Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Новиков, Глеб Вадимович

• Новиков, Глеб Вадимович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Новиков, Глеб Вадимович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Цель и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведенья о белках

1.2. Иерархия белковой структуры

1.3. Структурно-динамические особенности белка (двугранные углы)

1.4. Динамические особенности белков

1.5. Описание 7-ТМ рецепторов, исследованных в настоящей работе

1.6. Пространственная архитектура 7-ТМ рецепторов

1.7. Конформационная динамика 7-ТМ рецепторов

1.8. Развитие основных представлений о функционировании 7-ТМ рецепторов

1.9. Общие представления о конститутивной активности 7-ТМ рецепторов

1.10. Микропереключатели в 7-ТМ рецепторах

1.11. Исследование активации 7-ТМ рецепторов методом молекулярной динамики

1.11.1. Исследование фотоактивации родопсина

1.11.2. Исследование структурной подвижности микропереключателей

1.11.3. Исследование активации гормон-активируемых GPCRs

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ДИНАМИКИ

2.1. Метод молекулярной динамики

2.2. Метод главных компонент

2.3. Управляемая молекулярная динамика. Метод essential dynamics sampling

2.4. Детали расчетов

Исследование структурной подвижности Src-тирозин-киназы методом анализа главных

компонент

Исследование структурной подвижности 7-ТМ рецепторов методом главных компонент.. 67 Исследование структурной подвижности аденозинового Алл рецептора методом

молекулярной динамики

Моделирование молекулярной динамики Агл рецептора в окружении CCl^-вода

Моделирование молекулярной динамики Агд рецептора в окружении ПОГФ-вода

Расчет сдвига РКа для титруемых аминокислотных остатков рецептора

Моделирование молекулярной динамики аденозинового рецептора в окружении ПОГФ-

вода методом Essential Dynamics Sampling (EDS)

Моделирование p-2-адренорецептора в комплексе с лигандами

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование конформационной подвижности водорастворимых белков методом анализа главных компонент

3.2. Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методом анализа главных компонент

3.3. Исследование конформационной подвижности аденозинового А^л рецептора методом равновесной молекулярной динамики

3.4. Исследование конформационной подвижности аденозинового рецептора в окружении липиды-вода методом "управляемой" молекулярной динамики

3.5. Исследование влияния связывания лигандов на конформационную динамику р-2-адренорецептора методом "управляемой" молекулярной динамики

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1.СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

7-ТМ - семи-трансмембранный; А - ангстремм;

АГК - анализ главных компонент

ВП- внеклеточная петля;

ВНП- внутриклеточная петля;

ГК- главная компонента;

МВШ- модель Моно-Ваймена-Шанже;

МД- молекулярная динамика;

не- наносекунда;

нм- нанометр;

пс- пикосекунда;

ПОГФ - 1-Пальмитоил-2-олеил-глицеро-3-фосфат-етаноламин; СКО- среднеквадратичное отклонение; ТМ- трансмембранный;

ТМ1, ТМ I - первый трансмембранный домен (одна из семи а-спиралей);

ТМД- трансмембранный домен;

PDB- белковый банк данных (protein data bank);

EDA- Essential Dynamics Analysis ( метод анализа основной динамики);

EDS- Essential Dynamics Sampling (метод перебора основной динамики);

EXC- Extracellular (loop)- обычно служит для обозначения внеклеточных петель рецептора;

GPCR- G-protein-coupled receptors (рецепторы, сопряженные с действием G-белка);

1С - Intracellular (loop) - обычно служит для обозначения внутриклеточных петель рецептора;

РСА - Principal Components Analysis (метод анализа главных компонент);

PC- principal component (главная компонента);

RMSD- среднеквадратическое отклонение (СКО);

TMD- Transmembrane Domain (трансмембранный домен, обычно служит для обозначения одной из а-спиралей рецептора) Р2-ар- p-адренергический рецептор; Агл-аденозиновый рецептор подкласса Агд;

Приложение 2.Основные определения.

Обозначение аминокислот. Существует два альтернатиных способа обозначения аминокислотных остатков в 7-ТМ рецепторах. Наиболее традиционный способ- нумерация остатков от N- к С- концу полипептидной цепи. Например, Lys-15, означает остаток лизина в 15 позиции, относительно N-конца. Кроме того, существует альтернативная нумерация, предложенная Баллестеросом и Вейнштейном (Ballesteros-Weinstein nomenclature). Согласно этой номенклатуре, каждому аминокислотному остатку приписывается два номера, разделенных точкой (например, Тгр-6.48). При этом, первое число соответствует номеру а спирали, в которой расположен этот остаток, а второе (двузначное) число отражает степень консервативности данного остатка среди родопсин-подобных 7-ТМ рецепторов. Во втором случае, наиболее консервативный остаток имеет индекс х.50. Таким образом, остаток Тгр-6.48 обозначает высококонсервативный остаток триптофана из VI спирали рецептора. Подобная система удобна для обозначения высококонсервативных остатков в 7-ТМ рецепторах (например, микро-переключателей), имеющих неидентичное положение в полипептидной цепи различных рецепторов. Например, в вышеуказанном примере Тгр-6.48, в случае родопсина соответствует остатку Тгр-275, а в случае аденозинового рецептора- Тгр-265.

Алпостерия- феномен структурного и энергетического сопряжения между пространственно-удаленными участками белка. Например, в случае, когда связывание лиганда в ортостерическом сайте приводит к конформационным изменениям во внутриклеточной области рецептора, считается что два данных участка аллостерически сопряжены.

Множественная эффективность- способность одного рецептора активировать несколько различных молекул-эффекторов, в зависимости от связывания различных лигандов. В этом случае говорят, что рецептор способен осуществлять сигнализацию, по различным путям, переключение между которыми связано со стабилизацией его различных конформаций. Например, сигнализация, в случае p-2-адренергического рецептора может протекать либо через Gs, либо через Gi- белки. В первом случае активация рецептора сопровождается повышением уровня цАМФ, а во втором- его снижением. Существуют рецепторы с более выраженной "множественной эффективностью", в рамках которой связывание различных лигандов активирует принципиально различные пути сигнализации.

Микро-переключатели- высококонсервативные остатки 7-ТМ рецепторов, для которых характерна повышенная степень динамики их боковых групп (ротамерная изомеризация по двугранному углу %-1). Для всех 7-ТМ рецепторов обнаружено, по крайней мере, три подобных структурных элемента: (1) солевой мостик (ионный замок), образуемый остатками Arg- 3.50 (мотив DRY) и Glu - 6.32 из цитоплазматической области третьей, а так же шестой спиралей, соответственно; (2) ротамерный переключатель- высококонсервативный остаток триптофана (Тгр-6.48, мотив CWxP), расположенный в районе лиганд-связывающей области; (3) остаток Туг-7.53 (мотив NPxxY) из седьмой спирали рецептора.

Конститутивная (спонтанная, базовая) активность - доля активного (апо) рецептора, относительно его общей активной фракции, не вызываемая связыванием молекулы агониста.

Ортостерический (лиганд-связывающий) участок- лиганд-связывающая область, обычно расположенная внутри 7-ТМ а-спирального пучка родопсин-подобных рецепторов.

Аллостерический (лиганд-связывающий) участок- лиганд-связывающая область рецептора, расположенная в альтернативной позиции, относительно его ортостерического участка. Лиганды, связывающиеся в этих участках, обычно выступают в роли аллостерических модуляторов.

Отрицательная эффективность- функциональное свойство обратимых агонистов, связанное со снижением уровня конститутиврной активности рецептора, ниже его базового значения.

Функциональные классы лигандов 7-ТМ рецепторов.

Полный агонист- лиганд, связывание которого вызывает максимальный уровень активности рецептора.

Частичный агонист- лиганд, опосредующий суб-максимальный уровень активности рецептора, даже при связывании в насыщающей концентрации.

Обратимый агонист- лиганд, снижающий уровень базовой (конститутивной) активности, до минимального значения.

Нейтральный антагонист- лиганд, не влияющий на базовую ( конститутивную) активность рецептора. Обычно связывание нейтральных антагонистов приводит к стерической изоляции ортостерического кармана рецептора, препятствуя связыванию других лигандов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Рецепторы, сопряжённые с G-белком (G protein-coupled receptors, GPCRs) относятся к наиболее обширному классу семи-трансмембранных (7-ТМ) рецепторов [1,2]. Известно, что представители этого класса мембранных белков играют первостепенную роль в межклеточных коммуникациях, автокринных и паракринных регуляциях клеточных функций, а также в процессах подвижности и адгезии клеток [3]. В этой связи, исследование 7-ТМ рецепторов всегда было одним из основных направлений клеточной физиологии, биофизики и фармакологии. Помимо чисто академического интереса, экспериментальный и теоретический анализ данных белков имеет так же важное прикладное значение. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных средств являются лигандами этих белков [4, 5]. Поэтому развитие новых методов исследования функциональных аспектов этих белков непосредственно связано с областью разработки новых лекарств.

Долгое время считалось, что переход рецептора в активное состояние является прямым следствием его взаимодействия с агонистом. Тем не менее, в существующих представлениях о деталях механизма активации этих белков все еще много неясного [6, 7]. Например, экспериментально было показано, что антагонисты и обратные агонисты связываются с неактивным рецептором с большей афинностью, чем полные агонисты. Это свидетельствует о том, что связывание лиганда является необходимым, но недостаточным фактором для активации рецептора [8, 9]. Наряду с этим, недавно стало известно, что для 7-ТМ рецепторов характерно выраженное динамическое поведение в условиях in vivo [10]. При этом, находясь в различных подсостояниях, рецептор осуществляет сигнализацию по разным сигнальным каскадам [11]. В этой связи, совершенно необходимо понимание того, какие именно конформации рецептора соответствуют его истинно активному подсостоянию и каким именно путем в конформационом пространстве "движется" рецептор, для достижения данного состояния. В настоящее время для качественного описания функционального поведения мембранных рецепторов существует концепция популяционного сдвига, основанная на модели Моно, Ваймена и Шанже (МВШ) [12, 13]. Согласно этой концепции, для этих белков характерно существование ансамбля структурно-близких

подсостояний (конформеров), а так же их непрерывный перебор. При этом, любое внешнее воздействие приводит к стабилизации специфической конформации рецептора, делая её преобладающей, из числа возможных. Таким образом, в рамках модели МВШ, динамическое поведение рецептора является ествественным свойством его пространственной архитектуры [14, 15]. Подобное функциональное поведение лиганд-активируемых рецепторов, получившее название "функциональной избирательности", опосредует ряд физиологических явлений в этих белках [16, 17]. Например, определенная доля их конститутивной (лиганд-независимой) активности непосредственно связана с возможностью их активации в отсутствии [18]. Экспериментально было показано, что подобное спонтанное поведение может иметь функциональное значение для одних рецепторов, и в тоже же время являться нежелательным фактором для других. Тем не менее, в настоящее время отсутствуют какие-либо представления о структурных особенностях этого явления, а так же до конца остается неясным его функциональное значение.

В настоящее время исследование мембранных белков современными экспериментальными методами сопровождается рядом методических трудностей [19]. Например, для поддержания нативной структуры, а так же функциональных свойств этим белкам требуется наличие их мембранного окружения. С другой стороны, существенный прорыв в области расшифровки новых пространственных структур 7-ТМ рецепторов и значительное увеличение вычислительных мощностей, способствуют внедрению компьютерных методов исследования данных белков в среде ш зШсо. К настоящему времени этими методами широко исследуются разнообразные функциональные аспекты 7-ТМ рецепторов, включая особенности их структурной подвижности. Таким образом, полученные данные могут пролить свет на ключевые аспекты динамического поведения 7-ТМ рецепторов, как в фундаментальном, так и в прикладном плане, способствуя разработке новых лекарственных препаратов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является исследование спонтанной активации (конститутивной активности) родопсин-подобных рецепторов и взаимосвязи этого процесса с их конформационной подвижностью. Для выполнения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:

1. Провести апробацию метода главных компонент для исследования функционально значимых движений a-спиралей в белках. Исследовать конформационную подвижность двух водорастворимых белков (кальций-связывающего белка кальмодулина, а так же фермента SRC-тирозин киназы), используя их выборки кристаллографических структур.

2. Исследовать структурную подвижность фоторецептора родопсина млекопитающих, а так же трёх гормон-активируемых рецепторов (двух классов p-адренергических, а так же аденозинового Ала рецептора) методом главных компонент, используя выборки пространственных структур этих белков. Провести сравнительный анализ особенностей конформационной подвижности гормон-активируемых рецепторов, относительно контрольной выборки фоторецептора родопсина.

3. Методом молекулярной динамики исследовать структурную подвижность ano формы аденозинового А2а рецептора в окружении ССЦ-вода. Установить корреляцию между наиболее конформационно подвижными областями рецептора, а так же его функциональными особенностями. Методом главных компонент сравнить конформационную подвижность аденозинового рецептора, наблюдаемую на траектории МД, с характером распределения его экспериментальных структур.

4. Методамим молекулярной динамики и структурной биоинформатики исследовать конформационную подвижность ano формы аденозинового рецептора в окружении липиды-вода. Установить взаимосвязь между конформационной подвижностью рецептора и его конститутивной активностью. Изучить корреляцию между крупномасштабными конформационными движениями рецептора, а так же локальной динамикой его отдельных высоко-консервативных остатков.

5. Методом "ограниченной" молекулярной динамики исследовать влияние внешних факторов на конформационную подвижность p-2-адренорецептора. Провести сравнение проекций траекторий МД, рассчитанных для исследуемого белка в комплексе с различными лигандами (полным и обратным агонистом), а так же его ano формы.

