Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Перевощикова, Ирина Владимировна

• Перевощикова, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Перевощикова, Ирина Владимировна

Список условных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Строение и функции митохондрий в клетке: роль разности электрохимических потенциалов ионов водорода.

1.1.1. Строение и функции митохондрий в клетке.

1.1.2. Хемиосмотическая теория Митчелла.

1.1.3. Гидрофобные катионные красители как маркеры митохондрий в клетке.

1.1.4. Применение современных методов флуорометрии для изучения структуры и функций отдельных митохондрий в клетках и суспензии выделенных органелл.

1.1.5. Строение и функции порина во внешней мембране митохондрий.

1.2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: теория и приложения.

1.2.1. Исторические аспекты развития метода.

1.2.2. Экспериментальная реализация метода.

1.2.2.1. Схема установки для флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

1.2.2.2. Конфокальный объем и способы его определения.

1.2.2.3. Автокорреляционная функция.

1.2.2.4. Гистограмма распределения интенсивностей.

1.2.3. Применение техники флуоресцентной корреляционной спектроскопии в биофизике.*.

1.2.3.1.Изучение взаимодействия и агрегации биомолекул.

1.2.3.2. Использование метода ФКС для изучения кинетики химических реакций биологически-активных молекул.

1.2.3.3. Применение метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии для изучения движения отдельных молекул в проточных системах.

1.2.3.4. Применение метода анализа гистограмм интенсивности флуоресценции.

1.2.3.5. Анализ пиков флуоресценции в суспензии ярких частиц.

1.3. Предпосылки изучения митохондрий методом ФКС.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты.

3.1. Автокорреляционный анализ флуктуаций флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных флуоресцентными красителями.

3.2. Временные зависимости интенсивности флуоресценции для суспензии митохондрий, окрашенных потенциалзависимыми флуоресцентными красителями сафранином О и этиловым эфиром тетраметилродамина.

3.2.1 .Исследование взаимодействия сафранина О с митохондриями методом ФКС.

3.2.2.Исследование взаимодействия этилового эфира тетраметилродамина с митохондриями методом ФКС.

3.3. Метод анализа амплитуд пиков флуоресценции (ААП).

3.3.1. Разработка подхода на модельных системах.

3.3.2. Применение метода анализа амплитуд пиков флуоресценции к суспензии выделенных митохондрий.

3.4. Определение мембранного потенциала выделенных митохондрий в суспензии и на уровне одиночных частиц.

3.5. Исследование взаимодействия флуоресцентных митохондриальных индикаторов потенциала и красителя оксонола VI с субмитохондриальными частицами.

3.6. Изучение функционального состояния порина внешней мембраны выделенных митохондрий.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии»

Современную науку характеризирует постепенный переход от изучения« объектов на макроуровне (вещества в целом) к свойствам нанообъектов и даже одиночных молекул. Этот общий тезис особенно применим к современной биофизике, где в последнее время нашли применение^ такие методы изучения биомолекул как атомно-силовая микроскопия, флуоресцентная микроскопия отдельных молекул, измерение активности одиночных каналов и некоторые другие. Метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) основан на регистрации флуктуаций флуоресценции отдельных частиц, возникающих в результате броуновского движения в освещенном лазером* объеме1 пространства, (конфокальном объеме). Современные объективы позволяют сфокусировать лазерный луч в пятно размером в доли микрона и регистрировать сигнал от объема в, несколько фемтолитров. Стандартная\ обработка- сигнала в виде автокорреляционной функции (О(т)) позволяет получить информацию о двух важных параметрах суспензии частиц: времени диффузии частицы» (т^) и числе частиц в конфокальном объеме (И), т^ обратно пропорционально коэффициенту диффузии и прямо пропорционально размеру частиц. Традиционно метод ФКС используется, для- исследования' биофизических процессов, связанных с изменением подвижности объектов, и позволяет изучать такие процессы как агрегация частиц, связывание флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, связывание с липидными везикулами и т.д. Существенно, что такой подход имеет ограничение на размер исследуемых объектов, составляющее около 100 нм. Другим параметром суспензии флуоресцирующих частиц, измеряемым методом ФКС, является их яркость. Временная зависимость интенсивности флуоресценции для суспензии ярких частиц характеризуется появлением скачков (или пиков) сигнала на фоне практически постоянного (низкоамплитудного) сигнала базового уровня. Каждый скачок соответствует прохождению отдельной частицы через конфокальный объем. Важно отметить, что амплитуда флуктуаций флуоресценции не зависит от размера объекта, а определяется, числом молекул флуорофора на одну; частицу при постоянных технических; характеристиках прибора. Именно это свойство было использовано нами для определения яркости, отдельных частиц, в суспензии на основании анализа амплитуды пиков флуоресценции.

