Исследование механизма транспорта олигонуклеотидов в эукариотические клетки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Шестова, Ольга Евгеньевна

• Шестова, Ольга Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шестова, Ольга Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Основные механизмы транспорта макромолекул в эукариотические клетки 1 .¡.Введение.

1.2. Основные механизмы транспорта макромолекул.

1.3. Клатрин-зависимый транспорт.

3.1.Клатрин - структурная единица оболочки окаймленных везикул.

1.3.2. Динамический цикл сборки/диссоциации клатриновых оболочек.

1.3.3. Образование окаймленной везикулы. . г *-V-'-.

1.4. Альтернативные механизмы клеточного транспорта.

1.5.Кавеолин-зависимый транспорт.

1.6. Транспорт через неокаймленные ямки.

1.7. Макропиноцитоз.

1.8. Взаимосвязь между различными механизмами эндоцитоза.

1.9. Клеточные компартменты, участвующие в эндоцитозе.

1.10. Ранние эндосомы - сортировка и рециклизация.

1.11. Транспорт гормонов в ядро.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Общая характеристика олигонуклеотидсвязывающих белков. клеточной поверхности.

3.2.0лигонуклеотидсвязывающие белки клеточной поверхности. участвуют в транспорте олигонуклеотидов в клетку.

3.3.Олигонуклеотид-связыеающие белки клеточной поверхности. транспортируют олигонуклеотиды в закисляемые клеточные компартменты.

3.'4.Применение фоточувствительных реагентов в исследовании. олигонуклеотидсвязывающих белков

Ъ.5.Конъюгаты олигонуклеотидсвязывающий белок - олигонуклеотид . 60 транспортируются в клеточное ядро.

3.6. В клад различных механизмов в транспорт олигонуклеотидов в клетку.,

3.7. Транспорт полимерных нуклеиновых кислот.

4.ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма транспорта олигонуклеотидов в эукариотические клетки»

Применение олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям нуклеиновых кислот определенных клеточных генов, открывает новые возможности в плане регуляции активности генома. Реакционноспособные производные антисмысловых олигонуклеотидов рассматриваются как потенциальные химиотерапевтические препараты в лечении вирусных и онкологических заболеваний [1]. Экспериментально показана способность олигонуклеотидов ингибировать экспрессию генов в клетках за счет комплементарных взаимодействий [2, 3]. Созданы генноинженерные конструкции, способные эффективно экспрессировать в культивируемых клетках и клетках целого организма чужеродные белки, что в ближайшей перспективе позволит корректировать генетические дефекты в рамках генотерапии.

Существенным препятствием для развития антисмысловых технологий и практической генотерапии является низкая проницаемость клеточных мембран для олигонуклеотидов и полимерных нуклеиновых кислот. Разработано множество различных подходов к решению этой проблемы. Синтезированы неионные аналоги олигонуклеотидов, обладающие повышенной способностью проникать через клеточные мембраны [4-6]. Для повышения эффективности доставки в клетки олигонуклеотидов и генетических конструкций применяются разнообразные носители: липосомы [7], реконструированные оболочки вирусов Сендая и гриппа [8-10], катионные липиды [8].

Мы полагаем, что принципиально иной подход к проблеме создания методов эффективной доставки олиго- и полинуклеотидов в клетки организма может быть сформулирован в процессе изучения естественных транспортных 6 путей нуклеиновых кислот в живых системах. В результате исследований, проводимых в НИБХ СО РАН и параллельно ведущихся зарубежными исследователями, в эукариотических клетках были обнаружены белки, связывающие экзогенные олиго- и полинуклеотиды [11-15]. В то же время имеются многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу эндоцитоза как наиболее вероятного механизма транспорта олигонуклеотидов в клетки [11, 12, 15]. Однако участие выявленных олигонуклеотидсвязывающих белков в транспорте нуклеиновых кислот в клетки обсуждалось лишь предположительно.

Целью настоящей работы было исследование механизмов транспорта олигонуклеотидов в культивируемые эукариотические клетки, определение роли олигонуклеотидсвязывающих белков клеточной поверхности в этом транспорте и выявление промежуточных и целевых клеточных компартментов, участвующих в транспорте олигонуклеотидов.

Основные механизмы транспорта макромолекул в эукариотические клетки.

Введение

Эндоцитоз как постоянное перемещение в клетку фрагментов плазматической мембраны и молекул из внеклеточного пространства является процессом, связывающим внутренний мир клетки с экстраклеточным пространством. Во всех эукариотических клетках обнаружены транспортные везикулы, образованные из плазматической мембраны. Эндоцитоз необходим для поддержания клеточного гомеостаза и постоянного состава плазматической мембраны. Эндоцитоз является важным механизмом, поддерживающим физиологическое равновесие и на уровне многоклеточного организма, посредством контроля большого числа функций, которые клетка выполняет как элемент клеточного сообщества. Эти функции включают в себя передачу нервных, метаболических и пролиферативных сигналов, транспорт необходимых для жизнедеятельности клеток макромолекул, защиту от инфекционных агентов. В последние годы появилось много новых данных о функционировании клеточных структур, участвующих в эндоцитозе и механизмах, ответственных за молекулярную сортировку белков и липидов. Опубликованы обзорные работы по различным механизмам эндоцитоза, по конкретным этапам процесса транспорта и связанными с ними клеточными компартментами [16-20]. Целью настоящего обзора является обобщение существующей информации по компартментам и структурам, участвующим в разных путях транспорта экстраклеточных макромолекул и жидкости в клетку.

Основные механизмы транспорта макромолекул

К настоящему времени известно четыре морфологически различающихся пути транспорта внеклеточной жидкости и лигандов клетками [21]. Они различаются по составу оболочки (если она есть), размерам транспортных везикул (Рис. 1) и чувствительности к различным ингибиторам клеточного транспорта (Табл. 1).

Рис. 1. Схема множественных путей транспорта макромолекул и внеклеточной жидкости в клетку.

Таблица 1

Селективные ингибиторы для дискриминации различных путей эндоцитоза [21]

Условия обработки, приводящей к ингибированию транспорта Эффект

Окаймленные везикулы

Закисление цитозоля Селективное ингибирование [22]; неправильная сборка клатриновых решеток [23]

Истощение клеток по К+ Селективное ингибирование [24]; диссоциация клатрина [25]

Гипертоническая среда Селективное ингибирование [23], такой же эффект, как при истощении клеток по К+

Хлорпромазин Селективное ингибирование [25]; клатрин и адаптины диссоциируют от плазматической мембраны.

Кавеолы

Филипин Селективное ингибирование [26]; связывает холестерин.

Цитохалазин Д Ингибирует транспорт через кавеолы [27]; разрушает микрофиламенты.

Форболовые эфиры Селективное ингибирование [28]; активация протеинкиназы С.

Окадаевая кислота Селективная стимуляция [27]; ингибитор фосфатаз.

Неокаймленные везикулы

Селективные аффекторы неизвестны

Макропиноцитозные везикулы

Факторы роста, форболовые эфиры Селективная стимуляция [29,30]

Амилорид/ гексаметиламилорид Ингибирование [29,30]

Клатрин-зависимый транспорт

К настоящему времени наиболее подробно охарактеризован клатрин-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз [17, 19, 31], который представляет собой эффективную интернализацию рецептор-лигандных комплексов с клеточной поверхности посредством специализированных мембранных структур - окаймленных (клатриновых) ямок. Первый этап этого процесса - взаимодействие экстраклеточного лиганда с соответствующим рецептором на клеточной поверхности, несущим сигнал для эндоцитоза на обращенных в цитоплазму участках, которое инициирует концентрирование рецепторов в окаймленных ямках (Рис. 2). Затем происходит инвагинация окаймленных ямок, в итоге приводящая к отделению окаймленных

1. ишщшшяя активация. * клатршювъш Фнскелиопы рост

3, увеличение кршшзны. 4 К

ГТФ ГДФ : АТФ л

АДФ «•у

ГТФ

ГДФ

АТФ

4. отделение везикулы *

АТФ

АДФ V

V.У V адапташ рецептор ДйЩЯД. сайты связывания адаптинов

- 5. АТФ-зашешое высвобождение клатрша

6. диссоциация адаптинов ис.2 Динамический цикл сборки /диссоциации окаймленных везикул в процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза [20]. клатриновых) везикул. Т.о., лиганд-рецепторный комплекс доставляется в клетку в составе окаймленных везикул. Далее белки, формирующие окаймленные везикулы, диссоциируют от транспортных везикул, освобождаясь для следующего цикла сборки окаймленной ямки на клеточной поверхности, инвагинации и отделения от мембраны. Эндоцитированные с клеточной поверхности рецепторы и другие мембранные белки вместе с некоторым количеством внеклеточной жидкости в составе транспортных везикул попадают в ранние эндосомы. Из ранних эндосом многие белки, включая некоторые рецепторы, и примерно половина захваченной жидкости быстро возвращаются к плазматической мембране в составе специальных транспортных везикул. Прочие мембранные белки, регулируемые рецепторы, лиганды и оставшаяся жидкость транспортируются в поздние эндосомы и лизосомы.

Клатрин - структурная единица оболочки окаймленных везикул.

Рассмотрим подробно основные белки клеточной мембраны и цитоплазмы, принимающие участие в функционировании окаймленных ямок (везикул). Эти белки -клатрин и адаптины - выделены и охарактеризованы.

Основным структурным элементом мембраны окаймленных везикул является клатрин -белковый комплекс, состоящий из трех тяжелых (НС, ~ 190 кДа) и трех легких полипептидных цепей двух классов, LCa (23 кДа) и LCb (27 кДа). [20]. Другой мажорной группой белков оболочки являются адапторные белки (АР) или адаптины [32, 33]. Их функция in vivo точно не известна. В большинстве типов клеток имеются два структурно родственных класса АР. Представители обоих классов являются гетеротетрамерами. API состоит из двух больших субъединиц - у- и Р'-адаптинов(100 и 110 кДа соответственно) и двух малых субъединиц - 47 и 19 кДа. Аналогично, АР2 состоит из а- и р-адаптинов(100 и 110 кДа соответственно) и двух малых субъединиц -50 и 17 кДа.

Исследование in vitro возможной роли АР в функционировании окаймленных ямок показало, что адаптины способны стимулировать ассоциацию клатрина в физиологических условиях pH, ионной силы и в отсутствие двухвалентных катионов [34]. При этом они сами ассоциируются с клатрином в решетчатые структуры, аналогичные структуре оболочки окаймленной ямки. Пространственно молекулы АР находятся между клатриновой оболочкой и мембраной окаймленной ямки (или везикулы). С применением метода аффинной хроматографии получено непосредственное доказательство того, что адаптины способны взаимодействовать с сигналами эндоцитоза на цитоплазматических доменах рецепторов [35; 36]. Была сконструирована аффинная матрица с иммобилизованными белками, представляющими собой генноинженерные продукты, содержащие цитоплазматический домен рецептора липопротеина низкой плотности (LDL). Этот рецептор был обнаружен в окаймленных ямках плазматической мембраны. К другой матрице был присоединен полученный генноинженерным методом белок, содержащий цитоплазматический домен катион-независимого рецептора маннозо-6-фосфата (CI-M6P), найденного как в окаймленных ямках плазматической мембраны, так и в комплексе Гольджи. Оказалось, что с носителем, модифицированным CI-M6P, связываются и API и АР2 (очищенные и [1251]-меченые), а на колонке с цитоплазматическим доменом LDL-рецептора задерживался только АР2. Более подробные исследования показали, что связывание разных адаптинов происходит с различными сайтами цитоплазматического домена катион-независимого рецептора CI-M6P [36]. Этот результат указывает не только на способность адаптинов к непосредственному взаимодействию с цитоплазматическими доменами рецепторов in vitro, но и на вероятное их участие в адресной доставке рецепторов/рецептор-лигандных комплексов в целевой компартмент. Возможность участия других цитоплазматических факторов во взаимодействии мембранных рецепторов с клатриновой оболочкой in vivo в настоящее время остается неясной.

Динамический цикл сборки/диссоциации клатриновых оболочек.

Окаймленная ямка - сборка, рост, инвагинация.

Белки окаймленной ямки ассоциируют на клеточной поверхности в плоские структуры, которые постепенно приобретают кривизну - таким образом формируются окаймленные ямки [37]. Рецепторы, имеющие соответствующие сигналы эндоцитоза на своих цитоплазматических доменах, концентрируются в окаймленных ямках. Какой ([»актор является определяющим в этих процессах: происходит ли миграция рецепторов в уже начавшую формироваться окаймленную ямку или сами рецепторы инициируют ассоциацию белков клатриновой оболочки? Ответ на этот вопрос содержится в работе Miller К. [38] Авторы, используя трансформированные эмбриональные фибробласты цыпленка, эффективно экспрессирующие человеческий рецептор трансферрина (Tfn-R), показали, что увеличение количества этих рецепторов на клеточной поверхности не приводит к увеличению количества окаймленных ямок. Однако обнаружено, что Tfn-R ассоциируется и с плоскими фрагментами клатриновых решеток, лежащими за пределами окаймленных ямок. Оказалось также, что с повышением уровня экспрессии Tfn-R увеличивается плотность расположения рецепторов в плоских фрагментах клатриновых решеток, общая площадь этих участков в плазматической мембране также увеличивается. В итоге авторы делают вывод о том, что увеличенное число рецепторов, по-видимому, способствует росту клатриновых решеток, а взаимодействие элементов оболочки окаймленных ямок с рецепторами, аналогичными рецептору для трансферрина, является необходимым этапом в сборке клатриновых решеток [38; 39].

Однако предложенная модель имеет некоторые функциональные ограничения: очевидно, что сборка клатриновых решеток не происходит на внутриклеточно локализованных рецепторах. В то же время известно, что, например, рецептор трансферрина содержится в мембранах эндосом в значительно более высокой концентрации, чем в плазматической мембране. Итак, хотя и показана спонтанная самоассоциация клатрина и ассоциация его с мембранами in vitro, но очевидно также и то, что образование функционирующих окаймленных ямок на клеточной поверхности de novo зависит также от присутствия неопределенного цитозольного фактора [20].

Образование окаймленной везикулы.

Процесс образования окаймленной везикулы заключается в формировании замкнутой окаймленной структуры и слияния сближенных листков плазматической мембраны. Как оказалось, ингибиторы синтеза АТР не блокируют процесса инвагинации окаймленной ямки, но практически полностью подавляют слияние мембран. Фактически в этих условиях образуется полноценная окаймленная везикула, но соединенная с клеточной поверхностью мембранным мостиком. Недавно удалось выяснить, что ключевую роль в отделении сформировавшейся окаймленной везикулы играет специфическая GTP-аза динамин. Впервые этот белок был выделен из мозга крысы и идентифицирован как связывающий микротрубочки. Теперь известно, что динамин принадлежит к семейству "больших" GTP-аз [40], играющих ключевую роль в транспорте мембранных везикул. Впервые подробно функции и механизм действия динамина были исследованы в экспериментах на мембранах, выделенных из мозговой ткани [41]. Авторы инкубировали лизированные синаптосомы в присутствии цитозоля, АТР и негидролизуемого аналога GTP - GTPyS для реконструкции транспорта везикул с одновременной блокадой всех стадий, зависящих от гидролиза GTP. Электронная микроскопия полученных препаратов показала присутствие уникальных, никогда ранее не описанных мембранных интермедиатов: трубкообразных мембранных инвагинатов, обвитых регулярно уложенными витками - типа спирали. Эти структуры представляли собой углубления плазмалеммы, оканчивающиеся окаймленными ямками. Витки спирали напоминали кольца, образуемые очищенным динамином вокруг очищенных микротрубочек. Предположение о том, что эта спиралевидная структура образуется именно динамином, было подтверждено в экспериментах с использованием антител к динамину, меченных электроноплотной меткой [41]. Более того, в 1995 г. опубликована работа, в которой было показано, что очищенный динамин способен самоассоциироваться в кольцевые и спиралеподобные структуры с внутренним диаметром 25-30 мкм [42].

Имеющиеся к настоящему моменту данные позволили сформулировать модель функционирования окаймленной ямки как структурной и функциональной единицы эндоцитического процесса. В рамках этой модели клатриновая оболочка ответственна за формирование и стабилизацию окаймленной ямки, она обеспечивает концентрирование рецепторных молекул. Динамин является необходимым (но возможно, не единственным) фактором, который инициирует отделение окаймленной везикулы от плазматической мембраны. Процесс ассоциации клатриновой решетки приводит к постепенному углублению окаймленной ямки до тех пор, пока не образуется узкий перешеек, соединяющий окаймленную ямку с окружающей ее плазматической мембраной. Предполагается, что функциональные единицы динамина (вероятнее всего - тетрамеры [42]) концентрируются около формирующейся клатриновой решетки, обратимо взаимодействуя с ее компонентами. Высокая локальная концентрация динамина приводит 1С его олигомеризации в открытое кольцо вокруг горловины окаймленной ямки. Последущее конформационное изменение структуры этого кольца, зависящее от реакции гидролиза ОТР, приводит к отделению окаймленной везикулы и диссоциации динаминового кольца. В присутствии негидролизуемого аналога ОТР - ОТРу8 олигомерная структура динамина стабилизируется, равновесие реакции олигомеризации-диссоциации динамина сдвигается и происходит наращивание открытого кольца с образованием спиралевидной структуры, которая как бы обвивается вокруг удлиненного в этом случае перешейка окаймленной ямки.

