Исследование минимальной остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом из в-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-BABY, методом проточной цитометри тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат медицинских наук Попов, Александр Михайлович

• Попов, Александр Михайлович
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Попов, Александр Михайлович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Острый лимфобластный лейкоз у детей

1.1.1. Эпидемиология ОЛЛ у детей

1.1.2. Современные представления о механизмах развития острых лейкозов

1.1.3. Современные методы лечения острого лимфобластного лейкоза у детей

1.2. Минимальная остаточная болезнь

1.2.1. Ответ на терапию как фактор риска при ОЛЛ

1.2.2. Современные методы определения минимальной остаточной болезни при ОЛЛ

1.3. Определение минимальной остаточной болезни у детей с ОЛЛ методом проточной цитометрии

1.3.1. Принцип метода проточной цитометрии

1.3.2. Применение проточной цитометрии для определения минимальной остаточной болезни при ОЛЛ у детей

1.3.3. Комбинации моноклональных антител, применяющиеся для мониторинга минимальной остаточной болезни при

ОЛЛ из В-линейных предшественников

1.3.4. Изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии ВП-ОЛЛ

1.3.5. Выбор материала для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии

1.3.6. Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при ВП-ОЛЛ у детей первого года жизни

1.3.7. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни, определенной методом проточной цитометрии у детей с ОЛЛ

1.3.8. Сопоставление данных проточной цитометрии с результатами определения минимальной остаточной болезни другими методами

1.3.9. Мониторинг минимальной остаточной болезни в рамках протоколов, применяющихся в Российской Федерации и Республике Беларусь

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Пациенты, включенные в исследование

2.2. Методы исследования

2.2.1. Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии

2.2.2. Выявление экспрессии химерных генов

2.2.3. Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Аберрации иммунофенотипа, применимые для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии

3.1.1. Оценка интенсивности экспрессии антигенов опухолевыми и нормальными клетками

3.1.2. Оценка гетерогенности опухолевых клеток по экспрессии антигенов

3.1.3. Алгоритмы анализа данных при определении минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии

3.1.4. Особенности определения минимальной остаточной болезни при ВП-ОЛЛ у детей первого года жизни

3.2. Изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии

3.2.1. Изменения экспрессии антигенов во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB

3.2.2. Изменения экспрессии MLL-ассоциированного маркера

NG2 во время терапии ВП-ОЛЛ у детей первого года жизни

3.3. Выявление наличия нормальных В-линейных предшественников в костном мозге пациентов с ВП-ОЛЛ на различных этапах терапии

3.4. Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни при помощи «упрощенного» и стандартного подходов к анализу данных

3.5. Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе полимеразной цепной реакции

3.6. Определение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у пациентов с ВП-ОЛЛ в рамках протокола ALL-MB

3.6.1. Результаты определения минимальной остаточной болезни

3.6.2. Связь результата определения минимальной остаточной болезни на момент окончания индукционной терапии с другими факторами риска ОЛЛ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование минимальной остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом из в-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-BABY, методом проточной цитометри»

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении острого лимфобластного лейкоза (OJIJI) у детей, данное заболевание по-прежнему является самой частой причиной смерти детей от онкологических заболеваний [3, 8, 100, 137]. Дальнейшее повышение интенсивности химиотерапии не приводит к увеличению выживаемости детей с OJIJI, а во многих случаях повышает риск токсических осложнений [137, 138]. Поэтому крайне актуальным является вопрос выявления среди всех больных тех пациентов, у которых опухоль высокочувствительна к проводимой химиотерапии, и для которых возможно снизить интенсивность лечения.

С другой стороны, традиционный перечень факторов риска развития рецидива OJIJI нуждается в расширении, чтобы максимально точно выявлять пациентов с высокой вероятностью рецидивирования опухоли, и, следовательно, интенсифицировать терапию только этой группе пациентов, избегая повышения токсичности для остальных. В последние годы в большинстве протоколов инициальные факторы риска дополняются показателями, характеризующими ответ опухоли на терапию [54, 55, 85, 93, 105, 118, 122, 124, 143, 147, 148, 149, 153, 157, 158, 164, 165].

Ответ на терапию OJIJI уже в течение длительного времени используется как один из важнейших факторов прогноза и стратификации пациентов по группам риска [143]. Даже в том случае, если в образцах костного мозга (КМ), взятых во время терапии, количество опухолевых клеток ниже чувствительности обычных цитологических методов (менее 1%), они могут вносить существенный вклад в неблагоприятный исход заболевания [47, 80, 123, 171]. Совокупность этих клеток, не выявляемых цитологически, но обнаруживаемых другими более чувствительными методами диагностики, получила название минимальной остаточной болезни (МОБ). Для оценки и мониторинга МОБ чаще всего используются два метода: полимеразная цепная реакция (ГЩР) и многоцветная проточная цитометрия [39, 44, 46, 47, 48, 80, 123, 160]. Основным направлением применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ является определение лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа, т.е. специфичного для опухоли сочетания экспрессии антигенов [2, 11, 39, 43, 44, 47, 75, 109]. Клиническая значимость определения МОБ методом проточной цитометрии показана различными исследовательскими группами [10, 23, 30, 37, 57, 58, 79, 172].

Чаще всего разные исследовательские группы используют различные подходы к определению остаточных опухолевых клеток [38, 39, 43, 81, 109]. Поэтому, несмотря на определенный опыт применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ, накопленный к настоящему времени, крайне редки публикации, в которых бы описывался четкий алгоритм анализа данных цитометрического исследования. Кроме того, постоянно появляются новые маркеры, потенциальное применение которых для определения МОБ представляется перспективным. Одним из таких антигенов, например, является NG2, экспрессия которого специфична для ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена MLL [176]. В то же время, некоторыми исследователями предлагаются упрощенные подходы для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии [7, 61]. Применимость таких методов остается недостаточно изученной.

Кроме того, конкретные подходы к мониторингу МОБ могут применяться только в рамках конкретного протокола лечения. Методология определения МОБ во время терапии по одному протоколу может не удовлетворять условиям другого протокола. Это может быть обусловлено различиями в изменениях иммунофенотипа опухолевых клеток под воздействием различных препаратов, разным временем заселения КМ нормальными клетками-предшественниками, а также другими факторами, напрямую связанными с терапевтическим режимом.

Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии OJ1JI у детей разных возрастных групп [12, 13, 14, 86, 106] диктует необходимость разработки собственных алгоритмов мониторинга МОБ. Однако в настоящее время попытки применения проточной цитометрии для оценки минимальной остаточной болезни в рамках российских протоколов единичны [2, 7, 10, 11]. Таким образом, возможности применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ в рамках российских протоколов лечения OJIJI, таких как ALL-MB 2008 и MLL-Baby, остаются неизученными.

Все вышесказанное определило цель исследования - изучить количество остаточных опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby, методом проточной цитометрии.

