Исследование фибриллообразования искусственного белка альбебетина и его производных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Лаврикова, Марика Алексеевна

• Лаврикова, Марика Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лаврикова, Марика Алексеевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1.Процесс фибриллообразования.

Раздел 1.1 Актуальность проблемы.

Раздел 1.2 История изучения фибриллообразования.

Глава 2. Искусственные белки.

Раздел 2.1 Дизайн и свойства искусственного белка альбебетина.

Раздел 2.2 Биологически активные производные альбебетина.

2.2.1 Альбеферон (ABBI)-ABB с фрагментом l30LKEKKYSP' человеческого интерферона-а2.

2.2.2. ABB-df - ABB с фрагментом 41TGENHR46 фактора дифференцировки

HLDF клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека.

Глава 3. Предфибрнллярное или промежуточное состояние белка.22 Раздел 3.1 Общая характеристика расплавленной глобулы и ее роль в биологических процессах.

Раздел 3.2 Расплавленная глобула и фибриллообразование.

Глава 4. Современные исследования фибриллообразования.

Раздел 4.1 Модели фибриллообразования.

Раздел 4.2 Исследование цитотоксичности предфибриллярных образований.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1 Штаммы Е. coli.

3.1.2 Питательные среды.

3.2. Методы получения искусственных белков.

3.2.1 Экспрессия генов гибридных белков.

Приготовление компетентных клеток.

Трансформация плазмидной ДНК.

Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.2 Выделение и очистка гибридных белков.

3.2.3 Выделение и очистка целевых искусственных белков.

Электрофоретический анализ белков в SDS-ПААГ.

Количественный анализ белковых препаратов.

3.3 Методы исследований амилоидообразования искусственных белков.

3.3.1 Метод флуоресцентного анализа.

3.3.2 Метод атомно-силовой микроскопии.

3.3.3 Метод кругового дихроизма.

3.3.4 Методы исследования цитотоксичной активности амилоидных структур ABB.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Сравнительный анализ кинетики амилоидообразования

ABB и его производных.

4.2 Влияние электростатических взаимодействий на амилоидообразование искусственных белков.

4.3 Влияние температуры и амилоидообразования на вторичную структуру искусственных белков.

4.4 Модель фибриллогенеза искусственных белков. Полиморфизм амилоидных структур и пути их олигомеризации.

4.5 Исследование цитотоксичности амилоидных структур ABB.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1 Роль электростатических взаимодействий в амилоидообразовании ABB.

5.2. Предфибриллярное состояние белка.

5.3. Модель фибриллогенеза белков de novo.

5.4. Амилоидные структуры ABB и цитотоксичность.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фибриллообразования искусственного белка альбебетина и его производных»

Актуальность темы.

Амилоидные образования различных белков являются причиной тяжелых нейродегенеративных заболеваний человека, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, синдром Дауна, диабета второго типа, полиамилоидные полинейропатии и другие, которые часто имеют летальный исход. В 90% случаев амилоидные заболевания возникают спорадически, в 10% - имеют наследственный характер (1). Широкое распространение амилоидных болезней вызвало необходимость серьезного исследования проблемы неправильного сворачивания белка, ведущего к формированию фибриллярных отложений белков различного происхождения и функций.

В настоящее время известно около 30 белков, вовлеченных в амилоидные болезни. К ним относятся АР-пептид, прионовые белки, инсулин, лизоцим, транстиретин, а-синуклеин и другие белки, отличающиеся между собой по аминокислотным последовательностям, вторичным и третичным структурам. Однако многими исследованиями было показано, что, несмотря на отличия белков между собой, все они способны формировать амилоидные образования с общими чертами строения (1, 2). Общность строения конечной фибриллярной конструкции вызвала предположение о существовании единого механизма фибрилл ообразования.