Объектом: исследования в настоящей работе, были изолированные митохондрии,, окрашенные различными флуоресцентными ' красителями. Митохондрии играют важную роль в функционировании клетки. Источником энергии! для, большинства1; биохимических процессов в клетке является; АТФ, синтезируемый в митохондриях. На внутренней мембране; митохондрий в результате окисления; субстратов и векторного переноса, протонов«: и электронов генерируется разность электрохимических потенциалов, ионов водорода, используемая« впоследствии? для работы АТФ-сиптазы. Митохондрии также выполняют ряд. других важных функций , и играют центральную роль в таких процессах как; старение: и апоптоз. Поддержание постоянной величины мембранного потенциала митохондрий; является необходим условием жизнедеятельности митохондрии и клетки в целом:. Трудности прямого измерения, мембранного: потенциала связаны,.в первую очередь, с малым размером митохондрий (около 0,5 мкм). Это не позволяет использовать- стандартную электродную,- технику. В ходе: традиционных измерений? различных, функциональных параметров митохондрий, в том числе мембранного потенциала, с применением флуоресцентных и радиоактивных меток, а также; ион-селективных электродов^ регистрируются изменения4 соответствующего1 сигнала,, усредненного- по всем частицам в. суспензии' выделенных' органелл. Однако, сложность структуры и уникальность выполняемых функций делает актуальной задачу поиска методов характеристики митохондрий на уровне отдельных частиц в физиологических и патологических, условиях. Попытки; использования методов цитологических исследований; для решения; такой задачи не принесли значительных результатов в виду малых размеров органелл по сравнению с размерами клетки. В связи с этим представлялось весьма перспективным разработать экспериментальный подход на основе метода ФКС, применимый для анализа флуктуаций флуоресценции, связанных с движением одиночных окрашенных митохондрий в малом объеме пространства, и изучить функциональное состояние митохондрий в суспензии с помощью такого подхода.

Автор выражает благодарность научному руководителю Антоненко Юрию Николаевичу, научному консультанту Зорову Дмитрию Борисовичу и Котовой Елене Аврамовне за помощь в проведении исследовательской работы, обсуждении результатов, написании статей. А также коллегам и сотрудникам НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского за плодотворное обсуждение текущих результатов на семинарах.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Перевощикова, Ирина Владимировна

Выводы.

1. На. основе метода флуоресцентной; корреляционной спектроскопии, суть которого состоит в измерении флуктуаций флуоресценции от микрообъема, составляющего несколько фемтолитров, разработан модифицированный экспериментальный подход, названный методом анализа амплитуд пиков (ААП) флуоресценции- суспензии окрашенных частиц. Метод ААП позволяет оценить два основных параметра системы: яркость частицы и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии. Выведено аналитическое выражение для вычисления яркости: одиночной: частицы, и параметра, пропорционального числу флуоресцирующих частиц:в суспензии.

2. Метод ААП: опробован, на модельной системе; содержащей! гомогенные по яркости и размеру флуоресцентные сферы (типичный размер 500 нм).

3: Показано, что метод ААП позволяет исследовать свойства отдельных митохондриальных частиц или их малых ансамблей. Разработанный подход применен для анализа функционального; состояния выделенных митохондрий. С помощью анализа флуоресценции; суспензии выделенных . ' - ^ митохондрий, окрашенных потенциалзависимым флуоресцентным красителем, этиловым эфиром; тетраметилродамипа (ТМРЭ), измерен мембранный потенциал митохондрий, а также число частиц в миллиграмме белка. Преимущество, данного подхода перед традиционными методами измерения мембранного потенциала состоит в том, что он позволяет проводить измерения; при наличии менее 1 мкг белка в пробе, что делает доступным изучение митохондрий, выделенных из культур клеток.

4. Прямыми измерениями флуоресценции суспензии энергизованных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым красителем сафранином О; показано уменьшение концентрации молекул флуорофора в растворе и накопление их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения.

При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ.

5. Метод ААП позволил исследовать влияние различных модуляторов порина внешней мембраны митохондрий на вход флуоресцентно меченного АТФ в интактные органеллы в физиологических условиях. Показано, что наличие большого числа АТР-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает накопление флуоресцентно меченного АТФ внутри органелл в высоких концентрациях. Показано также, что связывание фермента гексокиназы приводит к блокированию транспорта АТФ через пориновый канал.

Заключение

Подведем некоторые итоги проделанной работе по применению техники ФКС к изучению выделенных митохондрий. Прежде всего, следует отметить переход от измерения усредненных характеристик флуоресценции системы в целом к измерениям флуоресценции от отдельных частиц: окрашенных митохондрий и несвязанного красителя. Одним из практических результатов этого методического достижения, полученным в нашей работе, является прямое измерение числа митохондриальных частиц в миллиграмме митохондриального белка. Благодаря такому анализу удалось разобраться в природе потенциалзависимых изменений флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных красителем сафранином О. Был подтвержден вывод о том, что снижение общего уровня флуоресценции в этом случае связано с уменьшением концентрации молекул флуорофора в растворе и накоплением их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения. При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ. Следует отметить также, что высокая чувствительность метода ФКС позволила проводить измерения в случае ТМРЭ при очень низких количествах митохондриального белка (до 1 мкг). Это открывает новые возможности для оценки функционального состояния (в том числе мембранного потенциала) суспензии выделенных митохондрий, полученных из культур клеток тканей.

Помимо традиционных митохондриальных красителей, которые использовались в данной работе, был обнаружен новый перспективный краситель, а именно флуоресцентно-меченый АТФ (АТФ-ВосНру). Оказалось, что окрашивание митохондрий этим красителем существенно зависит от проницаемости внешней мембраны митохондрий. С помощью ингибиторного анализа было показано, что накопление АТФ-ВосНру определяется

1 * функциональным состоянием, поринаг внешней мембраны* митохондрий; Это направление работы является очень актуальным, поскольку было показано, что порин участвует в таких процессах как формирование неспецифической поры в митохондриях и апоптоз. Таким образом, порин оказывает существенное влияние на жизнедеятельность клетки в целом.