Задачи исследования

1. Определить аберрации иммунофенотипа опухолевых клеток, применимые для определения минимальной остаточной болезни при OJIJI из В-линейных предшественников (ВП-OJIJI).

2. Оценить изменения экспрессии антигенов, применяемых для мониторинга минимальной остаточной болезни, в процессе терапии по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

3. Оценить возможность применения MZX-ассоциированного антигена NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни при B-линейном ОЛЛ с перестройками гена MLL.

4. Оценить возможности применения трехцветного «упрощенного» метода для определения минимальной остаточной болезни.

5. Разработать и внедрить алгоритм определения минимальной остаточной болезни при ОЛЛ из B-линейных предшественников.

6. Сравнить результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и экспрессии химерных генов в ПЦР.

7. Провести определение минимальной остаточной болезни на 15-й, 36-й и 85-й дни лечения у пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008.

Научная новизна

Показаны отличия опухолевых бластов при B-линейных OJIJI от нормальных B-клеток по экспрессии CD10, CD20, CD45, CD20 и CD58. Выявлена неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, использующихся для определения МОБ. Установлены особенности изменений иммунофенотипа бластов, происходящих во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008. Показано существенное снижение экспрессии MLZ-ассоциированного антигена NG2 во время терапии OJIJI, ассоциированного с перестройками гена MLL. Установлено появление в костном мозге у некоторых пациентов с OJIJI, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, нормальных B-линейных предшественников уже на момент окончания индукционной терапии, что может существенно осложнять определение МОБ в данной точке наблюдения. В результате детального сравнительного анализа показана хорошая сопоставимость результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПНР на различных этапах терапии OJIJI. В результате определения МОБ в 168 образцах КМ пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, выявлена положительная корреляционная связь показателей раннего ответа на терапию с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии.

Практическая значимость

Определены наиболее применимые для мониторинга МОБ аберрации иммунофенотипа опухолевых бластов при ВП-OJIJI. Разработаны алгоритмы анализа данных проточной цитометрии при определении МОБ у пациентов с различными иммунологическими вариантами ВП-ОЛЛ с учетом гетерогенности экспрессии антигенов опухолевыми клетками и изменений иммунофенотипа во время терапии. Установлена ограниченная применимость антигена N02 для мониторинга МОБ при ВП-ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена МЬЬ. Показана ограниченная применимость «упрощенного» трехцветного метода определения МОБ по Е. Со^ап-ЗгшА е! а1. На основании хорошей качественной сопоставимости результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР, предложено одновременное применение двух данных методов для мониторинга МОБ у детей с ВП-ОЛЛ с наличием химерных генов. Рекомендовано применять проточную цитометрию на ранних этапах терапию, когда важно определение уровня МОБ, а ПЦР - в более поздних точках наблюдения, когда прогностически значимо качественное определение МОБ.

Внедрение в практику

Разработанный по результатам исследования алгоритм мониторинга МОБ методом проточной цитометрии у детей с ВП-ОЛЛ успешно внедрен в работу Лаборатории иммунофенотипирования гемобластозов Отдела детской онкогематологии Областной детской клинической больницы №1 (г. Екатеринбург). Данный алгоритм успешно применяется для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии в рамках кооперативной группы по изучению ОЛЛ «Москва-Берлин». Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Лабораторная наука - практике: первое десятилетие XXI века»

Москва, 2010), Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2009), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007), Съезде детских онкологов России (Москва, 2008), конгрессах Европейского гематологического общества (Берлин, 2009; Барселона, 2010), Международного общества детских онкологов (Берлин, 2008; Сан-Паулу, 2009), Американского общества гематологов (Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010), Американского общества клинической химии (Анахайм, 2010). По материалам исследования опубликовано 53 печатные работы, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. Наиболее применимыми для мониторинга минимальной остаточной болезни при ВП-ОЛЛ аберрациями иммунофенотипа опухолевых клеток являются снижение экспрессии CD45, CD20, CD38 и повышение экспрессии CD 10, CD34, CD58.

2. Во время индукционной терапии происходят существенные изменения экспрессии антигенов, используемых для определения минимальной остаточной болезни, что обусловливает необходимость применения для мониторинга МОБ многоцветной проточной цитометрии.

3. Разработанный по результатом исследования алгоритм применения проточной цитометрии позволяет адекватно мониторировать минимальную остаточную болезнь у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Попов, Александр Михайлович

выводы

1. Наиболее применимыми для определения минимальной остаточной болезни аберрациями иммунофенотипа при ВП-OJIJI являются различия в экспрессии CD 10, CD34, CD20, CD45, CD58 и CD38 между опухолевыми и нормальными клетками.

2. Для ВП-ОЛЛ характерна неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, применяемых для определения МОБ.

3. Во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008 происходят изменения иммунофенотипа опухолевых клеток: снижается экспрессия CD10, CD34 и CD58, в то время как экспрессия CD 19, CD20 и CD45 повышается.

4. Опухолевая популяция неоднородна по количеству NG2 на поверхности клеток, а экспрессия данного антигена существенно снижается во время терапии, поэтому NG2 может применяться для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при ВП-ОЛЛ с перестройками гена MLL только в качестве вспомогательного антигена для дополнительной характеристики популяций, выделенных по другим маркерам.

5. Гетерогенная экспрессия антигенов опухолевыми клетками и изменения иммунофенотипа во время терапии делают необходимым применение для определения минимальной остаточной болезни широкой панели моноклональных антител, включающей в себя CD 19, CD 10, CD34, CD45, CD20, CD38 и CD58, а также, в некоторых случаях, дополнительные лейкоз-ассоциированные антигены.

6. Методологические упрощения приводят к ограниченной применимости проточной цитометрии для мониторинга МОБ. При сравнении результатов б-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного метода, были обнаружены качественные и количественные расхождения результатов в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов, взятых на 15, 36 и 85 день терапии OJIJI соответственно.

7. Результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления наличия химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР у детей с ВП-ОЛЛ имеют хорошую сопоставимость.

8. На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки были выявлены у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно.

9. Количество остаточных опухолевых клеток, определенное методом проточной цитометрии на 15-й день терапии по протоколу ALL-MB 2008 выше 0,160% является наиболее значимым фактором прогнозирования наличия МОБ на 36-й день терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время накоплен определенный опыт в мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Вместе с тем многие методические аспекты описаны в литературе крайне обще. Кроме того, алгоритмы применения проточной цитометрии для выявления МОБ различаются в рамках разных протоколов терапии ОЛЛ. Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии ОЛЛ у детей разных возрастных групп диктует необходимость разработки собственных подходов к мониторингу МОБ. Это и определило цель и задачи данного исследования.

В результате исследования образцов костного мозга взятых на момент диагностики и на разных этапах терапии у 199 детей с ВП-ОЛЛ, нами были разработаны алгоритмы применения проточной цитометрии для определения МОБ при разных иммунологических вариантах ВП-ОЛЛ. Созданный алгоритм позволяет адекватно мониторировать минимальную остаточную болезнь у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby. В рамках протокола ALL-MB 2008 определение МОБ было проведено у 61 пациента.