Белки, вызывающие амилоидозы, сложно устроены и порой недостаточно изучены, как в функциональном, так и в структурном отношении, что затрудняет теоретические и практические исследования механизма амилоидогенеза, а также природы взаимодействий, участвующих в нем или оказывающих влияние на этот процесс. Общие принципы фибриллообразования и общие черты строения амилоидных формирований позволяют использовать искусственные модели для исследования общих закономерностей процесса развития амилоидной структуры и построения схемы фибриллогенеза. Такой моделью в настоящей работе является белок de novo альбебетин, сконструированный в соответствии с теорией вторичной и третичной структуры и отвечающий принципам строения глобулярных белков (3). Структура и свойства альбебетина и его производных известны, что позволяет на примере этих белков исследовать как механизм фибриллогенеза, так и способы регуляции процесса формирования амилоидной структуры. Модельные искусственные белки (40, 118) позволяют также исследовать природу сил и взаимодействий, ведущих к фибриллообразованию. Поскольку амилоиды различных белков обладают структурным сходством, общими чертами развития, то понимание механизма амилоидообразования и свойств амилоидных структур на примере отдельного белка важно для общего понимания процесса и причин, ведущих к амилоидным патологиям.

К настоящему моменту существует только посмертная диагностика многих нейродегенеративных амилоидных заболеваний. Она выявляет в различных областях мозга специфические белковые отложения в форме волокон, фибрилл и бляшек из А|3-пептида, прионового белка, а-синуклеина и х-белка. Важнейшей задачей современной медицины является ранняя диагностика амилоидных заболеваний и назначение своевременного лечения. Одним из используемых подходов является иммунизация пациентов амилоидными структурами белков, вовлеченных в эти заболевания (4). Диагностика по аутоиммунному ответу к амилоиду имеет хорошие перспективы, поскольку такой ответ наблюдается до появления выраженных клинических симптомов.

Многие амилоидные белки плохо растворимы в воде и быстро агрегируют, как, например, Ар-пептид, что создает трудности в их исследовании и в использовании для иммунизации. Используя ABB как белок-носитель, можно увеличить растворимость и регулировать амилоидогенез Ар-пептида и других белков. Поскольку существует общий конформационный эпитоп для разных амилоидных структур, а ABB, не обладая собственной иммуногенностью, формирует амилоидные структуры, то амилоиды ABB, имеющие такой эпитоп могут быть использованы для иммунизации организма против амилоидных заболеваний.

Исследования, подобные проведенным в настоящей работе, имеют значение для понимания общих механизмов фибриллогенеза и развития научных представлений от простой модели (ABB) к более сложной (белки, вызывающие амилоидозы) и, в конечном счете, для построения общей картины причинно-следственных связей, ведущих к амилоидным заболеваниям.

Цель работы.

Целью настоящей работы было представить полную структурную и кинетическую картину развития амилоидов искусственным белком альбебетином, изучить природу взаимодействий, ответственных за ассоциацию белков, а также исследовать влияние внешних факторов на этот процесс.

Задачи исследования.

1. Изучить амилоидные свойства искусственных белков альбебетинового ряда и провести сравнительный анализ морфологии амилоидных структур и кинетики амилоидогенеза искусственных белков.

2. Исследовать природу взаимодействий, ведущих к формированию фибрилл, в частности, влияние электростатических и гидрофобных сил.

3. Провести морфологические исследования амилоидных структур и представить схему амилоидогенеза белков de novo.

Научная новизна.

Показано, что искусственные белки альбебетинового ряда, или белки de novo, обладающие уникальной топологией, способны формировать амилоиды различной сложности их организации. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) проведено детальное исследование развития амилоидных структур ABB и его производных. Результаты работы свидетельствуют о том, что белки, обладающие структурным сходством, проявляют различные способности к фибриллообразованию, что зависит от специфических электростатических взаимодействий в их аминокислотных последовательностях. Более того, обнаружено, что на морфологию фибрилл и кинетику развития амилоидных формирований оказывают сильное влияние короткие пептиды, присоединенные к iV-концу ABB или присутствующие в растворе. Тот факт, что белки de novo, сконструированные согласно теориям вторичной и третичной структуры, формируют амилоидные структуры, ярко демонстрирует, что способность к фибриллообразованию - фундаментальное свойство полипептидной цепи и, поэтому, образование амилоидных структур возможно в соответствующих условиях, в молекулах большинства, если не всех, белков.