Помимо явных достижений данный подход обнаружил и свои слабости. В первую очередь здесь» следует сказать о неспособности метода оценивать гетерогенность суспензии митохондрий по яркости1 частиц. Следует сказать, что популяционный анализ выделенных митохондрий является весьма важной и актуальной, задачей в-силу того, что множество косвенных данных указывает на существование функционально* различных фракций митохондрий в суспензии; что существенно затрудняет анализ получаемых результатов [184]. По* своей; сути подход ФКС призван решать задачу о нахождении яркости в смеси частиц. И'действительно, в случае5 красителей и окрашенных белков подобные, задачи были решены [107-108-, 156, 158]. К сожалению, использованные2 в. данных работах подходы» не позволяют измерять »частицы такого большого размера как митохондрии. Примененный нами метод ААП оказался, к сожалению,4 малоэффективным' к обнаружению смесей частиц различной, яркости. Необходима дальнейшая^ работа над * совершенствованием данного подхода для решения-задачи о популяционном анализе митохондрий. Нам представляется, что одним из направлений решения этой задачи является совершенствование техники проведения экспериментов. В частности, планируется- применение специальных ячеек в виде, узких капилляров, которые позволят осуществлять направленный пролет митохондриальных частиц через центр конфокального объема. Можно надеяться, что это приведет к существенному уменьшению разброса наблюдаемых амплитуд пиков флуоресценции от одинаковых по яркости частиц, что позволит достоверно различать наличие частиц различной яркости. Эта сложная задача выходит за рамки данной работы и должна быть решена в ходе другого самостоятельного исследования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Перевощикова, Ирина Владимировна, 2009 год

1. Johnson D., Lardy Н. Isolation of liver and kidney mitochondria. Methods Enzymol, 1967, 10: 94-96

2. Ленинджер А. Основы биохимии. M.: Мир, 1985, Т1, с. 36-38

3. Николе Д.Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. М.: Мир, 1985, с. 13-14

4. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмащук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.К., Митохондрия как многоликий Янус. Обзор. Биохимия, 2007, 72(10): 1371-1384

5. Mitchell P., Moyle J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature, 1967, 213(5072):137-139

6. Linnane A.W., Kios M., Vitetta L. Healthy aging: regulation of the metabolome by cellular redox modulation and prooxidant signaling systems: the essential roles of superoxide anion and» hydrogen peroxide. Biogerontology, 2007, 8(5): 445-467

7. Harman Di Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. Gerontol, 1956, 11(3): 298-300

8. Bakeeva L.E., Chentsov Yu.S., Skulachev V.P. Intermitochondrial contacts in myocardiocytes J.Mol.Cell.Cardiol., 1983, 15(7):413-420

9. Amchenkova A.A., Bakeeva L.E., Chentsov Yu.S., Skulachev V.P., Zorov D.B. Coupling membranes as energy-transmitting cables. I. Filamentous mitochondria in fibroblasts and mitochondrial clusters in cardiomyocytes. J.Cell Biol., 1988, 107(2):481-495

10. O.Chang D.T., Reynolds I.J. Mitochondrial trafficking and morphology in healthy and injured neurons. Prog.Neurobiol., 2006, 80(5): 241-268

11. Zorov D.B., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Vysokikh M.Yu., Zorova L.D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Biosci.Rep., 1997, 17(6): 507-520

12. Ленинджер А. Основы биохимии. M.: Мир, 1985, Т2, с. 447-500

13. Watford M. The urea cycle: two-compartment system. Essays.Biochem., 1991, 2: 649-658

14. Pellegrini L., Scorrano L. A cut «short to death: Pari and Opal in the regulation of mitochondrial morphology and apoptosis. Cell Death Differ., 2007, 14(7): 1275-1284

15. Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Hirsch Т., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J.Exp.Med., 1996, 183: 1533-1544

16. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson N., Wang X. Introduction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and. cytochrome c. Cell, 1996, 86:147-157

17. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B. The biochemistry of programmed cell death. FASEB J., 1995, 9:1277-1287

18. Bakeeva L.E., Grinius L.L., Jasaitis A.A., Kulene V.V., Levitsky D.O., Liberman E.A., Severina-I.L, Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. II. Intact mitochondria. Biochem. Biophys.Acta, 1970, 216(1):13-21

19. Скулачев В.П., Трансформация энергии в биомембранах. М.": Наука, 1972, с.203

20. Liberman Е.А., Topali V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. Nature, 1969. 222:1076-1078

21. Мейсель M.H., Заварзина Н.Б. Флуоресцентно-микроскопические наблюдения над живыми клетками микроорганизмов. I. Дрожжевые и дрожжеподобные микроорганизмы. Микробиология, 1947,Т XVI, 5: 394402

22. Bereiter-Hahn J. Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine (DASPMI) as, a fluorescent probe for mitochondria in situ. Biochim.Biophys.Acta, 1976, 423:114

23. Морозова Г.И., Добрецов Г.Е., Дубур Г.Я., Голицин В.М., Баренбойм Г.М., Владимиров Ю.А. Флуоресценция 4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния в животной клетке. Цитология, 1981, Т. 23: 916-923

24. Mewes H.W., Rafael J. The 2-(dimethylaminostyry 1)-1-methylpyridinium cation as indicator of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett., 1981, 131:7-10