Научная новизна. В рамках проведенного исследования впервые, используя комплексный подход из методов структурной биоинформатики и молекулярного моделирования, были получены детальные представления о конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов. Было установлено, что динамическое поведение этих белков является естественным свойством их пространственной архитектуры. Методом главных компонент, впервые были выделены функционально-значимые движения из траекторий молекулярной динамики, а так же выборки кристаллографических структур лиганд-активируемых рецепторов. Это позволило напрямую сравнить общую картину конформационной подвижности этих белков, наблюдаемую как на рассчитанной траектории, так и в распределениях известных экспериментальных структур. В результате впервые были установлены общие закономерности структурных движений, наблюдаемые как на траектории МД исследованных рецепторов, так и при сравнении их экспериментальных структур. Кроме того в ходе моделирования лиганд-активированных рецепторов методом молекулярной динамики впервые удалось наблюдать спонтанное движение этих белков, по направлению к их активным подсостояниям, наблюдаемым в кристалле. С другой стороны, на примере Р-2-адренорецептора впервые удалось исследовать влияние различных внешних факторов на конформационную динамику этого белка. Таким образом, были подобраны параметры и режимы компьютерной симуляции, позволяющие на относительно непродолжительных траекториях исследовать функционально-значимые движения в 7-ТМ рецепторах.

Практическая значимость. В настоящее время исследования активации родопсин-подобных рецепторов обладают приоритетным значением, благодаря ключевой роли этих белков в области фармакологии. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных препаратов являются лигандами 7-ТМ рецепторов. В этой связи, полученная информация о функционально-значимой конформационной подвижности этих белков может быть использована для разработки новых лекарств или проверки функциональных свойств уже существующих соединений. При этом, анализ конформационных движений рецепторов-мишеней по выделенным степеням свободы может быть особенно полезен, при моделировании комплексов этих белков с различными функциональными классами лигандов. Таким образом, полученные в настоящей работе результаты обладают как фундаментальным, так и прикладным значением.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведенья о белках.

Белки- это сложные макромолекулы, ответственные за осуществление широкого спектра высокоспецифических функций [20]. Данные макромолекулы принимают участие в ферментативном катализе, а так же межклеточной коммуникации и иммунном ответе, осуществляют транспорт низкомолекулярных веществ, а так же выполняют ряд структурных функций. Разнообразие осуществляемых белками функций существенно отражается на структурных особенностях данных макромолекул. Для сравнения, ДПК, являющаяся главным носителем наследственной информации, ограничена лишь 4 алфавитным кодом, в то время как её пространственная структура представлена двойной спиралью. С другой стороны, белки состоят более чем из 20 различных строительных блоков, аминокислот, формирующих, в конечном счете, несколько сотен различных пространственных укладок [21]. Кроме того, в последнее время, с расшифровкой большого числа пространственных структур различных белков, удалось пролить свет на характер взаимосвязи между аминокислотной последовательностью данных макромолекул и их пространственной архитектурой . Так, в ряде случаев, для практически негомологичных белков, было показано существование их крайне схожих пространственных структур. В этой связи, можно сделать вывод о существовании ограниченного числа способов создания уникальных пространственных архитектур белков, по сравнению с вариациями по их сиквенсу. Согласно центральной догме структурной биологии, именно пространственная структура белков определяет высокоспецифичность их функций [22]. В этой связи, можно предположить, что эволюция данных макромолекул протекает посредством естественного отбора, действующего именно на уровне их пространственной архитектуры.

В "Физике белка" Алексея Финкельштейна сказано, что различные белки "живут" в разном окружении, а их пространственная структура несет на себе явную печать этого окружения [23]. Считается, что чем меньше воды вокруг белка, тем невосполнимее разрыв мощных водородных связей, стягивающих его цепь, тем ценнее для белка эти связи, и, наконец, тем регулярнее вынуждена быть пространственная структура белка. В настоящее время существует несколько классификаций белковых молекул [24, 25]. На основании особенностей пространственной организации, белки разделяют на три основные группы:

1) Фибриллярные белки, образующие огромные агрегаты. Их высокоупорядоченная пространственная структура стабилизирована за счет взаимодействий между разными цепями. Поэтому эти белки, как правило, выполняют структурную функцию.

2) Сравнительно недавно в отдельную группу были выделены белки, лишенные определенной пространственной структуры [26]. При этом было показано, что различные представители данного класса instrinsically unstructured (disordered) proteins (IUP, ЮР), играют центральное значение в самых разнообразных биологических функциях, среди которых на первом месте- это функции, связанные с белок-белковым, белок-ДНК, а так же белок-лигандным узнаванием. В связи с этим, очевидна ключевая роль данных белков в самых разнообразных регуляторных функциях.

3) Наиболее обширный класс составляют глобулярные белки, осуществляющие наиболее широкий диапазон самых разнообразных биологически функций. В грубом приближении, пространственная структура данных белков напоминает глобулу. В свою очередь, по "жизненным условиям", белки данного класса можно разделить на два основных подтипа:

а) Мембранные белки "живут" в гидрофобной мембране, внутри которой практически нет воды [27]. При этом, отдельные части (гидрофильные, состоящие приемущественно из полярных аминокислот) этих белков выступают из мембраны во внешнюю среду. Анализ пространственных структур данных белков показал, что их внутримембранные части, как и фибриллярных белков, высокорегулярны, за счет стабилизации водородными связями. С другой стороны, их внемембранные участки обычно менее упорядочены. Таким образом, пространственная структура данных участков наиболее приближает их к IDP.

б) Водорастворимые глобулярные белки - наименее регулярны по их аминокислотным последовательностям. В общем плане, их пространственная структура держится за счет взаимодействий белковой цепи с самой собой. При этом, центральным значением обладают взаимодействия далеких по цепи, но сблизившихся в пространстве углеводородных (как правило, гидрофобных) групп, а также взаимодействия белковой цепи с кофакторами.

Таким образом, фибрилиарные и ГОР отличаются от глобурярных белков не только в структурном плане и функциональным многообразием, но также и рядом других физико-химических свойств. В первую очередь, очевидны отличия в степени растворимости в воде

(гидрофобности), плотности упаковки атомов, а так же степени динамики, проявляемой как на уровне сворачивающейся полипептидной цепи, так и в рамках уже свернутого состояния. Наконец, пространственная организация мембранных глобулярных белков наиболее сложна. Особенность их пространственной архитектуры заключается в одновременном сочетании трёх ключевых свойств. С одной стороны, высокорегулярная внутримембранная часть данных макромолекул, в структурном плане, крайне сходна с фибрилиарными белками. Этот участок не только осуществляет структурное 'заякоревание' белка в мембране, но так же напрямую связан с выполнением различных высокоспецифических функций (например, движений a-спиралей в рецепторах при передачи сигнала, либо же открытие\закрытие ионных каналов). Последнее сильно напоминает особенности пространственного строения водорастворимых глобулярных белков (например, динамика на уровне активных центров ферментов). Наконец, внемембранные петли, представленные доменами без определенной пространственной структуры (IDP), как правило, ответственны за межмолекулярное узнавание.

1.2. Иерархия белковой структуры.

Согласно центральной догме структурной биологии полное понимание функционального аспекта белка может быть достигнуто, только через исследование его пространственной структуры, которая полностью закодирована в его аминокислотной последовательности [22]. В современной литературе по структурной биологии белков, для лучшего понимание взаимосвязи комплексности их структурного аспекта часто приводится простой пример- известный конструктор Lego [28]. В последнем случае, относительно небольшое количество различающихся блоков используется для строительства функционально-различных структур (например, домом, кораблей и автомобилей) . При этом, все исходные строительные блоки Lego состоят из одного материала, но имеют различную форму. В итоге, форма каждого отдельного блока влияет на форму окончательной структуры, ограничивая при этом общее количество блоков другого типа, с которыми она может быть объединена. Таким образом, окончательная комплексность собранной структуры пропорциональна исходному количеству типов строительных блоков. Кроме того, если предположить, что каждая построенная структура будет обладать уникальной функцией (например, дом- для проживания, машина- для езды, а корабль- для плавания), то очевидна корреляция комплексности структуры с её функцией. Из данного примера может сложиться

впечатление, что ряд различных, структур может быть использован для осуществления схожих функцией, и таким образом, степень структурной комплексности не коррелирует с функциональным многообразием. Тем не менее, хотя различные структуры могут выполнять сходную общую функцию, это не означает, что они делают это абсолютно идентичным образом. Например, структуры автомобилей и кораблей могут выполнять общую функцию передвижения. Однако, в то время, как машина используется для передвижения на суше, корабль- плавает по воде. Таким образом, на данном простом примере становится очевидной взаимосвязь структуры и функции.

Подобно структурам, построенным из Lego, белки также являются полимерами, состоящими из ограниченного набора основных строительных блоков, органических аминокислот. В наиболее общем плане, белок может быть представлен линейной последовательностью, состоящей из нескольких сотен аминокислот. Типичный белок содержит только 20 основных аминокислот, найденных в большинстве бактерий, растений и животных. Данные 20 исходных "строительных блоков" обладают различными физико-химическими свойствами, обусловленных их атомарным строением. В результате, каждой аминокислоте характерен специфический размер, форма, величина заряда, а так же ряд иных свойств. Подобная гетерогенность данных молекул способствует их комбинации в линейную последовательность, самопроизвольно приобретающую в растворе уникальную пространственную структуру. Данная окончательная структура зависит как от взаимодействий между отдельными аминокислотными остатками, так и от взаимодействий с растворителем. В итоге, изменение свойств растворителя, например его полярность, рН, либо концентрация ионов непосредственно будет отражаться и на растворимости белка. Наконец, как тип исходных аминокислот, так и их уникальный порядок в полипептидной цепи определяет уникальность пространственной структуры каждого белка. Это связано с тем, что специфическая аминокислотная последовательность создает уникальную суперпозицию сил притяжения и отталкивания между различными аминокислотами. Последнее приводит к возникновению уникальной пространственной архитектуры. Наконец, поскольку каждая позиция вдоль полипептидной цепи может быть представлена одной из 20 исходных аминокислот, очевидно, что последовательность длинной в N звеньев, может быть представлена N20 вариантами. Таким образом, белки обладают сложпоустроенпой структурой, благодаря большому количеству возможных путей комбинирования их исходных строительных блоков. Кроме того, уникальная пространственная структура белка непосредственно определяет его функцию. Следовательно, белки, обладающие

схожими, но не идентичными пространственными структурами обычно выполняют различные биологические функции. Последнее утверждение подтверждается многочисленными исследованиями, проведенными на протяжении минувшего столетия, среди которых, хотелось бы выделить результаты работ трех выдающихся биохимиков. В первую очередь, Эмиль Фишер в 1894 году выдвинул предположение, что активность ферментов определяется их пространственной комплементарностыо, по отношению к их естественным субстратам [29]. Другой исследователь Лайнус Полинг, в ходе исследования денатурации белка, наблюдал потерю ферментативной активности, под влиянием экстремальных внешних условий (например, резких изменений температуры, рН, концентрации соли итп) [30]. В итоге, на основании подобных наблюдений, Полинг и его коллега Мирский пришли к выводу, что потеря активности ферментов происходит в результате изменений, происходящих на уровне их пространственных структур. Наконец, благодаря работам Кристиана Анфинсена, по исследованию денатурации рибонуклеазы, данные предположения были впоследствии подтверждены экспериментально [31].

Современные представления относительно пространственной организации белков были достигнуты, в первую очередь, благодаря развитию метода рентген-кристаллографии. В 1960 году, английский биохимик Джон Кендрыо использовал метод дифракции рентгеновских лучей для получения "статичных снимков" водорастворимого белка миоглобина с разрешением в 2 А [32]. Таким образом, Кендрыо стал первым исследователем, определившим пространственную структуру белка. Несколько позже, Макс Перутц, коллега Кендрыо при университете Кэмбриджа, получил пространственную структуру для более сложного белка гемоглобина [33]. За свои заслуги, в 1962 году, оба исследователя были удостоены нобелевской премии по химии. Дальнейшие исследования различных белков, показали, что данные макромолекулы обладают сложной иерархической структурной [21]. Первый уровень, получивший название первичной структуры, представляет собой упорядоченную последовательность аминокислот, образующих белковую цепь. На следующем уровне, отдельные сегменты, имеют тенденцию сворачиваться строго определенным образом, за счет образования специфических водородных связей главного остова полипептидной цепи. Это приводит к формированию спиралей, складок, петель, а так же прочих несложных пространственных структур. Совокупность данных "вторичных элементов" образует следующий уровень, получивший название вторичной структуры. В структурном плане, подобные элементы характеризуются 6лочешм расположением, а так же (за исключением петель) протяженностью вдоль одной оси полипептидной цепи. На

основании подобных стереохимических правил, принято отдельно выделять дополнительный структурный под-уровень, получивший название супер-вторичной структуры. Полипептидная цепь белков имеет тенденцию к дальнейшему сворачиванию в более компактную, трёхмерную структуру. Этот третий уровень структурной организации белка (третичная структура), является его наиболее стабильной формой, оптимизирующей совокупность сил притяжения между различными аминокислотами полипептидной цепи. Именно третичная (нативная) структура, является активной формой белка, а её разрушение приводит к полной утрате биологических функций. Наконец, некоторые белки состоят из нескольких цепей, являясь олигомерами. В этом случае, каждая из цепей сворачивается отдельно в третичную структуру, после чего происходит их ассоциация, с образованием четвертичной структуры.

1.3. Структурно-динамические особенности белка (двугранные углы).