Практическая значимость.

Исследования амилоидообразования искусственных белков открывают широкие возможности для понимания общих принципов фибриллообразования и разработки методов контроля фибриллогенеза на различных его этапах. Результаты настоящей работы показали, что создаваемые в биомедицинских целях белковые препараты должны быть исследованы на наличие фибриллообразующей способности перед рекомендацией их использования в медицине.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Процесс фибриллообразования.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Лаврикова, Марика Алексеевна

выводы

1. Искусственные белки альбебетинового ряда способны формировать амилоидные структуры в условиях, близких к физиологическим (рН 7.3, 25°С). Фибриллообразование ABB требует наличия его критической концентрации и температуры 57°С.

2. В процессе амилоидогенеза искусственных белков был обнаружен полиморфизм амилоидных структур и показаны различные пути их олигомеризации. ABB формирует первичные олигомеры 1.2 нм высотой, не связывающие амилоидный краситель, и вторичные амилоидные олигомеры 2 нм высотой, связывающие тиофлавин-Т и способные объединяться в протофибриллы. Конформационные преобразования малых олигомеров в амилоидные являются критическим шагом фибриллогенеза. В популяции фибрилл белков de novo также наблюдается полиморфизм по периодичности их скручивания (20-70 нм), длине (от 500 нм до нескольких мкм) и высоте (212 нм). Пути олигомеризации, не ведущие к фибриллообразованию, заканчиваются формированием первичных олигомеров или их объединением в кольца и цепи.

3. В амилоидообразовании ABB важную роль играют электростатические взаимодействия. Преодолению электростатического отталкивания способствует повышение ионной силы раствора, присутствие гексапептида HLDF-6 или присоединение коротких пептидов к N-концу молекулы ABB.

4. Амилоидные структуры ABB не токсичны по отношению к раковым клеткам HL-60 и IMR-2 и проявляют токсичные свойства в культуре гранулярных нейронов на стадии образования амилоидных олигомеров.

5.5. Заключение

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в процессе амилоидообразования искусственного белка ABB объединение отдельных субъединиц в амилоидную структуру в большой степени зависит от баланса электростатических и гидрофобных взаимодействий. Результаты данной работы показали, что значительное влияние на амилоидные свойства заряженной белковой молекулы альбебетина оказывает присоединение к его TV-концу пептидов или добавление их в раствор, а также повышение ионной силы раствора. В настоящей работе представлена модель фибриллогенеза искусственных белков, полученная методом АСМ. Отмечен полиморфизм амилоидов по длине (от менее 300 нм до более 1 микрона) и по диаметру (от 3 до 10 нм) или по количеству протофибриллярных нитей, входящих в состав фибриллы, а также по периодичности их скручивания (20-70 нм). Подробное исследование амилоидогенеза искусственных белков позволило представить полную картину процесса и различные пути олигомеризации ABB и его производных. Нами показано, что кинетика процесса олигомеризации, морфология амилоидных структур ABB и их токсичность на ранней стадии развития соответствуют таковым у природных белков, вызывающих амилоидозы. Кроме того, исследование амилоидных свойств искусственных белков было необходимо, учитывая потенциальную возможность применения биологически активных производных альбебетина в качестве терапевтических средств.

В свете данной работы становится очевидным, что применению любого белка в фармакологических целях должен предшествовать анализ его амилоидообразующей способности, чтобы избежать привнесенной с лекарствами амилоидной невропатии.