25. Rafael J. 2-(dimethylaminostyryl)-l-ethylpyridiniumiodide: a fluorescent probe* of energetic condition in brown adipose tissue mitochondria. Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem, 1980, 361:437-444

26. Rafael J. Nichols D.G. Mitochondrial' membrane potential monitored» in situ within isolated guinea brown adipocytes by a styryl pyridinium fluorescent indicator. FEBS Lett., 1984, 170:181-185

27. Johnson LV, Walsh ML, Chen LB Localization'of mitochondria* in!living cells with rhodamine 123*. Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 1980, 77(»2):990-994

28. Мурванидзе Г.В., Северина И.И., Скулачев В.П. Этилродамин: проникающий катион* и прижизненный F флуоресцентный индикатор мембранного потенциала цианобактерий. ДАН СССР,' 1981', Т.26Г, 5: 1252-1254

29. Matzke М.А., Matzke A.J.M. Visualization-of mitochondria and nuclei in living cells by the use of a potential-sensitive fluorescent dye. Plant.Cell Environ., 1986,9:73-77

30. Septinus M., Seiffert W., Zimmermann H.W. Hydrophobic acridine dyes for fluorescence staining of mitochondria in living cells. 1. Thermodynamic and spectroscopic properties of 10-n-alkylacridine orange chloride. Histochemistry, 1983,79:443-456

31. Erbrich U., Septinus M. Naujok A., Zimmerman H.W. Hydrophobic acridine dyes for fluorescence staining of mitochondria in living cells.2.Comparison ofstaining of living and fixed HeLa-cells with NAO and DPP AO. Histochemistry, 1984, 80:385-388

32. Erbrich U., Naujok A., Petschel K., Zimmermann H.W. The fluorescent staining of mitochondria in living HeLa-and LM-cells with new acridine dyes. Histochemistry, 1982, 74:1-7

33. Erbrich U., Berthold Th., Zimmermann H.W. Effect of acridine dyes on the ultrastructure of mitochondria in HeLa-and LM-cells. Histochemistry, 1982, 76: 211-218

34. Waggoner A.S. Dye indicators of membrane potential. Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 1979,f 8:47-68

35. Laris P.S., Bahr D.P., Chaffee R.RiJ. Membrane potentials in mitochondrial preparations as measured by means of cyanine dye. Biochim.Biophys. Acta, 1975, 376:415-425

36. Kinnally K.W., Maloff B.L., Tedeschi H. Use of dyes to estimate the electrical potential of the mitochondrial membrane. Biochemistry, 1978, 17: 3419-3428

37. Bunting J.R., Phan T.Y. Kamali E., Dowben R.M. Fluorescent cationic probes of mitochondria. Metrics andsmechanism of interaction. Biophys J'., 1989, 56: 979-993

38. Tomov T.Ch. Pyronin G as a fluorescent probe for quantitative determination of the membrane potentiaLof mitochondria. J. Biochem. Biophys. Methods, 1986, 13: 29-38

39. Waldmeier P.C., Feldtrauer J., Qian T., Lemasters J.J. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmuno suppressive cyclosporin derivate NIM811. Mol. Pharmacol., 2002, 62: 22-29

40. Millot J.M., Sharonov., Manfait M. Scanning microspectrofluorometry of rhodamine 123 in multidrug-resistant cells. Cytometry, 1994. 17:50-58

41. Salmeen Ii, Zacmanidis P., Jesion G., Feldkamp A. Motion of mitochondria: in cultered cellsquantificd by analysis.of digitized images. Biophys J. 1985. 48: 681-686

42. Medica-Napolitano J.S., Aprille J.R. Basis for the selective cytotoxicity of rhodamine 123 Cancer Res., 1987,47:4361-4365

43. Ehrenberg B., Montana V., Wei M.D., Wuskell J:P.,. Loew L.M. Membrane potential can be determined in individual cells from the Nernstian distribution of cationic dyes. Biophys J., 1988, 53:785-794 ,

44. Loew L.M., Tuft R.A., Carrington W. Fay F.S. Imaging- in five:dimentions: time-dependent membrane potentials in individual; mitochondrion. Biophys J., 1993, 65:2396-2407

45. Scaduto R.C., Grotyohann L.W. and- Jr. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J., 1999, 76:469-477 J

46. O'Reilly C:M., Fogarty K.E., Drummond R.M., Tult R.A., Walsh J.V.Jr. Quantitative analysis of spontaneous;mitochohdrial^depolarizations. Biophys.J.,2003, 85:3350-3357

47. Siemen D., Loupatatzis C., Borecky J., Gulbins E., Lang F. Ca activated K channel of the BK-type in the inner mitochondrial membrane of a human glioma cell line. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1999, 257:549-554

48. Petit P.X., O'Conner J.E., Grunwald D., Brown S.C. Analysis of the membrane potential of rat and mouse liver mitochondria by flow cytometry and possible applications. Eur. J. Biochem., 1990, 194:389-397

49. Shapiro H.M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods, 2000,21:271-279

50. Bassoe C-F., Li N., Ragheb K., Lawler G., Sturgis J., Robinson J.P. Investigation of phagosomes, mitochondria, and acidic granules in human neutrophils using fluorescent probes. Cytometry Part B, 2003, 51B:21-29