Морфологические исследования событий, развивающихся после отделения окаймленной везикулы от плазматической мембраны, показали, что при этом очень быстро происходит разрушение клатриновой оболочки. Катализирует этот процесс белок массой 70 кДа - "раздевающая" АТР-аза, которая высвобождает клатрин от окаймленных везикул, но не от окаймленных ямок (вне зависимости от их кривизны) [23]. Предполагается, что отделение клатриновой везикулы от плазматической мембраны сопровождается конформационными изменениями легких цепей клатрина (ЬСа), и регулирует таким образом разрушение клатриновой оболочки [43]. Клатрин при этом высвобождается в стехиометрическом комплексе с "раздевающей" АТР-азой и с утраченной способностью к самоассоциации, которая восстанавливается в присутствии неизвестных пока цитозольных факторов.

Альтернативные механизмы клеточного транспорта

Биохимические исследования транспорта в клетки в присутствии различных ингибиторов клатрин-зависимого эндоцитоза показали, что подавление транспорта различных лигандов и их рецепторов не сопровождается, как это не удивительно, существенным снижением уровня аккумуляции внеклеточной жидкости [44]. Показано также, что почти полное ингибирование эндоцитоза лигандов, транспортируемых клатрин-зависимым образом, только наполовину ингибирует транспорт рецепторов инсулина, интерлейкина 2, эпидермального фактора роста и рицина [45]. Эти данные послужили основанием для развития представлений о клатрин-независимых механизмах транспорта [44]. Следует заметить, что эти же данные свидетельствуют о возможности транспорта некоторых рецепторов в клетку не единственным способом. В литературе имеются указания на то, что рецепторы эпидермального фактора роста и инсулина могут использовать два механизма транспорта в клетку. Один характеризуется как быстрый и определяется как клатрин-зависимый, другой происходит в 5 раз медленнее и не зависит от клатрина [46, 47].

Кавеолин-зависимый транспорт

Кавеолы определяются как специализированные домены на клеточной поверхности, обогащенные гликозилированными сфинголипидами и холестерином. Специальная электронно-микроскопическая методика - "скалывание быстро замороженных образцов" - выявила спиральную структуру оболочки кавеолы [48]. Ранее предполагалось, что кавеолин/У1Р21 - 21 кДа интегральный мембранный фосфопротеин, локализованный иммунохимическим методом в кавеолах, является специфическим основным структурным белком оболочки кавеолы. Однако в недавних исследованиях было показано, что холестеролоксидаза вызывает перераспределение кавеолина в мембраны комплекса Гольджи без уменьшения его содержания в кавеолах [49]. Холестерин является обязательным структурным элементом кавеолы - известно, что препараты, связывающие холестерин, разрушают кавеолу и препятствуют ее функционированию [26]. Морфологический и биохимический анализ рецептор-опосредованной интернализации через кавеолы двух лигандов - холерного токсина и антител к щелочной фосфатазе, заякоренной в мембране через гликофосфатидилинозитол (ОР1), показал, что классический эндоцитозный механизм транспорта реализуется и при интернализации молекул через кавеолы. Так, оказалось, что меченный коллоидным золотом холерный токсин связывается с ганглиозидом GMi, концентрирующимся в кавеолах, а затем детектируется в эндоцитозных везикулах, отделяющихся от клеточной поверхности [27]. GPI - модифицированная щелочная фосфатаза в норме равномерно распределена по клеточной поверхности, но аккумулируется в кавеолах после кластеризации с перекрестно сшитыми антителами к ферменту. Указанное обстоятельство позволяет использовать предложенный подход для определения эффективности эндоцитоза именно через кавеолы.

Приведенные данные свидетельствуют о несомненном существовании альтернативных клатрин-зависимому путей транспорта, обеспечивающих селективный рецептор-опосредованный эндоцитоз.

Особенным, по-видимому, весьма частным механизмом транспорта, опосредуемым кавеолами, является потоцитоз. Этот термин был предложен R.G.W. Anderson. Им же были охарактеризованы основные свойства потоцитоза как специализированного механизма для транспорта в цитоплазму небольших молекул, выполняющих сигнальные функции. При этом предполагается, что особенность потоцитозных везикул (кавеол) в том, что они хотя и отшнуровываются от плазматической мембраны, но не сливаются с другими компартментами, участвующими в эндоцитозе, а транспортируемые молекулы попадают в цитоплазму через специальные водные каналы. Наиболее подробно потоцитоз охарактеризован как механизм транспорта в цитоплазму клеток 5-метилтетрагидрофолата (MeTHF). Интересные результаты, касающиеся сравнительной эффективности транспорта IvteTHF в цитоплазму из окаймленных везикул и из кавеол, представил Anderson R.G.W [50]. Авторы сконструировали две плазмиды, одна из них содержала полноразмерную копию гена природного рецептора фолата, вторая экспрессировала химерный фолатный рецептор, у которого часть С-конца была замещена на трансмембранный домен рецептора ЛНП с сохранением цитоплазматического эктодомена фолатного рецептора.

Трансмембранный домен ЛНП-рецептора определил локализацию химерного фолатного рецептора в окаймленных ямках, в чем авторы убедились специально. Полученными плазмидами были трансформированы СНО клетки, дефектные по рецепторам для ЛНП и фолата одновременно, получены стабильные клеточные линии, экспрессирующие природный и химерный рецептор примерно с равными эффективностями. В ходе работы авторы инкубировали клетки с [ Н]-фолиевой кислотой (не диссоциирующей от рецептора после связывания), различное время и затем в клетках каждой из линий экспериментально определяли количество рецепторов, расположенных на клеточной поверхности, и количество интернализованных рецепторов. Оказалось, что из окаймленных ямок о интернализуется более 75% от общего количества рецепторов, меченных [ Н]-фолиевой кислотой, а из кавеол - менее 25%. Далее, используя [3Н]- МеТШ, определили, какая часть интернализованного лиганда попадает в цитоплазму клетки. Так, оказалось, что в случае химерного рецептора, локализованного в окаймленных ямках, в цитоплазму попадает около 20% связанного клетками лиганда, а в случае рецептора, локализованного в кавеолах, практически весь интернализованный клетками МеТНР оказывается в цитоплазме клеток. На основании результатов этой работы авторы сделали вывод о том, что рецепторы, локализующиеся в кавеолах, располагают более эффективным механизмом для доставки небольших молекул в цитоплазму, чем рецепторы, локализованные в окаймленных ямках.

В последнее время появились данные, указывающие на необходимость пересмотра некоторых представлений о кавеолах. Показано, например, что ОР1-модифицированные белки исключаются из кавеол в клетках эндотелия [51]. Другие исследования демонстрируют близкое к равномерному распространение этих белков по клеточной поверхности [27; 52] и их перераспределение в кавеолы при ковалентном присоединении к антителам [27; 53] или при обработке детергентом [54]. Наиболее вероятным объяснением этих результатов является предположение о том, что ОР1-модифицированные белки обладают сродством к нерастворимым в детергенте гликосфинголипид-богатым доменам плазматической мембраны.

Скорость интернализации любого рецептора определяется тремя параметрами - площадью поверхности эндоцитозных везикул, скоростью образования эндоцитозной везикулы и степенью концентрирования рецептора в окаймленной ямке или се аналоге [21]. Проведем сравнение эффективностей клатрин-зависимого и кавеолин-зависимого путей транспорта. Обычно считается, что окаймленные ямки составляют 2-3% поверхности плазматической мембраны, и образование эндоцитозной клатриновой везикулы занимает около 1 мин. Это значит, что равномерно распределенные мембранные маркеры, интернализуются с окаймленными везикулами со скоростью 2-3 % от общего количества за мин. Трансферрин, который концентрируется в окаймленных ямках 10-20 кратно, аккумулируется клетками со скоростью 20-40 % в мин. Время, необходимое для образования пиноцитических везикул других классов, неизвестно, однако по косвенным данным, скорость интернализации кавеол весьма невелика [27]. Отсюда следует, что считать кавеолы основным путем интернализации какого-либо белка можно только тогда, когда соблюдаются два необходимых условия: концентрирование белка в кавеолах и исключение его из окаймленных ямок.

Транспорт через неокаймленные ямки

Очевидно, что кавеолами являются не все, не имеющие клатриновой оболочки инвагинации, наблюдаемые на плазматической мембране. В литературе для многих типов клеток подробно охарактеризованы неокаймленные ямки, отделяющиеся от клеточной мембраны с образованием гладких везикул, несущих маркерные молекулы жидкой фазы, например, пероксидазу хрена [55, 56]. Эти неокаймленные везикулы в среднем имеют больший размер по сравнению с кавеолами и несколько меньший, чем клатриновые везикулы (Рис.1). Биохимически дискриминируют эти два класса неокаймленных везикул по присутствию маркерного белка кавеол - кавеолина [21]. Селективным ингибитором транспорта рицина и жидкой фазы через неокаймленные везикулы является цитохалазин Д, на интернализации трансферриновых рецепторов его присутствие никак не сказывается. Колхицин оказывает на транспорт через неокаймленные ямки сходное воздействие [22]. Функциональное значение неокаймленных везикул для клеток остается не вполне ясным. Но относительно недавние исследования позволяют сделать некоторые предположения на этот счет. Были получены стабильно трансформированные клетки линии HeLa, суперэкспресирующие мутантный динамин [57]. Фенотипически это проявлялось как температурочувствительный (ts) дефект в образовании эндоцитических везикул клатринового пути транспорта. Этот ts-дефект рецептор-опосредованного эндоцитоза при повышении температуры до непермиссивной (38° С) развивался довольно быстро ( в течении 5-ти мин) и был полностью обратим. Однако транспорт пероксидазы (HRP) как маркера жидкой фазы ингибировался в этих условиях только частично. Более того, через 30 мин инкубации клеток при повышенной температуре уровень транспорта клетками жидкой фазы восстанавливался до нормального ( как при 37°) значения, в то время как рецептор-опосредованный транспорт оставался заблокированным. Выявленный транспорт HRP по альтернативному пути и его изменения (снижение уровня, наблюдаемое сразу после повышения температуры до 38° и поел едущее восстановление до нормального значения) оказались нечувствительными к действию агентов, вызывающих закисление цитозоля, и поэтому ингибирующих клатрин-зависимый транспорт. Авторы полагают, что именно через неокаймленные везикулы осуществляется охарактеризованный ими альтернативный компенсаторный транспорт жидкой фазы.

Макропиноцитоз

Макропиносомами называют неклатриновые везикулы, гетерогенные по размеру (0,5 - 2 мкм), которые образуются в основном на переднем крае способной к передвижению клетки в ответ на присутствие в среде форболовых эфиров и ростовых факторов [29, 58]. Существенное отличие макропиносом от эндосом клатринового пути заключается в том, что содержимое макропиносом не подвергается закислению. Следует отметить, что макропиносомы характеризуются высоким значением отношения объем везикулы/площадь ее поверхности по сравнению с окаймленными и неокаймленными везикулами [31]. Это обстоятельство объясняет формальную противоречивость некоторых ([»актов: показано, что стимуляция макропиноцитоза ростовыми факторами приводит к увеличению захвата жидкости клеткой в 6-10 раз [30], в то время как мембранносвязанные маркеры эндоцитоза, такие, как рицин, интернализуются клеткой всего в 1,5 - 2 раза эффективнее по сравнению с базовым уровнем [58].

Взаимосвязь меяеду различными механизмами эндоцитоза

Представления о существовании, по крайней мере, четырех различных путей транспорта в клетку не могут обойти вниманием естественный вопрос о том, попадают ли захваченные различными путями молекулы в один и тот же компартмент или, может быть, каждый путь существует для доставки экстраклеточных молекул в особый компартмент.

Имеющиеся к настоящему времени публикации не отвечают на этот вопрос однозначно. Так, в работе L.J. Hewlett [29] авторы исследовали, смешивается ли содержимое макроиииосом с содержимым ранних и поздних эндосом, меченных трансферрином или LDL. Было показано, что в клетках А431 клатрин-зависимый транспорт и макропиноцитоз приводят к появлению разных популяций эндосомных везикул. В процессе эксперимента ранние и поздние эндосомы через клатриновый путь нагружали FITC-трансферрином. Затем проводили стимуляцию макропиноцитоза добавлением EGF, в качестве маркера жидкой фазы использовали декстран, меченный красителем. Методом конфокальной микроскопии не удалось зафиксировать слияние между макропиносомами и ранними или поздними эндосомами. Однако было показано, что внутри популяции макропиносом слияние везикул происходит, и была зафиксирована рециклизация содержимого макропиноцитозных везикул на клеточную поверхность. Тем не менее, некоторые авторы не исключают возможности того, что судьба макропиносом может определяться фактором, который инициирует процесс макропиноцитоза [59].

Исследование судьбы других лигандов, маркирующих жидкую фазу, например, конканавалина А, меченного коллоидным золотом (Con A-Au) и использованного для характеризации неокаймленных везикул [60], показало, что после инкубации клеток НЕр-2 в присутствии этого лиганда, Con A-Au обнаруживается в тех же ранних эндосомах, что и классический маркер клатрин-зависимого пути, причем в условиях ингибирования транспорта через окаймленные ямки. Аналогичные результаты были получены для другого лиганда, также интернализуемого клеткой через неокаймленные ямки, - для холерного токсина [61].

Обычно считается, что лиганды, интернализуемые клеткой через кавеолин-зависимый путь, и лиганды, захватываемые клеткой через окаймленные ямки, локализуются в разных популяциях ранних эндосом, но в результате более тщательных исследований были получены результаты, свидетельствующие о том, что клатриновый и кавеолиновые пути могут все таки сходиться в один компартмент. Этот результат был получен на клетках СНО, экспрессирующих трансмембранную и ОР1-модифицированную формы рецептора Т-лимфоцитов - С04, которые интернализуются клеткой ('соответственно через окаймленные ямки и кавеолы и затем обнаруживаются в одних и тех же поздних эндосомах [62].

По-видимому, точность доставки лиганда в значительной степени определяется его собственной природой. Что касается слияния между популяциями различных по происхождению везикул, то оно, как правило, наблюдается на поздних этапах транспорта и, скорее всего, связано с "выбраковкой" компонентов транспортных везикул и их содержимого.

Существует несколько причин, которые объясняют существование в клетках гшьтернативных клатрин-зависимому путей транспорта жидкой фазы и лиганд-рецепторных комплексов.

Во-первых, разные популяции эндоцитозных везикул обеспечивают возможность их доставки по различным клеточным "адресам". Примером этому является транспорт инсулина в эпителиальных клетках [26]. Ранее предполагалось, что инсулин интернализуется в клетки через окаймленные ямки, но относительно недавно было показано, что, по крайней мере, в эндотелии капилляров он может эндоцитироваться и клатрин-независимым путем [63].

Во-вторых, разные пути эндоцитоза могут контролироваться различными механизмами, что расширяет спектр клеточных реакций на внешние стимулы. Так, сАМР селективно стимулирует клатрин-независимый эндоцитоз на апикальной поверхности поляризованных эпителиальных клеток, а интернализация через кавеолы селективно регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием конкретных белков [21]. Также имеются данные, свидетельствующие о том, что инсулин, эндоцитированный через окаймленные ямки, быстро деградирует, а доставленный в клетку кавеолами, подвергается трансцитозу [64].

В третьих, необходимой функцией клетки является функция поддержания площади и состава плазматической мембраны для того, чтобы убыль мембранной поверхности и ее компонентов за счет эндоцитоза компенсировалась посредством секреторного пути. В этом смысле феномен практически точной компенсации подавленного клатрин-зависимого эндоцитоза альтернативными (регулируемыми) путями транспорта по-видимому не является случайным совпадением [57]. Альтернативные механизмы эндоцитоза могут обеспечивать клетке возможность возврата в стационарное состояние после ответа на некие внешние воздействия. Относительный вклад каждого типа транспорта в суммарный процесс эндоцитоза скорее всего определяется типом клеток и может меняться в ответ на внешний сигнал. К примеру, при дифференцировке клеток 3T3-L1 в адипоциты увеличивается экспрессия кавеолина и соответственно количество кавеол возрастает в 9 раз [65, 66]. Этот результат прямо указывает на возможность изменения соотношения между различными путями эндоцитоза в ответ на меняющиеся физиологические потребности клетки.

Клеточные компартменты, участвующие в эндоцитозе

На рисунке 3 представлена схема, иллюстрирующая основные клеточные компартменты, участвующие во внутриклеточном транспорте эндоцитированного материала. Рассмотрим происхождение этих компартментов.

В настоящее время в литературе обсуждаются две основные модели биогенеза эндосом - эволюционная и стационарная.

В соответствии с первой ранние эндосомы постоянно образуются de novo при слиянии транспортных везикул, происходящих из плазматической мембраны. В этом случае состав

Плазма' ги' нч: к&я мембрана. г' ^-ч, Окаймленная

•(, ВЙЯИКУЛ»

Л " Л

I I Соотировка Рещрошзация "^га

Ршггше .

ЭНДОСОМ-Ы I

ЕСТ/МУВ'

Поздние

-:: шЛС.' ч^, -Л 11дед: ом Ы А : ° О " .

V .-"1 .Г-м.„. н-Ъ «о ./ ° \

Мзоеомы

Рис. 3. Основные клеточные компартменты эукариотической клетки, участвующие транспорте макромолекул [17]. ранних эндосом непрерывно меняется, некоторые компоненты возвращаются к клеточной поверхности, некоторые транспортируются из ^апэ-Гольджи комплекса, постепенно ранние эндосомы становятся поздними эндосомами, затем лизосомами. Альтернативная и, по-видимому, более близкая к реальности стационарная модель предполагает, что ранние и поздние эндосомы являются стабильными клеточными компартментами, связанными между собой, а ранние эндосомы с плазматической мембраной посредством везикулярного транспорта [17].

К настоящему времени показано, что ранние и поздние эндосомы отличаются между собой по внутриклеточной локализации, морфологии, значению рН, распределению специфических белков и рецепторов и потому являются отдельными компартментами. Как ранние, так и поздние эндосомы являются высокодинамичными структурами in vivo [67] и демонстрируют способность к гомотипическому слиянию in vitro [68]. Эти свойства ранних и поздних эндосом указывают на то, что каждая популяция эндосомных везикул, по-видимому, способна составлять единый компартмент функционально, посредством непрерывных обменов мембранами и содержимым между отдельными элементами.