Одно из важнейших структурных свойств белка, определяющих его динамическое поведение, заложено в двухгранных углах, получивших название ф и у. Точные значения данной пары двугранных углов характеризуют конформацию главного остова для каждого аминокислотного остатка полипептидной цепи. В структурном плане, по углу ф принято описывать вращения по одинарной связи между атомами СЫ, N1 и СА1, СМ , а по углу \|/ -между атомами СА1 и СИ, N1+1 (Рис. 1). Кроме того, принято так же выделять углы характеризующие вращения боковых групп, относительно атомов главного остова. Точное количество данных углов зависит от природы боковой группы конкретного аминокислотного остатка.

Наблюдаемые крупномасштабные движения в белках являются следствием согласованных вращений по их двугранным углам ф и у. С другой стороны, более высокоамплитудные колебания боковых групп обычно связаны с вращением по углу В связи с этим, точные значения углов ф и \)/ распределены не случайно, а скорее кластеризованы в специфических участках на картах Рамачандрана. Эти схемы представляют собой графики, на которых по одной оси отмечены величины для ф, а по другой- для у. В итоге, специфическое распределение, наблюдаемое на картах Рамачандрана, зависит от специфического типа аминокислотного остатка, а так же от типа элемента вторичной структуры, в которой он входит. Наконец, для углов % так же удалось получить схожее

"кластерное" распределение. Например, в работах Ефимова на примере сойес1-соП, а так же других белков, было показано, что внутриспиральные гидрофобные, полярные, а так же ваан-дер-вальсовые взаимодействия способствуют "выдавливанию" боковых цепей из поверхности контакта соседних а-спиралей [34]. Последнее существенно ограничивает возможную степень свободы отдельных ротамерных изомеров, а так же способствует сближению главных остовов соседних а-спиралей.

А ~

Рис. 1. Схема расположения двугранных углов на уровне первичной последовательности белка. На рисунках В и С показано вращение по углам ф и V)/, соответственно.

1.4. Динамические особенности белков.

Исследуя рентгеновские структуры белков, представляющие по сути их "усредненные-по-времени" конформации, может сложиться впечатление, что макромолекулы обладают крайне жесткой пространственной организацией. Тем не менее, подобно тому, как статичный снимок любого физического объекта не передаёт его функциональные особенности, кристаллографическая структура так же не отражает функциональность макромолекул. Таким образом, полное понимание функции белков может быть достигнуто только через исследование структурной динамики, которая является неотъемлемым свойством их пространственной архитектуры [35, 36]. Идея взаимосвязи структурной динамики белка с его функцией не является новой. Первые подобные представления были получены в группе Шелмана, в 1959 году [37]. В этой работе, методом дейтерообмена было показана взаимосвязь структурной гибкости активных центров ферментов с их каталитическим актом. Позднее, в работе Клотца было показано, что белки с одинаковой первичной структурой могли существовать в ансамблях конформационных подсостояний, являющихся динамическими системами [38]. Наконец, в исследовании Вебера было показано, что связывание различных лигандов стабилизировало отдельные подсостояния белка, существенно ограничивая его конформационный перебор [39]. Наряду с этим, первые

теоретические исследования белковой динамики были проведены в середине 70х годов. Например, в работах МакКаммона и Карплюса методом молекулярной динамики исследовалось функционирование ферментов в растворе [40, 41] . В результате удалось наблюдать динамическое поведение этих белков, на уровне пространственного расположения аминокислот их активного центра. В функциональном плане, это обуславливало специфичность ферментов относительно различных субстратов. Таким образом, авторами был сделан вывод, что подобное структурное поведение является неотъемлемым свойством пространственной архитектуры макромолекул, носящее спонтанный характер. При этом, внешнии факторы (например, связывание лигандов, либо пост-трансляционные модификации) оказывают влияние на общий характер подобного динамического распределения, стабилизируя специфические подсостояния (конформации) белка. Подобное понимание спонтанной динамики белка, "направляемой" внешними факторами, позднее было развито в работах Фраунфелдера [42, 43]. В настоящее время это является современной концепцией, связывающей структуру и функцию макромолекул, через их динамику [40, 44, 45].

Исторически, функциональное поведение белка принято описывать в рамках трёх различных моделей. Согласно наиболее устаревшей концепции Эмиля Фишера "Ключа к замку", активный центр белка подобен неподвижному углублению, которое обладает жесткой комплиментарностыо к специфическим субстратам [46]. Подобное представление хорошо согласуется со статичными кристаллографическими снимками белков, однако не дает никакого объяснения функциональным путям движения макромолекул в их конформационном пространстве. Координальная смена парадигмы произошла в середине XX века, благодаря появлению теории "Индуцированного соответствия" Даниеля Кошланда [47]. Эта концепция была основана на создании комплиментарности активного центра фермента (усилению специфичности), по отношению к субстрату, при связывании последнего. Впоследствии, основные постулаты данной теории удалось применить и к другим белкам, рассматривая любые структурные изменения в этих макромолекулах, как следствие связывания их лигандов. Дальнейшее развитие теории индуцированного соответствие было связано с работами Лайнуса Полинга 1926 года. Этим исследователем было выдвинуто предположение, что антитела могли принимать различные конфигурации, характеризующиеся близкими значениями свободной энергии [48]. Подобное предположение означало, что белки могли претерпевать конформационные переходы в отсутствии связанного лиганда. Стоит отметить, что идея Полинга не была общепринятой вплоть до 1965

года, когда Moho с соавторами, используя постулаты этой концепции, выдвинули собственную модель для описания функционирования белков [13, 49]. Согласно новой концепции, получившей название теории "пред-существующего равновесия" или модели Моно-Вайнема-Шанже (МВШ), для ano формы белка характерен непрерывный перебор между её различными подсостояниями (конформерами). При этом, связывание субстрата приводит к стабилизации одной из данных конформаций, смещая химическое равновесие в её сторону. В настоящее время, экспериментальные и теоретические данные свидетельствуют в пользу того, что как "индуцированное соответствие", так и "пред-существующее равновесие" сосуществуют в белках. Примером, функционального поведения по типу МВШ в мембранных рецепторах являются гормон-активируемые рецепторы (например, Р-адренергический). В последнем случае, связывание различных лигандов стабилизирует различные конформации рецептора, что отражается на специфичности его сигнальных путей. С другой стороны, типичным примером индуцированного соответствия, является фоторецептор родопсин, активация которого носит более линейный характер. Кроме того, функциональное поведение по Кошланду так же имеет место и в гормон-активируемых рецепторах, несколько видоизменяя общий характер конформационного перебора, характерный для модели МВШ. Подобная комбинированная модель, получившая названия "популяционного сдвига в рамках конформационного отбора", в настоящее время общепринята для описания функциональных свойств многих белков [50].

Временную шкалу явлений, связанных со структурными изменениями в белках, условно делят на несколько порядков (Табл.1) [44, 51]. При этом, в группу наиболее "быстрых" явлений относятся локальные колебания по отдельным ковалентным связям, а так же вращения боковых групп. Обычно данные события уже можно наблюдать в пико-наносекундном интервале. С другой стороны, на более "длительных" временах (начиная от миллисекунд), наблюдаются движения отдельных белковых доменов, диссоциация белок-лигандных комплексов, а так же сворачивание белка.

Табл. 1. Основные временные порядки белковой динамикн.

Тип движения Пример функции Характерные времена Характер ные амплитуд ы

Локальные движения Атомные колебания; . Движения боковых групп; Взаимодействие лиганда с активным центром белка; Фемптосекунды- пикосекуды (10"12-10"15 сек) <1 А

Срсдисмасштабныс движения Движения петель; Движение отдельных элементов вторичной структуры; Адаптация активного центра; Специфическое связывание; Наносекунды-микросекунды (10"9-10"6 сек) 1-5 А

Крупномасштабные движения Движения доменов; Движения субъединиц; Движение по типу "Hingebending"; Аллостерические переходы; Микросекунды-миллисекунды (Ю'МО'3 сек) 5-10 А

Глобальные движения Переход спираль-клубок; Сворачивание\разворачивание белковой глобулы; Ассоциация субъединиц; Связывание IDP белков со специфическими мишенями; Денатурация белка; Миллисекунды-минуты (10-3-103 сек) > 10А

Важной особенностью биомолекулярных движений является то, что различные типы движений взаимосвязаны друг с другом. Например, крупномасштабным конформационным переходам обычно предшествуют смещения отдельных а-спиралей. Предпосылкой подобных среднемасштабных движений, в свою очередь, являются согласованные колебания отдельных боковых групп. Наконец, подобные флуктуации не происходят без более быстрых, кооперативных атомных колебаний. Таким образом, более локальные флуктуации играют роль "смазочной жидкости", позволяя целой конструкции макромолекулы двигаться [52]. В этой связи, на физическом восприятии молекула белка подобна армированной капле, с жестким каркасом главного остова и более гибкими боковыми цепями на переферии [53]. Благодаря подобной иерархичности, общее количество возможных подсостояний такой системы чрезвычайно велико и её динамические свойства могут быть описаны только статистически. Согласно определению Больцмана, вероятность перехода белка в определенное подсостояние имеет экспонециальную зависимость от его свободной энергии (ДО). Таким образом, белок проводит большее время в подсостояниях, обладающих наименьшей свободной энергией. В отсутствии внешних сил, главным "двигателем" подобного конформационного перебора является тепловая энергия окружающей среды, величина которой, при ненулевой температуре, составляет порядка кТ (0.6 ккал\моль при комнатной температуре). При этом, поглощенное тепло превращается в кинетическую энергию атомных движений, а так же вибраций ковалентных связей. Структурную динамику, являющуюся результатом подобного энергообмена, можно уже наблюдать на пикосекундных временах. С другой стороны, поскольку отдельные атомы макромолекулы связаны между собой ковалентными взаимодействиями, подобные движения носят кооперативный характер.

Таким образом, происходит усиление локальных колебаний отдельных атомов в более крупномасштабные конформационные движения. В работах Элбера и Карплюса методом МД было показано, что подобный спонтанный перебор "около-нативных" конформаций миоглобина при комнатной температуре происходил между его подсостояниями, отличающимися по энергии не более чем на 0.6 ккал\моль [54, 55]. Таким образом, поверхность потенциальной энергии миоглобина включала большое количество локальных минимумов, в рамках единого глобального (нативного) минимума.

1.5. Описание 7-ТМрецепторов, исследованных в настоящей работе.

Родопсин является пигментом оболочки зрительной сетчатки, отвественным за формирование фоторецепторных клеток, а так же за первичные процессы светового восприятия [20]. Этот фоторецептор обладает исключительной чувствительностью к свету, обеспечивая живые организмы зрением, даже в условиях с бедным освещением. Известно, что поглощение светового кванта приводит к фотообесцвечиванию родопсина, сопровождаясь его иннактивацией. Последнее связано с изомеризацией хромофора 11-цис-ретиналя в полностыо-транс форму. Подобные внутримолекулярные изменения в последствии передаются на цитоплазматическую поверхность рецептора, ответственную за связывание с а субъединицей Трансдуцина (вО. Активация этого С-белка, в свою очередь, приводит к активации эффектора фосфодиэстеразы, действие которой вызывает снижение концентрации внутриклеточного цАМФ. Последнее приводит к закрытию специфических Иа+ и Са2+ каналов, вызывая гиперполяризацию мембраны клеток палочек, а так же остановку выброса нейромедиатора глутамата. Снижение концентрации ионов вызывает активацию гуанилатциклазы, что влечет за собой быстрый подъем уровня цГМФ, приводящий вновь к открытию и Са2+ каналов. Спустя короткое время, а-субьединица трансдуцина инактивируется за счет медленного гидролиза связанного ГТФ и вновь ассоциируется с комплексом р, у-субъедшшц. Наконец, инактивированный родопсин распадается на опсин и полностью /иргшс-ретиналь, который изомеризуется в г/г<с-ретиналь под действием ретиналь-изомеразы. Стоит отметить, что родопсин является единственным 7-ТМ рецептором, для которого специфический лиганд является одновременно обратным и полным агонистом, в зависимости от наличия светового освящения. Кроме того, на текущий момент только для родопсина известны его кристаллографические структуры,

соответствующие различным переходным (интермедиатным) подсостояниям. При этом, только одно из данных подсостояний (называемое Мета-Н) представляет собой фотоактивированную форму родопсина, способную активировать Трансдуцин.

Адренергическпе рецепторы относятся к классу метаботропных ОРСПэ, являясь мишенями производных катехоламина, в частности норадреналина и адреналина [56]. В настоящее время известно три подкласса Р-адренорецепторов, локализованных чаще всего на мембранах клеток гладкой мускулатуры. В частности, этот тип рецепторов преобладает на гладких мышцах бронхиол, а так же артериях скелетных мышц. Кроме этого, данные рецепторы локализуются на клетках печени, адипоцитах, слюнных желез, а так же на мембране тучных клеток, лимфоцитов и тромбоцитов. Известно, что сигнализация через адренорецепторы приводит к симпатическому ответу, который проявляется в увеличении частоты сердечных сокращений, расширении зрачков, мобилизации энергии, а так же отводу кровотока от внутренних органов, по направлению к поперечнополосатой мускулатуре. На молекулярном уровне, активация данных рецепторов связана с передачей сигнала, через специфический вэ (стимуляторный) белок. Взаимодействие этого трансдыосера с рецептором приводит к его распаду на а-субъединицу, которая осуществляет обмен ГДФ на ГТФ, а так же Р и у субъединицы, обладающие собственной активностью. На следующем этапе, активированная а -субъединица вэ белка взаимодействует с мембранным ферментом аденилатциклазой. Данный эффектор катализирует превращение АТФ в цАМФ, выполняющего роль вторичного мессенджера при активации протеинкиназы А (цАМФ-зависимой А-киназы). Наконец, активированные каталитические субъединицы протеинкиназы осуществляют фосфорилирование различных белков-субстратов. Недавно стало так же известно, что при некоторых условиях данные рецепторы могут связываться и с рядом других в-белков, а так же опосредовать передачу сигнала через другие трансдыосеры ( например, через Р-аррестины). Таким образом, данный класс мембранных рецепторов удивителен своим функциональным многообразием специфических сигнальных путей ("множественной эффективностью").

