шиврина А.Н.Протеазы «сычужного» действия в культурах высших грибов // Микология и фитопатология. -1974. Т.8. - №1. -С. 22-25.

49. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34. - Вып. 6 - С. 597 - 608.

50. Ферментные препараты в пищевой промышленности. / под. Ред. Чл.-кор. АНСССР B.JL Кретовича и доктора техн. Наук. B.JI. Яровенко. М.: «Пищевая промышленность». - 1975. - 536 с.

51. Ферменты в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Киев: Наук. Думка - 1968. - 252 с.

52. Храмцов А.Г., Милошенко В.В., Оноприйко А.В., Оноприйко В.А. Молоко: производство и переработка (Учебное пособие). Ставрополь: б.и.-2001.-с.

53. Шагинян К.А., Алёхина И.А., Денисова Н.П. Сериновая протеиназа из высшего базидиомицета рода Coprinus II Биохимия. — 1990. Т. 55. — вып. 8.-С. 1387-1395.

54. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. — Москва Ленинград: "Наука". - 1965. - 350 с.

55. Arima К., Iwasaki Sh., Tamura G. Milk clotting enzyme from microorganisms. Part I. Screening test and identification of the potent fungus // Agricultural and biological chemistry. 1967. - V. 32. - № 5.- P. 540 - 545.

56. Berridge N J. Some observations on the determination of the activity of rennet // The Analyst. 1952. - V. 77. - № 911.- P. 57 - 62.

57. Billon Grand G., Poussereau N., Fevre M. The extracellular proteases secreted in vitro and in planta by the phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum //Journal of phytopathology. 2002. - V. 150. - P. 507 - 511.78

58. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein die binding // Analitical Biochemistry. - 1976. - V.72.- P. 248 - 254.

59. Brown E.D., Wynne M.G., Clarke A. J., Yade R.Y. Purification of two fungal aspartic proteinases using fast protein liquid chromatography // Agricultural and biological chemistry. 1990. - V. 54. - № 6.- P. 1563 - 1565.

60. Burton K.S., Hammond J.B.W., Minamide T. Protease activity in Agaricus bisporus during periodic fruiting (flushing) and sporophore development // Current microbiology. 1994. - V. 28. - P. 275 - 278

61. Burton K.S., Wood D.A., Thurston C.F., Barker P,J. Purification and characterization of a serine proteinase from senescent sporophores of the commercial mushroom Agaricus bisporus // Journal of general microbiology. 1993. - V. 139.-P. 1379- 1386

62. Cavalcanti M.T.H., Teixeira M.F.S., Lina Filho J.L., Porto A.L.F. Partial purification of new milk-clotting enzyme prodused by Nocardiopsis spJ/ Biore-sourse Technology. 2004. - V. 93. - P. 29 - 35

63. Dohmae N., Hayashi K., Miki K., Tsumuraya Y., Hashimoto Y. Purification and haracterization of intracellular proteinases in Pleurotus ostreatus fruiting bodies // Bioscience, biotechnology and biochemistry. 1995. - V. 59. - № 11. -P. 2074-2080

64. Esteves C.rL.C., Lucey J.A., Pires E.M.V. Mathematical modelling of the formation of rennet induced gels by plant coagulants and chymosyn // Journal of Dairy Research. - 2001. - V. 68. - P. 499 - 510

65. Fan L. , Pan H., Soccol A.T., Pandey A., Soccol C.R. Advances in mushroom research in last decade // Food technology and biotechnology. 2006. - V. 44. - № 3. - P. 303-311

66. Fujimoto Z., Fujii Y., Kaneko S., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of aspartic prteinase from Irpex lacteus in complex with inhibitor pepstatin // Journal of molecular biology. 2004. - V. 41. - P. 1227 - 1235

67. Hashem A.M. Purification and properties of a milk-clotting enzyme prodused by Penicillum oxalicum I I Bioresource technology. 2000. - V. 75. - P. 219 — 222

68. Hattory M., Isomura Sh., Yo Kogama E., Ujita M., Hara A. Extracellular tryp-sin-like proteases produced by Cordyceps militaris II Journal of Bioscience and Bioengineering. 2005. - V. 100. - № 6. - P. 631 - 636