Изучение способности к слиянию различных популяций эндосом между собой in vitro показало, что слияние между ранними и поздними эндосомами не происходит, хотя известно, как уже было указано выше, что гомотипическое слиние везикул внутри этих популяций имеет место. Электронно-микроскопические исследования, проведенные на разных типах клеток, выявили существование везикул, содержащих внутренние мембраны и названных мультивезикулярными тельцами или эндосомальными транспортными везикулами (ECW MVBs). Эти везикулы, предполагалось, являются транспортными интермедиатами между ранними и поздними эндосомами [69]. И, действительно, оказалось, что ECV/ MVBs способны к слиянию с поздними эндосомами, но не сливаются ни между собой, ни с ранними эндосомами, причем, взаимодействию между ECV/ MVBs и поздними эндосомами способствуют элементы цитоскелета -микротрубочки - как in vivo, так и in vitro. К тому же, как было выше указано, ранние и поздние эндосомы имеют различный состав белков, в то время, как все белки, найденные в ECV/ MVBs, обнаруживаются также либо в ранних, либо в поздних эндосомах [70]. Совокупность этих данных явно определяет функцию ECV/ MVBs как временных транспортных интермедиатов между ранними и поздними эндосомами.

Ранние эндосомы - сортировка и рециклизация.

К настоящему времени известно, что сортировка рециклизуемых мембранных компонентов и лигандов происходит в специальных тубуло-везикулярных и цистернальных структурах ранних эндосом, которые отличны от структур, содержащих только рециклизуемые мембранные компоненты. Поскольку уже подчеркивалась высокая фьюзогенная активность ранних эндосом in vitro, это их свойство, по-видимому, и создает предпосылки для динамической сегрегации сортирующих и рециклизующих доменов. Сортировка в эндосомах подробно изучена для трансферрина, который рециклизуется вместе со своим рецептором [71], и для LDL, который доставляется в поздние эндосомы и лизосомы [72]. Интернализация LDL и трансферрина с клеточной поверхности происходит довольно быстро, оба лиганда доставляются в одни и те же ранние эндосомы с типичной морфологией [73], где, собственно, и происходит сортировка. Везикулярная часть ранних эндосом имеет диаметр примерно 0,3 - 0,4 мкм с выходящими из нее узкими трубочками диаметром не более 60 нм ( тубулярная часть). Внутри поддерживается pH в диапазоне 6,0 - 6,2 единиц. В таких условиях большинство белковых лигандов, включая LDL, диссоциируют от своих рецепторов [74]. В отсутствие дополнительной информации для сортировки мембранные рецепторы перемещаются вместе с мембранным потоком в отделяемые везикулы или в тубулярные структуры (с высоким отношением поверхности к объему). В то же время LDL и другие высвобождаемые в кислых условиях лиганды накапливаются в большой, вакуолярной части эндосомы, которая, по-видимому, формирует ECV/MVBs. В дополнение к облегчению сортировки мембранных компонентов малый диаметр тубулярных структур может способствовать также селекции находящихся в объеме эндосомы лигандов на основании их размера [75]. Время пребывания молекул в сортирующих доменах невелико: в экспериментах с внесением меченых лигандов в среду на короткое время показано, что трансферрин покидает эти домены с ti/2 около 1,5-3 мин [76].

Из общих соображений можно предположить, что перемещение по эндоцитозному пути рецепторных молекул происходит со скоростью перемещения мембранной фазы. Действительно, показано, что в контрольных (нативных) клетках рецепторы трансферрина рециклизуются с той же скоростью, что и флуоресцентный аналог сфинголипида (в качестве мембранного маркера) [77]. Однако в присутствии различных ингибиторов клатрин-зависимого эндоцитоза естественное равенство скоростей перемещения этих молекул нарушается. Инкубация клеток в присутствии 2 мкМ монензина, в гипертоническом растворе №С1 или в условиях, истощающих клетки по ионам К+, оказывала одинаковый эффект: происходило 2-х кратное уменьшение скорости кругооборота рецептора трансферрина при прежней скорости транспорта мембранного маркера [77]. Авторы предполагают, что подобное рассогласование транспортных потоков является результатом изменений в эндосомном закислении. Правильное значение рН в эндосоме может, таким образом, быть необходимым условием для предотвращения нежелательных взаимодействий между белками, например, агрегации рецепторов. Действительно, другими авторами было продемонстрировано, что олигомеризованный трансферриновый рецептор рециклизуется в 4 раза медленее, чем мономерный [78]. Изложенные результаты свидетельствуют о многообразии механизмов регуляции процессов транспорта, сортировки и рециклизации.

Итак, из компартмента, в котором происходит сортировка, трансферрин и другие рециклизуемые молекулы попадают в узкие тубулярные компартменты, с диаметром около 50 нм. Эти тубулярные элементы во многих клетках соединены в единую сеть или несколько сетей. Во многих клетках общее распределение и морфология этих сетей в значительной степени напоминает таковые для ^апэ-Гольджи комплекса, но данные электронной микроскопии однозначно свидетельствуют о том, что это отдельные компартменты. Известно, что на клеточной поверхности происходит отщепление остатков сиаловой кислоты от рециклизуемых мембранных белков, параллельно этому процессу идет восстановление сиалирования этих белков в комплексе Гольджи, однако, скорость ресиалирования значительно ниже, чем скорость рециклизации этих же рецепторов [79]. Сопоставление этих данных указывает на то, что транспорт через trans-Гольджи является относительно редким событием для рециклизуемых рецепторов.

Показана ассоциация сети тубулярных элементов эндосом с микротрубочками цитоскелета. Однако это взаимодействие не является небходимым условием для рециклизации мембранных белков, которая происходит практически с той же скоростью в присутствии ингибиторов реакции полимеризации микротрубочек [80].

Тубулярная сеть является составной частью системы ранних эндосом, поскольку содержит рециклизуемые рецепторы, однако по некоторым критериям все же отличается от тубуло-везикулярных сортирующих эндосом. Во-первых, рециклизующий компартмент включает в себя трансферрин, но не LDL и другие лиганды, транспорт которых далее осуществляется в лизосомы [81]. Это означает, что функционально рециклизующий компартмент располагается после сортирующего в системе ранних эндосом. Во-вторых, не обнаруживается физической связи между сортирующими эндосомами (с LDL и трансферрином в качестве маркеров) и рециклизующими эндосомами (содержащими только трансферрин). Во многих случаях внутриклеточная локализация этих двух типов эндосомальных элементов различна. Наконец, для клеток СНО показано, что рециклизующие эндосомы имеют pH, на 0,3 - 0,4 единицы более щелочной, чем сортирующие [81].

Выше уже упоминалось, что кругооборот рецепторов, мембранных маркеров и маркеров жидкой фазы происходит с достаточно близкими скоростями. Так, для рецепторов среднее ti/г транспортного цикла составляет 4 - 7 мин [82]. Около 50 % или более интернализованных в клетки СНО флуоресцентно-меченных липидов возвращается к клеточной поверхности примерно за 5 мин. Половина захваченной клетками сахарозы высвобождается из фибробластов за время около 6 - 8 мин [17]. Сравнение этих данных, представленных разными авторами, наводит на мысль о том, что существует более чем один путь возвращения рецепторов и мембранного материала в состав плазматической мембраны. Возможно, некоторая часть рецепторов рециклизуется непосредственно из сортирующих элементов ранних эндосом (рис. 3 ).

Одна из основных функций рециклизующих эндосом - транспорт мембранных компонентов к клеточной поверхности. Однако было показано, что имеет место существенный внутриклеточный транспорт от рециклизующих к сортирующим эндосомам [67]. Этот результат кажется парадоксальным, поскольку подобный ретроградный поток должен уменьшать эффективность сортировки в сортирующих эндосомах. Однако такого рода прецеденты клеточной биологии уже известны: продемонстрировано существование транспорта из комплекса Гольджи в эндоплазматическую сеть. Наличие транспорта в этом направлении обосновывается необходимостью поддерживать специфический состав белков в этих органеллах [83]. Функция ретроградного транспорта в ранних эндосомах остается до конца не выясненной, но в любом случае приведенные данные иллюстрируют динамическое взаимодействие между разными элементами сложноорганизованного эндосомного компартмента. (Рис. 3).

Перенос материала из ранних эндосом к поздним происходит через диссоциацию везикулярных элементов от специализированных доменов сети ранних эндосом, их последущую миграцию вдоль микротрубочек цитоскелета в перинуклеарные отделы клетки и слияние транспортных везикул с поздними эндосомами [19]. Образование этих транспортных везикул сопровождается образованием в них же большого числа внутренних везикул. Эти внутренние везикулы происходят из инвагинаций самой эндосомной мембраны [84]. Эти многослойные структуры и есть известные довольно давно мультивезикулярные тельца [85].

Поздние эндосомы определяются как везикулярные структуры, которые аккумулируют и концентрируют интернализованные молекулы после их прохождения через систему ранних эндосом. Поздние эндосомы содержат функционально активные лизосомальные гидролазы, и, по-видимому, в них начинаются процессы деградации. Подобные свойства поздних эндосом используются некоторыми авторами как основание для отнесения их к пре-лизосомальному компартменту. [19]. Но поскольку существует непрерывный поток материала от поздних эндосом к лизосомам, эти два компартмента довольно сложно дискриминировать друг от друга. Обычно считается, что лизосомы имеют более высокое значение плавучей плотности при центрифугировании субчастиц в Перколле'е, не содержат рецепторы для маннозо-6-фосфата и функционально являются финальным местом аккумуляции интернализованных клеткой макромолекул [86]. Известно, что лизосомы получают эндоцитированный материал посредством слияния с поздними эндосомами или транспортными везикулами, поэтому удобно рассматривать их функционирование как циклический процесс (Рис. 3). В рамках циклической модели поздние эндосомы являются активными лизосомами, в которых происходит деградация внутреннего содержимого и одновременное удаление рециклизуемых рецепторов, например, рецептора маннозо-6-фосфата, с последовательным увеличением плавучей плотности. Продукты катаболизма высвобождаются, оставшийся негидролизуемый материал - лизосомальные гидролазы, некоторые мембраны и липидные компоненты -концентрируются, формируются так называемые "покоящиеся" лизосомы. Эти "покоящиеся" лизосомы, по-видимому, могут быть снова активированы при слиянии с другими транспортными везикулами. Предложенная выше модель согласуется с данными о том, что даже продолжительная инкубация не приводит к освобождению иммуноцитохимически определенных поздних эндосом от такого маркера как коллоидное золото и к полному перемещению этого маркера в лизосомы [87]. Эти результаты определенно свидетельствуют в пользу циклического функционирования поздних лизосом/эндосом, а не транспорта исключительно в одном направлении - от поздних эндосом к лизосомам. Эта схема циклического функционирования поздних лизосом/эндосом предполагает существование специализированных транспортных везикул, осуществляющих перенос лизосомальных гидролаз из комплекса Гольджи и мембранного и внутривезикулярного материала от поздних эндосом к ^апэ-Гольджи. В пользу этого свидетельствует наличие как в поздних эндосомах, так и в комплексе Гольджи идентичных малых ОТР-аз - специализированных белков, ответственных за мембранный транспорт [88].

Транспорт гормонов в ядро

Обычно рассмотрение транспорта экстраклеточных молекул заканчивается определением их локализации в поздних эндосомах или лизосомах. Однако известно, что некоторые молекулы, например, гормоны и ростовые факторы, способны проникать из внешней среды в клеточное ядро. Рассмотрим ситуацию с представлениями о транспорте в ядро стероидных и пептидных гормонов. Ранее предполагалось, что стероидные гормоны, являясь относительно липофильными молекулами, проникают в клетку простой диффузией через плазматическую мембрану. Однако экспериментальные данные о насыщаемом характере этого транспорта, зависимости от температуры доказывают существование на плазматической мембране специфических рецепторов, опосредующих транспорт стероидных гормонов по эндоцитозному механизму [89-91]. Если сопоставить современные представления о транспорте стероидных гормонов в клетку и тот факт, что действие стероидных гормонов на клетки-мишени осуществляется на уровне транскрипции генов [92], становится очевидным существование транспортного пути этих молекул из поздних эндосом (лизосом) в клеточное ядро. Известно также, что многие пептидные гормоны и факторы, такие как гормон роста [93], пролактин [94, 95], инсулин [96], интерлейкин-1а [97] и некоторые другие [98], имеют специфические рецепторы на клеточной поверхности, эндоцитируются клеткой и претерпевают транслокацию в ядро. Существующие данные об участии рецепторов в процессе транспорта лигандов в ядро противоречивы. Так, для гормона роста [93], эпидермального фактора роста и фактора роста нервов [99] показано, что транслокация в ядро является рецептор-зависимым процессом. По крайней мере, для гормона роста известно, что интернализация его в клетку и транспорт в ядро определяются присутствием одного и того же белка -рецептора гормона роста (ГР). В клетках, экспрессирующих только цитоплазматический белок, связывающий гормон роста, не наблюдается ни интернализация соответствующего гормона, ни его транспорт в ядро [93]. В то же время для инсулина [100] и пролактина [95], показано, что их специфические рецепторы только транспортируют свой лиганд к ядру, а в транслокации гормона в ядро участия не принимают. Есть еще одно свидетельство существования, по крайней мере, двух механизмов транспорта полипептидных гормонов и ростовых факторов в ядро - весьма различающаяся скорость транспорта этих молекул в ядро. Насыщение процесса транспорта гормона роста в ядра клеток СНО, экспрессирующих соответствующий рецептор, происходит к 40-50 мин инкубации в среде, содержащей этот гормон. Другие авторы для пролактина [95], соматостатина [98], эпидермального фактора роста [99] оценивают время, необходимое для ядерной транслокации, в диапазоне 18-24 час. Однако корреляции между участием рецептора в транспорте своего лиганда в ядро и временем, необходимым для транслокации гормона в ядро, обнаружить не удалось.

К сожалению, имеющиеся к настоящему времени данные не позволяют судить о механизме транспорта экстраклеточных молекул и, в частности, гормонов и ростовых факторов из эндоцитозных компартментов в клеточное ядро.

Еще недавно представления о значении процесса эндоцитоза для эукариотической клетки сводились к описанию фагоцитоза и пиноцитоза как процессов, реализующих преимущественно питательную и защитную функцию в жизни клетки. Поэтому эндоцитоз рассматривался как жестко направленный в лизосому транспорт внеклеточных макромолекул и микробов исключительно с целью их переваривания и возможной утилизации продуктов деградации [18,100]. Современные представления о функциях и конкретных механизмах эндоцитоза еще не оформились в единую картину, однако очевидно, что эндоцитоз является важным механизмом, поддерживающим физиологическое равновесие на уровне клетки и целого организма и контролирующим большое число клеточных функций. Показано участие клеточных сигнальных систем в регуляции эндоцитоза [101]. Предложенный обзор, как мы надеемся, отражает сложность и многоплановость процесса эндоцитоза, использующего разные транспортные пути и подразумевающего возможность сортировки эндо- и экзогенных молекул практически на всех этапах этого процесса.

Материалы и методы.

I Материалы

В работе были использованы следующие материалы: акриламид, N,N-метиленбисакриламид, трис-гидроксиметил аминометан, додецилсульфат натрия, глицин, АТР, декстран сульфат, среда для культивирования клеток IMDM, ДНК КРС (Sigma), маркеры молекулярного веса белков для SDS-ПААГ электрофореза (Amersham и Bio-Rad), детергент Тритон Х-100 (LKB), аммоний над сернокислый (Fluka), рентгеновская пленка "Кодак", [у-32Р]АТР, [а-32Р]АТР(БИОСАН) с удельной активностью 5000 Ci/mmol, трифенилфосфин (Fluka), дипиридилдисульфид (Aldrich), [14С]-сахароза (ЧССР). Т4 полинуклеотидкиназа (Biolabs), ДНК-полимераза I Е. coli ("Сибэнзим"). Остальные использованные реактивы были отечественного производства квалификации осч или хч.

II Методы

Культивирование клеток. В работе использовали культивируемые клетки фибробластов почки эмбриона свиньи СПЭВ и клетки мышиных фибробластов NIH ЗТЗ. [Слетки культивировали в среде IMDM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мг/мл гентамицина при 37° С в атмосфере 5% СОг. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трипановым синим. В экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 90%. Все эксперименты с клетками, если не указано иначе, проводили при 37°С.

Получение меченых олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды были синтезированы Т.В.Абрамовой (НИБХ СО РАН) фосфотриэфирным методом [102]. Олигонуклеотиды

32 метили Р в реакции фосфорилирования по 5'-концу с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 [103]. Меченые олигонуклеотиды отделяли от невключившейся метки электрофорезом в 20 % ПАА геле (1/20 бис-акриламид), содержащем 7 М мочевину, 0,05 трис-борат, pH 8,3. Проводили электроэлюцию меченого олигонуклеотида из геля на DEAE целлюлозу в течение 1 час в буфере 0,005 трис-борат, pH 7,4 при напряженности электрического поля 20 В/см. Олигонуклеотид смывали с DEAE целлюлозы 2М IJCIO4 в воде, осаждали 10-ю объемами 2% раствора LiC104B ацетоне (3 мин, 10000g), промывали осадок ацетоном, высушивали, растворяли в воде и определяли концентрацию олигонуклеотида спектрофотометрически на приборе Милихром -2.

Введение алкилирующей группировки 4(1Ч-2-хлорэтил-1\метиламино)бензиламина (C1R-) по 5'-концевой фосфатной группе олигонуклеотидов проводили по методу [104]. Активность полученного реагента тестировали в реакции с тиосульфатом натрия ( 0,5 М Na2S203, 1ч, 60°С) с последующим анализом полученного продукта электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Выход реакционноспособных алкилирующих производных по данным электрофоретического анализа реакционной смеси составлял не менее 90 %. Раствор алкилирующего производного олигонуклеотида в воде хранили при -70° С.