51. Mathur A., Hong Y., Kemp B.K., Barrientos A.A., Erusalimsky J.D. Evaluation of fluorescent dyes for the detection of mitochondrial membrane potential changes in cultured cardiomyocytes. Cardiovascular Research, 2000, 46:126-138

52. Cossarizza A., Ceccarelli D., Masini A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level Exp.Cell.Res., 1996, 222:84-94

53. Medina J.M., Lopez-Mediavilla C., Orfao A. Flow- cytometry of isolated mitochondria during development and under some pathological conditions. FEBS Lett., 2002, 510: 127-132

54. Lecoeur H., Langonne A., Baux L., Rebouillat D., Rustin P., Prevost M-Ch., Brenner C., Edelman L., Jacotot E. Real-time flow cytometry analysis of permeability transition in isolated mitochondria. Exp.Cell Res., 2004, 294: 106117

55. Parsons D.F., Boner W.D., Verboon J.G. Electron microscopy of isolated plant mitochondria and plastids using both the thin-section and negative-staining techniques. Canad. J.Botany, 1965, 43:647-655

56. Schein J.S., Golombini M., FinkelsteinA: Reconstitution'in planar.lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria. J.Membrane Biol., 1976, 30: 99-120

57. Zoratti Ml, Szabo I. The: mitochondrial permeability transitions Biochim.Biophys. Acta, 1995, 1241(2):139-176 ,

58. Biihler Sj. Michels:Jj, WendtiS*. Ruck A,.BrdiczkaiD| WelteïiW/ PrzylylskiM; Mass Spectrometric mapping ■ oê ion; channel' proteins (porins) and? idëntification • of their supramolecular membrane assembly . Proteins, 1998/2:63-73?

59. Beutner. G, Ruck A, Riede Bi, Welte; W, Brdiczka D. Complexes between kinases mitochondriaPporin and- adenylate translocator:in! ratibráin resemble the permeability transition pore. FEB SEett., 1996, 396:189-195

60. Crompton M., Virji S., Wand JIM; Cyclophilin-D binds strongly to complexes of the voltage-dependent anion'channel and the adenine nucleotide translocase to form the.permeability transition pore. Eur.J.Biochem, 1998, 258(2):729-35

61. Vyssokykli MY, Brdiczka D. The function of complexes between the outer mitochondrial membrane pore (VDAC) and the adenine nucleotide translocase in regulation of energy metabolism and apoptosis. Acta Biochim Pol., 2003, 50(2);389-404 '

62. Shimizu S., Shinohara Y., Tsujimoto Y. Bax and Dcl-xL independently regulate apoptotic changes of yeast mitochondria that require VDAC but not adenine nucleotide translocator. Oncogene, 2000, 19(38):4309-4318

63. Pastorino JG, Shulga N, Hoek JB. Mitochondrial binding of hexokinase II inhibits Bax-induced cytochrome c release and apoptosis. J.Biol.Chem., 2002, 277:7610-7618

64. Zorov D.B., Juhaszova M., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S., Sollott S.J. regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc.Res., 2009, 83(2): 213-25

65. Azoulay-Zohar H., Israelson A., Abu-Hamad S., Shoshan-Barmatz V. In self-defence: hexokinase promotes voltage-dependent anion channel closure and prevent mitochondria-mediated apoptotic cell death. Biochim J., 2004, 37:347355

66. Mikhailov V, Mikhailova M., Pulkrabek D.J., Dong Z., Venkatachalam M.A., Saikumar P. Bcl-2 prevents Bax oligomerization in the mitochondrial outer membrane J.Biol.Chem., 2001, 276(21):18361-18374

67. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role n cell death.'Biochim J., 1999, 341:233-249

68. Tan W., Colombini M. VDAC closure increases calcium ion flux. Biochim.Biophys.Acta, 2007, 1768(10):2510-2515

69. Baines C P, Kaiser R.A., Sheiko T., Craigen W.J:, Molkentin J.D. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat.Cell.Biol., 2007, 9(5):550-555

70. D. Magde, E. Elson and W. W. Webb Thermodynamic fluctuations in a reacting system measurement by fluorescence correlation spectroscopy. Phys. Rev. Letters, 1972, 29: 705

71. Elson E.L., Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolumers, 1974, 13:1-27

72. Magde D., Elson- E.L., Webb W.W. Fluorescence correlationspectroscopy.ir.An experimental realization. Biopolymers, 1974, 13:29-61

73. Magde Di-, Webb W.W., Elson E.L. Fluorescence correlation spectroscopy.III.Uniform translation and laminar flow. Biopolymers, 1978, 17:361-376

74. Elson E.L., Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolumers, 1974, 13:1-27

75. Ehrenberg M., Rigler R. Fluorescence correlation spectroscopy applied to rotational diffusion of macromolecules Q.Rev.Biphys, 1976, 9(1) 69-81

76. Koppel D.E., Axelrod D., Schlessinger J., Elson E.L., Webb W.W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility Biophys J., 1976, 16:1315-1329,

77. Aragon S.R., Pecora R. Fluorescence correlation spectroscopy and Brownian rotational diffusion. Biopolymers, 1975, Y4: 119-139

78. Fahey P.F., Koppel D.E., Barak L.S., Wolf D.E., Elson E.L., Webb W.W. Lateral diffusion in planar lipid bilayers. Scince, 1977, 195(4275) 305-306