Адепозпповые рецепторы принадлежат к отдельному подклассу пуринергических вРСЯ, для которых аденозин является эндогенным лигандом [57]. На основании различной селективности к аналогам аденозина, а также различий в биохимических и фармакологических свойств, аденозиновые рецепторы делят на четыре подтипа (А1, Ага, Агь и Аз) [58]. Эти рецепторы широко представлены в разных типах тканей, осуществляя регуляциию целого ряда биологических процессов. Известно, что действие белков из А1 и

Аза подклассов связано с работой ссрдца, выполняя регуляцию миокардиального потребления кислорода, а так же коронарного кровяного потока. Наряду с этим, Агд рецептор имеет особое значение в противовоспалительных процессах. Наконец, оба подтипа данных рецепторов так же выполняют ключевую роль на уровне головного мозга, регулируя высвобождение специфических нейтротрансмиттеров, таких как дофамин и глутамат. Известно, что активация А1- и Аз-рецепторов вызывает снижение уровня цАМФ , в то время, как активация Ага- и Агь-рецепторов, напротив, приводит к его увеличению. Последнее, как и в случае Р-адренорецепторов, связано с типом С-белка, посредством которого осуществляется передача сигнала. Кроме того, стимуляция А1-рецепторов вызывает активацию калиевых и деактивацию кальциевых каналов, а стимуляция Ага-рецепторов приводит к ингибированию функциональной активности Б2-дофаминовых рецепторов. Последнее имеет важное значение в развитии неврологических и психических заболеваний. Таким образом, лиганды аденозиновых рецепторов находят широкое применение в фармакологии и медицине, что в свою очередь делает крайне важной и актуальной задачу изучения пространственной структуры данных белков, а так же поиска их новых, более эффективных и селективных лигандов.

1.6. Пространственная архитектура 7-ТМрецепторов.

Детальные представления об организации пространственной структуры вРСИ. были получены относительно недавно, прежде всего благодаря методу рентген кристаллографии [59]. Для данных белков был показан ряд общих структурных особенностей [60]. Прежде всего характерна высокая степень сходства в организации пространственной структуры, при низкой (20-30%) гомологии по аминокислотной последовательности. Наиболее структурно-консервативный трансмембранный домен данных белков состоит из семи а-спиралей (ТМ1-ТМ7), расположенных против часовой стрелки, если смотреть со стороны внутриклеточного пространства. Эти а-спирали объединены между собой в "змеевидной" манере, с помощью петель. Результаты спектроскопических исследования бактериородопсина (еще одного 7-ТМ белка, не являющегося, однако, СРС11), свидетельствуют в пользу того, что общая архитектура а-спирального пучка 7-ТМ рецепторов неслучайна [61]. В этой работе было показано, что именно семь а-спиралей является минимальным числом для создания пространственного окружения лиганда. На рисунке 2 показана пространственная топология

7-ТМ рецепторов, на примере родопсина млекопитающих, а ниже приведено подробное описание каждого домена этих белков.

Рис. 2. Слева показана пространственная топология зрительного рецептора родопсина млекопитающих (картинка сделана на основании пространственной структуры рс!Ь ¡с! ^гш). Градиент цвета а-спиралей белка соответствует ходу полипептидной цепи от N ( более холодные цвета), к С- концу. На картинки подписана области внеклеточных (ЕХС), а так же внутриклеточных (1С) петель рецептора (показаны синим цветом).. Лиганд ретиналь, показанный в виде шаровой модели, выделен овалом.Справа- показана пространственная топология 7-ТМ участка со стороны внутриклеточного пространства. На этом рисунке толщина зеленых линий соответствует среднему числу не-ковалентных контактов между отдельными а-спиралями.

1- Внеклеточный участок.

Показано, что наибольшие структурные отличия 7-ТМ рецепторах локализованы в их внеклеточных петлях [60]. В отличие от фотоактивируемого родопсина, все гормон-активируемые рецепторы содержат в данной области специфические аминокислотные последовательности (мотивы), ответственные за первичное узнавание и связывание специфических лигандов [62, 63]. Внеклеточный участок родопсина характеризуется достаточно компактной, жесткой пространственной структурой. Подобная архитектура способствует изоляции ретиналь-связывающей области фоторецептора от молекул растворителя. При этом, наиболее ключевым значением обладает ВП2, образующая короткую Р-шпильку. Кроме того, подобный жесткий внеклеточный сегмент фоторецептора снижает общую подвижность внеклеточных концов его ТМ спиралей. С другой стороны, в случае Р-адренорецептора наблюдается противоположная картина, с более доступной для

1С 1оор III

растворителя, структурно гибкой внеклеточной областью. В частности, из анализа кристаллографических структур данного белка видно, что его ВПЗ не взаимодействует с прочими внеклеточными участками, а ВП2 образует короткую а-спираль. Наконец, во всех 7-ТМ рецепторах показано наличие нескольких высоко-консервативных дисульфидных связей, дополнительно стабилизирующих конформацию ВП2 этих белков. Показано, что пространственная жесткость этого участка необходима для избирательности рецепторов, по отношению к различным лигандам [63].

2- Трансмембранный- домен и ортостерический лиганд-связывающий карман.

Семи-трансмембранный домен родопсин-подобных рецепторов наиболее структурно консервативен. Известно, что для различных рецепторов, СКО между их отдельными а-спиралями, не превышает 1.5 А. При этом, считается, что третяя а-спираль выполняет наиболее ключевую роль, ответственную за стабилизацию всего а-спирального пучка этих белков (рис. 2). С другой стороны, для У-УИ а спиралей, напротив свойственна повышенная доля структурной подвижности. Считается, что колебания в их цитоплазматических участках приводят к созданию области, комплиментарной для связывания О-белка. Из анализа пространственных структур родопсин-подобных рецепторов было установлено наличие трёх высоко-конервативных пролинов в их У-УН спиралях. В мембранном окружении эти остатки выполняют роль своеобразных "шарниров", обеспечивая тем самым гибкость внеклеточных участков отдельных а-спиралей рецептора. Кроме этого, в рамках ТМ домена родопсин-подобных рецепторов, был обнаружен целый ряд высококонсервативных мотивов ("микропереключателей"), так же непосредственно связанных с функциональной динамикой этих белков [64, 65]. С другой стороны, расположение ортостерического лиганд-связывающего кармана значительно варьирует среди различных СРСЛ. Например, локализация этого участка в родопсине, а так же обоих классах Р-адренорецепторов достаточно схожа [60, 64]. В этих рецепторах, лиганды связываются в цитоплазматической области, между их ТМ5-ТМ7 доменами. С другой стороны, лиганд-связывающий карман аденозинового рецептора локализован несколько иначе, по сравнению с родопсином и р-адренорецепторами. В последнем случае, этот участок немного сдвинут по направлению к ВП2. Таким образом, лиганд распологается в этой области более перпендикулярно оносительно плоскости мембраны, с более сильным углублением во внеклеточную область рецептора, доступную растворителю.

3- Цитоплазматический участок

Цитоплазматический домен родопсин-подобных рецепторов представлен тремя внутриклеточными петлями (ВНП1- ВНПЗ), а так же длинным С-концевым сегментом [60]. Известно, что ВНП2, а так же ВНПЗ ответственны за взаимодействие со специфическими в-белками, в то время как С-конец содержит потенциальные сайты фосфорилирования для специфических протеин-киназ. Впоследствии, фосфорилированный С-конец может связываться с р-аррестинами, опосредующими либо сигнализацию по в-белок-независимым путям, либо десенситизации рецептора [66]. Таким образом, повышенная гибкость внутриклеточного участка лиганд-активируемых рецепторов связана с их "функциональной-избирательностыо", по отношению к различным трансдыоссерам.

1.7. Копформациоппая динамика 7-ТМрецепторов.

Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что передача сигнала может происходить за счет конформационных изменений в молекуле рецептора [6]. До недавнего времени, основные представления о функционировании мебранных рецепторов были получены на основании исследований фоторецептора родопсина млекопитающих [20]. Известно, что поглощение светового кванта родопсином приводит к фотоизомеризации его хромофора 11-цис-ретиналя в полностыо-транс форму [67]. Эта реакция является основной предпосылкой более крупномасштабных структурных изменений во внутриклеточной области отдельных трансмембранных (ТМ) спиралей фоторецептора. Методом рентген кристаллографии расшифровано более двух десятков структур этого белка, которые соответствуют различным стадиям его фотоактивации (фотоинтермедиатам) [68]. Таким образом, исследуя данное конформационное разнообразие, можно попытаться оценить взаимосвязь динамики, наблюдаемой в различных экспериментальных структурах (например, по степени движения отдельных а-спиралей), а так же функции этого белка (передачи зрительного сигнала). Благодаря появлению новых экспериментальных структур этих белков, стало известно, что активация всех родопсин-подобных рецепторов, в структурном плане, происходит практически одинаково [69]. Первые представления о характере подобных внутримолекулярных движений были получены из биохимических и биофизических

исследований. Например, в работах Хуббелля и Корана методами спектроскопии ЭПР, а так же цистеинового спин-меченья было показано, что движение шестой спирали (ТМ6) родопсина было связано с его фотоактивацией [70]. В последствии, детальные подробности этого явления для различных 7-ТМ рецепторов удалось получить, используя флуоресцентные методы, а так же ИК спектроскопию и ЯМР [71-73]. Дальнейшие исследования показали, что конформационные движения цитоплазматических участков У-УП спиралей рецептора в последствии распространяются на их внутриклеточные петли [74, 75]. Подобное структурное поведение, связывающее динамику внеклеточной и внутриклеточной областей, хорошо вписывается в рамки модели "множественной эффективности" [76]. На рисунке 3 показан пример, отражающий основные принципы этой концепции. Центральной идеей является то, что связывание различных лигандов стабилизирует различные подсостояния (конформации) рецептора. В результате, это приводит к активации различных в-белков, либо же к передачи сигнала по в-белок независимым путям [77]. С другой стороны, связывание других лигандов может ингибировать передачу сигнала, вызывая потерю чувствительности (десенситизацию) рецептора [78].

у 1пЬ-асе11и1аг

/ \ \

в!

Бз^дпаШпд

С|-31дпа1Нпд

Веи-аггезЬп 51дпаШпд

Рис. 3. Схема концепции "множественной-эффективности", служащей для описания функциональных аспектов 7-ТМ рецепторов, на примере Р-2-адренорецептора. В кружки выделены области молекулы рецептора с наиболее выраженной структурной динамикой. В нижней части рисунка показаны возможные пути передачи сигнала.

В настоящее время существует несколько теоретических моделей для описывания "множественной эффективности" 7-ТМ рецепторов. В основу этих моделей лежит теория энергетической поверхности, изначально предложенная для описания сворачивания белков [79, 80]. Согласно этой концепции, каждому конформационному подсостоянию белка характерно определенное значение свободной энергии. При этом, наиболее устойчивые конформации характеризуются минимальным значением этой величины. Подобная иерархичная классификация конформационных подсостояний впервые использовалась при исследовании функционирования моглобина [43]. На рисунке 4А показан пример идеализированного энергетического ландшафта, состоящего из гладких холмов и впадин. Подобное представление в большей степени соответствует дву-стадийному описанию функционирования белка. Таким образом, два минимума свободной энергии соответствуют неактивной (К) и активной (Л*) конформациям рецептора. При этом, форма каждой впадины может быть преобразована, вследствии влияния внешних факторов, например, связывания лигандов, О-белков, точечных мутаций, либо изменения окружающих условий. Стоит отметить, что подобное представление энергетической поверхности является достаточно упрощенной моделью, не подходящей для описания функционирования вРСЯ. На рисунке 4В показан пример другой поверхности, более подходящей для описания множественной эффективности 7-ТМ рецепторов. В последнем случае неровная поверхность каждой впадины включает несколько энергетических подсостояний, с близкими значениями свободной энергии. Таким образом, совокупность подсостояний рецептора можно разделить на несколько ярусов, показаных как Т1ег-0 и Т1ег-1 на рисунке 4В.

Рис. 4. Использование поверхности свободной энергии для описания конформационной динамики белков. Рисунок взят из работы [11].

Одна из подобных моделей, связывающей "множественную эффективность" 7-ТМ рецепторов с их конформационной динамикой через поверхность свободной энергии, была

предложена в группах Кобилки и Вайдехи [81, 82]. В этих работах функциональный рецептор представлен ансамблем подсостояний (конформеров), между которыми происходит непрерывный перебор. При этом, структурные процессы, сопровождающие активацию рецептора (переход из одного подсостояния в другое), наглядно изображается в виде фазовых диаграмм. Эти графики являются проециями конформационных изменений рецептора на плоскость его энергетического ландшафта, форма которого зависит от динамики внутримолекулярных химических связей. Таким образом, наиболее термодинамически допустимые конформации (обладающие балансом между внутренней энергией и конформационной энтропией) должны преобладать в подобном ансамбле. Важно, что основные постулаты подобной теоритической модели нашли подтвеждения в исследованиях Кенакина [16]. В цитируемой работе, на основании анализа экспериментальных данных, автором была показана взаимосвязь между эффективностью 7-ТМ рецепторов, а так же ансамблями их конформеров. Таким образом, совокупность этих данных указывает на рациональность исследования функциональных аспектов лиганд-активируемых рецепторов, с точки зрения их конформационной динамики.