Нерешенной задачей современной медицины является выявление амилоидных заболеваний на ранних стадиях их возникновения и назначение соответствующего своевременного лечения, а также выявление основополагающих причин заболевания, а не только облегчение симптомов на поздних его стадиях. Одним из используемых подходов для диагностики и раннего лечения амилоидозов является иммунизация пациентов амилоидными структурами белков, вовлеченных в эти заболевания (4). Диагностика по аутоиммунному ответу к амилоиду является очень перспективной, поскольку такой ответ наблюдается до появления ярко-выраженных клинических симптомов.

Для решения существующих задач необходимо четкое понимание самого процесса амилоидогенеза, выявление общих черт развития амилоидных формирований различных белков, определение биохимических факторов, стимулирующих или ингибирующих фибриллообразование, а также поиск механизмов взаимодействия амилоидных формирований с клеточными структурами и причин их токсичности.

Иммунизация амилоидными формированиями природных белков, в том числе белков, вызывающих амилоидозы, не всегда удобна, например, в связи с плохой растворимостью, собственной иммуногенностью или быстрой амилоидной олигомеризацией белковых молекул. ABB не обладает иммуногенностью, хорошо растворим и скорость его амилоидогенеза не велика, поэтому в дальнейшем этот белок может быть использован для разработки методов иммунизации против амилоидных болезней и их ранней диагностики.

Поскольку амилоиды различных белков обладают структурными сходствами, общими чертами развития и токсичности, то понимание механизма амилоидообразования и свойств амилоидных структур на примере одного белка важно для общего понимания самого процесса и причин, ведущих к амилоидным патологиям. Исследования, подобные проведенным в настоящей работе, имеют первостепенное значение для понимания общих механизмов фибриллогенеза и развития научных представлений от простой модели (ABB) к более сложной (белки, вызывающие амилоидозы) и, в конечном счете, для построения общей картины причинно-следственных связей, ведущих к амилоидным заболеваниям.

Исследования принципов фибриллообразования как на примере альбебетина, по многим параметрам удачной модели этого процесса, так и на примере других белков, представляют актуальную задачу настоящего времени. Современные данные, имеющиеся в литературе, многое прояснили в этом вопросе: исследованы варианты конформационных изменений молекул, способствующие амилоидной перестройке, выяснены условия, способствующие образованию предамилоидных состояний молекул (в частности, изменение ионной силы, присоединение или присутствие пептидов в растворе). В некоторых работах, в частности (130), проведены исследования взаимодействия небольших нейропептидов с а-синуклеином и показано их влияние на амилоидобразующую способность белка. Возможно, наши результаты по влиянию пептидов на фибриллообразующие свойства ABB могут быть использованы для понимания общих принципов этих взаимодействий в природных белках, в том числе, вызывающих амилоидозы, таких как а-синуклеин. Последние работы в большой степени посвящены исследованию мутантных форм а-синуклеина, а некоторые исследуют и его взаимодействие с нейропептидом дофамином. Принципы, лежащие в основе взаимодействий между пептидом и молекулой белка, а также влияние общих условий инкубации на процесс фибриллообразования удобно исследовать на искусственных моделях, доступных для более надежного теоретического и практического анализа, таких как ABB. Большое количество работ, посвященных фибриллообразованию, постепенно дополняют сложную мозаику общей картины болезни от ее возникновения до серьезного развития. Логическое объединение многих биохимических и биофизических исследований с нейрофизиологическими работами должно представить общую схему патологического процесса. Известно, что особое распространение амилоидные заболевания получили в последнее столетие, что связывают с повышенным уровнем стресса, загрязнением окружающей среды и т.д. Были выявлены и психологические аспекты амилоидных болезней. Например, одним из постоянно сопутствующих диагнозов на начальных стадиях паркинсонизма является депрессия определенного типа, в связи с чем, для создания полной картины развития болезни и вариантов лечения, необходим общий подход, включающий и психологические исследования. Важной задачей является объединение во многом обособленных результатов биохимических исследований амилоидообразования с нейрофизиологическими и психологическими исследованиями амилоидных болезней. Создание общей картины позволит определить причины и выработать оптимальные медицинские подходы лечения, а, возможно, и предотвращения этих серьезных заболеваний, при условии выявления причин их распространения за последние столетие.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лаврикова, Марика Алексеевна, 2005 год

1. Мальцев А.В., Каминский Ю.Г., Ильясов Ф.Э., Розанова Н.А., Федюкин B.C., Байрамов В.М. «Конформационные и межмолекулярные взаимодействия белков при амилоидозе.» IIБиофизика, 2005. Т. 50. вып. 3. С. 470-474.