Синтез фотоактивируемого производного олигонуклеотида. Фотоактивируемую группировку я-азидотетрафторбензальгидразон-К-пропиониламин -(Ft) присоединяли к З'-концевому фосфату олигонуклеотида по методу [105]. Выход производного составлял 60%. Фотоактивируемое производное олигонуклеотида выделяли ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Милихром (ПО Научприбор, г. Орел) на колонке с сорбентом Silasorb SPH С-18, 110 мкм (Chemapol, ЧСФР), хроматографию проводили ступенчатым градиентом концентрации ацетонитрила 0 - 40 % с шагом 5% в 0,05М перхлорате лития. В полученное производное вводили радиоактивную метку 32Р

Х') переносом концевого фосфата с [у- Р]АТР при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4. Меченое производное олигонуклеотида отделяли от невключившейся метки гель-фильтрацией на колонках Micro-Spin G-25 (Pharmacia-Biotech). пазидотетрафторбензальгидразон-Ы-пропиониламин был любезно предоставлен М.И.Добриковым (НИБХ СОР АН).

Модификация клеточных белков фотоактивным производным олигонуклеотида [32Р]- p(Tp)io-Ft. Для проведения специфической фотомодификации олигонуклеотид-связывающих белков клетки выращивали в 24-луночных планшетах. Перед экспериментом клетки дважды промывали средой IMDM и инкубировали в среде 1MDM, содержащей фотоактивное производное олигонуклеотида [32Р]- р(Тр)ю - Ft необходимое время. Затем клетки в планшетах в течение 2 мин облучали фильтрованным светом ртутной лампы высокого давления СВД-120 с использованием стеклянных светофильтров БС-6, УФС-6 (330-365 нм) (Мощность облучения, измеряемая с помощью ферриоксилатного актинометра, была равна 2x10"4 Вт см-1). Далее клетки трижды отмывали средой IMDM от несвязавшегося олигонуклеотида, механически снимали в 0,5 мл среды и осаждали центрифугированием (1мин, 4000g). Для электрофоретического анализа модифицированных белков осадок клеток растворяли в буфере (0,03 М трис/НС1, рН 6,8, 1% SDS, 5% (3-меркаптоэтанол, 20% глицерин) и прогревали 3 мин при 100° С. Модифицированные белки разделяли SDS-электрофорезом в 10% ПААГ и визуализовали при помощи авторадиографии.

Электрофоретический анализ белков. Электрофорез проводили по методу Ьаешш1у. Концентрирующий гель содержал 5% акриламид, 0,08% бис-акриламид, 0,125 М трисНО, рН6,8; 0,1%8П8. Разделяющий гель содержал 10% акриламид, 0,375 М трисНС1, рН 8,8; 0,1%8Б8. Электродный буфер 0,025 М трисНС1, 0,192 М глицин, 0,1%8Б8, рН 8,3. Электрофорез проводили с силой тока 5 мА, при достижении красителем границы концентрирующего и разделяющего гелей - 10-15 мА.

Определение уровня связывания клетками нереакционноспособных производных олигонуклеотидов. Для определения количества связанного клетками алкилирующего производного олигонуклеотида клетки выращивали в 24 - луночных планшетах до 50-70% плотности монослоя, трижды отмывали средой НУТОМ,

ОЛ А инкубировали с [ Р]-ВгНН-(рТ)ю, отмывали 3 раза средой 1МБМ при 4 С, снимали с подложки механически в 35 мкл 0,14 М ЫаС1, наносили на фильтровальную бумагу. Каждую точку повторяли 4 раза. Количество связанного с клетками [32Р]- ВгМ1-(рТ)1о определяли по радиоактивности образца в толуольном сцинтилляторе в [ Р]-канале счетчика ЯаскЬе1а (ЬКВ).

Определение эффективности жидкофазного эндоцитоза. Клетки выращивали в 24 луночных планшетах до достижения плотности 50-70% монослоя. Перед экспериментом клетки дважды отмывали средой НУТОМ, инкубировали в 1\ГОМ, содержащей [14С]- сахарозу и олигонуклеотид Тю в концентрации от 0,1 до 8 мкМ, 30 мин, после инкубации клетки трижды отмывали средой 1МОМ при 4° С, механически снимали в 20 мкл 0,14 М №С1, наносили на фильтровальную бумагу, считали в толуольном сцинтилляторе в канале 14С на счетчике ЯаскЬе1а. Каждую точку повторяли 4 раза. За значение эффективности жидкофазного эндоцитоза принимали объем жидкости захваченной клетками за известное время, который определяли, исходя из значения количества радиоактивности, связанной известным количеством клеток за время инкубации, и значения радиоактивности аликвоты среды, в которой инкубировались клетки.

Модификация клеточных белков алкилирующим производным олигонуклеотида СШ-(рТ)ю. Клетки линий СПЭВ и ЗТЗ выращивали в 24- луночных планшетах до достижения плотности 50-70% монослоя. Перед экспериментом клетки

32 дважды отмывали средой 1МЕ)М, затем инкубировали в среде 1МБМ, содержащей [ Р]-С1К-(рТ)ю. Через 30 мин планшет с клетками помещали на лед, дважды отмывали средой от несвязавшегося реагента, механически снимали в 0,5 мл среды, осаждали центрифугированием (1мин, 400С^). Для электрофоретического анализа осадок клеток растворяли в буфере для образцов (0,03 М трис/НС1, рН 6,8, 1%БВ8, 5%(3-меркаптоэтанол, 20% глицерин) и прогревали 3 мин при 100° С. Модифицированные белки разделяли ЗОБ-электрофорезом в 10% ПААГ и визуализовали при помощи авторадиографии. Относительную эффективность модификации белков определяли, сканируя соответствующий радиоавтограф. Для сканирования использовали проекционный сканер Унискан Плюс (Россия) Для сканирования использовали радиоавтографы, оптическая плотность которых не выходила за границы диапазона линейного соответствия количества радиоактивности в зоне степени потемнения рентгеновской пленки. Для определения этого диапазона строили калибровочную кривую по данным денситометрирования калибровочной радиоавтограммы.

Определение константы диссоциации комплекса белок*модифицированный олигонуклеотид. Для определения зависимости константы диссоциации комплекса белок'модифицированный олигонуклеотид от длины олигонуклеотида использовали реакционноспособное производное олигонуклеотидов СЖ-(рТ)7, С111-(рТ)1о, С1Я-(рТ)]з, С111-(рТ)25. Клетки линии СПЭВ выращивали в 24- луночных планшетах до достижения плотности 50-70% монослоя. Перед экспериментом клетки дважды отмывали средой 1МБМ, затем инкубировали в среде 1МОМ, содержащей 32Р- меченное производное олигонуклеотида в концентрации 0,03, 0,06, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 мкМ 30 мин. Модификацию клеточных белков анализировали электрофорезом как описано выше. Каждый эксперимент повторяли по крайней мере 3 раза. Данные, полученные при сканировании соответствующих радиоавтографов электрофоретического анализа модификации олигонуклеотид-связывающих белков алкилирующими производными олиготимидилатов различной длины были использованы для оценки константы диссоциации комплекса белок*олигонуклеотид по методу [129].

Выделение ядер из клеток. После инкубации с меченым производным олигонуклеотида клетки в лунках отмывали при 4° С и 10 мин инкубировали в 400 мкл буфера (0,25М сахароза, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисНС1, рН7,4), содержащего 0,5 % Тритона Х-100. Лизированные клетки собирали и центрифугировали 3 мин при 1000g, супернатант отбрасывали, осадок суспендировали в 400 мкл того же буфера (0,25М сахароза, 5 мМ МдСЬ, 10 мМ трисНС1, рН7,4, 0,5 % Тритон Х-100), центрифугировали 3 мин при 2000g. Полученный осадок ядер использовали для электрофоретического анализа

40 модифицированных белков и для определения связавшейся с ядрами радиоактивности, как указано выше.

Определение сохранности интернализованных олигонуклеотидов ядрах в составе клеток. Клетки инкубировали в среде, содержащей 0,5 мкМ [32Р]-меченного нереакционноспособного производного олигонуклеотида BzNH-(pT)io- После окончания инкубации планшет с клетками переносили на лед, клетки отмывали от несвязавшегося олигонуклеотида. Ядра из клеток выделяли, как описано выше. Осадок ядер растворяли в 80%-ном формамиде, сохранность олигонуклеотидов анализировали электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину, с последующей радиоавтографией (условия электрофореза олигонуклеотидов приведены выше, в разделе "Получение меченых олигонуклеотидов").

Введение метки в полимерную ДНК. Плазмида pZOV была любезно предоставлена С.А. Гайдамаковым. Р-меченую плазмиду pZOV (2,6 Кб) получали, используя ДНК-полимеразу I из Е. coli в реакции ник-трансляции в присутствии [а-32Р]-dATP и немеченых dGTP, dCTP, dTTP. От невключившейся метки ДНК освобождали хроматографией на сефадексе G-50. Определение количества ДНК (32Р-меченой плазмиды pZOV), связанной клетками после инкубации, проводили, как описано выше для определения уровня связывания клетками нереакционноспособных производных олигонуклеотидов.

41

Результаты экспериментов их обсуждение.

ОСС*ЙС*А* I

На начальном этапе исследований в области генотерапии и развития антисмысловых технологий предполагалось, что спонтанное проникновение олигонуклеотидов и генноинженерных конструкций в клетку невозможно, поскольку эти полианионные молекулы не могут диффундировать сквозь липофильные мембраны. Другие механизмы клеточного транспорта или априори считались неэффективными или не рассматривались вообще. С целью доставки нуклеиновых кислот в клетки были предложены различные методы, использующие в качестве векторов липосомы, реконструированные оболочки вирусов Сендай, гриппа, а также химически синтезированные катионные липиды [106]. Однако экспериментальные исследования показали, что олигонуклеотиды и свободная ДНК способны эффективно проникать в клетки. При инъекции плазмидного вектора в растворе, без каких либо "усилителей" трансфекции в мышцу животного происходит экспрессия репортерного гена в миофибриллах [107-109], при инъекции в портальную вену печени экспрессия наблюдается в гепатоцитах [110-111]. Показана весьма высокая эффективность доставки свободной ДНК - в 1-5% гепатоцитов обнаруживаются продукты экспрессии репортерного гена.

Методами флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии и электронно-микроскопической радиоавтографии было продемонстрировано, что инкубация культивируемых эукариотических клеток в среде, содержащей олигонуклеотиды или их синтетические аналоги, приводит к накоплению экзогенных олигонуклеотидов внутри клеток, при этом, как правило, в везикулярных компартментах. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с клетками животных в культуре показало, что транспорт олигонуклеотидов в клетки описывается в рамках модели рецептор -опосредованного эндоцитоза, т.е. является насыщаемым, частично обратимым процессом, скорость и равновесные уровни связывания олигонуклеотидов зависят от типа клеток. Показано также, что интернализованные олигонуклеотиды оказываются в некотором количестве в клеточном ядре [112-117]. К настоящему времени разными авторами получены данные, свидетельствующие о существовании на поверхности эукариотических клеток белков, специфично связывающих экстраклеточные олиго - и полинуклеотиды [12,13,15,118,127]. Приведенные факты прямо указывают на существование естественных специфических механизмов транспорта нуклеиновых кислот в эукариотические клетки.

Задача настоящего исследования состояла в определении роли олигонуклеотид-связывающих белков клеточной поверхности в транспорте олиго - и полинуклеотидов в культивируемые эукариотические клетки и выявлении промежуточных и целевых клеточных компартментов, участвующих в транспорте олигонуклеотидов.

I Общая характеристика олигонуклеотидсвязывающих белков клеточной поверхности.

Ранее на поверхности эукариотических клеток различными методами были выявлены белки, взаимодействующие с экстраклеточными олигонуклеотидами и, возможно, участвующие в транспорте олигонуклеотидов в клетки [12, 13, 15, 118-122]. Эти олигонуклеотидсвязываюгцие белки были обнаружены в культивируемых клетках линий различного видового и тканевого происхождения [15, 118-124, 127].

Мы исследовали участие клеточных белков во взаимодействии с экстраклеточными олигонуклеотидами методом аффинной модификации алкилирующим производным олигонуклеотида. Для этого клетки линии СПЭВ (фибробласты почки эмбриона свиньи)

32 инкубировали в среде, содержащей различные концентрации - от 0,025 до 2 мкМ [ Р]-меченого алкилирующего производного олигонуклеотида ([32Р]-С1К.-(рТ)ю), в течение 30 мин при 37°. После электрофоретического разделения клеточных белков с

32 радиоавтографией на радиоавтограмме были выявлены две особенно интенсивные [ Р]-полосы (рис.4), соответствующие по своей электрофоретической подвижности белкам с молекулярными массами 79 и 33 кДа. Количество модифицированных белков в полосах 79 и 33 кДа увеличивалось с ростом концентрации алкилирующего производного олигонуклеотида в растворе. При концентрации [32Р]-СЖ-(рТ)ю в среде 1-2 мкМ появлялись дополнительные слабо меченые белковые полосы с подвижностями менее 79 кДа и интенсивно меченая полоса с электрофоретической подвижностью, соответствующей 90 кДа (Рис. 4).

Мы предположили, что белки, идентифицируемые нами с помощью метода аффинной модификации, взаимодействуя с экстраклеточными олигонуклеотидами, обеспечивают их транспорт внутрь клетки. Для доказательства этого предположения кДа

220

Рис.4 Электрофоретическое разделение продуктов модификации белков клеток

97 4 СПЭВ алкилирующим производным олигонуклеотида. Клетки СПЭВ инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей различные концентрации [32Р]- Ст(рТ)ю. 1 дор. - клетки ЗТЗ,

66 концентрация [32Р]- С1К-(рТ)10 0,5 мкМ.

2-7 дор. - клетки СПЭВ, концентрация [32Р]- <Ж-(рТ)ю: 2 - 0,025; 3 - 0,05; 4-0,1;

5-0,2; 6-1; 7-2 мкМ.

46

I—^—ШЖ. <30

1 2 3 4 5 6 7 мы исследовали, влияют ли условия, изменяющие эффективность модификации этих белков алкилирующими производными олигонуклеотидов, на параметры процесса транспорта олигонуклеотидов в клетки. Для этого клетки инкубировали в среде, в которую кроме Р-меченого алкилирующего производного олигонуклеотида добавляли вещества - потенциальные конкуренты транспорта олигонуклеотидов и изучали влияние каждого конкурента как на модификацию олигонуклеотидсвязывающих белков (рис. 5), так и на способность клеток аккумулировать меченые олигонуклеотиды (рис. 6). кДа

220 <97.4

66

46

30

123 456 7 89 10

Рис. 5. Электрофоретическое разделение белков клеток СПЭВ, модифицированных алкилирующим производным олигонуклеотида (10% SDS-ПААГ). Влияние конкурентов различной природы на эффективность модификации. Модификацию клеточных белков проводили, инкубируя клетки в среде IMDM, содержащей

2 мкМ ГР]- ClR-(pT)io при

37°С в присутствии различных полинуклеотидных и полианионных конкурентов в течение 1 час.

1- контроль, в отсутствие конкурентов; 2 - 30-кратный избыток фрагментированной ультразвуком ДНК крупного рогатого скота (КРС); 3 - 3-кратный избыток той же ДНК; 4 -3-кратный избыток фрагментированной ультразвуком и денатурированной прогреванием ДНК КРС; 5 - 30-кратный избыток суммарной РНК дрожжей; 6 - 3-кратный избыток той же РНК; 7 - 30-кратный избыток тРНК Е. coli; 8 - 3-кратный избыток той же тРНК; 9-10 мкМ гепарин; 10-10 мкМ декстрансульфат 500 000.

В качестве конкурентов использовали фрагментированную ультразвуком неденатурированную и денатурированную ДНК крупного рогатого скота (КРС), суммарную РНК дрожжей, тРНК E.coli, взятые приблизительно в равных концентрациях, а также гепарин и сульфодекстран 500 000. Как видно из радиоавтографа блота (рис.5), 3 -х кратные избытки ДНК, РНК и тРНК эффективно, а 30-ти кратные их избытки практически полностью ингибируют модификацию белков массой 33 и 79 кДа. На модификацию белка 90 кДа присутствие этих конкурентов влияет в меньшей степени. Гепарин, взятый в 5-ти кратном молярном избытке, практически не влияет на модификацию всех трех белков (Рис.5, дор. 9). Присутствие 5-ти кратного избытка сульфодекстрана влияет на модификацию олигонуклеотидсвязывающих белков специфическим образом (Рис. 5, дор. 10): этот конкурент ингибирует модификацию белка 90 кДа, не влияет на модификацию белка 33 кДа и усиливает модификацию белка 79 кДа в два раза.

Таким образом, в клетках СПЭВ присутствует набор белков различных молекулярных масс, специфично связывающих экзогенные олигонуклеотиды. Далее в работе преимущественно обсуждается поведение олигонуклеотидсвязывающего белка клеток СПЭВ с электрофоретической подвижностью, соответствующей 79 кДа ( р79), поскольку этот белок всегда определяется как мажорный в радиоавтографах элекгрофореграмм клеточных белков, модифицированных алкилирующим производным олигонуклеотида.