1.8. Развитие основных представлений о функционировании 7-ТМ рецепторов.

Известно, что на динамическое поведение 7-ТМ рецепторов значительно влияет широкий спектр внешних факторов [17, 83]. Например, благодаря гибкой пространственной архитектуре, рецептор способен взаимодействовать с различными клеточными партнерами [17, 84]. В связи с этим, выделяют два ключевых свойства лигандов: их эффективность, отражающую способность стабилизировать различные конформации рецептора, а так же аффиность, которая характеризует сродство лиганда к рецептору. В зависимости от конечной эффективности лиганды 7-ТМ рецепторов условно делятся на несколько под-классов [66]. Например, обратные агонисты ингибируют базовую активность рецептора, в то время как полные агонисты, напротив, опосредуют её максимальный уровень. С другой стороны, связывание частичных агонистов приводит лишь к субмаксимальной активности рецептора. Наконец, нейтральные антагонисты вообще не оказывают влияния на базовую активность рецептора, стерически блокируя связывание других лигандов.

Существующие экспериментальные данные указывают на то, что присутствие молекулы агониста в лиганд-связывающем кармане рецептора является необходимым, но

недостаточным условием для его активации. Таким образом, связывание агониста лишь частично способствовует стабилизации активного подсостояния рецептора [69]. Экспериментальным подтверждением этого факта является полученная в кристалле структура р-2-адренергического рецептора, в комплексе с синтетическим агонистом (рёЬ ¡<1 ЗрсЬ). В этом случае конформация белка соответствовала его неактивному подсостоянию, как и в случае его структур, закристаллизованных с антагонистами [85]. Спустя некоторое время, удалось закристаллизовать и активную форму данного рецептора (рс!Ь Зр(^), в комплексе с а-субъединицей вв-белка [86]. Совокупность этих экспериментальных данных находится в хорошем соответствии с моделью "тройственного комплекса", предложенной Робертом Левковицем [76, 87] . Согласно этой концепции, активацию рецептора можно интерпретировать как аллостерический процесс, по аналогии с фермент-субстратными комплексами. Традиционно, подобные процессы описываются при помощи дву-стадийных моделей, в рамках которых специфические лиганды смещают равновесие между двумя различными конформациями белка-мишени. Одна из первых подобных моделей была предложена Катцем (рис. 5а).

a Katz two-state model

L + R

LR

LR*

b Simple ternary complex model

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Новиков, Глеб Вадимович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. Методом главных компонент были получены распределения кристаллографических структур фермента SRC-тирозин киназы и кальций-связывающего белка кальмодулина, в соответствии с их функциональными подсостояниями. Установлена взаимосвязь между функционально-значимыми движениями исследуемых белков с подвижностью их отдельных a-спиралей. Таким образом, удалось связать особенности конформационной подвижности исследованных макромолекул с их биологическими функциями

2. Методом главных компонент были получены проекции кристаллографических структур родопсин-подобных рецепторов на плоскость первых трёх главных компонент этих белков. Из полученного распределения были установлены следующие закономерности. Флуктуации, наблюдаемые по первой главной компоненте, были наиболее высокоамплитудными при наименьшей степени коллективности. По этой низкочастотной моде все структуры рецепторов группировались в соответствии с движением цитоплазматической области их VI a-спирали. Флуктуации, наблюдаемые по второй главной компоненте, характеризовались средней степенью подвижности, при наименьшей коллективности. По этой моде наблюдалось движение третьей внутриклеточной петли. Флуктуации третьей главной компоненты были наименее амплитудными, при наибольшей степени коллективности. По этой моде экспериментальные структуры группировались в соответствии с согласованными колебаниями внеклеточной области (в особенности, второй и третьей внеклеточных петель). Для всех рецепторов по ГК-3 была установлена наименьшая изменчивость в рамках кластера активных экспериментальных структур, по сравнению с их неактивными формами.

3. Методом молекулярной динамики в потенциальном поле GROMOS удалось наблюдать спонтанную активацию аденозинового рецептора. Во всех случаях движение рецептора по направлению к активному подсостоянию сопровождалось подвижностью цитоплазматических концов его V и VI a-спиралей Подобная конститутивная активность рецептора непосредственно связана с его конформационной динамикой, природа которой предопределена на уровне его пространственной архитектуры, а основная движущая сила- тепловые флуктуации.

4. Было показано, что конформационная динамика родопсин-подобных рецепторов непосредственно связана с подвижностью их отдельных высоко-консервативных остатков. Методом молекулярной динамики было показано, что обратимая изомеризация индольной группы остатка Тгр-246 коррелировала по времени с дестабилизацией ионного замка (солевого мостика между Arg-102 и Glu-228). Кроме этого, стабилизация "активной" конформации рецептора коррелировала со стабилизацией специфического подсостояние ионного-замка, в котором боковой радикал остатка Arg-102 взаимодействовал с боковой группой остатка Туг-288. Эти конформационно подвижные микро-домены являются основой внутреннего регуляторного механизма, стабилизирующего различные функциональные подсостояния лиганд-активируемых рецепторов.

5. Методом молекулярной динамики было исследовано влияние внешних факторов на конформационную динамику Р-2-адренорецептора. При анализе ano траектории этого белка удалось наблюдать несколько его функционально-значимых подсостояний. С другой стороны, связывание различных лигандов стабилизировало отдельные области конформационного пространства рецептора, включая более короткоживущие подсостояния его ano ансамбля. Таким образом, полный спектр функционально-значимых подсостояний лиганд-активируемых рецепторов предпопределен на уровне их пространственной архитектуры, а связывание лигандов стабилизирует отдельные подсостояния пред-существующего ансамбля.

БЛАГОДАРНОСТИ

В первую очередь, автору хотелось бы поблагодарить своего научного руководителя Сивожелезова Виктора Семеновича за оказанную помощь на всех этапах выполнения диссертационной работы. Кроме этого, автор выражает огромную благодарность Шайтану К.В. и Шайтану А.К. за многочисленные консультации, посвященные теории метода молекулярной динамики, а так же написании и публикации научных статей. Отдельная благодарность выражается Колесникову С.С. за проведение внутрилабораторных семинаров, посвященных вопросам внутриклеточной сигнализации, а так же Балабаеву Н.К. за любезно предоставленный доступ к вычислительному центру ИМПБ. Наконец, автор благодарит своих родителей, а так же друзей за поддержку, оказанную на протяжении проведения работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В работе проведено исследование структурной подвижности родопсин-подобных рецепторов, используя методы молекулярной динамики, в совокупности с биоинформатическим анализом экспериментальных данных. В частности, методом главных компонент удалось выделить отдельные коллективные степени свободы исследуемых белков, каждая из которых имеет уникальное функциональное значение. Наряду с этим, структурные движения лиганд-активируемых рецепторов, наблюдаемые в ходе вычислительных экспериментов, удалось связать с процессом спонтанной активации этих белков. Было показано, что конститутивная активность этих белков, регистрируемая in vivo, непосредственно связана с их динамической природой, предопределенной в некоторой степени на уровне пространственной архитектуры. Наконец, анализ полученных результатов позволил связать конформационные движения в рецепторах с подвижностью боковых групп их отдельных высоко-консервативных остатков. В последнем случае, была показана роль этих "микро-переключателей" как внутренних стабилизаторов отдельных функционально-значимых подсостояний родопсин-подобных рецепторов. Таким образом, были получены детальные представления о наиболее ключевых аспектах активации родопсин-рецепторов с точки зрения их конформационной динамики.

Показанная в работе структурная подвижность лиганд-активируемых рецепторов в литературе нередко сравнивается со своеобразным "конформационным хаосом". При этом, различные внешние факторы, например связывание лигандов, аллостерических модуляторов, а так же влияние специфического окружения (например, липидного состава мембраны, рН, либо концентрации электролитов), значительно ограничивают отдельные конформационные степени свободы, выделяя из них наиболее биологически-значимые. Таким образом, ансамбль возможных подсостояний этих белков предопределен на уровне их пространственной укладки, и отдельные конформации могут быть использованы клеткой, для осуществления специфических функций. Следовательно, функционально-значимая динамика данных макромолекул, наблюдаемая in vivo, может быть эволюционно отобранной посредством естественного отбора, действующего на уровне их пространственной архитектуры.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Новиков, Глеб Вадимович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hopkins A. L., Groom С. R. "The draggable genome" // Nature Reviews Drug Discovery -2002- 1,-pp. 727-730.

2. Vassilatis D. K., Hohmann J. G., Zeng H., Li F., Ranchalis J. E., Mortrud M. Т., Brown A., Rodriguez S. S., WellerJ. R„ Wright A. C. "The G protein-coupled receptor repertoires of human and mouse" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2003 - 100,- pp. 4903.

3. WettschureckN.. Offermanns S. "Mammalian G proteins and their cell type specific functions" // Physiological reviews - 2005 - 85,- pp. 1159-1204.

4. Congreve M., Marshall F. "The impact of GPCR structures on pharmacology and structure - based drug design" // Br J Pharmacol - 2010 - 159,-pp. 986-996.

5. Bosier В., Hermans E. "Versatility of GPCR recognition by drugs: from biological implications to therapeutic relevance" // Trends Pharmacol Sci - 2007 - 28,- pp. 438-446.

6. Park P. S., Lodowski D. Т., Palczewski K. "Activation of G protein-coupled receptors: beyond two-state models and tertiary conformational changes" // Annn Rev Phannacol Toxicol - 2008 - 48,- pp. 107-141.

7. YaoX. J., VelezRuiz G., Whorton M. R., Rasmussen S. G., DeVree В. Т., DeupiX., Sunahara R. K, Kobilka B. "The effect of ligand efficacy on the formation and stability of a GPCR-G protein complex" // Proc Natl Acad Sci USA - 2009 - 106,- pp. 9501-9506.

8. Kenakin T. "Agonist-receptor efficacy I: mechanisms of efficacy and receptor promiscuity" I I Trends Pharmacol Sci - 1995 - 16,- pp. 188-192.

9. Kenakin Т., Onaran O. "The ligand paradox between affinity and efficacy: can you be there and not make a difference?" // Trends Pharmacol Sci - 2002 - 23,- pp. 275-280.

10. Kobilka В. K, DeupiX. "Conformational complexity of G-protein-coupled receptors" // Trends Pharmacol Sci - 2007 - 28,- pp. 397-406.

11. Park P. S. H. "Ensemble of G protein-coupled receptor active states" // Current Medicinal Chemistry - 2012 - 19,- pp. 1146.

12. Canals M., Lane J. R., Wen A., Scammells P. J., Sexton P. M., Christopoulos A. "A Monod-Wyman-Changeux mechanism can explain G protein-coupled receptor (GPCR) allosteric modulation" IIJ Biol Chem - 2012 - 287,- pp. 650-659.

13. Changeux J. P. "Allosteiy and the Monod-Wyman-Changeux model after 50 years" // Annu RevBiophys - 2012 - 41,- pp. 103-133.

14. Smock R. G., Gierasch L. M. "Sending signals dynamically" // Science's STKE - 2009 -324,-pp. 198.

15. Bakan A., Bahar I. "The intrinsic dynamics of enzymes plays a dominant role in determining the structural changes induced upon inhibitor binding" // Proc Natl Acad Sci USA- 2009 -106,-pp. 14349-14354.

16. Kenakin T. "Efficacy at G-protein-coupled receptors" // Nature Reviews Drug Discovery -2002- 1,-pp. 103-110.

17. Kenakin T. "Functional selectivity and biased receptor signaling" II Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics - 2011 - 336,- pp. 296-302.

18. Costa Т., Cotecchia S. "Historical review: Negative efficacy and the constitutive activity of G-protein-coupled receptors" // Trends Pharmacol Sci - 2005 - 26,- pp. 618-624.

19. Caffrey M. "Membrane protein crystallization" // Journal of Structural Biology - 2003 -142,-pp. 108-132.

20. Berg J. M., Tymoczko J., Stryer L. "Biochemistry" // WH Freeman and Co - 2006 -,-.

21

22

23,

24,

25,

26

27

28,

29

30,

31,

32,

33.

34,

35,

36.

37,

38.

39,

40,

41,

42,

43,

44,

Branden C., Toozc J. (1991) Introduction to protein structure, Vol. 2, Garland New York. Red/em O. C., Dessailly B., Orengo C. A. "Exploring the structure and function paradigm" // Curr Opin Struct Biol: 2008 - 18,- pp. 394-402.

Finkelstein A. V., Ptitsyn O. B. (2002) Protein physics: a course of lectures, Academic Pr. MurzinA. G., Brenner S. E., Hubbard T., Chothia C. "SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures" IIJ Mol Biol - 1995 -247,- pp. 536-540.

Orengo C. A., MichieA., Jones S„ Jones D. T., Swindells M., Thornton J. M. "CATH-a hierarchic classification of protein domain structures" // Structure - 1997 - 5,- pp. 10931109.

Tompa P. "Intrinsically unstructured proteins" // Trends Biochem Sci - 2002 - 27,- pp. 527533.

Hedin L. E., Illergàrd K., Elofsson A. "An Introduction to Membrane Proteinst" 11 Journal of Proteome Research - 2011 - 10,- pp. 3324-3331.

Sheehan D. "Introduction to Proteins: Structure, Function and Motion. By Amit Kessel and Nir Ben - Tal" // ChemBioChem - 2011 - 12,- pp. 1603-1604. Fischer E. "Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme" // Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft - 1894 - 27,- pp. 2985-2993.