При сравнении экспрессии различных антигенов нормальными и опухолевыми клетками, нами были выявлены существенные отличия бластов при ВП-ОЛЛ как от зрелых B-лимфоцитов, так и от нормальных ВП по уровню экспрессии CD 10, CD45, CD20, CD58 и CD38. В то же время экспрессия CD34 опухолевыми клетками достоверно не отличалась от экспрессии данного антигена ВП. Все исследованные маркеры применимы для мониторинга МОБ как во время индукционной терапии, так и на более поздних этапах лечения. Даже CD34, применение которого не всегда позволяет отличить опухолевые клетки от нормальных ВП, достаточно ценен при CDIO(-) ВП-ОЛЛ, так как нормальные ВП, в отличие от опухолевых клеток, экспрессируют CD 10, и, соответственно С010(-)С034(+)-клетки расцениваются при анализе данных как опухолевые. Кроме того, отсутствие CD34 при высокой экспрессии CD 10 также является аберрацией иммуиофенотипа, применимой для мониторинга МОБ. Несмотря на четкие отличия между опухолевыми и нормальными клетками в экспрессии различных антигенов, в настоящее время не существует единственного маркера, который был бы применим для мониторинга МОБ во всех случаях ВП-ОЛЛ. Причин этого несколько.

Несмотря на выявленные количественные отличия в экспрессии антигенов опухолевыми и нормальными клетками, зачастую маркеры экспрессируются далеко не всеми бластами. Так в 16,8% случаев наблюдалась гетерогенная экспрессия CD 10 - маркера, на котором чаще всего основывается определение МОБ при CD10(+) ВП-ОЛЛ. Гетерогенная экспрессия CD34, еще одного антигена, часто используемого для мониторинга МОБ, наблюдалась в 30,6% случаев. Кроме того, у 11,6% пациентов бласты оказались CD34-негативными. В итоге, менее чем у половины больных (45,08%) все бласты коэкспрессировали CD 10 и CD34. У 4,1% пациентов обнаруживались также опухолевые клетки, не экспрессировавшие ни CD 10, ни CD34. Анализ экспрессии CD34 опухолевыми клетками пациентов с различной экспрессией CD 10 показал, что чаще всего хотя бы один из этих двух антигенов клеток-предшественников гомогенно экспрессируется всеми бластами. Сходные результаты определения экспрессии CD34 были получены и в группе пациентов с CDIO(-) ВП-ОЛЛ. У большинства пациентов (особенно при CDIO(-) варианте ВП-ОЛЛ) выделение опухолевых клеток только по экспрессии CD45 может оказаться проблематичным, так как у них бласты отличаются от нормальных клеток по экспрессии пан-лейкоцитарного антигена только количественно. Разные варианты экспрессии CD20 и CD38, а также выявление случаев с наличием С058-негативных бластов свидетельствуют в пользу того, что и эти маркеры не всегда применимы для мониторинга МОБ.

Кроме того, фенотип опухолевых клеток изменяется под действием химиопрепаратов. Экспрессия таких антигенов, как CD 19, CD20 и CD45 повышается, в то время как экспрессия CD10, CD34 и CD58 во время индукционной терапии снижается. В результате этого во время лечения бласты на точечных графиках бывает сложнее отличить от нормальных клеток, чем на момент диагностики. Несмотря на то, что численная разница в экспрессии CD 10, CD34, CD58, CD20 и CD45 сохраняется, анализ точечных графиков на 15-й день терапии осложняется тем, что опухолевые клетки и зрелые лимфоциты на графиках сближаются. В результате этого во время лечения бласты на точечных графиках бывает сложнее отличить от нормальных клеток, чем на момент диагностики.

Таким образом, несмотря на четкие отличия между опухолевыми и нормальными клетками в экспрессии различных антигенов, в настоящее время не существует единственного маркера, который был бы применим для мониторинга МОБ во всех случаях ВП-OJIJI. Гетерогенность экспрессии антигенов опухолевыми клетками, выявленная для всех исследованных маркеров при обоих вариантах ВП-ОЛЛ, приводит к тому, что у некоторых пациентов приходится мониторировать одновременно несколько субпопуляций бластов, а изменения иммунофенотипа ограничивают применение каждого маркера по отдельности.

По результатам исследования нами были сформулированы алгоритмы анализа данных для выявления остаточных опухолевых клеток при CD 10-позитивном и CDlO-негативном вариантах ВП-ОЛЛ. Для CD10(+) ВП-ОЛЛ после выделения С019-позитивных клеток анализ точечных графиков основывается на определении экспрессии CD 10 и маркеров, по которым можно отличить опухолевые клетки от нормальных ВП (например, CD45 при CD45(-) ВП-ОЛЛ, или CD58). В случае гетерогенной экспрессии CD 10 необходимо оценивать также экспрессию всех остальных используемых маркеров, прежде всего, CD34. Для CDIO(-) ВП-ОЛЛ при анализе данных наиболее значимым является определение экспрессии CD 10 и CD20. При этом из анализа исключаются CDlO-позитивные и С020-позитивные клетки. Среди оставшихся

CD19(+)CD10(-)CD20(-) клеток необходимо отличать МОБ от плазмоцитов и продуктов неспецифического связывания антител. Для этого необходимо использовать CD38, CD34, CD45, а также антигены, ассоциированные с перестройками гена MLL (CD15, CD65, CD133, NG2), если эти перестройки были обнаружены на момент диагностики.

Несмотря на то, что NG2 является специфическим маркером, ассоциированным с перестройками гена MLL, данный антиген экспрессируется в большинстве случаев лишь частью опухолевой популяции (медиана доли позитивных клеток — 63,75%). Кроме того, экспрессия NG2 и доля NG2-положительных клеток существенно снижаются во время лечения, особенно после окончания индукционной терапии, а при рецидиве у части пациентов опухолевые клетки КС2-негативны. Таким образом, даже NG2 нельзя использовать как основной маркер для выделения опухолевых клеток на точечных графиках при мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Тем не менее, в комбинации с другими антигенами NG2 может использоваться для мониторинга МОБ, но не для выделения опухолевых клеток, а как дополнительная характеристика популяций, выделенных по другим маркерам. Особенно применение дополнительных лейкоз-специфических маркеров важно в тех случаях, когда количество остаточных опухолевых клеток крайне невелико. Так как алгоритм анализа данных при мониторинге МОБ при CDIO(-) ВП-ОЛЛ основан на выделении CD10(-)CD20(-)-KneTOK, могут возникнуть трудности с отличием бластов от плазмоцитов и результатов неспецифического связывания антител. Дополнительные антигены, такие как CD38, CD34, CD45, CD58, не всегда применимы в таких случаях. Именно поэтому NG2 может оказать существенную помощь в определении, являются ли выделенные клетки опухолевыми, или нет.