2. Serpell L.C., Sunde М., Blake С.С. «The molecular basis of amyloidosis.» Review. II Cell. Mol. Life Sci., 1997. Vol. 53. P. 871-887.

3. Lansbury P. Т. «Evolution of amyloid: what normal protein folding may tell us about fibrillogenesis and disease.» II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96. P. 3342-3344.

4. Dobson C.M. «The structural basis of protein folding and its links with human disease.» // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, Biol. Sci., 2001. Vol. 356. P. 133-145.

5. Zurdo J., Guijarro J.I., Dobson C.M. «Preparation and characterization of purified amyloid fibrils.» II J. Am. Chem. Soc., 2001. Vol. 123. P. 8141-8142.

6. Pepys M.B., Hawkins P.N., Booth D.R., Vigushin D.M., Tennent G.A., Soutar A.K., Totty N., Nguyen O., Blake C.C., Terry C.J. «Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis.» //Nature, 1993. Vol. 362. P. 553-557.

7. Serpell L.C. «Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly.» // Biochim. Biophys. Acta., 2000. Vol. 1502. P. 16-30.

8. Jimenez J.L., Guijarro J.I., Orlova E., Zurdo J., Dobson C.M., Sunde M., Saibil H.R. «Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.» // EMBO J., 1999. Vol. 18. P. 815-821.

9. Anfinsen C.B. «Principles that govern the folding of protein chain.» // Science, 1973. Vol. 181. P. 223-230.

10. Karplus M. «The Levinthal paradox: yesterday and today.» // Fold. Des., 1997. Vol. 2. P. 69-75.14a. Redford S.E. «Protein folding: progress made and promises ahead.» // Trends Biochem. Sci., 2000. Vol. 25. P. 611-618.

11. Redford S.E. «Protein folding: pulling back the frontiers.» Curr. Biol., 2000. Vol. 21. P. 662-664.

12. Юсупов M.M., Спирин A.C. «Исследование поверхности рибосом Escherichia coli и рибосомных частиц с помощью бомбардировки тритием.» // Биохимия, 1986. Вып. 11. С. 1858-1867.

13. Колб В.А., Коммер А.А., Спирин А.С. «Есть ли канал для пептидного синтеза на рибосоме ? Мечение рибосомы в процессе трансляции тритием.» // Докл. АН СССР, 1987. Т. 29. С. 1497-1501.

14. Gething M.J., Sambrook J. «Protein folding in the cell.» Review. // Nature, 1992. Vol. 355. P. 33-45.

15. Ellis R.J., Hartl F.U. «Principles of protein folding in the cellular environment.» Review. // Curr. Opin. Struct. Biol., 1999. Vol. 9. P. 102-110.

16. Птицын О.Б., Финкельштейн A.B. «Взаимосвязь между первичной и вторичной структурами белков.» // Биофизика, 1970. Т. 15. Вып. 5. С. 757-767.

17. Dobson С.М. «Folding and Binding.» Editorial Overview. // Curr. Opin. Struct. Biol., 1995. Vol. 5. P. 56-57.

18. Dobson C.M., Karplus M. «The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment.» // Curr.Opin. Struct. Biol., 1999. Vol. 9. P. 92-101.

19. Dobson C.M. «Finding the right fold.» // Nature Struct. Biol., 1995. Vol. 2. P. 513-517.

20. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. «Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PSI+., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.» // Cell, 1997. Vol. 89. P. 811-819.

21. Thomas D.J. «Chaos in protein folding: a simple one-dimensional model.» // J. Theor. Biol., 1995. Vol. 174. P. 299-311.