В экспериментах по определению уровня связывания олигонуклеотида клетками

32

СПЭВ было установлено, что связывание клетками Р-меченого олигонуклеотидного производного ингибируется ДНК - и РНК-конкурентами примерно в той же степени, что и модификация белка р79 этим производным. В то же время используемые нами нолианионные конкуренты гепарин и сульфодекстран лишь в незначительной степени уменьшают уровень связывания олигонуклеотида с клетками (Рис. 6). Эти результаты указывают на специфичность взаимодействия исследуемого белка с реакционноспособным производным олигонуклеотида и на то, что выявленный с помощью аффинной модификации белок р79 принимает непосредственное участие во взаимодействии клетки с экзогенными олиго- и полинуклеотидами. контроль ДНК, ЗОх w/w

Н-н

ДНК, Зх w/w

РНК, ЗОх w/w ?

РНК, Зх w/w тРНК, ЗОх w/w } тРНК, Зх w/w А гепарин, 5х М/М D-SO4, 5х М/М

-1-!-1-

О 50 100 150 от контроля

Рис.6. Влияние природы конкурентов на уровень связывания клетками СПЭВ нереакционноспособного производного олигонуклеотида [32Р]- BzNH-(pT)io и на эффективность модификации белка 79 кДа (р79) алкилирующим производным этого же олигонуклеотида. Контроль - в отсутствие конкурентов; ДНК, 30 х w/w - 30-кратный избыток фрагментированной ультразвуком ДНК крупного рогатого скота (КРС); ДНК, 3 х w/w -той же ДНК; РНК, 30 х w/w - 30-кратный избыток суммарной РНК дрожжей; РНК, 3 х w/w - той же РНК; тРНК, 30 х w/w - 30-кратный избыток тРНК Е. coli; тРНК, 3 х w/w -3-кратный избыток той же тРНК; Гепарин, 5 х М/М - 10 мкМ гепарин; Д-8С>4 - 10 мкМ декстрансульфат 500 000. w/w -вес/вес □□относительная эффективность модификации ■ ■ относительная эффективность связывания

Другими авторами в клетках разных клеточных линий также были обнаружены белки, специфично взаимодействующие с олигонуклеотидами. В некоторых клетках выявлялись одиночные олигонуклеотидсвязывающие белки - в клетках HL60 белок с молекулярной массой 80 кДа [13], в человеческих лимфобластных Т-клетках - белок 34 кДа[125]. Показано наличие олигонуклеотид-связывающих белков, 69 и 29 кДа, в мононуклеарных клетках периферической крови и культивируемых мышиных Т-клетках [14], белков 79 и 90 кДа в клетках L929 [12], белков 100-110 кДа в клетках HL-60, HepG2, Hl и KB [126], белков 97 и 46 кДа в клетках почки мыши [118], белков 63 и 35 кДа в клетках А431 и HeLa [127]. Несколько групп белков, связывающих экстраклеточные олигонуклеотиды, было обнаружено в клетках линии К562 [15]: 137-147; 79-85; 43-46; 2932 и 20-22 кДа. Следует отметить, что почти все обнаруженные в клетках разного происхождения олигонуклеотидсвязывающие белки по молекулярным массам можно отнести к одной из нескольких компактных групп.

Мы исследовали влияние состава инкубационной среды на модификацию олигонуклеотидсвязывающего белка р79 алкилирующим производным олигонуклеотида

32 Р]- С1К-(рТ)ю и на уровень связывания клетками нереакционноспособного производного олигонуклеотида

ГР]- ВгЫН-(рТ)ю. Если при инкубации клеток в эксперименте вместо среды 1МОМ использовали физиологический раствор, то эффективность модификации белка р79 алкилирующим производным олигонуклеотида значительно уменьшалась, одновременно снижался уровень связывания клетками [ -Р]-ВгШ-(рТ)10.

0,14 М ЫаС1 среда 1МБМ среда 1МЭМ

10%ЭТС

Рис. 7. Эффективность модификации белка р79 клеток СПЭВ алкилирующим производным олигонуклеотида [ "Р]- С1К-(рТ)ю и уровень связывания клетками [ Р]-Вг>Щ-(рТ)1о в разных условиях инкубации. За 100% эффективность модификации белка р79 и 100% уровень связывания олигонуклеотидов клетками принимали значения, полученные при инкубации клеток в среде 1МПМ. □- относительная эффективность модификации белка р79, ■ - относительное значение уровня связывания олигонуклеотидного производного клетками.

150 100 50

Рис.7). В случае добавления в среду ДМЕМ эмбриональной телячьей сыворотки до 10% усиливались и специфическая модификация белка р79, и связывание олигонуклеотидов клетками (Рис. 7). Заметим, что в сыворотке крови сывороточный альбумин (БСА) содержится в концентрации приблизительно 5 %. Находится в противоречии с нашими данными о влиянии сыворотки на олигонуклеотид - белковые взаимодействия сообщение о том, что существенную роль в процессе связывания олигонуклеотидов с клетками HL60 играет именно альбумин сыворотки как компонент полной среды для культивирования клеток. Авторы показали, что основным олигонуклеотидсвязывающим белком, который они ранее обнаружили и исследовали с помощью фотоактивируемого производного олигонуклеотида [127], является БСА, и на этом основании предположили, что специальных, собственно клеточных белков, ответственных за связывание олигонуклеотидов, не существует. Результат, полученный в этой работе, по-видимому, объясняется тем, что разветвленная ароматическая Denny-Jeff группировка, вероятно, сильно повышает сродство олигонуклеотидного производного к альбумину, поэтому в присутствии сыворотки или сывороточных белков, ассоциированных с клеточной мембраной, практически все внесенное в среду производное олигонуклеотида расходуется на модификацию альбумина. Для используемого нами алкилирующего производного олигонуклеотида известно, что сродство его к белку определяется в значительной степени именно олигонуклеотидной его частью, гидрофобная алкилирующая группировка увеличивает сродство незначительно. По оценке Якубова Л.А. и др., изучавших аффинные взаимодействия белка-рецептора Т-лимфоцитов CD4 с олигонуклеотидами и их алкилирующими производными, эта реакционноспособная группировка увеличивает сродство олигонуклеотида к CD4, который также является олигонуклеотидсвязывающим белком, примерно в 1,5 раза [129]. Полученные в экспериментах на клетках данные по модификации клеточных олигонуклеотид-связывающих белков алкилирующими производными олиготимидилатов различной длины были использованы для оценки константы диссоциации комплекса р79*олигонуклеотид. Результат представлен в виде диаграммы, отражающей зависимость величины константы диссоциации комплекса белок»олигонуклеотид от длины олигонуклеотида (Рис. 8). Полученная зависимость свидетельствует о том, что линейный размер сайта связывания олигонуклеотидов на белке имеет протяженность более длины 13-звенного олигонуклеотида.

Кс1, мкМ 0,4

0,3

0,2

0,1

I 0

Рис. 8. Зависимость константы диссоциации комплекса белок р79*модифицированный олигонуклеотид от длины олигонуклеотида.

II. Олигонуклеотид-связывающие белки клеточной поверхности участвуют в транспорте олигонуклеотидов в клетку.

Еще одно подтверждение непосредственного участия исследуемых нами белков в транспорте олигонуклеотидов во внутриклеточные компартменты было получено в следующем эксперименте: клетки СПЭВ различное время - от 30 до 270 мин

7 10 13 25 длина олигонуклеотида инкубировали в среде, содержащей 0,5 мкМ олигонуклеотид Bz.NI1-(рТ)ю при 37° С, затем клетки отмывали и в лунки с клетками на одинаковое время (30 мин) вносили Р -меченое реакционноспособное производное олигонуклеотида в той же концентрации, модифицированные белки анализировали. На радиоавтографе электрофореграммы (рис. 9) видно, что непродолжительная инкубация клеток с холодным олигонуклеотидом приводит к существенному уменьшению количества белка р79 на клеточной поверхности, доступного для модификации алкилирующим производным олигонуклеотида. Однако с увеличением продолжительности инкубации клеток с холодным олигонуклеотидом количество меченого белка р79 увеличивается. < р79

1 2 3 4 5 6

Рис.9. Эффект предварительной инкубации клеток СПЭВ в присутствии немеченого олигонуклеотида, на количество белка р79, доступного для модификации, при последующей инкубации клеток в среде, содержащей алкилирующее производное олигонуклеотида. Клетки инкубировали указанное время в среде, содержащей 0,5мкМ В2МН-(рТ)|о, затем 2 раза отмывали и продолжали инкубацию в среде, содержащей (),5мкМ ГР]- С1Я-(рТ)ю в течение 30 мин. Электрофоретический анализ продуктов модификации в 10% 808-ПААГ. 1 - без предынкубации, 2 - 6 - предынкубация клеток с немеченным олигонуклеотидом 30, 60, 120, 240, 320 мин соответственно.

Влияние предынкубации клеток с холодным олигонуклеотидом на количество олигонуклеотидсвязывающего белка р79, доступного для модификации, не может быть объяснено просто блокированием связывания и последующей модификации рецептора алкилирующим производным олигонуклеотида.

Связывание олигонуклеотида с рецептором непрочно, обмен лигандов происходит быстро, а константа диссоциации комплекса оценена нами и ранее Якубовым Л.А.и др. в -0,2 мкМ [12]. Это означает, что олигонуклеотиды полностью удаляются с поверхностных рецепторов при отмывании клеток. Однако немеченый олигонуклеотид, интернализованный клеткой, остается в эндосомах внутри клетки в достаточной концентрации для того, чтобы конкурировать с алкилирующим олигонуклеотидным производным за рецепторы, рециклизуемые через эндосомы. Следствием этой конкуренции, происходящей внутри эндосом, является уменьшение количества модифицированных белков. Полученный результат свидетельствует о том, что исследуемый белок не только связывает экстраклеточные олигонуклеотиды, но и интернализуется в виде олигонуклеотид-белковых комплексов в клетку. Постепенное увеличение количества р79, доступного для модификации, при продолжительности инкубации более 1 час, по-видимому, указывает на мобилизацию этого белка из медленно обмениваемых внутриклеточных компартментов.

Параллельно нами были проведены эксперименты по изучению влияния предварительной инкубации клеток СПЭВ с немеченым олигонуклеотидом на скорость связывания меченых олигонуклеотидов клетками (Рис. 10, А и Б). Из представленных данных видно, что эффективность процесса связывания в этих условиях коррелирует с доступностью исследуемого белка для модификации: предынкубация клеток с немеченым олигонуклеотидом приводит к зависящему от времени снижению эффективности захвата меченых олигонуклеотидов: эффективность снижается в течение первых 30 мин в 3-4 раза, а затем можно наблюдать некоторое увеличение скорости транспорта в течение нескольких часов, хотя значение эффективности так и не достигает начального уровня (Рис. 10, А). Этот результат, очевидно, объясняется тем, что в начальный момент времени основная часть белков, участвующих в транспорте, находится на клеточной поверхности и в быстро обмениваемых клеточных компартментах. При инкубации клеток с холодным олигонуклеотидом значительная часть белка р79 вовлекается в транспортный процесс и

А В

О 0,5 1 2 3 4 ° о 0,5 1 2 3 4 час время предынкубации

Рис. 10. Зависимость эффективности накопления клетками меченого олигонуклеотида из среды от времени предварительной инкубации клеток с немеченым олигонуклеотидом. А. Клетки СПЭВ инкубировали в присутствии 1 мкМ (рТ)ю при 37°С в течение 0,5; 1; 2; 3; 4 часов и меняли среду на содержащую 1 мкМ [32Р] - ВгМН-(рТ)ю, инкубировали в течение еще 30 мин. Б - аналогичный эксперимент с единственным отличием: клетки после инкубации с немеченым олигонуклеотидом в течение часа инкубировали в среде, не содержащей олигонуклеотиды. За 100 % эффективности накопления принимали количество радиоактивного материала, связанного клетками за первые 30 мин инкубации в среде, содержащей 1 мкМ [32Р] - Вг>Ш-(рТ)1о. оказывается в медленно обмениваемых компартментах и, таким образом, изымается из процесса связывания и транспорта между клеточной мембраной и быстро обмениваемым клеточным компартментом, эндосомой. Постепенное увеличение эффективности клеточного захвата олигонуклеотидов при увеличении времени предынкубации может быть объяснено либо индукцией синтеза новых рецепторов, либо, что более вероятно, мобилизацией рецепторов из медленно обмениваемых депо неясной клеточной локализации. Полученная зависимость подтверждает непосредственное участие белка р79 в захвате олигонуклетидов клетками. Обнаруженный эффект предварительной инкубации клеток с холодным олигонуклеотидом на эффективность связывания меченого олигонуклеотида полностью исчезает при последующей одночасовой инкубации прединкубированных клеток в среде без олигонуклеотида (Рис. 10, Б). Это означает, что перераспределение исследуемых олигонуклеотидсвязывающих белков в клетке в пользу медленно обмениваемых компартментов, связанное с транспортом холодных олигонуклеотидов, обратимо, и белки, транспортирующие олигонуклеотиды, возвращаются из медленно обмениваемых компартментов.

III. Олигонуклеотидсвязывающие белки клеточной поверхности транспортируют олигонуклеотиды в закисляемые клеточные компартменты.

Приведенные выше результаты прямо указывают на то, что обнаруженный ранее [12,119] и выявленный теперь также на клетках СПЭВ олигонуклеотидсвязывающий белок р79 является рецепторным белком для олиго-, а, возможно, и полинуклеотидов. Для многих рецепторов, выполняющих функцию доставки молекул в клетку, показано, что они транспортируют свои лиганды в эндосомы, где в условиях низкого значения рН и с участием других факторов происходит диссоциация комплекса рецептор*лиганд [81, 86]. Для дискриминации клеточных компартментов, участвующих в транспорте олигонуклеотидов внутри клетки, мы использовали известное свойство ионов аммония блокировать закисление эндосомных везикул. Было исследовано влияние ионов М-14+ на эффективность модификации белка р79 алкилирующим производным олигонуклеотида. Оказалось, что при одновременном добавлении в среду реакционноспособного производного олигонуклеотида и хлорида аммония зависимость накопления модифицированного 79 кДа белка в клетках от продолжительности инкубации достигает насыщения позже и на более высоком уровне по сравнению с контрольными клетками (Рис. 11). Задержка в развитии эффекта присутствия ионов аммония на модификацию белка р79 объясняется тем, что эффект ионов МП}" собственно на внутриэндосомный рН

Рис. 11. Влияние деацидификации закисляемых клеточных компартментов на аффинную модификацию белка 79 кДа в клетках СПЭВ алкилирующим производным олигонуклеотида. Клетки инкубировали различное время в присутствии 0,5 мкМ [32Р]-С111(рТ)1о в среде КБМ и в среде с добавлением 5 мМ ЫН4С1. Модифицированные клеточные белки анализировали электрофорезом. М - модификация в условных единицах. II - контроль, инкубация в ЕУПЭМ, □- инкубация в КОМ с 5 мМ N^0. формируется примерно в течение часа [130]. Аналогичные результаты были получены нами с использованием другого препарата, блокирующего закисление эндосом, метиламина. Отдельно было показано, что при проведении модификации клеточных белков алкилирующим производным олигонуклеотида в условиях низкого значения рН (при рН 5,5) количество модифицированного олигонуклеотидсвязывающего белка р79 в клетках уменьшается, но уровень связывания клетками олигонуклеотида в этих условиях не меняется (данные не приведены).

Таким образом, наблюдаемая разница в поведении кривых, характеризующих относительную эффективность модификации белка р79 в разных условиях, может быть объяснена уменьшением количества химических групп в белке, способных участвовать в реакции алкилирования реакционноспособным производным олигонуклеотида в условиях кислого значения рН. Полученный результат означает, что комплекс олигонуклеотидсвязывающего белка с олигонуклеотидом транспортируется в эндоцитозный (закисляемый) компартмент клетки. Необходимо отметить, что количественно влияние присутствия ионов NH44 в инкубационной среде на эффективность модификации исследуемого олигонуклеотидсвязываюгцего белка незначительно и является лишь свидетельством того, что транспорт олигонуклеотидов в комплексе с белками осуществляется через эндоцитозный компартмент, и локализация олигонуклеотид-рецепторных комплексов в эндосомах кратковременна. Диссоциация комплекса слабо связана со значением рН и в заметной степени имеет место только во время накопления экстраклеточных олигонуклеотидов в эндосомах до некой равновесной концентрации,. Об этом свидетельствуют наши данные и данные других авторов о том, что применение препаратов, препятствующих закислению эндосом, таких, как хлорохин, монензин [131], метиламин (данные не приведены), практически не влияет на эффективность транспорта олигонуклеотидов в клетки.

Приведенные результаты полностью согласуются с данными других авторов, полученными другими методами и свидетельствуют о преимущественном транспорте экстраклеточных олигонуклеотидов в эндоцитозный компартмент [15, 131, 132]. Кроме того, наши данные существенно уточняют представления об этом процессе, свидетельствуя о том, что при экстраклеточной концентрации олигонуклеотида до 2-4 мкМ эти молекулы попадают в клетку именно в комплексе с олигонуклеотид-связывающими белками, и указывают на эндоцитозный компартмент как на промежуточный этап транспорта олигонуклеотидов в клетке. Что касается конкретного пути транспорта олигонуклеотидов в клетки, то проведенные нами исследования транспорта олигонуклеотидов в клетки СПЭВ в присутствии блокаторов различных путей эндоцитоза пока не позволили выявить преимущественный путь интернализации олигонуклеотидов. Белтингер С. и другие исследовали взаимодействие и транспорт олигонуклеотидов в клетки К562 и показали локализацию олигонуклеотидов в клатриновых ямках [15]. Это означает, что одним из возможных путей интернализации олионуклеотидов явлется транспорт через окаймленные везикулы.