69. Ichishima E. Unique catalytic and molecular properties of hydrolases from Aspergillus used in Japanese bioindustries // Boiscience, biotechnology and biochemistry. 2000. - V. 64. - № 4. - P. 675 - 688

70. Ikasari L., Mitchell D. Leaching and characerization of Rhizopus oligosporus acid protease from solid state fermentation // Enzyme and microbial technology. - 1996.-V. 19.-P. 171-175

71. Ilani J., Netzer A. Milk-clotting activity of proteolytic enzymes // Journal of dairy science. 1969. - V. 52. - № 1. - P. 43 - 46

72. Kawai M. Flavor enchancement of milk foodstuffs. Pat. US. 3858492. 1975

73. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymes and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes // Nippon Nogei Kagku Kaishy. Journal of the agricultural chemical society of Japan. 1973. - V. 47. - № 8. - P. 467-472

74. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes prodused by Basidiomycetes. Part III. Partial purification and some properties of the enzyme prodused by Irpex lacteus Fr. // Agricultural and biological chemistry. -1971.-V. 35. № 35. -P. 1517-1525

75. Kikuchi E., Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Fiber-structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme // Agricultural and biological chemistry. 1988. - V. 52. - № 5. - P. 1277 - 1278

76. Kikuchi E., Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Suitability of milk-clotting enzyme from Irpex lacteus for Gouda cheese manufacture // The journal of zootechnical science. 1988. - V. 59. - № 6. - P. 532 - 539

77. Kim J.-H., Kim Y.S. A fibrinolytic metalloprotease from the fruiting bodies of an edible mushroom Armillariella mellea II Bioscience, biotechnology and biochemistry. 1999. - V. 63. - № 12. - P. 2130 - 2136

78. Kim J.-H., Kim Y.S. Characterization of a metalloenzyme from a wild mushroom Tricholoma saponaceum II Bioscience, biotechnology and biochemistry. 2000. - V. 65. - № 2. - P. 356 - 362

79. Kobayashi H., Kasamo K., Mizuno H., Kim H., Kusakabe I., Murakamy K. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of aspartic proteinase from Irpex lacteus II Journal of molecular biology. 1992. - V. 226. - P. 1291 -1293

80. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K.Milk-clotting enzyme from Irpex lacteus as a calf rennet substitute for cheddar cheese manufacture // Agricultural and biologycal chemistry. 1985. - V. 49. - № 6. - P. 1605 - 1609

81. Kobayashi H., Kusakabe I., Okamura M., Murakami K. Substrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on peptide hormones // Agricultural and biologycal chemistry. 1986. - V. 50. - № 4. - P. 923 - 930

82. Kobayasy H., Kusacabe I., Muracami K. Purification and characterization of two milk-clotting enzymes from Irpex lacteus II Agricultural and biologycal chemistry. 1983. - V. 47. - № 3. - P. 551 - 558

83. Kowalchyk A.W., Olson N.F. Effekts of pH and temperature on the secondary phase of milk clotting by rennet // Journal dairy science. 1977. - V. 60. - P. 1256 -1259

84. Kumar S., Sharma N.S. , Saharan M.R., Singh R. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization // Process Biochemistry. -2005. -V. 40.-P. 1701 1705

85. Lindahl B.D., Olsson S. Fungal translocation creating and responding to environmental heterogeneity // Mycologyst. - 2004. - V. 18. - part 2. - May. - P. 79-88

86. Lopez A., Teixeira G., Liberatio M.C., Pais M.S., demente A. New vegetal sources for milk clotting enzymes // Journal of molecular catalysis B: enzymatic. 1998.-№ 5. - P. 63-68

87. Lopez M.B., Lomholt S.B., Qvist K.B. Rheological properties and cutting time of rennet gels. Effect of pH and enzyme concentration // International dairy journal. 1998. - V. 8. - P. 289 - 293

88. Machalinski C., Pirpignani M.L., Marino C., Mantegazza A., de Jimenez Boni-no H.B. Structural aspects of the Mucor bacilliformis proteinase, a new member of the aspartyl-proteinase family // Journal of biotechnology. 2006. - V. 123.-P. 443-452