MirskyA. E., Pauling L. "On the structure of native, denatured, and coagulated proteins" // Proc Natl Acad Sci USA - 1936 - 22,- pp. 439.

White Jr F., Anfinsen C. B. "Some relationships of structure to function in ribonuclease" // Annals of the New York Academy of Sciences - 1959 - 81,- pp. 515-523. Kendrew J., Dickerson R., Strandberg B„ Hart R. "Structure of myoglobin" // Science is not a quiet life: unravelling the atomic mechanism of haemoglobin - 1997 - 4,- pp. 176. PerutzM. F. "X-ray analysis of hemoglobin" // Science - 1963 - 140,- pp. 863. EftmovA. V. "Mechanism of selection of side-chain rotamers in a-helices" // Biochemistry (Moscow) - 2007 - 72,- pp. 188-191.

EisenmesserE. Z., Millet O., Labeikovsky W., KorzhnevD. M., Wolf-WatzM., Bosco D. A., SkalickyJ. J., Kay L. E„ KemD. "Intrinsic dynamics of an enzyme underlies catalysis" // Nature - 2005 - 438,- pp. 117-121.

Henzler-Wildman K. A., Thai V., Lei M., OttM., Wolf-Watz M., Fenn T., PozharskiE., Wilson M. A., Petsko G. A., Karplus M„ Hubner C. G., Kern D. "Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory" // Nature - 2007 - 450,- pp. 838-844. LinderstrOm-Lang K., Schellman J. (1959) The Enzymes, edited by PD Boyer, HA Lardy, and K, Myrbaclc.

Klotzl. M. "Protein conformation: autoplastic and alloplastic effects" // Archives of biochemistiy and biophysics - 1966 - 116,- pp. 92-96.

Weber G. "Ligand binding and internal equilibiums in proteins" // Biochemistry - 1972 -11,- pp. 864-878.

McCammon J. A., Gelin B. R., Karplus M. "Dynamics of folded proteins" // Nature - 1977 -267,- pp. 585.

McCammon J. A., Gelin B. R„ Karplus M., WOLYNES P. G. "The hinge-bending mode in lysozyme" // - 1976 -,-.

Frauenfelder H., ParakF., Young R. D. "Conformational substates in proteins" // Annual review of biophysics and biophysical chemistry - 1988 - 17,- pp. 451 -479. Frauenfelder H., Sligar S. G., Wolynes P. G. "The energy landscapes and motions of proteins" // Urbana - 1991 - 51,- pp. 61801.

Henzler-Wildman K, Kern D. "Dynamic personalities of proteins" // Nature - 2007 - 450,-pp. 964-972.

45. BaharL, Lezon Т. R., YangL. W., Eyal E. "Global dynamics of proteins: bridging between structure and function" // Annu Rev Biophys - 2010 - 39,- pp. 23-42.

46. Koshland JrD. E. "The key-lock theory and the induced fit theory" I I Angewandte Chemie International Edition in English - 1995 - 33,- pp. 2375-2378.

47. Levitzki A., Koshland D. "Negative cooperativity in regulatory enzymes" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1969 - 62,- pp. 1121.

48. Pauling L., CAMPBELL D., Pressman D. "The nature of the forces between antigen and antibody and of the precipitation reaction" // Nature - 1943 - 23,-.

49. Changeux J. P., Rubin M. M. "Allosteric interactions in aspartate transcarbamylase. III. Interpretation of experimental data in terms of the model of Monod, Wyman, and Changeux" II Biochemistiy - 1968 - 7,- pp. 553-560.

50. BoehrD. D., Nussinov R., Wright P. E. "The role of dynamic conformational ensembles in biomolecular recognition" // Nat Client Biol - 2009 - 5,- pp. 789-796.

51. Henzler- Wildman K. A., Lei M., Thai V., Kerns S. J., Karplus M., Kern D. "A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis" II Nature - 2007 - 450,- pp. 913-916.

52. Becker О. M., MacKerell Jr A. D., Roux В., Watanabe M. (2001) Computational biochemistiy and biophysics, CRC Press.

53. Шайтан К. "Конформационная подвижность белка с точки зрения физики" // Соросовский образовательный журнал - 1999 - 5,- pp. 8-13.

54. Elber R., Karplus M. "Multiple conformational states of proteins: a molecular dynamics analysis of myoglobin" // Science - 1987 - 235,- pp. 318-321.

55. Karplus M., Briinger A., Elber R., Kuriyan J. (1987) Molecular dynamics: applications to proteins, pp 381-390, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

56. Woo A. Y., Xiao R. P. "beta-Adrenergic receptor subtype signaling in heart: from bench to bedside" И Acta Pharmacol Sin - 2012 - 33,- pp. 335-341.

57. Fredholm В. B. "Adenosine receptors as drug targets" // Exp Cell Res - 2010 - 316,- pp. 1284-1288.

58. Иванов А., Баскин И., Палюлин В., Зефиров Н. "Молекулярное моделирование аденозиновых рецепторов" // Вестник Московского Университета - 2002 - 43,- pp. 231-236.

59. Yonath A. "X-ray crystallography at the heart of life science" // Curr Opin Struct Biol - 2011

60. Mustafi D., Palczewski К "Topology of class A G protein-coupled receptors: insights gained from crystal structures of rhodopsins, adrenergic and adenosine receptors" // Mol Pharmacol -2009- 75,-pp. 1-12.

61. White S. H. "Biophysical dissection of membrane proteins" // Nature - 2009 - 459,- pp. 344346.

62. Wheatley M., SimmsJ., Hawtin S., Wesley V., Wootten D., Conner M., Lawson Z., Conner A., Baker A., Cashmore Y. "Extracellular loops and ligand binding to a subfamily of Family A G-protein-coupled receptors" // Biochemical Society Transactions - 2007 - 35,- pp. 717.

63. Bokoch M. P., Zou Y., Rasmussen S. G., Liu C. W., NygaardR., Rosenbaum D. M., Fung J. J., ChoiH. J., Thian F. S„ Kobilka T. S., PuglisiJ. D., Weis W. /., Pardo L„ ProsserR. S., Mueller L., Kobilka В. K. "Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor" II Nature - 2010 - 463,- pp. 108-112.

64. Nygaard R., Frimurer Т. M., Hoist В., Rosenkilde M. M., Schwartz T. W. "Ligand binding and micro-switches in 7TM receptor structures" // Trends Pharmacol Sci - 2009 - 30,- pp. 249-259.

65. Ahuja S., Smith S. O. "Multiple switches in G protein-coupled receptor activation" // Trends Pharmacol Sci - 2009 - 30,- pp. 494-502.

66. Rosenbaum D. M., Rasmnssen S. G. F., Kobilka B. K. "The structure and function of G-protein-coupled receptors" // Nature - 2009 - 459,- pp. 356-363.

67. Okada T„ Ernst O. P., Palczewski K„ Hofmann K. P. "Activation of rhodopsin: new insights from structural and biochemical studies" // Trends Biochem Sci - 2001 - 26,- pp. 318-324.

68. Novikov G., Sivozhelezov V., Shebanova A., Shaitan K. "Classification of rhodopsin structures by modern methods of structural bioinformatics" II Biochemistry (Moscow) - 2012 - 77,-pp. 435-443.

69. DeupiX., Standfuss J. "Structural insights into agonist-induced activation of G-protein-coupled receptors" // Curr Opin Struct Biol - 2011 -,-.

70. Hubbell W. L„ Altenbach C., Hubbell C. M., Khorana H. G. "Rhodopsin structure, dynamics, and activation: a perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking" II Advances in protein chemistry - 2003 -63,- pp. 243-290.

71. Gether U„ Lin S., Kobilka B. K. "Fluorescent labeling of purified P2 adrenergic receptor" // Journal of Biological Chemistiy - 1995 - 270,- pp. 28268-28275.

72. Kobilka B. K, Gether U. "Examination of Ligand-Induced Conformational Changes in the P< sub> 2</sub>-Adrenergic Receptor by Fluorescence Spectroscopy" II Advances in Pharmacology - 1997 - 42,- pp. 470-473.

73. Peleg G., Ghanouni P., Kobilka B. K„ Zare R. N. "Single-molecule spectroscopy of the P2 adrenergic receptor: Observation of conformational substates in a membrane protein" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2001 - 98,- pp. 8469-8474.

74. Sprang S. R. "Cell signalling: Binding the receptor at both ends" II Nature - 2011 - 469,- pp. 172-173.

75. Schwartz T. W., Frimurer T. M., Hoist B., Rosenkilde M. M„ Elling C. E. "Molecular mechanism of 7TM receptor activation—a global toggle switch model" II Amu Rev Pharmacol Toxicol - 2006 - 46,- pp. 481 -519.

76. Rajagopal S., Rajagopal K, Lefkowitz R. J. "Teaching old receptors new tricks: biasing seven-transmembrane receptors" // Nat Rev Drug Discov - 2010 - 9,- pp. 373-386.

77. Hinsen K. "Analysis of domain motions by approximate normal mode calculations" // Proteins Structure Function and Genetics - 1998 - 33,- pp. 417-429.

78. Ma S., Dai Y. "Principal component analysis based methods in bioinformatics studies" // Brief Bioinform - 2011 - 12,- pp. 714-722.

79. Kumar S., Ma B., Tsai C. J., Sinha N.. Nussinov R. "Folding and binding cascades: dynamic landscapes and population shifts" // Protein Science - 2000 - 9,- pp. 10-19.

80. Daidone /., Amadei A., Roccatano D., Nola A. D. "Molecular dynamics simulation of protein folding by essential dynamics sampling: folding landscape of horse heart cytochrome c" // Biophys J- 2003 - 85,- pp. 2865-2871.

81. DeupiX., Kobilka B. K. "Energy landscapes as a tool to integrate GPCR structure, dynamics, and function" // Physiology (Bethesda) - 2010 - 25,- pp. 293-303.

82. Vaidehi N., Kenakin T. "The role of conformational ensembles of seven transmembrane receptors in functional selectivity" // Current opinion in pharmacology - 2010 - 10,- pp. 775-781.

83. Kenakin T. P. "'7TM receptor allostery: putting numbers to shapeshifting proteins" // Trends Pharmacol Sci - 2009 - 30,- pp. 460-469.

84. Kenakin T. "Agonist-receptor efficacy II: agonist trafficking of receptor signals" // Trends Pharmacol Sci - 1995 - 16,- pp. 232-238.

'■'KW

85. Rosenbaum D. M., Zhang C., Lyons J. A., Holl R., Aragao D., Arlow D. H., Rasmussen S. G. F., Choi H. J., DeVree B. T„ Sunahara R. K. "Structure and function of an irreversible agonist-[bgr] 2 adrenoceptor complex" // Nature - 2011 - 469,- pp. 236-240.

86. Rasmussen S. G. F., Choi H. J., Fung J. J., Pardon E., Casarosa P., Chae P. S., DeVree B. T., Rosenbaum D. M„ Titian F. S., Kobilka T. S. "Structure of a nanobody-stabilized active state of the [bgr] 2 adrenoceptor" // Nature - 2011 - 469,- pp. 175-180.

87. De Lean A., Stadel J., Lefkowitz R. "A ternary complex model explains the agonist-specific binding properties of the adenylate cyclase-coupled beta-adrenergic receptor" // Journal of Biological Chemistry - 1980 - 255,- pp. 7108-7117.

88. Sum C. S., Park P. S. H., Wells J. W. "Effects ofN-ethylmaleimide on conformational equilibria in purified cardiac muscarinic receptors" II Journal of Biological ChemisUy - 2002

- 277,-pp. 36188-36203.

89. Weiss J. M., Morgan P. H„ Lutz M. W., Kenakin T. P. "The cubic ternary complex receptor-occupancy model III. Resurrecting efficacy" II Journal of Theoretical Biology - 1996 -181,- pp. 381-397.

90. Swaminath G., Xiang Y., Lee T. W., Steenhuis J., Pamot C., Kobilka B. K. "Sequential Binding of Agonists to the p2 Adrenoceptor KINETIC EVIDENCE FOR INTERMEDIATE CONFORMATIONAL STATES" II Journal of Biological Chemistry - 2004 - 279,- pp. 686-691.

91. Vilardaga J. P., Biinemann M., Krasel C., Castro M., Loltse M. J. "Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells" II Nature biotechnology - 2003 - 21,- pp. 807-812.

92. Gbahou F., Rouleau A., Morisset S., Parmentier R„ Crochet S., Lin J. S„ Ligneau X., Tardivel-Lacombe J„ Stark H„ Schtmack W. "Protean agonism at histamine H3 receptors in vitro and in vivo" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2003 - 100,- pp. 11086-11091.

93. AzziM., CharestP. G., Angers S., Rousseau G., Kohout T., Bouvier M., Piheyro G. "Beta-Arrestin-mediated activation of MAPK by inverse agonists reveals distinct active conformations for G protein-coupled receptors" // Science Signalling - 2003 - 100,- pp. 11406.

94. Weiss J. M., Morgan P. H., Lutz M. W., Kenakin T. P. "The cubic ternary complex receptor-occupancy model I. Model description" // Journal of Theoretical Biology - 1996 - 178,- pp. 151-167.

95. BondR. A., IJzerman A. P. "Recent developments in constitutive receptor activity and inverse agonism, and their potential for GPCR drug discovery" // Trends Pharmacol Sci -2006- 27,-pp. 92-96.

96. Costa T., HerzA. "Antagonists with negative intrinsic activity at delta opioid receptors coupled to GTP-binding proteins" // Proceedings of the National Academy of Sciences -1989- 86,-pp. 7321-7325.

97. Johnson J., Liggett S. "Cardiovascular pharmacogenomics of adrenergic receptor signaling: clinical implications and future directions" // Clinical Pharmacology & Therapeutics - 2011

- 89,-pp. 366-378.