Ни в одном образце, взятом на 15-й день терапии, нормальные ВП не были обнаружены вне зависимости от того, выявлялись ли в этих образцах остаточные опухолевые бласты. При этом в 6,9% образцов, взятых на момент окончания индукционной терапии, и в 87,2% образцов, взятых на 85-й день терапии, были выявлены нормальные ВП в различных количествах. Таким образом, даже на момент окончания индукционной терапии в костном мозге могут обнаруживаться нормальные ВП, а на 85-й день терапии нормальные клетки-предшественники обнаруживаются у подавляющего большинства пациентов.

Отсутствие единственного применимого для определения МОБ маркера, изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии и колонизация костного мозга нормальными клетками-предшественниками уже на момент окончания индукционной терапии приводят к тому, что для адекватного определения остаточных опухолевых клеток предпочтительно применять многоцветные комбинации антител, включающие в себя, кроме CD 19, такие маркеры как CD10, CD20, CD34, CD45, CD58 и CD38. Попытки упростить подходы к определению МОБ путем сокращения панелей МкАТ уменьшают число пациентов, у которых возможно определение МОБ методом проточной цитометрии, а также ведут к качественно и количественно некорректным результатам анализа, количество которых возрастает с каждой дальнейшей точкой наблюдения. Так при сравнении результатов 6-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного подхода, были обнаружены расхождения в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов на 15, 36 и 85 день терапии OJIJ1 соответственно.

Крайне интересным показалось нам сопоставление результатов проточной цитометрии и другого метода, часто применяемого для мониторинга МОБ — ПЦР химерного транскрипта. Качественная сходимость составила 93,9%. Сходимость результатов не зависела от этапа терапии, типа молекулярной перестройки, варианта ВП-OJIJI, наличия в образце нормальных ВП. Несмотря на хорошую качественную сходимость, прямое количественное сопоставление результатов определения МОБ двумя данными методами невозможно по нескольким причинам. Во-первых, экспрессия химерного гена может заметно меняться в процессе терапии вне зависимости от изменения количества опухолевых клеток. Во-вторых, существуют значительные различия при расчете величины МОБ при иммунофенотипировании и ПЦР-РВ. Так при проведении проточной цитометрии определяется процентное содержание опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного мозга, в то же время при ПЦР-РВ величина МОБ определяется как процентное отношение нормализованного числа копий ХТр в остаточных опухолевых клетках к аналогичной величине на момент диагностики. Тем не менее, кинетика уровня МОБ во время терапии сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие этого, одновременное применение данных методов может с успехом использоваться у пациентов, у которых определяется ХТр. Особенно это важно для детей с OJIJI, имеющих высокий риск развития рецидива: пациентов с наличием химерного гена BCR-ABL р190, перестройками гена MLL, а также пациентов, у которых в костном мозге в течение длительного времени обнаруживаются опухолевые клетки или ХТр. У таких больных, с нашей точки зрения, необходим продолжительный мониторинг МОБ, в том числе во время консолидации/интенсификации и (при сохранении МОБ) в ходе поддерживающей терапии. При этом во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные проточной цитометрии. В то же время, в последующих ТН достаточно только качественного определения МОБ, поэтому предпочтительнее использовать результаты определения ХТр методом ОТ-ПЦР, вследствие более высокой чувствительности метода.

На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки выявляются у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно. При этом среди МОБ-позитивных пациентов на 15-й день преобладали пациенты с относительно высокими величинами МОБ (более 0,1%), а на более поздних этапах лечения - пациенты с относительно низким содержанием опухолевых клеток (менее 0,1%). Наличие пациентов с величинами МОБ в диапазоне от 0,001% до 0,01% не позволяет ограничивать чувствительность проточной цитометрии уровнем более или равным 1х10~4. Особенно это важно на 36-й день терапии, когда пациентов со столь низким уровнем МОБ больше всего (14,7%).

Мы исследовали влияние на наличие МОБ у детей с ОЛЛ на момент окончания индукционной терапии протокола А1Х-МВ-2008 различных инициальных клинических и лабораторных показателей, а также параметров, характеризующих ранний ответ на терапию. Среди инициальных показателей значимые отличия МОБ-позитивных от МОБ-негативных пациентов были выявлены только для возраста. Дети старше 3 лет имели статистически значимо больший шанс быть МОБ-позитивными. Среди параметров раннего ответа, величина МОБ на 15-й день терапии позволяет наиболее точно разделить МОБ-позитивных и МОБ-негативных на 36-й день пациентов (диагностическая эффективность теста - 79,31%). Пороговым уровнем для МОБ на 15-й день является 0,160%. Данный параметр оказался единственной независимой переменной при проведении многофакторного анализа. Наиболее распространенные показатели раннего ответа на терапию, такие как определенные цитологически количество бластов в периферической крови на 8-й день терапии и процентное содержание бластов в костном мозге на 15-й день, также могут влиять на МОБ-статус по окончании индукционной терапии (пороговые уровни 38/мкл и 0,8% соответственно), но при многофакторном анализе они оказались зависимыми переменными (р=0,131 и рЮ,677 соответственно), как и возраст (р=0,113). Какой-либо связи остальных исследованных показателей с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии выявлено не было.

Прогностическая значимость мониторинга МОБ методом проточной цитометрии в рамках данных протоколов нуждается в дальнейшем исследовании.

Таким образом, если учитывать различия в экспрессии маркеров нормальными и опухолевыми клетками, гетерогенность экспрессии антигенов, изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии и заселение костного мозга нормальными клетками-предшественниками, определение МОБ методом проточной цитометрии возможно практически у всех пациентов с ВП-OJIJI, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby. При этом для адекватной оценки МОБ во всех точках наблюдения, предусмотренных протоколами, необходимо использовать широкую панель МкАТ включающую в себя, кроме CD 19, такие маркеры как CD 10, CD20, CD34, CD45, CD58 и CD38. В ряде случаев может оказаться полезным также применение дополнительных лейкоз-ассоциированных маркеров, таких как NG2. У части пациентов возможно комбинирование определения МОБ проточной цитометрией и выявления ХТр в ходе ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Попов, Александр Михайлович, 2011 год

1. Азовская, Т.Ю. Клинико-иммунологическая характеристика острых лейкозов у детей Уральского региона: Автореф. канд. Мед. Наук. / Т.Ю. Азовская; ГНЦ Институт иммунологии Минздрава России. — М., 1998. - 27 с.

2. Белевцев, М.В. Определение остаточных опухолевых клеток в костном мозге детей с B-линейным острым лимфобластным лейкозом методом проточной цитофлюорометрии / М.В. Белевцев, В.П. Савицкий, H.H. Савва и др. // Клин. Лаб. Диагн. 2006. - №10. - С. 42-46.

3. Клиническая онкогематология / Под ред. М.А. Волковой — М: Медиина, 2007.-1120 с.

4. Руководство по гематологии. В 3-х т. Т. 1 / Под ред. А.И.Воробьева М: Ньюдиамед, 2002. - 280 с.