79. Webb W.W. Application of fluorescence correlation spectroscopy Q. Rev.Biophys, 1976, 9(l):49-68

80. Rigler R., Mets U., Widengren J., Kask P. Fluorescence correlation spectroscopy with high count rate and low background: analysis of translational diffusion. Eur. Biophys. J., 1993, 22:169-175

81. Eigen M., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. ProcNatlAcadSci, USA, 1994, 91(13): 5740-7

82. Rigler R., Pramanik A., Jonasson P., Kratz G., Jansson O.T., Nygren P.-A.,j

83. Stahl S., Ekberg K., Johansson B.-L., Uhlen S., Uhlen M., Jörnvall H., Wahren J. Specific binding of proinsulin C peptide to human cell membranes Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 1999, 96(23): 13318-13323

84. Koppel D! Statistical accuracy in fluorescence correlation spectroscopy Phys.Rev.A., 1974, 10:1935

85. Kask P. Günther R. Axhausen P. Statistical accuracy in fluorescence fluctuation experiments Eur.Biophys.J. Biophys Lett., 1997, 25:163-169

86. Qian H. On the statistics of fluorescence correlation spectroscopy Biophys. Chem., 1990,38:49-57

87. Meseth U., Wohland Т., Rigler R., Vogel H. Resolution of fluorescence correlation spectroscopy Biophys. J., 1999, 76:1619-31

88. Kask P., Palo K., Ullman D., Gall K. Fluorescence intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. PNAS, 1999, 96(24): 13756-13761

89. Chen Y., Müller J.D., So P.T.C., Gratton E. The photon counting histogram in fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 1999, 77:553-567

90. Chen Y., Müller J.D., Tetin S.Y., Tyner J.D., Gratton E. Probing liand protein binding equilibria with fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 2000, 79:1074-1084

91. Denk W., Strickler JH, Webb W.W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science, 1990, 248 (4951): 73-76

92. Ремизов A.H., Максина А.Г., Потапенко А.Я:. Медицинская и биологическая физика. М.:Дрофа, 2003, с. 375-383

93. Enderlein» J., Gregor J., Patra D., Dertinger Т., Kaupp U.B. Performance of fluorescence correlation spectroscopy for measuring diffusion and concentration. ChemPhysChem., 2005, 6(11): 2324-36

94. Rüttinger S., Buschmann V., Krämer* В., Erdman R., Macdonald R., Koberling F. Determination of the confocal volume for quantitative fluorescence correlation spectroscopy. SPIE-OSA, 2007, 6630, 66300D-1

95. Sachl R., Mikhalyov I., Hof M., Johansson L. A comparative study oni * »/ » 1 f,'ganglioside micelles using electronic energy transfer, fluorescence correlation spectroscopy and light scattering techniques. Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11: 4335-4343

96. Petrasek Z., Schwille P. Precise measurement of diffusion* coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 2008, 94: 14371448

97. Gendron P.O., Avaltroni F. Wilkinson K.J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclean magnetic resonance and FCS. J. Fluoresc., 2008, 18(6): 1093-1101

98. Miiller J. D., Chen Y, Gratton E. Resolving heterogeneity on* the single molecular level with the photon-counting histogram. Biophys J., 2000, 78: 474486

99. Chen Y., Miiller J. D., Ruan Q.Q., Gratton E. Molecular brightness characterization of EGFP in vivo by fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 2002, 82:133-144

100. Clamme J.P., Azoulay J., Mely Y. Monitoring of the formation and dissociation of polyethylenimine/DNA complexes by two photon fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 2003. 84: 1960-1968

101. Pramanik A., Thyberg P., Rigler R. Molecular interactions of peptides with phospholipid vesicle membrane as studied by FCS. Chem.Phys.Lipids, 2000, 104(1)35-47

102. Rhoades E., Ramlall T.F., Webb W.W., Eliezer D. Quantification of a-synuclein binding toiipid vesicles using FCS. Biophys J., 2006, 90:4692-4700

103. Schwille P., Korlach J., Webb W.W. FCS with single-molecular sensitivity on cell and model membranes. Cytometry, 1999, 36(3) 176-182

104. Korlach J., Schwille P., Webb W.W., Feigenson G.W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and FCS. Proc.Natl.Acad.Sci., USA. 1999, 96(15)8461-8466

105. Gerard M., Debyser Z., Desender L., Kahle P.J., Baert J., Baekelandt V., Engelborghs Y. The aggregation of alpha-synuclein is stimulated by FK506 binding proteins as shown by FCS. FASEBJ., 2006, 20(3): 524-526

106. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein liked to early-onset Parkinson disease. Nat.Med., 1998,4:1318-1320

107. Kinjo M., Rigler R. Ultrasensitive hybridization analysis using fluorescence correlation spectroscopy. Nucleic.Acids.Research, 1995, 23(10)» 1795-1799

108. Wetmur J.G., DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 1991, 26(3-4) 227-259

109. Sevenich F.W., Langawski J., Weiss V., Rippe K. DNA binding and oligomerization of NtrC studied by fluorescence anisotropy and FCS. Nucleic. Acids.Res., 1998, 26(6) 1373-1381

110. Politz J.C., Browne E.S., Wolf D.E. Pederson T. Intranuclear diffusion and hybridization state of oligonucleorides measured by FCS' in living cells. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(11) 6043-6048

111. Saffarian S., Li Y., Elson E.L., Pike L.J. Oligomerization of the EGF receptor investigated by the live cell'fluorescence intensity distributiomanalysis. Biophys J., 2007, 93: 1021-1031