IV. Применение фоточувствительных реагентов в исследовании олигонуклеотидсвязывающих белков

Для ясного понимания роли исследуемого белка в транспорте олигонуклеотидов в клетку необходимо было получить доказательства того, что обнаруженный ранее [12] и выявленный нами в клетках СПЭВ и №Н ЗТЗ олигонуклеотидсвязывающий белок р79 представлен непосредственно на клеточной поверхности и именно там взаимодействует с экстраклеточными олигонуклеотидами. Алкилирующее производное олигонуклеотида не пригодно для изучения быстрых процессов, происходящих в клетке с участием олигонуклеотидов, поскольку при 37° время полупревращения алкилирующей группы составляет около 40 мин [104]. За это время транспортные процессы могут значительно изменить локализацию олигонуклеотидов в клетке а, значит, и спектр белков, взаимодействующих с этими лигандами. Этого недостатка лишены фотоактивируемое производное олигонуклеотида, несущее на 3' конце перфторированную ароматическую азидогруппу. Активация арилазидной группы происходит при облучении длинноволновым УФ-светом, и эффективность этого процесса не зависит от температуры. Было показано, что при аффинной модификации клеточных белков фотоактивируемым

32 0 реакционноспособным производным Р-меченого олигонуклеотида при 4 выявляется тот же набор белков, как и при модификации клеточных белков алкилирующим производным олигонуклеотида (Рис. 12), и среди них обнаруживается р79.

79 кДа

Рис. 8. Электрофоретическое разделение продуктов модификации белков клеток СПЭВ различными реакционноспособными производными олигонуклеотидов. Слева - клеточные белки, л л модифицированные Р-меченным фоточувствительным производным р(Тр)15р1;, при 4°,

32 справа - клеточные белки, модифицированные Р-меченным алкилирующим производным олигонуклеотида.

Так как в условиях фотомодификации возможность энергозависимого транспорта олигонуклеотидного производного в клетки была исключена, полученный результат означает, что исследуемый олигонуклеотидсвязывающий белок взаимодействует с реакционноспособным производным олигонуклеотида непосредственно на клеточной поверхности. На приведенном рис. 12 обращает на себя внимание присутствие меченых белков с подвижностью более 79 кДа. Мы предполагаем, что эти дополнительные белковые полосы имеют то же происхождение, что и в случае модификации клеточных белков алкилирующим производным олигонуклеотида при его концентрации более 2 мкМ. По-видимому, эти полосы являются результатом модификации одного и того же белка по разным сайтам связывания. Аналогичные результаты были получены Колпащиковым и др. при исследовании фотоаффинной модификации ТСе-ДНКполимеразы фотоактивируемым аналогом сПТР [133]. Было показано, что в процессе электрофореза в ЗБЗ-ПААГ происходит разделение меченого белка на 2-5 полос. Авторы считают, что этот эффект является результатом различной электрофоретической подвижности продуктов модификации ТЧе-ДНК-полимеразы по разным аминокислотам. В принципе, подобные результаты были получены Якубовым Л.А и др. при исследовании модификации генноинженерного белка - фрагмента рецептора Т-лимфоцитов СЭ4 алкилирующим производным [ Р]-олигонуклеотидов. Показано, что при электрофоретическом разделении продуктов модификации происходит разделение меченого С04 на две полосы, соответствующие одному и тому же белку, но модифицированному по разным сайтам [129].

Фотоактивное производное олигонуклеотида было использовано для того, чтобы определить, меняется ли спектр белков, взаимодействующих с олигонуклеотидом, в процессе его транспорта с поверхности в клеточные компартменты. Клетки СПЭВ инкубировали с фотоактивным производным олигонуклеотида различное время при 37°, а затем активировали фоточувствительную группу. Оказалось, что в первые минуты

Рис. 13. Электрофоретическое разделение продуктов модификации белков клеток линии

32

А9, инкубированных с фотоактивируемым производным олигонуклеотида [ Р]- р(Тр)15 -ГЧ в течение различных промежутков времени (радиоавтограф геля).

Дорожки 1 - 6 соответствуют временам инкубации 0, 2, 5, 10, 20, 40 минут соответственно. инкубации происходит преимущественное образование белково-олигонуклеотидных коньюгатов с молекулярными массами примерно 79 и 85 кДа (рис. 13). При увеличении продолжительности инкубации до 40 мин новых клеточных белков, сшивающихся с олигонуклеотидом, не обнаруживалось.

Полученные результаты указывают на непосредственное и специфическое участие белка р79 в связывании клеткой нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов, поскольку: а) обнаружено явное соответствие между влиянием конкурентов различной природы на эффективность модификации указанного белка и влиянием этих же конкурентов на уровень связывания клеткой олигонуклеотидов (Рис.6); б) показана поверхностная локализация исследуемых белков (Рис.12).

Можно предполагать, что и другие олигонуклеотидсвязывающие белки, выявляемые при модификации рекционноспособными производными олигонуклеотидов, также участвуют в связывании и транспорте клеткой поли- и олигонуклеотидов.

V. Коньюгаты олигонуклеотидсвязывающий белок - олигонуклеотид транспортируются в клеточное ядро.

Ранее многими авторами с использованием радиоактивно- и флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов было показано, что некоторая часть, по разным оценкам от 10 до 50 % [12, 15, 115, 119, 124, 127] от общего количества связанных клетками олигонуклеотидов, оказывается в клеточном ядре. Механизм транспорта олигонуклеотидов в ядра не рассматривался даже предположительно. Реакционноспособные производные меченных Р олигонуклеотидов оказались весьма эффективным инструментом для исследования процесса транспорта олигонуклеотидов в клетку и клеточное ядро, поскольку позволили наблюдать параллельно за взаимодействием олигонуклеотидов с конкретными белками и интегральным связыванием олигонуклеотидов с клеткой (или ее отдельным компартментом). Мы следили одновременно за аккумуляцией меченых белков в клетках и ядрах в составе клеток СПЭВ при инкубации клеток в присутствии [32Р]-СШ-(рТ)ю и накоплением меченых олигонуклеотидов в клетках и ядрах в составе клеток СПЭВ при инкубации клеток в присутствии [ Р] - ВгЫНЧр'Ою

Рис. 14. Электрофоретический анализ (10% БОБ-ПААТ) белков, модифицированных в клетках СПЭВ и их ядрах, после инкубации клеток с алкилирующим производным олигонуклеотида ю. А. (1-6) - белки ядер из клеток, инкубировавшихся с аффинным реагентом в течение 5, 15, 25, 40, 60 и 120 мин при 37°С, соответственно; (712) - белки клеток, инкубировавшихся такие же времена в таких же условиях. Б. Зависимость содержания основного меченого р79 в целых клетках и в выделенных из них ядрах. М - относительная эффективность модификации белка р79 в условных единицах (результаты денситометрии геля А).

Для выделения ядер использовали раствор, содержащий 0,5 % Тритон Х-100. Этот метод позволяет выделять ядра, свободные от внешней ядерной мембраны и фрагментов цитоплазматических мембранных структур [134]. При этом риск загрязнения препаратов ядер олигонуклеотидами, накопленными в цитоплазматических компартментах, сводится ]с минимуму. На рисунке 14 приведен соответствующий радиоавтограф геля (Рис.14, А) на котором видно, что в целых клетках и в выделенных ядрах в первые минуты инкубации клеток в среде, содержащей ГР] - С111(рТ) ю , модифицируется один и тот же основной белок р79, а также минорный белок 35 кДа. В ядрах никаких новых меченых белков при дальнейшей инкубации не появляется. Среди суммарных клеточных белков через примерно 25 мин после начала инкубации появляются (Рис. 14, дор. 7) и с течением времени накапливаются (Рис. 14А, дор. 8-12) несколько меченых пептидов меньшей чем 79 кДа молекулярной массы, что может быть объяснено происходящей в клетках деградацией олигонуклеотидсвязывающего белка. Следует заметить, что этот процесс не затрагивает клеточное ядро. Кинетика изменения интенсивности полосы основного олигонуклеотид-связывающего белка р79 в препарате, полученном из целых клеток, представляет собой кривую, соответствующую кинетике реакции алкилирования белка реакционноспособным производным олигонуклеотида С1К(рТ)ю- Эта кривая выходит на уровень насыщения к 40 мин. Кривая, характеризующая содержание меченого белка в препарате ядер (Рис. 14Б, нижняя кривая), имеет сигмовидную форму и поднимается на плато с задержкой около 20 мин по сравнению с кривой накопления меченого белка в клетках (Рис. 14, Б, верхняя кривая). Эта задержка отражает, по-видимому, существование промежуточных стадий транспорта на пути олигонуклеотид-белковых комплексов от плазматической мембраны к ядру (Рис. 14, Б). Не ясно, какова дальнейшая судьба попавшего в ядро белка, транспортирующего олигонуклеотиды. После диссоциации олигонуклеотид-белкового комплекса белок может возвращаться в цитоплазму, оставив лиганд-олигонуклеотид в ядре, и опять включаться в транспорт олигонуклеотидов с ююточной поверхности внутрь клетки и далее в ядро, а может остаться и деградировать в клеточном ядре. Определенно можно утверждать, основываясь на форме кинетики, представленной на рисунке 14 Б, что конъюгаты олигонуклеотида с поверхностным белком, попав в ядро, не деградируют значительно и не возвращаются обратно в цитоплазму, по крайней мере, в течение двухчасового времени эксперимента.

Одновременно с нами Лактионов П. и др., исследуя локализацию олигонуклеотидсвязывающих белков в культивируемых клетках кератиноцитов, показали локализащию выявленного ими белка 61-63 кДа как в мембранно-цитозольной фракции клеток, так и в ядерной фракции [127].

С использованием фотоактивируемого производного олигонуклеотида было показано, что олигонуклеотиды, ковалентно сшитые с белком р79 непосредственно на клеточной поверхности, транспортируются в ядро клетки. Для этого клетки СПЭВ инкубировали в среде, содержащей фотоактивируемое производное олигонуклеотида, при 4 С. Через 10 мин проводили фотоактивацию, после чего клетки различное время инкубировали при 37°С и анализировали содержание меченых белков в ядрах. Оказалось, что через 15 мин после начала инкубации клеток при 37°С в ядрах регистрируются конъюгаты р79*олигонуклеотид (Рис. 15).

Рис. 15. Электрофоретический анализ накопления конъюгатов белок р79 олигонуклеотид в ядрах в составе клеток СПЭВ.

1 - белки ядер после инкубации клеток СПЭВ в среде, содержащей 0,1 мкМ [32Р]-С1К-(рТ)ю в течение 30 мин при 37°.

2 - 5 - белки ядер после 10 мин инкубации клеток в среде, содержащей 0,1 мкМ р(Тр)15-Р1 при 4°С, с последующей фотоактивацией и инкубацией при 37°С в течение 15, 30, 60, 120 мин соответственно.

1 2 3 4 5

97,6

66 <45 BzNH- (pT)10

Рис. 16. Электрофоретический анализ сохранности олигонуклеотидов в ядрах в составе клеток.

Образцы для анализа готовили, как описано в главе "Материалы и методы" 1-5 образцы ядер из клеток, инкубированных в среде, содержащей 0,5 мкМ [32Р]-BzNH-(pT) 1 о, 15, 30, 60, 120, 180 мин соответственно. 6 - исходный [32Р] -BzNH-(pT) 1 о

1 2 3 4 5 6

Была проанализирована сохранность олигонуклеотидов, доставленных в клеточное ядро. Показано, что в ядро попадают преимущественно целые олигонуклеотиды, и за время пребывания в ядре их деградация происходит в незначительной степени (Рис. 16).

Содержание олигонуклеотид-белковых конъюгатов в выделенных ядрах по данным денситометрии радиоавтографов составляет 30-60% от их общего содержания в клетке. Учитывая то, что субклеточное фракционирование, особенно из небольшого числа клеток, всегда сопряжено с потерями части клеточного материала, можно полагать, что реальное содержание комплексов в ядрах может быть выше. На рис. 17 представлены кривые, характеризующие кинетики связывания меченых нереакционноспособного производного олигонуклеотидов клетками и клеточными ядрами в составе клеток. имп/мин хЮОО среда без олигонуклеотида Ф т

400

200 О ядра осоо-снз

0 100 200 300 400 время инкубации (мин)

Рис. 17. Кинетика накопления меченых олигонуклеотидов в клетках СПЭВ и ядрах в составе клеток. Клетки инкубировали в среде, содержащей 0,5 мкМ [32Р]-В2>Щ-(рТ)1о, указанное время и определяли радиоактивность, связанную с клетками и ядрами в составе клеток. Через 5 час от начала инкубации среду меняли на среду, не содержащую олигонуклеотид и определяли радиоактивность, связанную с клетками и ядрами при продолжении инкубации.

Видно, что кинетика связывания олигонуклеотидов клетками СПЭВ выходит на плато после двух часов инкубации, при смене среды с меченым олигонуклеотидом на среду, не содержащую олигонуклеотида, количество радиоактивного материала, связанного с клетками, в клетках начинает уменьшаться, отражая процесс экзоцитоза олигонуклеотидного материала из клеток в соответствии с полученными нами ранее на клетках Ь929 результатами [12, 124]. При этом из клеток олигонуклеотид выходит только из быстро обмениваемого компартмента, и кривая спускается на плато, высота которого составляет около 50% от максимального уровня связывания. Этот уровень связывания соответствует олигонуклеотидам, содержащимся в медленно обмениваемых или не обмениваемых клеточных компартментах. В ядрах, выделенных из клеток, инкубированных с мечеными олигонуклеотидами по этой же схеме, содержание олигонуклеотидов растет как функция времени значительно медленнее, чем связывание с клетками и при смене инкубационной среды на среду, не содержащую олигонуклеотиды, не снижается, а, наоборот, продолжает увеличиваться. Очевидно, это обусловлено продолжением процесса внутриклеточного перераспределения связанных клеткой олигонуклеотидов, находящихся в медленно обмениваемых цитоплазматических компартментах. Линейная зависимость ядерного накопления олигонуклеотидов от времени инкубации указывает на ядро как конечный клеточный компартмент, в котором происходит накопление связанных клеткой олигонуклеотидов. То обстоятельство, что аккумуляция олигонуклеотидов в ядре не зависит от их экстраклеточной концентрации в широком диапазоне - от 0,1 до 5 мкМ (рис. 18), означает, что транспорт олигонуклеотидов в этом случае осуществляется в условиях насыщения белка-рецептора, а характер зависимости этого процесса от времени отражает, как мы предполагаем, рециклизацию рецепторов из ядра. и мп/мин

Рис. 18. Зависимость эффективности транспорта олигонуклеотидов в клеточное ядро от их концентрации в растворе. Клетки инкубировали в среде ШБМ, содержащей различные концентрации Р- меченого олигонуклеотидного производного ВгМН-(рТ)ю 30 мин при 37°С, количество связанной с ядрами радиоактивности определяли, как указано в "Материалах и методах'

Была проведена оценка примерного числа молекул олигонуклеотидов, доставляемых в ядро клетки СПЭВ за 1-2 часа. Оказалось, что за это время с ядрами в составе клеток связывается количество радиоактивности, соответствующее примерно 106 - 107 молекулам олигонуклеотида на ядро, что составляет в среднем 1 мкМ концентрацию олигонуклеотидов в объеме ядра.

Полученные результаты позволяют сформулировать следующую схему транспорта и перераспределения связываемых клеткой экстраклеточных олигонуклеотидов (Рис. 19). В начальный момент происходит взаимодействие олигонуклеотидов с экспонированными на клеточной поверхности олигонуклеотид связывающим белком (белками). Образовавшийся олигонуклеотид-белковый комплекс в эндоцитозных везикулах транспортируется в эндосомы. В эндосомах этот комплекс может диссоциировать, по крайней мере, по двум причинам - из-за низкого значения рН и из-за близкой к нулю в начальный период инкубации концентрации олигонуклеотидов в эндосомах. Освободившийся белок рециклизуется на клеточную поверхность и вновь участвует в транспорте олигонуклеотидов в эндосому. Многократное повторение этого цикла приводит к накоплению в эндосоме олигонуклеотидов, причем, как в свободном виде, так и виде комплекса с рецепторными белками. В результате первого этапа транспорта устанавливается состояние равновесия (но не равенства) между внеклеточной и внутриэндосомной концентрацией олигонуклеотидов. В достигнутом состоянии равновесия концентрация олигонуклеотид-белковых комплексов внутри эндосомы определяется константой диссоциации этого комплекса. А транспорт олигонуклеотид-белковых комплексов в ядро начинается, по-видимому, тогда, когда доставленные в эндосому олигонуклеотиды уже не диссоциируют из комплекса, т.е., с некоторой задержкой по отношению к общему транспорту в клетку, что собственно демонстрирует рис. 15. Следует думать, что в ядре также имеет место диссоциация олигонуклеотидных комплексов, а освобождаемые при этом белки способны к рециклизации.

Таким образом, получены результаты, доказывающие существование ранее не описанного насыщаемого эффективного рецептор-опосредованного механизма транспорта олигонуклеотидов в клеточное ядро.

Рис. 19. Гипотетическая схема механизма транспорта олигонуклеотидов в эукариотические клетки.

VI. Вклад различных механизмов в транспорт олигонуклеотидов в клетку.

Представления о транспорте олигонуклеотидов в клетку в основном по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза к настоящему времени уже сформировались. Однако олигонуклеотиды, как небольшие гидрофильные молекулы несомненно проникают в клетку и с захваченной жидкостью, т.е., посредством жидкостного эндоцитоза. Поэтому мы сочли необходимым для полной характеристики накопления олигонуклеотидов клетками оценить вклад разных типов транспорта в этот процесс. Для этого были проведены экперименты по сравнительному анализу транспорта в клетки СПЭВ [14С]-сахарозы как маркера жидкой фазы [135] и 32Р-меченных олигонуклеотидов.

Основные характеристики изотермы адсорбции [ Р]-ВгЫН-(рТ)ю клетками СПЭВ (Рис. 20 ) совпадают с показанными нами ранее для клеток Ь929. имп/мин

Рис. 20. Зависимость уровня связывания клетками меченого олигонуклеотида от его концентрации в среде.