98. Vassart G., Costagliola S. "G protein-coupled receptors: mutations and endocrine diseases" // Nature Reviews Endocrinology - 2011 - 7,- pp. 362-372.

99. Sin it M. J., Vischer H. F., Bakker R. A., Jongejan A„ Timmerman II., Pardo L., Leurs R. "Pharmacogenomic and structural analysis of constitutive g protein-coupled receptor activity" // Annual review of pharmacology and toxicology - 2007 - 47,- pp. 53-87.

100. Pamvels P. J., Wurch T. "Review: amino acid domains involved in constitutive activation of G-protein-coupled receptors" // Molecular neurobiology - 1998 - 17,- pp. 109-135.

101

102

103

104

105

106.

107.

108,

109.

110.

111.

112,

113.

114,

115,

116,

117.

118.

i '.eh ■

Dizhoor A. M., Woodruff M. L., Olshevskaya E. V., Cilluffo M. C„ Cornwall M. C., Sieving P. A., Fain G. L. "Night blindness and the mechanism of constitutive signaling of mutant G90D rhodopsin" II The Journal ofNeuroscience - 2008 - 28,- pp. 11662-11672. SPSansom M., Weinstein H. "Hinges, swivels and switches: the role of prolines in signalling via transmembrane [alpha]-helices" // Trends Pharmacol Sci - 2000 - 21,- pp. 445-451. Yohannan S., Faham S., YangD., Whitelegge J. P., Bowie J. U. "The evolution of transmembrane helix kinks and the structural diversity of G protein-coupled receptors" // Proc Natl Acad Sci USA - 2004 - 101,- pp. 959.

Vogel R., Mahalingam M., Liideke S., Huber T„ Siebert F., Sakrnar T. P. "Functional role of the" ionic lock"~an interhelical hydrogen-bond network in family A heptahelical receptors" // JMol Biol - 2008 - 380,- pp. 648.

Trzaskowski B„ LatekD., Yuan S., Ghoshdastider U., Debinski A., FilipekS. "Action of Molecular Switches in GPCRs-Theoretical and Experimental Studies" // Current Medicinal Chemistiy - 2012 - 19,- pp. 1090-1109.

Lebon G., Warne T., Tate C. G. "Agonist-bound structures of G protein-coupled receptors" // Curr Opin Struct Biol - 2012 -,-.

Hallmen C., Wiese M. "Molecular dynamics simulation of the human adenosine A3 receptor: agonist induced conformational changes of Trp243" // J Comput AidedMol Des - 2006 -20,- pp. 673-684.

Rodriguez D., Pineiro A., Gutierrez-de-Teran H. "Molecular dynamics simulations reveal insights into key structural elements of adenosine receptors" // Biochemistry - 2011 - 50,-pp. 4194-4208.

Schneider E. H., Schnell D., StrasserA., Dove S., Seifert R. "Impact of the DRY motif and the missing "ionic lock" on constitutive activity and G-protein coupling of the human histamine H4 receptor" // J Pharmacol Exp Ther - 2010 - 333,- pp. 382-392. DeupiX., Kobilka B. "Activation of G protein-coupled receptors" II Adv Protein Chem -2007- 74,-pp. 137-166.

Balmforth A. J., Lee A. J., Warburton P., Donnelly D., Ball S. G. "The conformational change responsible for ATI receptor activation is dependent upon two juxtaposed asparagine residues on transmembrane helices III and VII" II Journal of Biological Chemistry - 1997 -272,- pp. 4245-4251.

Jongejan A., Bruysters M., Ballesteros J. A., Haaksma E., Bakker R. A., Pardo L., Leurs R. "Linking agonist binding to histamine HI receptor activation" // Nat Chem Biol - 2005 - 1,-pp. 98-103.

DrorR. 0., ArlowD. H„ Maragakis P., MildorfT. J, Pan A. C., XuH., BorhaniD. IV., Shaw D. E. "Activation mechanism of the beta2-adrenergic receptor" II Proc Natl Acad Sci U SA - 2011 - 108,-pp. 18684-18689.

Feng Z., Hon T., Li Y. "Studies on the Interactions between beta(2) Adrenergic Receptor and Gs Protein by Molecular Dynamics Simulations" IIJ Chem Inf Model - 2012 -,-. Schlegel B., Sippl W., Holtje H. D. "Molecular dynamics simulations of bovine rhodopsin: influence of protonation states and different membrane-mimicking environments" // JMol Model -2005- 12,-pp. 49-64.

GrossfieldA. "Recent progress in the study of G protein-coupled receptors with molecular dynamics computer simulations" // Biochim Biophys Acta - 2011 - 1808,- pp. 1868-1878. Liu Y., Burger S. K., Ayers P. W., Vohringer-Martinez E. "Computational study of the binding modes of caffeine to the adenosine A2A receptor" // JPhys Chem B- 2011 - 115,-pp. 13880-13890.

Mansourian M., Madadkar-Sobhani A., Mahnam K., FassihiA., SaghaieL. "Characterization of adenosine receptor in its native environment: insights from molecular

119.

120,

121,

122,

123,

124,

125,

126,

127,

128.

129.

130.

131.

132.

133.

134.

dynamics simulations of palmitoylatcd/glycosylated, membrane-integrated human A(2B) adenosine receptor" // J Mol Model - 2012 -,-.

Simpson L. M., Wall I. D., Blaney F. E„ Reynolds C. A. "Modeling GPCR active state conformations: the beta(2)-adrenergic receptor" // Proteins - 2011 - 79,- pp. 1441-1457. Saam J., Tajkhorshid E„ Hayashi S., Schulten K. "Molecular Dynamics Investigation of Primary Photoinduced Eventsin the Activation of Rliodopsin" II Biophys J- 2002 - 83,- pp. 3097-3112.

Borhan B„ Souto M. L., Imai H., Shichida Y., Nakanishi K. "Movement of retinal along the

visual transduction path" // Science's STKE - 2000 - 288,- pp. 2209.

CrozierP. S., Stevens M. J., WoolfT. B. "How a small change in retinal leads to G - protein

activation: Initial events suggested by molecular dynamics calculations" // Proteins:

Structure, Function, and Bioinformatics - 2007 - 66,- pp. 559-574.

Hornak V., Ahuja S., Eilers M., Goncalves J. A., Sheves M., Reeves P. J., Smith S. O. "Light

activation of rhodopsin: insights from molecular dynamics simulations guided by solid-state

NMR distance restraints" IIJ Mol Biol - 2010 - 396,- pp. 510-527.

Isberg V., Balle T., Sander T., Jorgensen F. S., Gloriam D. E. "G protein-and agonist-bound serotonin 5-HT2A receptor model activated by steered molecular dynamics simulations" // J Chem Inf Model - 2011 - 51,- pp. 315-325.

Isin B„ Schulten K„ Tajkhorshid E„ Baharl. "Mechanism of signal propagation upon retinal isomerization: insights from molecular dynamics simulations of rhodopsin restrained by normal modes" // Biophys J-2008 - 95,- pp. 789-803.

Ballesteros J. A., Jensen A. D., Liapakis G., Rasmussen S. G. F., Shi L., Gether U., JavitchJ. A. "Activation of the p2-adrenergic receptor involves disruption of an ionic lock between the cytoplasmic ends of transmembrane segments 3 and 6" II Journal of Biological Chemistiy -2001 - 276,-pp. 29171-29177.

Prioleau C., Visiers I., Ebersole B. J., Weinstein H., Sealfon S. C. "Conserved Helix 7 Tyrosine Acts as a Multistate Conformational Switch in the 5HT2C Receptor" // Journal of Biological Chemistry - 2002 - 277,- pp. 36577-36584.

Greasley P. J., Fanelli F., Rossier O., Abuin L„ Cotecchia S. "Mutagenesis and modelling of the alb-adrenergic receptor highlight the role of the helix 3/helix 6 interface in receptor activation" // Mol Pharmacol - 2002 - 61,- pp. 1025-1032.

CrozierP. S., Stevens M. J., Forrest L. R., WoolfT. B. "Molecular dynamics simulation of dark-adapted rhodopsin in an explicit membrane bilayer: coupling between local retinal and larger scale conformational change" // J Mol Biol - 2003 - 333,- pp. 493-514. KolinskiM., FilipekS. "Molecular dynamics of mu opioid receptor complexes with agonists and antagonists" // TOSBJ- 2008 - 2,- pp. 8-20.

HoelzL. V. B., RibeiroA. A. S. T., Bernardi R. C., HortaB. A. C„ Albuquerque M. G., da Silva J. F. M., Pascutti P. G., de Alencastro R. B. "The role of helices 5 and 6 on the human pi-adrenoceptor activation mechanism" // Molecular Simulation - 2012 - 38,- pp. 236-240. Romo T. D., Grossfield A., Pitman M. C. "Concerted interconversion between ionic lock substates of the beta(2) adrenergic receptor revealed by microsecond timescale molecular dynamics" // Biophys J-2010 - 98,- pp. 76-84.

Kaszuba K., Rog T., BiylK., Vattidainen I., Karttunen M. "Molecular Dynamics Simulations Reveal Fundamental Role of Water As Factor Determining Affinity of Binding of P-Blocker Nebivolol to P2-Adrenergic Receptor" // The Journal of Physical Chemistry B - 2010 -114,- pp. 8374-8386.

Ghosh A., Sonavane U., Andhirka S. K., Aradhyam G. K., Joshi R. "Structural insights into human GPCR protein OA1: a computational perspective" I IJ Mol Model - 2012 - 18,- pp. 2117-2133.

135. Deflorian F., Kumar T. S„ Phan K, Gao Z. G„ Xu F„ Wu H., Katritch V., Stevens R. C., Jacobson K. A. "Evaluation of molecular modeling of agonist binding in light of the crystallographic structure of an agonist-bound A(2)A adenosine receptor" IIJ Med Chem -2012- 55,-pp. 538-552.

136. Huber T., Menon S., Sakmar T. P. "Structural Basis for Ligand Binding and Specificity in Adrenergic Receptors: Implications for GPCR-Targeted Drug Discovery!" II Biochemistry -2008- 47,-pp. 11013-11023.

137. Vanni S., Neri M„ Tavemelli /., Rothlisberger U. "Observation of "ionic lock" formation in molecular dynamics simulations of wild-type pi and p2 adrenergic receptors" // Biochemistiy - 2009 - 48,- pp. 4789-4797.

138. Vanni S., Neri M., Tavemelli I., Rothlisberger U. "Insights into G-Protein Coupled Receptors Activation from All-Atom Molecular Dynamics Simulations" II Biophys J - 2010 -98,-pp. 419.

139. Vanni S. (2011) Exploring G-Protein Coupled Receptor Activation with Multiscale Molecular Simulations.

140. Shapiro D. A., Kristiansen K, WeinerD. M., Kroeze W. K, Roth B. L. "Evidence for a model of agonist-induced activation of 5-hydroxytryptamine 2A serotonin receptors that involves the disruption of a strong ionic interaction between helices 3 and 6" II Journal of Biological Chemistiy - 2002 - 277,- pp. 11441-11449.

141. Miyano M., Ago H., Saino H., Hori T., Ida K "Internally bridging water molecule in transmembrane alpha-helical kink" II Curr Opin Struct Biol - 2010 - 20,- pp. 456-463.

142. Dror R. O., Arlow D. H., Maragakis P., MildorfT. J., Pan A. C., Xu H., Borhani D. W., Shaw D. E. "Activation mechanism of the p2-adrenergic receptor" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2011 - 108,- pp. 18684-18689.

143. Dror R. O., Arlow D. IL, Borhani D. W., Jensen M. 0., Piana S„ Shaw D. E. "Identification of two distinct inactive conformations of the p2-adrenergic receptor reconciles structural and biochemical observations" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2009 -106,- pp. 4689.

144. Dror R. 0., Pan A. C., Arlow D. H., Borhani D. W., Maragakis P., Shan Y., Xu H., Shaw D. E, "Pathway and mechanism of drug binding to G-protein-coupled receptors" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2011 - 108,- pp. 13118-13123.

145. Romo T. D., Grossfield A., Pitman M. C. "Concerted Interconversion between Ionic Lock Substates of the [beta] 2 Adrenergic Receptor Revealed by Microsecond Timescale Molecular Dynamics" // Biophys J- 2010 - 98,- pp. 76-84.

146. Ivanov A. A., Baskin 1.1., Palyulin V. A., Piccagli L., Baraldi P. G., Zefirov N. S. "Molecular modeling and molecular dynamics simulation of the human A2B adenosine receptor. The study of the possible binding modes of the A2B receptor antagonists" IIJ Med Chem - 2005 -48,-pp. 6813-6820.

147. Jojart B., Kiss R., Viskolcz B„ Kolossvary I., Keserii G. M. "Molecular dynamics simulation at high sodium chloride concentration: toward the inactive conformation of the human adenosine A2A receptor" // The Journal of Physical Chemistry Letters - 2010 - 1,- pp. 1008-1013.

148. Lebon G., Warne T., Edwards P. C., Bennett K, Langmead C. J., Leslie A. G„ Tate C. G. "Agonist-bound adenosine A2A receptor structures reveal common features of GPCR activation" // Nature - 2011 - 474,- pp. 521-525.

149. Piirainen H., Ashok Y., Nanekar R. T., Jaakola V. P. "Structural features of adenosine receptors: from crystal to function" // Biochim Biophys Acta - 2011 - 1808,- pp. 1233-1244.

150

151.

152,

153.

154,

155,

156,

157.

158,

159,

160,

161,

162,

163,

164,

165,

166,

167,

168,

169.