112. Lieto A.M., Cush R.C., Thompson N.L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J., 2003, 85:3294-3302 ^

113. Allen N.W., Thompson N.L. Ligand binding by estrogen receptor Beta attached to nanospheres measured by fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry Part A, 2006, 69A:524-532

114. Iannone M.A., Consler T.G., Pearce K. H., Stimmel L.B., Parks D.J., Gray J.G. Multiplexed molecular interactions of nuclear receptors using fluorescent microspheres. Cytometry, 2001, 44:326-337

115. Wohland T., Friedrich K., Hovius R., Vogel H. Study of ligand-receptor interections by FCS with different fluorophores evidence that the homopentameric 5-hydroxytryptamine type 3As receptor binds only one ligand. Biochemistry, 1999, 38(27) 8671-8681

116. Tairi A.P., Hovius R., Pick H., Blasey H., Bernard A., Surprenant A., Lundstrom K., Vogel H. Ligand binding to the serotonine 5HT3 receptor studied with a novel fluorescent ligand. Biochemistry, 1998, 37: 15850-15864

117. Oehlenschlanger F., Schwille P., Eigen M\ Detection of HIV-1 RNA by nucleic acid sequence-based amplification* combined with FCS. Proc.NatI.Acad.Sci., USA, 1996, 93(23) 12811-12816

118. Walter N.G., Schwille P., Eigen: M. Fluorescence correlation analysis of probe diffusion simplifies quantitative pathogen detection by PCR. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1996, 93(23)12805-12810

119. Van Craenenbroeck E., Enqelborghs Y. Quantitative characterization of the binding of fluorescently labeled colchicine to tubulin in vitro using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistiy, 1999, 38(16): 5082-5088

120. Starchev K., Zhang J., Buttle J. Application of FCS-Particle size effect. Journal of colloid and interface science, 1998, 203: 189-196

121. Krichevsky O., Bonnet G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep.Prog.Phys., 2002. 65: 251-297164

122. Haupts U., Maiti S., Schwüle P., Webb W.W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by FCS. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95:13573-13578*

123. Dickson R.M., Cubitt A.B., Tsien R.Y., Moerner W.E. On/off blinking and switching behavior of single molecules of green fluorescent protein. Nature, 1997, 388(6640): 355-358

124. Persson G., Thyberg P., Widengren J. Modulated fluorescence correlation* spectroscopy with complete time range information. Biophys J., 2008, 94: 977985

125. Bonnet G., Krichevsky O., Libchaber A. Kinetics of conformational fluctuations in DNA hairpin-loops. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998; 95: 86028606

126. Magzoub M. Padmawar P., Dir J.A., Verkman A.S. Millisecond association kinetics of K+ with triazacryptand-based K+ indicator measured by FCS. J.Phys.Chem.B., 2006, 110(42):21216-2121

127. Gösclr M. Blom H., Holm J., Heino T., Rigler R. Hydrodynamic flow profiling in microchannel structures by single molecule fluorescence correlation spectroscopy. Anal.Chem., 2000, 72:3260-3265

128. Dittrich P.S. Schwille P. Special two-photon fluorescence cross-correlation spectroscopy for controlling molecular transport in microfluidic structures. Anal.Chem., 2002, 74: 4472-4479

129. Brister P.C., Kuricheti K. K.,Buschmann V., Weston K.D. FCS for flow rate imaging and monitoring-optimization, limitations and artifacts. Lab Chip, 2005, 5:785-791

130. Kuricheti K.K., Buschmann V., Weston K.D: Application of FCS for velocity imaging in microfluidic devisee. Appl.Spectrosc., 2004, 58(10): 11801186

131. Brinkmeier M., Dörre K., Stephan J., Eigen M. Two beam cross-correlation: a i method to characterize transport phenomena in micrometer-sized stuctures. Anal.Chem., 1999, 71: 609-616

132. Pan X., Shi X., Korzh V., Yu H., Wohland T. Line scan FCS for three-dimensional microfluidic flow velocity measurement. J.Biomed.Opt., 2009, 14(2): 024049

133. Pan X., Yu II., Shi X., Korzh V., Wohland T. Characterization of flow direction* in microchannels and zebrafish, blood vessels by scanning FCS. J.Biomed.Opt., 2007, 12(1):014034

134. Malone M.H., Sciaky N., Stalheim L., Hahn K.M., Linney E., Johnson G.L. Laser scanning velocimetry: a confocal microscopy method for quantitative measurement of cardiovascular performance in zebrafish embryos and larvae. BMS Biothechnol, 2007, 7:40

135. Okagbare P.I., Soper S.A. High throughput single molecule detection for monitoring biochemical reactions. Analyst, 2009, 134(1):97-106

136. SantaLucia J. Jr. A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95:1460-5

137. Edel J.B., de Mello A.J. Single particle confocal fluorescence spectroscopy in microchannels: dependence of burst width and burst area distribution on particle size and flow rate. Analytical Science, 2003, 19: 1065-1069

138. Park H:Y., Qie X., Rhoades E., Korlach J., Kwok L.W., Zipfel W.R., Webb W.W., Pollach L. Achieving uniform mixing in a microfluidic device: hydroydamic focusing prior to mixing. Anal.Chem., 2006, 78: 4465-4473

139. Qian H., Elson E.L. On the analysis of high order moment6 of fluorescence fluctuations. Biophys.J., 1990, 57: 375-380