5. Глузман Д.Ф. Диагностика лейкозов. Атлас и практическое руководство. / Д.Ф. Глузман, И.В. Абраменко, Л.М. Скляренко и др. Киев: Морион, 2000. - 224 с.

6. Глузман Д.Ф. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. / Д.Ф. Глузман, И.В. Л.М. Скляренко В.А. Надгорная, И.А. Крячок. Киев: Морион, 2003.- 156 с.

7. Ланцковский, Ф. Детская гематология и онкология / Ф. Ланцковский. М.: Лори, 2005. - 766 с.

8. Луговская, С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, H.H. Тупицын. М.: «Триада», 2005.- 167 с.

9. Румянцева, Ю.В. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей в России и Белоруссии: стратегия Москва-Берлин / Ю.В. Румянцева, А.И. Карачунский // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2007. - №4. — С. 13-22.

10. Румянцева, Ю.В. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей в России / Ю.В. Румянцева, А.И. Карачунский, А.Г. Румянцев // Педиатрия. 2009. - №4. - С. 19-27.

11. Фукс, О.Ю. Ранний ответ на терапию при использовании ПЭГ-аспарагиназы в циторедуктивной фазе лечения острого лимфобластного лейкоза / О.Ю. Фукс, К.Л. Кондратчик, Н.В. Мякова и др. // Гематология и траснфузиология. 2007. — №6. — С. 22-26.

12. Хоффбранд, В. Гематология. Атлас-справочник. / В. Хоффбранд, Дж. Петтит. М.: Практика, 2007.-408с.

13. Цаур, Г.А. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом / Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, А.М. Попов и др. // Онкогематология. 2010. - №2. - С. 46-54.

14. Шориков, Е.В. Результаты программного лечения острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни: Автореф. Канд. Мед. Наук. / Е.В. Шориков; НИИ Детской гематологии Минздрава России. М., 2005.-39 с.

15. Armstrong, S.A. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia / S.A. Armstrong, J.E. Staunton, L.B. Silverman et al // Nat. Genetics. 2002. - Vol. 30, - P. 41-47.

16. Basso, G. The role of immunophenotype in acute lymphoblastic leukemia of infant age / G. Basso, R. Rondelli, A. Covezzoli, M. Putti // Leuk. Lymphoma. 1994.-Vol. 15,-P. 51-60.

17. Basso, G. New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias / G. Basso, B. Buldini, L. De Zen, A. Orfao // Haematologica. 2001. -Vol. 86-P. 675-692.

18. Basso, G. Diagnosis and genetic subtypes of leukemia combining gene expression and flow cytometry / G. Basso, C. Case, M. Campo Dell'Orto // Blood cells, molecules and diseases. 2007. - Vol. 39, N2. - P. 164-168.

19. Basso, G. Risk of relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia is predicted by flow cytometric measurement of residual disease on day 15 bone marrow / G. Basso, M. Veltroni, M.G. Valsecchi et al // J. Clin. Oncol. 2009. - Vol. 27,-P. 5168-5174.

20. Beillard, E. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR)-a Europe Against Cancer

21. Program / E. Beillard, N. Pallisgaard, V.H.J, van der Velden et al // Leukemia. -2003.-Vol. 17, N1.-P. 1-13.

22. Bene, M.C. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) / M.C. Bene, G. Castoldi, W. Knapp et al // Leukemia. 1995. - Vol. 9, N 10. -P. 1783-1786.

23. Bene, M.C. How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukemiaNet / M.C. Bene, J.S. Kaeda // Haematologica. 2009. - Vol. 94, N8. - P. 1135-1150.

24. Bhojwani, D. High-risk childhood acute lymphoblastic leukemia / D. Bhojwani, S.C. Howard, C.-H. Pui // Clin. Lymphoma Myeloma. 2009. - Vol. 9, Supp. 3.-P. S222-S230.

25. Biondi, A. Role of treatment intensification in infants with acute lymphoblastic leukemia: results of two consecutive AIEOP studies / A. Biondi, C. Rizzari, M.G. Valsecchi et al // Haematologica. 2006. - Vol. 91, - P. 534-537.

26. Bonney, G.E. Logistic regression for dependent binary observations / G.E. Bonney//Biometrics. 1987. - Vol. 43.-P. 951-973.

27. Borkhardt, A. Molecular analysis of MLL/AF4 recombination in infant acute lymphoblastic leukemia / A. Borkhardt, R. Repp, E. Haupt et al // Leukemia. -1994. Vol. 8, N4. - P. 549-553.

28. Borkhardt, A. Infant acute lymphoblastic leukemia combined cytogenetic, immunophenotypical and molecular analysis of 77 cases / A. Borkhardt, C. Wuchter, S. Viehmann et al // Leukemia. - 2002. - Vol. 16, - P. 1685-1690.

29. Borowitz, M.J. Minimal residual disease detection in childhood ALL / M.J. Borowitz //Haematopoiesis Immunology. 2010. - Vol. 7, N1. - P. 24-35.

30. Campana, D. The immunologic detection of minimal residual disease in acute leukemia / D. Campana, E. Coustan-Smith, G. Janossy // Blood. 1990. - Vol. 76,N1.-P. 163-171.

31. Campana, D. Detection of minimal residual disease in acute leukaemia: methodologic advances and clinical significance / D. Campana, C.-H. Pui // Blood. — 1995.-Vol. 85, N6.-P. 1416-1434.

32. Campana, D. Detection of minimal residual disease in acute leukaemia by flow cytometry / D. Campana, E. Coustan-Smith // Cytometry. 1999. - Vol. 38, N8.-P. 139-152.

33. Campana, D. Advances in the immunological monitoring of childhood acute lymphoblastic leukaemia / D. Campana, E. Coustan-Smith // Best practice & clinical research haematology. 2002. - Vol. 15, N1. - P. 1-19.

34. Campana, D. Determination of minimal residual disease in leukaemia patients / D. Campana // Br. J. Haematol. 2003. - Vol. 121,- P. 823-838.

35. Campana, D. Minimal residual disease studies by flow cytometry in acute leukaemia / D. Campana, E. Coustan-Smith // Acta Haematol. 2004. - Vol. 112, N1-2.-P. 8-15.

36. Campana, D. Minimal residual disease studies in acute leukaemia / D. Campana // Am. J. Clin. Pathol. 2004. - Vol. 122, - P. S47-S57.

37. Campana, D. Progress of minimal residual disease studies in childhood acute leukemia / D. Campana // Curr. Hematol. Malig. Rep. 2010. - Vol. 5, N3. - P. 169-176.

38. Cazzaniga, G. Monitoring of minimal residual disease in leukemia, advantages and pitfalls / G. Cazzaniga, G. Gaipa, V. Rossi, A. Biondi // Ann. Med. -2006.-Vol. 38,-P. 512-521.

39. Chen, J.S. Identification of novel markers for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia / J.S. Chen, E. Coustan-Smith, T. Suzuki et al // Blood. 2001. - Vol. 97, N7. - P. 2115-2120.