89. Methods in enzymology. Vol. 19 Proteolytic enzymes. N. Y., San Francisco, London: Academic press. 1970. 1042 p.

90. Mukai N., Kawai M. Flavor enhancement of milk foodstuffs. US Patent № 3858492. March 1968

91. Mukai N., Kawai M. Process for produsing milk clotting enzyme. US Patent № 3607655. September 1971.

92. Nerud F., Misurcova Z., Musilek V. Production of milk-clotting enzymes by Basidiomycetes // Folia microbiology. 1989. - V. 34. - P. 310 - 315

93. Newman M., Safro M., Frazao C., Khan G., Zdanov A., Tickle I.J., Blundell T.L., Andreeva N. X-ray analyses of aspartic proteinases IV // Journal of molecular biology. 1991. -V. 221. - P. 1295 - 1309

94. Ng T.B. Peptides and proteins from fungi // Peptides. 2004. - V. 25. - P. 1055-1073

95. Northrop J.H. Pepsin activity units and methods for determining peptic activity. 1932.

96. Pina D.G., Oliveira C.S., Sacramento A.C., Barros M., Pires E., Zhadan G.G., Villar E., Gavilanes F., Shnyrov V.L. Thermostability of cardosin A. from Cynara cardunculus L. // Thermochimica Acta. 2003. - V. 402. - P. 123-134

97. Poza M., de Miguel T. , Sieiro C., Villa T.G. Characterization of a broad pH range protease of Candida caseinolytica II Journal of applied microbiology. V. 91.-P. 916-921

98. Poza M., Prieto-Alcedo M. , Sieiro C., Villa T.G. Cloning and Expression of clt Genes Encoding Milk-Clotting Proteases from Myxococcus xanthus 422 // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70. - No, 10. - P. 6337 - 6341

99. Psurtseva N.V., Mnukhina A.Y. Morphological, physiological and enzyme variability of Flammulina P.Karst. cultures // Микология и фитопатология. -1998. Т. 32. - № 1. - С. 49 - 54

100. Raymond M.N., Bricas Е., Salesse R., Gamier J. A proteolytic unit for chy-mosin (rennin) activity based on a reference synthetic peptide //Journal dairy science. 1973. - V. 56. - № 4. - P. 419 - 422

101. Sardinas J.L. Rennin enzyme of Endothia parasitica II Applied microbiology. 1968. - V. 16. - № 2. - P. 248 - 255

102. Shin H.-H., Choi H.-S. Purification and characterization of cystein protease from Pleurotus ostreatus II Bioscience, biotechnology and biochemistry. — 1998. V. 62. - № 7. - P. 1416 - 1418

103. Silva S.V., Allmere Т., Malcata F.X., Andren A. Comparative studies on the gelling properties of cardosins extracted from Cynara cardunculus and chymo-sin on cow's skim milk // International dairy journal. 2000. - V. 13. - P. 559 -564

104. Silva S.V., Malcata F.X. Studies pertaining о coagulant and protolitic activities of plant proteases from Cynara cardunculus И Food chemistry. 2005. -V. 89.- P. 19-26

105. Sousa M.J., Ardo Y., McSweeney P.L.H. Advances in the study of proteolysis during the cheese ripening // International dairy journal. 2001. - V. 11. -P. 327-345

106. Sternberg M.Z. Crystalline milk-clotting protease from Mucor miehei and some of its properties // Journal of dairy science. 1971. - V. 54- № 2. - P. 159-167

107. Tavaria F.K., Sousa M.J., Malcata F.X. Storage and lyophilization effects of extracts of Cynara cardunculuson the degradation of ovine and caprine caseins // Food chemistry. 2001. - V. 72. - P. 79 - 88

108. Taylor J.B. Biochemical characterization of some additional mycelial cultures of basidiomycetes // Annals of applied biology. 1977. - V. 85. - № 2. -P. 181-193

109. Terashyta T.,. Oda K, Kono M., Murao S. Purification and some properties of metal proteinases from Lentinus edodes II Agricultural and biological chemistry. 1985. - V. 49. - № 8. - P. 2293 - 2300

110. Wadekar R.V., North M.J., Watkinson S.C. Proteolytic activities in two wood-decaing basidiomycete fungi, Serpula lacrimans and Coriolus versicolor II Micobiology. 1995. - V. 41. - P. 1575 - 1583