140. Eid J.S., Mliller J.D., Gratton E. Data acquisition card for fluctuation correlation spectroscopy. Rev.Sci.Instrum., 2000, 71(2): 361-368

141. Qian H., Elson E.L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. PNAS, 1990, 87: 5479-5483

142. Kask P., Palo K., Ullmann D., Gall K. Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1999, 96(24): 13756-13761

143. Kask P., Palo K., Fay N., Brand L., Mets U., Ullmann D., Jungmann J., Pschorr J., Gall K. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. BiophysJ., 2000, 78(4): 1703-1713

144. Chen Y., Wei L-N., Miiller J.D. Probing protein oligoinerization in living cells with fluorescence fluctuating spectroscopy. PNAS, 2003, 100(2): 1549215497

145. Egea P.F., Rochel N., Birch C., Vachette P., Timmins P.A., Moras D. Effect of ligand, binding on the association properties and conformation in solution of retinoic acid receptor RXR and RAR. J.Mol.Biol., 2001, 307:557-576

146. Huang B., PeiTOud T.D., Zare R.Nt Photon counting histogram: one photon excitation. Chem.Phys.Chem., 2004, 5: 1523-1531

147. Van Craenenbroeck E., Matthys G., Beirlant J., Engelborghs Y. A statistical analysis of fluorescence correlation data. Journal of Fluorescence, 1999, 9(4): 325-331

148. Van Rompaey E., Sanders N., De Smedt S.C., Demeester J., Craenenbroeck E., Engelborghs Y. Complex formation between cationic polymethacrylates and oligonucleotides. Micromolecules, 2000, 33: 8280-8288

149. Van Rompaey E., Engelborghs Y., Sanders N., De Smedt S.C., Demeester J. Interactions between oligonucleotides and cationic polymers investigated by FCS. Pharmaceutical research, 2001, 18(7): 928-936

150. Kendall D.A., MacDonald R.C. A fluorescence assay to monitor vesicle fusion and lysis. J.Biol.Chem., 1982, 257(23): 13892-13 895

151. Park S.C., KimJiY, ShimS:©;, JeongG.Y,, Kim,M.N., Shin S.Y., Gheong-. G.W., Park Y., Hahm K.S. Investigation^of toroidal pore and oligomerization by melittin using transmission . • electron microscopy. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2006, 343:222-228

152. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 1985 150: 76-85

153. Hofmann G. ISCOtables: a handbook of data for biological and physicalhscientists. Lincoln, Nebraska, Instrumentation Specialties Company 7 ed, 1977

154. Schwerzman K., Cruz-Orive L.M., Eggman R., Sanger A., Weibel E.R. Molecular architecture of the inner membrane of mitochondria from rat liver: a combined biochemical and stereological study. J.Cell Biol., 1986, 102:97-103

155. Skulachev V.P. Transmembrane electrochemical H+-potential as a convertible energy source for the living cell. FEBS Lett., 1977, 74:1-9

156. Azzone G.F., Bragadin M., Pozzan T., Antone P.D. Proton electrochemical potential in steady state rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1977, 459:96-109

157. Chen R.F., Knutson J'. Mechanism of fluorescence quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimmers. Analytical biochemistry, 1988, 172:61-77

158. Hess S.T., Webb W.W. Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy. Biophys.J., 2002, 83:23002317

159. Gear A.R., Bednarek J.M. Direct counting and sizing- of mitochondria in solution. J. Cell Biol., 1972, 54:325-345

160. J.Duszynski, L.Wojtczak, The apparent non-linearity of the relationship between the rate of respiration and the protonmotive force of mitochondria can be explained by heterogeneity of mitochondrial preparations, FEBS Lett., 1985, 182: 243-248.

161. Halestrap A.P., Quinlan P.T. The intramitochondrial volume measured using sucrose as an extramitochondrial marker overestimates the true matrix volume determined with mannitol. Biochem. J., 1983, 214: 387-393

162. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М. Мир, 1997, с. 105

163. Schonfeld P., Schild L., Kunz W. Long-chain fatty acids act as protonophoric uncouplers of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1989, 977:266-272

164. Smith JC, Chance B. Kinetics of the potential-aenaitive extrinsic probe oxonol VI in beef heart submitochondrial particle. J. Membr. Biol., 1979, 46:255-82

165. Рубин А.Б. Биофизика. Биофизика клеточных процессов. Т.2 Наука, М., 2004, с. 9.1. Список публикаций.

166. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Антоненко Ю.Н. Сафранин О как флуоресцентный индикатор мембранного потенциала митохондрий: исследование на уровне суспензии и уровне отдельных митохондрий, Биохимия, 74 (6), 663-671, 2009

167. Пашковская А.А., Перевощикова И.В., Майзлиш В.Е., Шапошников Г.П., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами. Биохимия, 74 (9), 1252-1259, 2009

168. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B, Antonenko Y.N. Brightness analysis of isolated mitochondria doped with TMRE and Mitotracker. Abstracts of the 6th EBSA European Biophysics Congress, London (U.K.), Eur. Biophys. J., 36, S22, 2007.

169. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Antonenko Y.N. Fluorescently-labeled ATP as a probe of the outer mitochondrial membrane barrier: role of VDAC. Abstracts of the 7th European Biophysics Congress, Genova (Italy), Eur. Biophys. J., 38, 201,2009.