40. Chen, T. Application of triple-color flow cytometry for minimal residual disease detection in acute B-lymphoblastic leukemia / T. Chen, Y. Zhu, X. Zhou et al // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2001. - Vol. 22, N1. - P. 20-23.

41. Chen, W. Stability of leukemia-associated immunophenotypes in precursor B-lymphoblastic leukemia/lymphoma: a single institution experience / W. Chen, N.J. Karandikar, R.W. McKenna, S.H. Kroft // Am. J. Clin. Pathol. 2007. -Vol.127, N1.-P. 39-46.

42. Ciudad, J. Immunophenotypic analysis of CD 19+ precursors in normal human adult bone marrow: implications for minimal residual disease detection / J. Ciudad, A. Orfao, B. Vidriales et al // Haematologica. 1998. - Vol. 83, N12. - P. 1069-1075.

43. Coustan-Smith, E. Immunological detection of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukaemia / E. Coustan-Smith, F.G. Behm, J. Sanchez et al // Lancet. 1999. - Vol. 21, N2. - P. 550-554.

44. Coustan-Smith, E. Clinical importance of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukaemia / E. Coustan-Smith, J. Sancho, M.L. Hancock et al // Blood. 2000. - Vol. 96, N8. - P. 2691-2696.

45. Coustan-Smith, E. Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childhood acute lymphoblastic leukaemia / E. Coustan-Smith, J. Sancho, F.G. Behm et al // Blood. 2002. - Vol. 100, N1. - P. 5258.

46. Coustan-Smith, E. Use of peripheral blood instead of bone marrow to monitor residual disease in children with acute lymphoblastic leukaemia / E.

47. Coustan-Smith, J. Sancho, M.L. Hancock et al I I Blood. 2002. - Vol. 100, N7. - P. 2399-2402.

48. Coustan-Smith, E. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse / E. Coustan-Smith, A. Gajjar, N. Hijiya et al // Leukemia. 2004. - Vol. 18, N3. - P. 499-504.

49. Coustan-Smith, E. A simplified flow cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leukemia who have a superior clinical outcome / E. Coustan-Smith, R.C. Ribeiro, P. Stow et al. // Blood. 2006. - Vol. 108, N1. - P. 97102.

50. Craig, F.E. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms / F.E. Craig, K.A. Foon //Blood. 2008. - Vol. 111, N8. - P. 3941-3967.

51. Cutrona, G. CD 10 is a marker for cycling cells with propensity to apoptosis in childhood ALL / G. Cutrona, P. Tasso, M. Dono et al // Brit. J. Cancer. -2002. Vol. 86, - P. 1776-1785.

52. DeLong, E.R. Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach / E.R. DeLong, D.M. DeLong, D.L. Clarke-Pearson // Biometrics. 1988. - Vol. 44. - P. 837-845.

53. Demidenko, E. Sample size and optimal design for logistic regression with binary interaction / E. Demidenko // Stat. Med. 2008. - Vol. 27. - P. 36-46.

54. De Zen, L. Quantitative multiparametric immunophenotyping in acute lymphoblastic leukemia: correlation with specific genotype. I. ETV6/AML1 ALLs identification / L. De Zen, A. Orfao, G. Cazzaniga et al // Leukemia. 2000. — Vol. 14.-P. 1225-1231.

55. De Zen, L. Computational analysis of flow-cytometry antigen expression profiles in childhood acute lymphoblastic leukemia: an MLL/AF4 identification / L. De Zen, S. Bicciato, G. Te Cronie, G. Basso // Leukemia. 2003. - Vol. 17. - P. 1557-1565.

56. DiGiuseppe, J.A. Overexpression of CD49f in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia: potential usefulness in minimal residual disease detection /

57. J.A. DiGiuseppe, S.G. Fuller, MJ. Borowitz // Cytometry B Clin. Cytom. 2009. -Vol. 76B.-P. 150-155.

58. Dworzak, M.N. Flow cytometric assessment of human MIC2 expression in bone marrow, thymus and peripheral blood / M.N. Dworzak, G. Fritsch, P. Buchinger et al // Blood. 1994. - Vol. 83, N2 - P. 415-425.

59. Dworzak, M.N. Multiparameter phenotype mapping of normal and post-chemotherapy B lymphopoiesis in pediatric bone marrow / M.N. Dworzak, G. Fritsch, C. Fleisher et al // Leukemia. 1997. - Vol. 11. - P. 1266-1273.

60. Dworzak, M.N. Comparative phenotype mapping of normal vs. malignant pediatric B-lymphopoiesis unveils leukemia-associated aberrations / M.N. Dworzak, G. Fritsch, C. Fleischer et al // Exp. Hematol. 1998. - Vol. 26, - P. 305313.

61. Dworzak, M.N. CD99 (MIC2) expression in paediatric B-lineage leukemia/lymphoma reflects maturation-associated patterns of normal Blymphopoiesis / M.N. Dworzak, G. Fritsch, C. Fleischer et al // Br. J. Haematol. -1999. Vol. 105, - P. 690-695.

62. Dworzak, M.N. Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia / M.N. Dworzak, G. Froschl, D. Printz et al // Blood. 2002. - Vol. 99, N6. -P. 1952-1958.

63. Dworzak, M.N. Flow cytometric detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia / M.N. Dworzak, E.R. Panzer-Grumayer // Leuk. Lymphoma. 2003. - Vol. 44, N9. - P. 1445-1455.

64. Dworzak, M.N. Standardization of flow cytometric minimal residual disease evaluation in acute lymphoblastic leukemia: multicentric assessment is feasible / M.N. Dworzak, G. Gaipa, R. Ratei et al // Cytometry B Clin. Cytom. — 2008.-Vol. 74B.-P. 331-340.

65. Dworzak, M.N. Modulation of antigen expression in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia during induction therapy is partially transient: evidence for a drug-induced regulatory phenomenon. Results of the AIEOP-BFM-ALL

66. FLOW-MRD-Study group / M.N. Dworzak, G. Gaipa, A. Schumich et al // Cytometry B Clin. Cytom.-2010.- Vol. 78B.-P. 147-153.

67. Eckert, C. Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia / C. Eckert, A. Biondi, K. Seeger et al // Lancet.-2001.-Vol. 358.-P. 1239-1241.

68. Escherich, G. Cooperative study group for childhood acute lymphoblastic leukaemia (COALL): long-term results of trials 82, 85, 89, 92 and 97 / G. Escherich, M.A. Horstmann, M. Zimmermann, G.E. Janka-Schaub // Leukemia. -2010. Vol. 24. - P. 298-308.

69. Gaipa, G. Drug-induced immunophenotypic modulation in childhood ALL: implications for minimal residual disease detection / G. Gaipa, G. Basso, O. Maglia et al // Leukemia. 2005. - Vol. 18. - P. 703-708.