Сначала при увеличении концентрации меченого олигонуклеотида в среде наблюдается быстрый рост количества связанной клетками радиоактивности, кривая связывания выходит на плато и достигает максимума при концентрации олигонуклеотида 0,5-1 мкМ.

При повышении концентрации олигонуклеотидов от 1,5 до 3 мкМ дальнейшего увеличения уровня связывания не происходит, и даже наблюдается снижение количества связываемой клетками радиоактивности, и только при концентрации реакционноспособного производного олигонуклеотида в среде более 4-6 мкМ количество накапливаемой клетками метки начинает постепенно увеличиваться. Этот подъем, по-видимому, отражает увеличение вклада жидкофазного эндоцитоза (захват возрастающих концентраций олигонуклеотидов с жидкой фазой). Для маркеров жидкой фазы (например, [ 14С]-сахарозы) известно, что накопление их клетками в начальный период времени прямо пропорционально их концентрации в среде [136]. Существенным различием процессов аккумуляции меченой сахарозы и олигонуклеотидов является то, что количество связанного клеткой олигонуклеотида при данной его концентрации в среде не соответствует объему захваченной клеткой при этом жидкости (исходя из определенной нами эффективности жидкофазного эндоцитоза), а значительно превышает его,

1 9 соответствуя 500 п1 ( 500*10" л) жидкой фазы /300 тыс. клеток. В свете приведенных выше данных ясно, что при концентрации олигонуклеотидов в среде менее 2-4 мкМ накопление их в клетках происходит в основном посредством связывания с определенными мембранными белками, концентрированием и последующей интернализацией, при этом вклад транспорта жидкой фазы в общую аккумуляцию составляет около 5%.

Далее, мы исследовали, влияет ли присутствие олигонуклеотидов в среде на эффективность процесса жидкофазного эндоцитоза, т.е. на захват клетками [14С]-сахарозы. Оказалось, что количество аккумулированной клетками [14С]-сахарозы увеличивается с увеличением концентрации в среде олигонуклеотида (рТ)ю, выходя на плато и достигая максимального значения при его концентрации 2 мкМ (рис. 21). В клетках СПЭВ, характеризующихся относительно высоким базовым уровнем эндоцитоза, объем захваченной внеклеточной жидкости увеличивается от 25п1/300 тыс. клеток за 30 мин до 50п1/300 тыс. клеток за 30 мин. Обнаруженная стимуляция транспорта в клетку жидкой фазы объясняет сложную форму кривой, характеризующей полученную изотерму связывания: по-видимому, при концентрации олигонуклеотида в среде в диапазоне 1,5-3 мкМ происходит ингибирование рецептор-опосредованного эндоцитоза, при этом уровень связывания олигонуклеотидов клетками уменьшается ( рис. 20), одновременно компенсаторно активируется захват клетками жидкости (рис. 21). имп/мин

900

600 300" имп/мин 900 мкМ, (рТ>ю Ч

2 4 мкМ, (рТ)10

Рис. 21. Стимуляция захвата клетками СПЭВ (слева) и ЗТЗ (справа) [14С]-сахарозы как маркера жидкой фазы в присутствии экстраклеточных олигонуклеотидов.

Подобного рода прецеденты уже были показаны ранее ( см. обзор литературы) [57]. Вклад транспорта жидкой фазы в общее связывание олигонуклеотидов клеткой при этих концентрациях (до ЗмкМ) олигонуклеотидов все еще не превышает 5%, поэтому на кривой, характеризующей изотерму связывания олигонуклеотидов клетками виден отчетливый минимум.

Итак, мы предполагаем, что в ответ на присутствие в среде в определенной концентрации экстраклеточных олигонуклеотидов клетки СПЭВ реагируют ингибированием рецептор-опосредованного транспорта и стимуляцией неспецифических транспортных механизмов.

К настоящему времени имеются убедительные данные, указывающие на формирование ряда физиологических реакций эукариотической клетки на присутствие экстраклеточных ДНК и олигонуклеотидов. Показано, что связывание полимерной ДНК с клеточной поверхностью клеток селезенки мыши стимулирует высвобождение в среду значительных количеств интерлейкина-2 [14]. При исследовании влияния экзогенных олигонуклеотидов на клеточные сигнальные системы, было продемонстрировано, что взаимодействие олигонуклеотидов с клетками Ь929 стимулирует фосфорилирование диацилглицерола с образованием фосфатидовой кислоты [137]. Этот результат дополняет представления о существовании специфических мембранных рецепторов, взаимодействующих с экстраклеточными олигонуклеотидами, поскольку обнаруживает индукцию изменений в метаболизме липидов - компонентов системы вторичных посредников клеточной сигнальной системы.

VII. Транспорт полимерных нуклеиновых кислот

Доказанное нами участие олигонуклеотидсвязывающих белков в транспорте коротких фрагментов нуклеиновых кислот в эндосомный компартмент клетки и клеточное ядро прямо не означает использование клеткой этой естественной транспортной системы для аккумуляции экстраклеточных полимерных нуклеиновых кислот. Однако, данные по ингибированию модификации этих белков алкилирующим производным олигонуклеотида и ингибированию связывания олигонуклеотидов клетками полимерной ДНК косвенно свидетельствует о такой возможности. Мы исследовали параметры связывания плазмиды pZOV (размер 2,6 кб) с клетками СПЭВ. Оказалось, что связывание этой ДНК с клетками также имеет насыщаемый характер (Рис. 22). Константа диссоциации комплекса полимерная ДНК*клетка, приблизительно оцененная нами по кривой, характеризующей изотерму связывания (Рис. 22), по порядку величины соответствует константе диссоциации для комплекса олигонуклеотид -олигонуклеотид-связывающий белок 79 кДа. срт I

200000 0 0

100

200

300 рМ, ДНК рХОУ

Рис. 22. Зависимость уровня связывания Р-меченной ДНК плазмиды pZOV клетками СПЭВ от ее концентрации в среде.

Таким образом, приведенные данные и обсуждаемые в литературе результаты по трансфекции разнообразных клеток организма свободной плазмидной ДНК с очевидностью указывают на существование механизма или механизмов, посредством которых эукариотические клетки захватывают из экстраклеточного пространства нуклеиновые кислоты и транспортируют их в цитоплазму и клеточное ядро. Мы полагаем, что эти исследуемые нами рецепторные олигонуклеотидсвязывающие белки, присутствующие на поверхности клеток разных клеточных линий, являются существенным компонентом природной клеточной транспортной системы, назначение которой - обеспечение транспорта олиго- и полинуклеотидов в клетки, в эндосомальный компартмент и в клеточное ядро.

Некоторые из изложенных выше экспериментов параллельно проводились также на клетках других линий - на клетках человеческого происхождения НеЬа и на клетках мыши ЗТЗ и А9. Результаты совпали с результатами, полученными нами для клеток СПЭВ (данные не приведены).

Выводы

1. С помощью аффинной модификации олигонуклеотидсвязывающего белка клеток линии СПЭВ реакционноспособными производными олигонуклеотидов получены доказательства участия специфических белков клеточной поверхности в связывании и транспорте дезоксирибоолигонуклеотидов в клетки.

2. Показано, что конъюгаты олигонуклеотида с белком р79 транспортируются с клеточной поверхности в закисляемый клеточный компартмент - эндосому.

3. Обнаружено, что конъюгаты олигонуклеотида с олигонуклеотид-связывающим белком р79, образующиеся на клеточной поверхности, транспортируются и накапливаются в клеточном ядре. Ядро, таким образом, является основным медленно-обмениваемым клеточным компартментом, куда транспортируются олигонуклеотиды.

4. Показано, что инкубация олигонуклеотидов с клетками вызывает перераспределение белка р79 в клетке, приводя к уменьшению их содержания на плазматической мембране в пользу медленно обмениваемых компартментов. Обратимость клеточного перераспределения белка р79 при короткой инкубации клеток в среде, не содержащей олигонуклеотидов, свидетельствует о рециклизации исследуемого олигонуклеотидсвязывающего белка при транспорте олигонуклеотидов в клетку и клеточное ядро.

Список литературы:

1. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. Oligonucleotides: Antisence inhibitors of gene expression. (Cohen, J.S., ed.) CRC Press. 1989. P. 173-196.

2. Zamecnic P.C., Stephenson M.L., Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc. Natl. Acad, of Sci. USA. 1978. V. 75. P. 280-284.

3. Matsucura M., Zon G., Shinozuka K., Robert-Guroff M., Shimada Т., Stein C.A., Mitsuya H., Wong-Staal F., Cohen J.S., Broder S. Regulation of viral expression of human immunodeficiency virus in vitro by an antisence phosphorotioate oligonucleotide against rev (art/trs) in chronically infected cells // Proc. Natl. Acad, of Sci. USA. 1989. 1989. V. 86. P. 4244-4248.

4. Wickstrom E. Strategies for administering targeted therapeutic oligodeoxynucleotides // TIBS. 1992. V. 10. P. 281-287.

5. Shoji Y., Akhtar S., Periasamy A., Herman В., Juliano R.L. Mechanism of cellular uptake of modified oligodeoxynucleotides containing methylphosphonate linkages // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 5543-5550.

6. Tonkinson J.L., Guvakova M., Khaled Z., Lee J., Yakubov., Marshall W.S., Caruthers M. H., Stein C.A. Cellular pharmacology and protein binding of phosphoromonotioate and phosphoroditioate oligodeoxynucleotides: A comparative study // Antisence Res. Dev. 1994. V. 4. P.269-278.

7. Li S., Huang L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes // Gene Ther. 1997. 9. P. 891-900.

8. Власова И.Е., Нечаева M.B., Власов В.В. Системы доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Успехи совр. биологии // 1994. Т.114. С. 715-727.

9. Ramani К., Bora R.S., Kumar M., Tyagi S.K., Sarkar D.P. Novel gene delivery to liver cells using engineered virosomes // FEBS Lett. 1997. V.404. P.164-168. lO.Schoen P., Leserman L., Wilschut J. Fusion of reconstituted influenza virus envelopes with liposomes mediated by streptavidin/biotin interactions // FEBS Lett. 1996. 390. P.315-318

П.Власов B.B., Деева E.A., Якубов JI.А. Возможное участие специфических рецепторов в транспорте нуклеиновых кислот в клетки. // ДАН СССР. 1989. Т. 308. С. 998-1000.

12.Yakubov L.A., Deeva Е.А., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Ylassov V.V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989; V. 86. P. 6454-6458.

13.Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H., Mori K., Nakanishi M., Subasinghe C., Cohen J.S., Neckers L.M. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc Natl Acad Sci U S A 1989. V. 86. P. 3474-3478.

14.Hefeneider S.H., Cornell K.A., Brown L.E., Bakke A.C., McKoy S.L., R.M., Bennett. Nucleosomes and DNA bind to specific cell-surface molecules on murine cells and induce cytokine production // Clinical Immunology and Immunopathology. 1992,V. 63. P. 245251.

15.Beltinger C., Saragovi H.U., Smith R.M., LeSauteur L., Shah N., DeDionisio L., Christensen L., Raible A., Jarett L., Gewirtz A.M. Binding, uptake, and intracellular trafficking of phosphorothioate-modified oligodeoxynucleotides // Clin. Invest. 1995. V. 95. P. 1814-1823 .

16.Helenius A., Mellman I., Wall D., Hubbard A. Endosomes //Trends Biochem. Sci. 1983. Y. 8. P. 245-250.

17.Gruenberg J., Maxfield F.R., Membrane transport in the endocytotic pathway // Current Opinion in Cell Biology. 1995. V. 7. P. 552-563.

18.Steinman R.M., Mellman I.S., Muller W.A., Cohn Z.A. Endocytosis and and the recycling of plasma membrane // J. Cell. Biol. 1983. V. 96. P. 1-27. 19.Mellman Ira, Endocytosis and molecular sorting // Annu. Rev. Cell Dev. 1996. V. 12. P. 575-625.

20.Schmid S.L. The mechanism of receptor-mediated endocytosis: more questions than answers // BioEssays. 1992. V. 14. P. 589-596. 21.Lamaze C., Schmid S.L. The emergence of clatrin-independent pinocytic pathways // Curr.

Oppin. Cell Biol. 1995. V. 7. P. 573-580. 22.Sandvig K., van Deurs B. Selective modulation of the endocytic uptake of ricin and fluid phase markers without alteration in transferrin endocytosis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 6382-6388.

23.Heuser J. Effect of cytoplasmic acidification on clatrin lattice morphology // J. Cell Biol. 1989. V. 108. P. 401-411.

24.Larkin, J. M., Donzell W. D., Anderson R. G. W. Potassium-dependent assembly of coated pits: new coated pits form as planar clatrin lattices // J. Cell Biol. 1986. V. 103 P. 26192627.

25.Wang L-H., Rothberg K.G., Anderson R. G. W. Misassembly of clatrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pits formation // J. Cell Biol. 1993. V. 123. P.1107-1117.

26.Schnitzer J.E., Oh P., Pinney E., Allard J. Filipin-sensitive caveolae-mediated transport in endotelium: reduced transcytosis, scavenger endocytosis, and capillary permeability of select macromolecules // J. Cell Biol. 1994. V. 127. P. 1217-1232. 27.Parton R.G., Joggert B., Simons K. Regulated internalization of caveolae // J. Cell Biol. 1994. V. 127. P. 1199-1215.

28.Smart E.J., Foster D., Ying Y.S., Kamen B.A., Anderson R. G. W. Protein kinase C activators inhibit receptor-mediated potocytosis by preventing internalization of caveolae // J. Cell Biol. 1993. V. 124. P.307-313.

29.Hewlett L.J., Prescott A.R., Watts C. The coated pit and macropinocytic pathways serve distinct endosome populations // J.Cell. Biol. 1994. V. 124. P. 689-703.

30.West M.A., Bretsher M.S., Watts C. Distinct endocytic pathways in EGF stimulated human carcinoma A431 cells//J. Cell. Biol. 1989. V. 109. P. 2731-2739.

31 .Watts, M. Marsh, Endocytosis: what goes in and how? // J. Cell. Sci. 1992. V. 103. P. 1-8.

32.Pearse B.M.F., Robinson M.S. Clatrins, adaptors and sorting // Annu. Rev. Cell. Biol. 1990. V. 6. P. 151-171.

33.Keen J.H., Clatrin and associated assembly and disassembly proteins // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P.415-438.

34.Zaremba S., Keen J.H., Assembly polypeptides from coated vesicles mediate reassembly of unique clatrin coats // J. Cell. Biol. 1983. V. 28. P. 47-58.

35.Pearse B.M.F., Receptors complete for adaptors found in plasma membrane coated pits II EMBO J. 1988. V. 7. P. 3331-3336.

36.Glickman J.N., Conibear E., Pearse B.M.F. Specificity of binding of adaptors to signals on the mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor // EMBO J. 1989. V. 8. P. 1041-1047.

37.Heuser J., Evans L. Three dimentional visualization of coated pits formation in fibroblasts // J. Cell. Biol. 1980. V. 84. P. 560-583.

38.Miller K., Shipman M., Trowbridge I.S., Hopkins C.R. Transferrin receptors promote the formation of clatrin lattices // Cell. 1991. V. 65. P. 621-632.

39.Iacopetta B.J., Rothenberger S., Kuhn L.C. A role for the cytoplasmic domain in transferrin receptor sorting and coated pit formation during endocytosis // Cell. 1988. V. 54. P. 485489.

40.Urrutia R., Henley J.R., Cook T., McNiven M.A. The dynamins: redundant or distinct functions for an expanding family of related GTPases? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 377-384.

41.Takei K., McPherson P., Schmid S.L., De Camilli P. Tubular membrane invaginations coated by dynamin rings are induced by GTP-gamma S in nerve terminals // Nature. 1995. V. 378. P. 186-190.

42.Hinshaw.J.E., Schmid S.L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding // Nature. 1995. V. 374. P. 190-192.

43.DeLuca-Flaherty C., McKay D.B., Parham P., Hill B.L. Uncoating protein (hsc70) binds a conformationally labile domain of clatrin light chain LCa to stimulate ATP hydrolysis // Cell. 1990. V. 62. P. 875-887.

44.Sandvig K., Van Deurs B., Endocytosis without clatrin // Trends Cell. Biol. 1994. V. 4. P. 275-277.

45.Subtil A., Hemar A., Dautry-Varsat A. Rapid endocytosis of interleukin 2 receptors when clatrin-coated pit endocytosis is inhibited// J. Cell Sci. 1994. V. 107. P. 3461-3468.

46.Lund K.A., Opresko L.K., Starbuck C., Walsh B.J., Wiley H.S. Quantative analysis of the endocytic system involved in hormone-induced receptor internalization // J.Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 15713-15723.

47.Backer J.M., Shoelson S.E., Haring E., White M.F. Insulin receptors internalize by a rapid, saturable pathway requireng receptor autophosphorilation and an intact juxtamembrane region//J. Cell Biol. 1991. V. 115. P.1535-1545.

48.Van Deurs B., Holm P.K., Sandvig K., Hansen S.H // Are caveolae involved in endocytosis? Trends Cell Biol. 1993. V. 3. P. 249 -251.

49.Rothberg K.G. Heuser J.E., Donzell W.C., Ying Y.S., Glenney J.R.,Anderson R.G.W. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coat // Cell. 1992. V. 68. P. 673-682.

50.Ritter O., Fajardo H., Matsue, Anderson R.G.W., Lacey S.W. Folate receptor targeted to clatrin-coated pits cannot regulate vitamin uptake // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3824 - 3828.

51.Schnitzer J.E., Mcintosh D.P., Dvorak A.M., Liu J., Oh P. Separation of caveolae from associated microdomain of GPI-anchored proteins // Science. 1995. V. 269. P. 1435-1439.