170,

Lyman E., Higgs C., Kim В., Lupyan D., Shelley J. C., Farid R., Voth G. A. "A role for a specific cholesterol interaction in stabilizing the Apo configuration of the human A(2A) adenosine receptor" // Structure - 2009 - 17,- pp. 1660-1668. Khelashvili G., Grossfield A., Feller S. E., Pitman M. C„ Weinstein H. "Structural and dynamic effects of cholesterol at preferred sites of interaction with rhodopsin identified from microsecond length molecular dynamics simulations" // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics - 2009 - 76,- pp. 403-417.

Peeters M., Van Westen G., Li O., Ijzerman A. "Importance of the extracellular loops in G protein-coupled receptors for ligand recognition and receptor activation" // Trends Pharmacol Sci - 2011 - 32,- pp. 35-42.

Niesen M. J., Bhattachaiya S., Vaidehi N. "The role of conformational ensembles in ligand recognition in G-protein coupled receptors" II J Am Chem Soc - 2011 - 133,- pp. 1319713204.

Chill J. H., NaiderF. "A solution NMR view of protein dynamics in the biological membrane" // Curr Opin Struct Biol - 2011 -,-.

Tzeng S. R., Kalodimos C. G. "Protein dynamics and allostery: an NMR view" // Curr Opin Struct Biol - 2011 - 21,- pp. 62-67.

Judge P. J., Watts A. "Recent contributions from solid-state NMR to the understanding of membrane protein structure and function" // Curr Opin Chem Biol - 2011 - 15,- pp. 690695.

Johnston J. M., Filizola M. "Showcasing modern molecular dynamics simulations of membrane proteins through G protein-coupled receptors" // Curr Opin Struct Biol - 2011 -21,- pp. 552-558.

Frauenfelder H., Fenimore P. W„ Young R. D. "Protein dynamics and function: Insights from the energy landscape and solvent slaving" // IUBMB life - 2007 - 59,- pp. 506-512. Schlick T. "Molecular dynamics-based approaches for enhanced sampling of long-time, large-scale conformational changes in biomolecules" // F1000 Biol Rep - 2009 - 1,- pp. 51. Karplus M., Kuriyan J. "Molecular dynamics and protein function" // Proc Natl Acad Sci U S A - 2005 - 102,-pp. 6679.

DeLano W. L. "The PyMOL molecular graphics system" // - 2002 -,-.

Ishima R., Torchia D. A. "Protein dynamics from NMR" // Nature structural biology - 2000 -

7,-pp. 740-743.

Nugent Т., Jones D. T. "Membrane Protein Structural Bioinformatics" // Journal of Structural Biology - 2011 -,-.

Dietmann S„ Holm L. "Identification of homology in protein structure classification" // Nature structural & molecular biology - 2001 - 8,- pp. 953-957.

Hasegawa H., Holm L. "Advances and pitfalls of protein structural alignment" 11 Curr Opin Struct Biol - 2009 - 19,- pp. 341-348.

Barthel D., Hirst J., Blazewicz J., Burke E., Krasnogor N. "ProCKSI: a decision support system for protein (structure) comparison, knowledge, similarity and information" // BMC bioinformatics - 2007 - 8,- pp. 416.

Шайтан К. "Молекулярная динамика пептидов" // Методическое пособие -Wong-ekkabut J., Karttunen М. "Assessment of Common Simulation Protocols for Simulations of Nanopores, Membrane Proteins, and Channels" // Journal of Chemical Theory and Computation - 2012 - 8,- pp. 2905-2911.

Ma S., Dai Y. "Principal component analysis based methods in bioinformatics studies" // Brief Bioinform - 2011 -,-.

Hayward S., Kitao A., Go N. "Harmonicity and anharmonicity in protein dynamics: a normal mode analysis and principal component analysis" // Proteins - 1995 - 23,- pp. 177-186.

171. Новиков Г., Сивожелезов В., Шебанова А., Шайтан К. "Классификация структур родопсинового рецептора современными методами структурной биоинформатики" // Биохимия - 2012 - 77,-.

172. Garcia А. Е. "Large-amplitude nonlinear motions in proteins" // Physical review letters -1992- 68,-pp. 2696-2699.

173. Amadei A., Linssen A., Berendsen H. J. C. "Essential dynamics of proteins" // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics - 2004 - 17,- pp. 412-425.

174. Hess B. "Convergence of sampling in protein simulations" // Physical Review E - 2002 -65,- pp. 031910.

175. Amadei A., Linssen A., De Groot В., Van Aalten D., Berendsen H. "An efficient method for sampling the essential subspace of proteins" // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics - 1996 - 13,- pp. 615-625.

176. Daidone I., Amadei A. "Essential dynamics: foundation and applications" // Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Molecular Science - 2012 - 2,- pp. 762-770.

177. Lange O. F., Schafer L. V, GrubmullerH. "Flooding in GROMACS: accelerated barrier crossings in molecular dynamics" // J Comput Chem - 2006 - 27,- pp. 1693-1702.

178. Hess B. "Similarities between principal components of protein dynamics and random diffusion" // Physical Review E - 2000 - 62,- pp. 8438.

179. Snow С., Qi G., Hayward S. "Essential dynamics sampling study of adenylate kinase: comparison to citrate synthase and implication for the hinge and shear mechanisms of domain motions" // Proteins - 2007 - 67,- pp. 325-337.

180. Daidone I., Roccatano D., Hayward S. "Investigating the accessibility of the closed domain conformation of citrate synthase using essential dynamics sampling" // JMolBiol - 2004 -339,- pp. 515-525.

181. Hayward S„ Kitao A., Berendsen H. J. C. "Model - free methods of analyzing domain motions in proteins from simulation: A comparison of normal mode analysis and molecular dynamics simulation of lysozyme" // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics -1998- 27,-pp. 425-437.

182. Narzi D., Daidone L, Amadei A., Di Nola A. "Protein Folding Pathways Revealed by Essential Dynamics Sampling" // Journal of Chemical Theory and Computation - 2008 - 4,-pp. 1940-1948.

183. Warne Т., Serrano-Vega M. J., Baker J. G., Moukhametzianov R„ Edwards P. С., Henderson R., Leslie A. G., Tate C. G., Schertler G. F. "Structure of a beta 1-adrenergic G-protein-coupled receptor" // Nature - 2008 - 454,- pp. 486-491.

184. Konagurthu A. S., WhisstockJ. C., Stuckey P. J., LeskA. M. "MUSTANG: a multiple structural alignment algorithm" // Proteins - 2006 - 64,- pp. 559-574.

185. Dolinsky T. J., Czodrowski P., Li H„ Nielsen J. E„ Jensen J. H„ Klebe G., Baker N. A. "PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations" // Nucleic acids research - 2007 - 35,- pp. W522-W525.

186. ParkH. Г., Kim S. A., Korlach J., Rhoades E., KwokL. W, Zipfel W. R., Waxham M. N., Webb W. W., Pollack L. "Conformational changes of calmodulin upon Ca2+ binding studied with a microfluidic mixer" // Proc Natl Acad Sci USA- 2008 - 105,- pp. 542-547.

187. Reuland S. N., VlasovA. P., Krupenko S. A. "Disruption of a calmodulin central helix-like region of 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase impairs its dehydrogenase activity by uncoupling the functional domains" IIJ Biol Chem - 2003 - 278,- pp. 22894-22900.

188. Huse M., Kuriyan J. "The conformational plasticity of protein kinases" // Cell - 2002 - 109,-pp. 275-282.

189. Roskoski R., Jr. "Src protein-tyrosine kinase structure and regulation" // Biochem Biophys Res Commun - 2004 - 324,- pp. 1155-1164.

190.

191,

192,

193.

194.

195,

196,

197.

198,

199,

200,

201,

202,

203,

204,

205.

206.

TemizN. A., Meirovitch E., Baharl. "Escherichia coli adenylate kinase dynamics: comparison of elastic network model modes with mode-coupling (15)N-NMR relaxation data" // Proteins - 2004 - 57,- pp. 468-480.

Temiz N. A., Baharl. "Inhibitor binding alters the directions of domain motions in HIV-1 reverse transcriptase" // Proteins - 2002 - 49,- pp. 61 -70.

Шайтан К., Рубин А. "Изгибныс флуктуации a-спиралей и динамика фермент-субстратных взаимодействий" // Молекулярная биология - 1983 - 17,-. Беляков А. "Молекулярная динамика изгибных флуктуации элементов вторичной структуры белков" // Биофизика - 2002 - 47,- pp. 411-419.

Baharl. "On the functional significance of soft modes predicted by coarse-grained models for membrane proteins" 11 The Journal of general physiology - 2010 - 135,- pp. 563-573. Peelers M. C., van Westen G. J., Li Q., АР I. J. "Importance of the extracellular loops in G protein-coupled receptors for ligand recognition and receptor activation" // Trends Pharmacol Sci - 2011 - 32,- pp. 35-42.

DeupiX., Standfuss J. "Structural insights into agonist-induced activation of G-protein-coupled receptors" // Curr Opin Struct Biol - 2011 - 21,- pp. 541 -551. Rosenbaum D. M„ Zhang C., Lyons J. A., Holl R., Aragao D., Arlow D. #., Rasmussen S. G„ ChoiH. J., DevreeB. Т., SunaharaR. K., ChaeP. S., Gellman S. #., DrorR. O., Shaw D. E., Weis W. I., Caffrey M., Gmeiner P., Kobilka В. K. "Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex" // Nature - 2011 - 469,- pp. 236-240. Rasmussen S. G., DeVree В. Т., Zou Y., Kruse A. C., ChungK. Y„ Kobilka T. S., Thian F. S„ Chae P. S., Pardon E„ Calinski D„ Mathiesen J. M„ Shah S. Т., Lyons J. A., Caffrey M., Gellman S. H., SteyaertJ., Skiniotis G., Weis W. L, SunaharaR. K, Kobilka В. K. "Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex" // Nature - 2011 - All,- pp. 549-555.

Moukhametzianov R., Warne Т., Edwards P. C, Serrano-Vega M. J., Leslie A. G., Tate C. G., Schertler G. F. "Two distinct conformations of helix 6 observed in antagonist-bound structures of a beta 1-adrenergic receptor" // Proc Natl Acad Sci US A - 2011 - 108,- pp. 8228-8232.

Milligan G. "Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective" // Molecular pharmacology - 2003 - 64,- pp. 1271-1276. Salom D., Lodowski D. Т., Stenkamp R. E., Le TrongL, GolczakM., Jastizebska В., Harris Т., Ballesteros J. A., Palczewski K. "Crystal structure of a photoactivated deprotonated intermediate ofrhodopsin" II Proc Natl Acad Sci USA - 2006 - 103,- pp. 16123-16128. Warne Т., Moukhametzianov R., Baker J. G., NehmeR., Edwards P. C., Leslie A. G., Schertler G. F., Tate C. G. "The structural basis for agonist and partial agonist action on a beta(l)-adrenergic receptor" // Nature - 2011 - 469,- pp. 241-244.

Brunskole I., StrasserA., Seifert R., Buschauer A. "Role of the second and third extracellular loops of the histamine H(4) receptor in receptor activation" // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol - 2011 - 384,- pp. 301-317.

VanniS., NeriM., Tavemelli I., Rothlisberger U. "Observation of "ionic lock" formation in molecular dynamics simulations of wild-type beta 1 and beta 2 adrenergic receptors" // Biochemistiy - 2009 - 48,- pp. 4789-4797.

Ibrisimovic E., DrobnyH., Yang Q., Hófer Т., Boehm S., Nanoff C., Schicker K. "Constitutive activity of the A 2A adenosine receptor and compartmentalised cyclic AMP signalling fine-tune noradrenaline release" // Purinergic Signalling - -,- pp. 1-16. Chung K. Y., Kim T. #., ManglikA., Alvares R., Kobilka B. K, ProsserR. S. "The role of detergents on conformational exchange of a G protein-coupled receptor" II Journal of Biological Chemistry - 2012 -,-.

Q. /

207. YamniukA. P., Vogel H. J. "Calmodulin VlTexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides" // Molecular biotechnology - 2004 - 27,- pp. 33-57.

208. Nobeli I., Favia A. D„ Thornton J. M. "Protein promiscuity and its implications for biotechnology" // Nature biotechnology - 2009 - 27,- pp. 157-167.

209. Tawfik O. K. D. S. "Enzyme promiscuity: a mechanistic and evolutionary perspective" // Annual review of biochemistry - 2010 - 79,- pp. 471-505.

210. Kar G., Keskin O., Gursoy A., Nussinov R. "Allostery and population shift in drug discovery" // Current opinion in pharmacology - 2010 - 10,- pp. 715-722.

211. Moukhametzianov R., Warne T„ Edwards P. C., Serrano-Vega M. J., Leslie A. G. W., Tate C. G., Schertler G. F. X. "Two distinct conformations of helix 6 observed in antagonist-bound structures of a pi-adrenergic receptor" // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2011 - 108,- pp. 8228-8232.

212. Qin K., Sethi P. R., Lambert N. A. "Abundance and stability of complexes containing inactive G protein-coupled receptors and G proteins" // FasebJ- 2008 - 22,- pp. 29202927.

213. Scarselli M„ Li B„ Kim S. K., Wess J. "Multiple residues in the second extracellular loop are critical for M3 muscarinic acetylcholine receptor activation" H J Biol Chem - 2007 - 282,-pp.7385-7396.

214. Bhattacharya S., Vaidehi N. "Computational mapping of the conformational transitions in agonist selective pathways of a G-protein coupled receptor" // J Am Chem Soc - 2010 -132,-pp. 5205-5214.