70. Gaipa, G. Reply to van der Sluijs-Gelling et al / G. Gaipa, G. Basso, R. Ratei et al // Leukemia. 2005. - Vol. 19. - P. 2351-2352.

71. Gaipa, G. Prednisone induces Immunophenotypic modulation of CD 10 and CD34 in nonapoptotic B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells / G. Gaipa, G. Basso, S. Aliprandi et al // Cytometry Part B. 2008. - Vol. 74B, - P. 150155.

72. Gaipa, G. Time-point dependent concordance of flow cytometry and RQ-PCR in the MRD detection in childhood ALL: the experience of the AIEOP-BFM-ALL MRD Study Group / G. Gaipa, G. Cazzaniga, M. Veltroni et al // Blood. -2009. Vol. 112, № 11 - P. 260-261.

73. Gaynon, P.S. Long-term results of the children's cancer group studies for childhood acute lymphoblastic leukemia 1983-2002: A Children's Oncology Group Report / P.S. Gaynon, A.L. Angiolillo, W.L. Carroll et al // Leukemia. 2010. - Vol. 24.-P. 285-297.

74. Germano, G. Two consecutive immunophenotypic switches in a child with MZZ-rearranged acute lymphoblastic leukemia / G. Germano, M. Pigazzi, L. del Giudice et al // Haematologica. 2006. - Vol. 91, N2. - P. e29-e31.

75. Harbott, J. Incidence of TEL/AML I fusion gene analized consecutively in children with acute lymphoblastic leukemia in relapse / J. Harbott, S. Viehmann, A. Borkhardt et al // Blood. 1997. - Vol. 90, N12. - P. 4933-4937.

76. Hilden, J.M. Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report on CCG 1953 from the Children's Oncology Group / J.M. Hilden, P.A. Dinndorf, S.O. Meerbaum et al // Blood. 2006. - Vol. 108, N2. - P. 441-451.

77. Hrusak, O. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemia / O. Hrusak, A. Porwit-MacDonald // Leukemia. 2002. - Vol. 16. - P. 1233-1258.

78. Hulspas, R. Consideration for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry / R. Hulspas, M.R.G. O'Gorman, B.L. Wood et al // Cytometry B Clin. Cytom. 2009. - Vol. 76B. - P. 355-364.

79. Imbach, P. Pediatric oncology / P. Imbach, T. Kühne, R. Arceci. -Heidelberg: Springer, 2006. 267 p.

80. Iwamoto, S. Mesenchymal cells regulate the response of acute lymphoblastic leukaemia cells to asparaginase / S. Iwamoto, K. Mihara, J.R. Downing et al//J. Clin. Invest. 2007.-Vol. 117, N4.-P. 1049-1057.

81. Jarvik, J.G. The research framework / J.G. Jarvik // Am. J. Roentgenol. — 2001.-Vol. 176.-P. 873-877.

82. Jennings, C.D. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematologic malignancy / C.D. Jennings, K.A. Foon // Blood. — 1997. — Vol. 90, N8.-P. 2863-2892.

83. Kamps, W.A. Long-term results of Dutch Childhood Oncology Group studies for children with acute lymphoblastic leukemia from 1984 to 2004 / W.A. Kamps, K.M. van der Pal-de Bruin, A.J.P. Veerman et al // Leukemia. 2010. -Vol. 24.-P. 309-319.

84. Karachunskiy, A. Results of the first randomized multicentre trial on childhood acute lymphoblastic leukaemia in Russia / A. Karachunskiy, R. Herold, A. von Stackelberg et al // Leukemia. 2008. - Vol. 22. - P. 1144-1153.

85. Kerst, G. Concurrent detection of minimal residual disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry and real-time PCR / G.

86. Kerst, H. Kreyenberg, C. Roth et al // Br. J. Haematol. 2005. - Vol. 128 - P. 774782.

87. Krampera, M. Flow cytometric detection of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukaemia / M. Krampera, O. Perbellini, A. Maggioni et al // Haematologica. 2001. - Vol. 86, N3. - P. 322-323.

88. Krampera, M. Methodological approach to minimal residual disease detection by flow cytometry in adult B-lineage acute lymphoblastic leukemia / M. Krampera, O. Perbellini, C. Vincenzi et al // Haematologica. 2006. - Vol. 91, N8. -P. 1109-1112.

89. Liu, L. Nonpositive terminal deoxynucleotidyl transferase in pediatric precursor B-lymphoblastic leukemia / L. Liu, L. McGavran, M.A. Lovell et al // Am. J. Clin. Pathol. 2004. - Vol. 121,-P. 810-815.

90. Lucio, P. Flow cytometric analysis of normal B cell differentiation: a frame of reference for the detection of minimal residual disease in precursor-B-ALL / P. Lucio, A. Parreira, M.V.M. van den Beemd et al // Leukemia. 1999. - Vol. 13. -P. 419-427.

91. Lucio, P. BIOMED-I concerted action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B-ALL with standardized triple-stainings / P.1.cio, G. Gaipa, E.G. van Lochem et al // Leukemia. 2001. - Vol. 15. - P. 11851192.

92. Malec, M. Flow cytometry and allele-specific oligonucleotide PCR are equally effective in detection of minimal residual disease in ALL / M. Malec, E. Bjorklund, S. Soderhall et al. // Leukemia. 2001. - Vol. 15. - P. 716-727.

93. Mann, G. Acute lymphoblastic leukemia with t(4;ll) in children 1 year and older: the "big sister" of the infant disease? / G. Mann, G. Cazzaniga, V.H.J, van der Velden et al // Leukemia. 2007. - Vol. 21. - P. 642-646.

94. McKenna, R.W. Immunophenotypic analysis of hematogones (B-lymphocyte precursors) in 662 consecutive bone marrow specimens by 4-color flow cytometry / R.W. McKenna, L.T. Washington, D.A. Aquino // Blood. 2001. - Vol. 98, N8.-P. 2498-2507.

95. Mejstrikova, E. Detection of residual B precursor lymphoblastic leukemia by uniform gating flow cytometry / E. Mejstrikova, E. Fronkova, T. Kalina et al // Pediatr. Blood Cancer. 2010. - Vol. 54, N1. - P. 62-70.

96. Mitchell, C. Long-term follow-up of the United Kingdom medical research council protocols for childhood acute lymphoblastic leukaemia, 1980-2001 / C. Mitchell, S. Richards, C.J. Harrison, T. Eden // Leukemia. 2010. - Vol. 24. - P. 406-418.

97. Moppett, J. The clinical relevance of detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia / J. Moppett, G.A.A. Burke, C.G. Steward et al // J. Clin. Pathol. 2003. - Vol. 56, - P. 249-253.

98. Morike, A. Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000 / A. Morike, M. Zimmermann, A. Reiter et al. // Leukemia. 2010. - Vol. 24. -P. 265-284.

99. Naeim, F. Hematopathology: morphology, immunophenotype, cytogenetics and molecular approaches / F. Naeim, P.N. Rao, W.W. Crody. -Amsterdam: Elsevier, 2008. 577 p.