52.Rijnboutt S., Jansen J., Strous J.L. Endocytosis of GPI-linked membrane folate receptor-alpha//J. Cell. Biol. 1996. V. 132. P. 36-47.

53.Mayor S., Rothberg K., Maxfield F. Sequestration of GPI-anchored proteins in caveolae triggered by crosslinking // Science. 1994. V. 264. P. 1948-1951.

54.Mayor S., Maxfield F. Insolubility and redistribution of GPI-anchored proteins at the cell surface after detergent treatment // Mol. Biol. Cell. 1995. V. 6. P. 929-944.

55.Cupers P., Veithen A., Kiss A., Baudhuin P., Courtoy P.J. Clatrin polymerization is not required for bulk-phase endocytosis in rat fetal fibroblasts // J. Cell. Biol. 1994. 127. P. 725-735.

56.Hansen S.H., Sandvig K., Deurs B., The preendosomal compartment comprises distinct coated and uncoated endocytic vesicle populations // J. Cell Biol. 1991. V. 113. P. 731741.

57.Damke H, Baba T, van der Bliek AM, Schmid SL., Clathrin-independent pinocytosis is induced in cells overexpressing a temperature-sensitive mutant of dynamin // J. Cell Biol. 1995. V. 131. P. 69-80.

58.Sandvig K, van Deurs B. Selective modulation of the endocytic uptake of ricin and fluid phase markers without alteration in transferrin endocytosis // J Biol Chem. 1990. V. 265 p. 6382-6388.

59.Racoosin E.L., Swanson J.A., M-CSF - induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages // J. Cell Sci. 1992. 102. P. 867-880.

60.Hansen S.H., Sandvig K., Deurs B., The preendosomal compartment comprises distinct coated and uncoated endocytic vesicle populations // J. Cell Biol. 1991. V. 113. P. 731741.

61.Tran D., Carpentier J.-L., Sawano F., Gordon P., Orci L., Ligands internalized through coated or uncoated invaginations follow a common intracellular pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 7957-7961.

62.Keller J.-A., Siegel M.W., Caras I.W. Endocytosis of of glycophospholipid-anchored and transmembrane forms of CD4 by different endocytic pathways // EMBO J. 1992. V. 11. P. 863-874.

63.Roberts R.L., Sandra A., Receptor-mediated endocytosis of insulin by cultured endotelial cells // Tissue & Cell. 1992. V. 24. P. 603-611.

64.Rabkin R., Tsao T., Elliot S.J., Striker L.J., Striker G.E. Insulin uptake and processing by cultured mouse glomerular endotelial cells // Am. J. Phys. 1993. V. 265. P.C453-C459.

65.Fan J.Y., Carpentier J.L., Van Obberghen E., Grunfeld C., Gorden P., Orci L. Morphological changes of the 3T3-L1 fibroblast plasma membrane upon differentiation to adipocyte form//J. Cell. Sci. 1983. V. 61. P. 219-230.

66.Scherer P.E., Lisanti M.P., Baldini G., Sargiacomo M., Mastick C.C., Lodish H.F. Induction of caveolin during adipogenesis and association of GLUT4 with caveolin-rich vesicles//J. Cell. Biol. 1994. V. 127. P. 1233-1243.

67.Ghosh R.N., Maxfield F.R. Evidence of nonvectorial, retrograde transferrin trafficking in the early endosomes of Hep2 cells // J. Cell Biol. 1995. V. 128. P. 549 -561.

68.Gruenberg J., Griffiths G., Howell K.E., Characterization of early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo and with an assay of vesicle fusion in vitro // J Cell Biol. 1989. V. 108. P. 1301-1316.

69.Gruenberg J., Howell K.E., Membrane traffic in endocytosis: insight from cell-free assays //Annu Rev Cell Biol. 1989. V. 5. P. 453-481.

70.Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes // J Cell Biol.,1993. V. 120. P. 1357-1370.

H .Dautry-Varsat A., Ciechanover A., Lodish N.F. pH and the recycling of transferrin during receptor - mediated endocytosis // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1983. V. 80. P. 2258-2262.

72.GoldsteinJ.L., Brown M.S., Anderson R.G., Russel D.W., Scheider W.J., Receptor -mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system // Annu. Rev. Cell Biol. 1985. V. l.P. 1-39.

73.Griffiths G.,Back R., Marsh M., A Quantitative analysis of the endocytic pathway in baby hamster kidney cells // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 2703-2720.

74.Maxfield F.R.,Yamashiro D.J. Acidification of organelles and the intracellular sorting of proteins during endocytosis // In: Intracellular trafficking of proteins. Ed. by C .J. Steer, J.A. Hanover. Cambridge: Cambridge University Press. 1991. P. 157-182.

75.Berthiaume E., Medina C., Swanson J.A. Molecular size fractionation during endocytosis in macrofages // J. Cell Biol. 1995. V. 129. P. 989-998.

76.Ghosh R.N., Gelman D.L., Maxfield F.R., Quantification of density lipoprotein and transferrin endocytic sorting in Hep2 cells using confocal microscopy // J.Cell Sci. 1994. V. 107. P. 2177-2198.

77.Cupers Ph., A. Veithen, D. Hoekstra, P. Baudhuin, P. Courtoy. Three unrelated perturbations similarly uncouple fluid, bulk-membrane, and receptor endosomal flow in rat fetal fibroblasts // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997. V. 236. P. 661-664.

78.Marsh E.W., Leopold P.L., Jones N.L., Maxfield F.R. Oligomerized transferrin receptors are selectively retained by a lumenal sorting signal in a long-lived endocytic recycling compartment // J Cell Biol 1995. V. 129. P. 1509-1522

79.Snider M.D., Remodeling of glycoprotein oligosaccharides after endocytosis: a measure of transport into compartments of the secretory apparatus // Meth. Cell Biol. 1989. V. 32. P. 339-350.

HO.Jin M., Snider M.D. Role of microtubules in transferrin receptor transport from the cell surface to endosomes and the Goldgi complex // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1839018397.

81.Yamashiro D.J., Tycko B., Fluss S.R., Maxfield F.R // Segregation of transferrin to a midly acidic (pH 6.4) para - Golgi compartment in the recycling pathway // Cell. 1984. V. 37. P. 789-800.

82.Hopkins C.R., Gibson A., Shipman M., Strickland D.K.,Trowbridge I.S. In migrating fibroblasts, recycling receptors are concentrated in narrow tubules in the perycentriolar area, and then routed to the plasma membrane of the leading lamella // J. Cell. Biol. 1994. V. 125. P.1265-1274.

83.Lippincott-Schwartz J. Membrane cycling between the ER and Golgi apparatus and its role in biosynthetic transport // Subcell Biochem., 1993. V. 21. P. 95 - 119.

84.McKanna J.A., Haigler H.T., Cohen S. Hormone receptor topology and dynamics: morfological analysis using ferritin labeled epidermal growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1979. V. 76. P. 5689-5693.

85.Hopkins C.R., Gibson A., Shipman M., Miller K., Movement of internalized ligand-receptor complexes along a continius endosomal reticulum // Nature. 1990. V. 346. P. 335339.

86.Kornfeld S., Mellman I., The biogenesis of lysosomes // Annu. Rev. Cell Biol. 1989. V. 5. P. 483-525.

87.Griffiths G., HoflackB.,Simons K., Mellman I., Kornfeld S // The mannose-6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 1988. V. 52. P. 329-341.

88.Lombardi D., Soldati T., Riederer M.A., Goda Y.,Zerial M., Pfeffer S. rab9 functions in transport between late endosomes and trans - Golgi network // EMBO J. 1993. V. 12. P. 677-682.

89.Allera A.,Wildt L. Glucocorticoid-recognizing and -effector sites in rat liver plasma membrane. Kinetics of corticosterone uptake by isolated membrane vesicles. Binding and transport // J. Steroid Biochem. 1992. V. 42. P. 737-756.

90.Pietras R.J., Scego C.M. Specific binding sites for oestrogen at the outer surface of isolated endometrial cells // Nature. 1977. V. 265. P. 69-72.

91.Pietras R.J., Scego C.M. Estrogen receptors in the uterine plasma membrane // J. Steroid Biochem. 1979. V. 11. P. 1471-1483.

92.Beato M. Gene regulation by steroid hormones // Cell. 1989. V. 56. P. 335-344.

93.Lobie P.E., Mertani H., Morel G., Morales-Bustos O., Norstedt G., Waters M.J. Receptor-mediated nuclear translocation of growth hormone // J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 2133021339.

94.Clevenger C.V., Sillman A.L., Prystowsky M.B. Interleukin-2 driven nuclear translocation of prolactin in cloned T-lymphocytes // Endocrinology. 1990. V. 127. P. 3151-3159.

95.Clevenger C.V., Russel D.H., Appasami P.M., Prystowsky M.B. Regulation of interleukin 2-driven T-lymphocyte proliferation by prolactin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 6460-6464.

96.Wong K.Y., Hawley D., Vigneri R., Goldfme I.D. Comparison of solubilized and purified plasma membrane and nuclear insulin receptors // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 375-379.

97.Bouche G., Gas N., Prats H., Baldin V., Tauber J.P., Teissie J., Almaric F. Basic fibroblast growth factor enters the nucleolus and stimulates the transcription of ribosomal genes in ABAE cells undergoing GO—G1 transition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 6770-6774.

98.Morel G. Internalization and nuclear localization of peptide hormones // Biochem. Pharmacol. 1994. V. 47. P. 63-76.

99.Racowicz-Szulczunska E.M., Rodeck U., Herlyn M., Koprowski H. Chromatin binding of epidermal growth factor, nerve growth factor, and platelet-derived growth factor in cells bearing the appropriate surface receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3728-3732.

100. Silverstein S.C., Steinman R.M., Cohn Z.A Endocytosis // Annu. Rev. Biochem. 1977. V. 46. P. 669-722.

101.Seaman M.N.J., Burd C.G., Emr S.D., Receptor signalling and the regulation of endocytic membrane transport // Curr. Opinion Cell Biol. 1996. V. 8. P. 549-556.

102.Абрамова T.B., Комарова Н.И., Мундус Д.А., Перебоева О.С. Эффективный синтез 5'-фосфорилированных дезоксиолигонуклеотидов в препаративных количествах. // Известия СОАН СССР. Серия химические науки. 1990. Вып. 5. С. 45-51.

103.Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY. 1982. P. 127.

104.Zarytova V.F., Godovikova T.S., Kutyavin I.V., Khalimskaya L.M. Reactiva oligonucleotides as affinity reagents and probes in molecular biology // Biophosphates and their analogues - synthesis, structure, metabolizm and activity / Eds. Bruzik K.S., Stec W.J. Amsterdam: Elsevier Science Publishers. 1987. P. 149-164.

105.Vlassov V.V., Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gaidamakova E.K., Koshkin A.A. DNA and RNA cleavers and chemotherapy of cancer and viral diseases (Meunier B., ed.) 1996, Kluwer Academic Publishers. P. 195-207.

106.Li S., Huang L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes // Gene Ther. 1997. V. 4. P. 891-900

107.Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Feigner PL Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science 1990; V. 247. P. 1465-1468.

108.Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, Margalith M, Barnhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, Manthorpe M An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle // Hum. Gene Ther. 1996. V. 20, P. 1205-1217.

109.Budker V., Zhang G., Danko I., Williams P., Wolff J. The efficient expression of intravascularly delivered DNA in rat muscle // Gene Ther. 1998. V. 5. P. 272-276.

110.Budker V., Zhang G., Knechtle S., Wolff J.A. Naked DNA delivered intraportally expresses efficiently in hepatocytes // Gene Ther. 1996. V. 3. P. 593-598.

111 .Zhang G, Vargo D, Budker V, Armstrong N, Knechtle S, Wolff JA Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers // Hum Gene Ther 1997. V. 8. P. 1763-1772.

112.Wu-Pong S., Weiss T.L., Hunt C.A. Antisense c-myc oligonucleotide cellular uptake and activity // Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 155-163.

113.Zhao Q., Matson S., Herrera C.J., Fisher E., Yu H., Krieg A.M. Comparison of cellular binding and uptake of antisense phosphodiester, phosphorothioate, and mixed phosphorothioate and methylphosphonate oligonucleotides // Antisense Res. Dev. 1993. V. 3. P. 53-66.

114.1versen P.L., Zhu S., Meyer A., Zon G. Cellular uptake and subcellular distribution of phosphorothioate oligonucleotides into cultured cells // Antisense Res Dev 1992. V. 2. P. 211-222.

115.Zamecnik P., Aghajanian J., Zamecnik M., Goodchild J., Witman G. Electron micrographie studies of transport of oligodeoxynucleotides across eukaryotic cell membranes // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1994. V. 91. P. 3156-60.

116.Vlasov V.V., Ivanova E.M., Kutiavin I.V., Rait A.S., Yurchenko L.V. Interaction of alkylating oligonucleotide derivatives with mammalian cells. A study of the uptake mechanism of derivative cells // Mol Biol (Mosk) 1989. V. 23. P. 93-100.

117.Власов B.B., Нечаева M.B., Байбородин С.И., Шестова О.Е., Сафронов И.В., Кошкин А.А., Якубов JI.A. Олигонуклеотиды, адсорбированные клеткой, быстро накапливаются в ядре // ДАН. 1995, Т. 345. С. 123-126.

118.Rappaport J., Hanss В., Корр J.B., Copeland T.D., Bruggeman L.A., Coffman T.M., Klotman P.E. Transport of phosphorothioate oligonucleotides in kidney: Implication for molecular therapy // Kidney International. 1995. V. 47. P. 1462-1469.

119.Власов В.В., Горохова (Шестова) О.Е. Иванова Е.М., Кутявин И.В., Юрченко JI.B., Якубов Л.А., Абдукаюмов М.Н., Скоблов Ю.С. Взаимодействие алкилирующих производных олигонуклеотидов с фибробластами мышей. Биополимеры и клетка. 19867 Т.27 С. 323-327.

120.Hawley P., Gibson I. The detection of oligodeoxynucleotide molecules following uptake into mammalian cells // Antisense Res Dev 1992. V. 2. P.l 19-127.

121.Gang-Qing Yao, Corrías S., Yung-Chi Cheng. Identification of two oligodeoxyribonucleotide binding proteins on plasma membranes of human cell lines // Biochem. Pharm. 1996. V. 51. P. 431-436.

122.Власов B.B., Иванова E.M., Нечаева M.B., Рыкова Е.Ю., Карамышев В.Н., Якубов JI.A., Зон Д. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты в клетках млекопитающих, алкилирующими производными олигонуклеотидов. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 962-966.

123.Якубов JI.A., Карамышев В.Н., Власов В.В., Савинкова И.В., Щербаков Д.Ю. Олигонуклеотид-связывающие белки дрозофил: свойства и тканевая специфичность. //Мол. биология. 1991. Т. 25. С. 1611-1614.

124.Власов В.В., Иванова Е.М., Кутявин И.В., Райт А.С., Юрченко JT.B., Якубов JI.A., Якубов JI.A., Абдукаюмов М.Н., Скоблов Ю.С. Взаимодействие алкилирующих производных олигонуклеотидов с клеткам млекопитающих. Исследование механизмов захвата производных клетками. // Мол. биология. 1989. Т. 23. С. 93-100.

125.Goodarzi G., Watabe М., Watabe К. Binding of oligonucleotides to cell membranes at acidic pH // Biochim. Biophys. Res. Comm. 1991. V. 181. P. 1343-1351.

126.Yao G.Q., Corrias S., Cheng Y.C. Identification of two oligodeoxyribonucleotide binding proteins on plasma membranes of human cell lines // Biochem. Pharmacol. 1996. Y. 51. P. 431-436.

127.Laktionov P., Dazard J-E., Vives E., Rykova E., Piette J., Vlassov V., Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Research .1999. V. 27. P. 2315-2324.

128.Geselowitz D.A., Neckers L.M. Bovine serum albumin is a major oligonucleotide-binding protein found on the surface of cultured cells // Antisence Res. Dev. 1995. V. 5. P. 213-217.

129.Yakubov, L.A., Khaled, Z., Zhang, L.M., Truney A., Vlassov V.V., and Stein C.A. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 18818-18823.

130.Короленко Т.А. Биохимические основы лизосомотропизма. // Новосибирск. Наука. 1983. С. 120.

131.Nakai D., Seita Т., Terasaki Т., Iwasa S., Shoji Y., Mizushima Y., Sugiyama Y. Cellular uptake machanism for oligonucleotides: involvement of endocytosis in the uptake of phosphodiester oligonucleotides by human colonorectal adenocarcinoma cell line, HCT -15 // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. V. 278. P. 1362-1372.

132.Hawley P., Gibson I. Interaction of oligodeoxynucleotides with mammalian cells // Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1996. V. 6. P. 185-195.

133.Колпащиков Д.М., Захаренко A.JI., Дежуров С.В., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. Новые реагенты для фотоаффинной модификации биополимеров. Фотоаффинная модификация Tte-ДНК-полимеразы // Биоорганическая химия. 1999. Т.25 С. 129-136.

134.Rickwood D., Messent A., Patel D. Isolation and characterization of nuclei and nuclear subfractions. In Subcellular fractionation A Practical Approach. // Ed. by Graham J.M., Rickwood D. IRL Press. 1997.

135.Besterman J.M., Airhart J.A., Woodworth R.C., Low R.B. Exocytosis of pinocytosis fluid in cultured cells: Kinetic evidence for rapid turnover and compartmentation // J. Cell. Biol. 1981. V. 91. P. 716-727.

136.Sasaki A.W., Williams S.K., Jain M., Wagner R.C. Mechanism of sucrose uptake by isolated rat hepatocytes // J. Cellular Physiology. 1987. V. 133. P. 175-180.

137.Balakireva L.A., Levashova Z.B., Chroboczek J., Vlassov V.V. Rapid sequence-independent cellular response to oligonucleotides // FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 267-270.