100. Neudenberger, J. Lack of expression of the chondroitin sulphate proteoglycan neuron-glial antigen 2 on candidate stem cell population in pediatric acute myeloid leukemia / abn (llq23) and lymphoblastic leukemia / t(4;ll) / J.

101. Neudenberger, M. Hotfilder, A. Rosemann et al // Br. J. Haematol. 2006. - Vol. 133 - P. 337-344.

102. Obuchowski, N.A. ROC analysis / N.A. Obuchowski // Am. J. Roentgenol. 2005. - Vol. 184. - P. 364-372.

103. Orfao, A. Flow cytometry: its applications in hematology / A. Orfao, A. Ruiz-Arguelles, F. Lacombe et al // Haematologica. 1995. - Vol. 80, - P. 69-81.

104. Paganin, M. Minimal residual disease is an important predictive factor of outcome in children with relapsed "high-risk" acute lymphoblastic leukemia / M. Paganin, M. Zecca, G. Fabbri et al // Leukemia. 2008. - Vol. 22, N12. - P. 21932200.

105. Pui, C.H. Treatment of acute leukemias / C.IT. Pui. Totowa NJ: Humana Press, 2003. - 580 p.

106. Pui, C.H. Toward a total cure for acute lymphoblastic leukemia / C.H. Pui // J. Clin. Oncol. 2009. - Vol. 27, - P. 5121 -5123.

107. Pui, C.H. Long-term results of St. Jude Total therapy studies 11, 12, 13A, 13B and 14 for childhood acute lymphoblastic leukemia / C.H. Pui, D. Pei, J.T. Sandlund et al // Leukemia. 2010. - Vol. 24. - P. 371-382.

108. Ratei, R. Immunophenotype and clinical characteristics of CD45-negative and CD45-positive childhood acute lymphoblastic leukemia / R. Ratei, C. Sperling, L. Karawajew et al // Ann. Hematol. 1998. - Vol. 77, - P. 107-114.

109. Ratei, R. Normal lymphocytes from leukemic samples as an internal control for fluorescence intensity in immunophenotyping of acute leukemias / R. Ratei, L. Karawajew, F. Lacombe et al // Cytometry B Clin. Cytom. 2005. - Vol. 70B.-P. 1-9.

110. Rhein, P. CDllb is a therapy-resistant and minimal residual disease-specific in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia / P. Rhein, R. Mitlohner, G. Basso et al // Blood. 2010. - Vol. 115, - P. 3763-3771.

111. Salzer, W.L. Long-term results of the pediatric oncology group studies for childhood acute lymphoblastic leukemia 1984—2001: a report from the children's oncology group / W.L. Salzer, M. Devidas, W.L. Carroll // Leukemia. 2010. - Vol. 24.-P. 355-370.

112. Schmiegelow, K. Long-term results of NOPHO ALL-92 and ALL-2000 studies of childhood acute lymphoblastic leukemia / K. Schmiegelow, E. Forestier, M. Hellebostad et al // Leukemia. 2010. - Vol. 24. - P. 345-354.

113. Schrappe, M. Improved outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use of anthracyclines and cranial radiotherapy: results of trial ALL-BFM 90 / M. Schrappe, A. Reiter, W.-D. Ludwig et al. // Blood. 2000. -Vol. 95.-P. 3310-3322.

114. Seegmiller, A.C. Characterization of immunophenotypic aberrancies in 200 cases of acute lymphoblastic leukemia / A.C. Seegmiller, S.H. Kroft, N.J. Krandikar, R.W. McKenna // Am J. Clin. Pathol. 2009. - Vol. 132, N6. - P. 692698.

115. Stam, R.W. Towards targeted therapy for infants acute lymphoblastic leukfemia / R.W. Stam, M.L. den Boer, R. Pieters // Brit. J. Haematol. 2006. - Vol. 132,-P. 539-551.

116. Stam, R.W. Gene expression profiling-based dissection of MLL translocated and MLL germline acute lymphoblastic leukemia in infants / R.W. Stam, P. Schneider, J.A.P. Hagelstein et al // Blood. 2010. - Vol. 115. - P. 2835-2844.

117. Stark, B. Long-term results of the Israeli National Studies in childhood acute lymphoblastic leukemia: INS 84, 89 and 98 / B. Stark, R. Nirel, G. Avrahami et al // Leukemia. 2010. - Vol. 24. - P. 419-424.

118. Stary, J. Long-term results of treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia in the Czech Republic / J. Stary, Y. Jabali, J. Trka et al // Leukemia. 2010. -Vol. 24.-P. 425-428.

119. Stow, P. Clinical significance of low levels of minimal residual disease at the end of remission induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia / P. Stow, L. Key, X. Chen et al // Blood. 2010. - Vol. 115. - P. 4657-4663.

120. Szczepanski, T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia / T. Szczepanski // Leukemia. 2007. - Vol. 21, - P. 622-626.

121. Toedling, J. Automated in-silico detection of cell populations in flow cytometry readouts and it's application to leukemia disease monitoring / J. Toedling, P. Rhein, R. Ratei et al // BMC Bioinformatics. 2006. - Vol. 7, - P. 282-293.

122. Tsuchida, M. Long-term results of Tokyo Children's Cancer Study Group trials for childhood acute lymphoblastic leukemia, 1984-1999 / M. Tsuchida, A. Ohara, A. Manabe // Leukemia. 2010. - Vol. 24. - P. 383-396.

123. Vidríales, M.B. Minimal residual disease monitoring by flow cytometry / M.B. Vidríales, J.F. San-Miguel, A. Orfao et al // Best Pract Res Clin Haematol. -2003.-Vol. 16, N12.-P. 599-612.

124. Weinstein, S. Clinical evaluation of diagnostic tests / S. Weinstein, N.A. Obuchowski, M.L. Lieber // Am. J. Roentgenol. 2005. - Vol. 184. - P. 14-19.

125. Wuchter, C. Detection of acute leukemia cells with mixed lineage leukemia (MLL) gene rearrangements by flow cytometry using monoclonal antibody 7.1 / C. Wuchter, J. Harbott, C. Schoch et al // Leukemia. 2000. - Vol. 14, - P. 1232-1238.

126. Zangrando, A. Validation of NG2 in identifying BP-ALL patients with MLL-rearrangements using qualitative and quantitative flow cytometry: a prospective study / A. Zangrando, F. Intini, G. te Kronie, G. Basso // Leukemia. 2008. — Vol. 22,-P. 858-861.

127. Zangrando, A. MLL rearrangements in pediatric acute lymphoblastic and myeloblasts leukemias: MLL specific and lineage-specific signatures / A. Zangrando,

128. M. C. Dell'Orto, G. te Kronnie, G. Basso // BMC Med. Genom. 2009. - Vol. 23, -P. 2-36.

129. Zweig, M.H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine / M.H. Zweig, G. Campbell // Clin. Chem.- 1993. -Vol. 31.-P. 561-577.