22. Pepys M.B. «Amyloid, familial Mediterranean fever, and acute phase response.» (Weatherall D.J., Ledingham J.G.G., Warrel DA. Eds.) // Oxford Textbook of Medicine, 1996. Vol. 2. P. 1512-1525. (Oxford Univ. Press, Oxford).

23. Kelly J.W. «Mechanisms of amyloidogenesis.» // Nature Struct. Biol., 2000. Vol. 7. P. 824-826.

24. Koo E.H, Lansbury P.T., Kelly J.W. «Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neurodegeneration.» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96. P. 9989-9990.

25. Missmahl H.P., Hartwig M. «Optical polarization studies of amyloid substance.» // Virchows Arch., 1953. Vol. 324. P. 489-508.

26. Klunk W.E., Pettegrew J. W., Abraham D.J. «Quantitative evaluation of congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation.» // J. Histochem. Cytochem., 1989. Vol. 37. P. 1273-1281.

27. Suzuki K., Terry R.D. «Fine structural localization of acid phosphatase in senile plaques in Alzheimer's presenile dementia.»II Acta Neuropathol. (Berl.), 1967. Vol. 8. P. 276-284.

28. Shirahama Т., Cohen A.S. «High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril.» II J. Cell. Biol., 1967. Vol. 33. P. 679-708.

29. Cohen A.S., Calkins E. «Electron microscopic observations on a fibrous component in amyloid of diverse origins.» // Nature, 1959. Vol. 183. P. 1202-1203.

30. Cohen AS. «An update of clinical, pathologic, and biochemical aspects of amyloidosis.» Review. II Int. J. Dermatol., 1981. Vol. 20. P. 515-530.

31. Merz P.A., Wisniewski H.M., Somerville R.A., Bobin S.A., Masters C.L. «Ultrastructural morphology of amyloid fibrils from neuritic and amyloid plaques.» // Acta Neuropathol., 1983. Vol. 60. P. 113-124.

32. Blake C.C.F., Serpell L.C., Sunde M., Sangren O., Lundgren E. «А molecular model of the amyloid fibrils. The nature and origin of amyloid fibrils.» // Ciba Foundation Symposium, 1996. Vol. 199. P. 6-21.

33. Blake C.C.E., Serpell L.C. «Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibrils is a continuous p-sheet helix». // Structure, 1996. Vol. 4. P. 989-998.

34. Sunde M. & Blake C.C.F. «The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction.» Review. //Adv. Protein Chem., 1997. Vol. 50. P. 123-159.

35. Sunde M., Serpell L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C. «Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction.» // J. Mol. Biol., 1997. Vol. 273. P. 729-739

36. Sinha N, Tsai C.J., Nussinov R. «А proposed structural model for amyloid fibril elongation: domain swapping forms interdigitating P-structure polymer.» // Protein Eng., 2001. Vol. 14. P. 93-103.

37. Zhu M., Souillac P.O., Ionescu-Zanetti C., Carter S.A., Fink A.L. «Surface-catalyzed amyloid fibril formation.» //J. Biol. Chem., 2002. Vol. 277. P. 50914-50922.

38. Jansen R., Dzwolak W., Winter R. «Amyloidogenic self-assembly of insulin aggregates probed by high resolution atomic force microscopy.» // Biophys. J., 2005. Vol. 88. P.1344-1353.

39. Petkova A.T., Leapman R.D., Guo Z., Yau W.M., Mattson M.P., Tycko R. «Self-propagating, molecular-level polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils.» // Science, 2005. Vol. 307. P. 262-265.

40. Regan L., DeGrado W.F. «Characterization of a helical protein designed from first principles.» // Science, 1988. Vol. 241. P. 976-978.

41. Птицын О.Б, Финкелыптейн A.B. «Проблема предсказания структуры белка.».// «Итоги науки и техники», сер. «Мол. Биология» (ред.: Волькенштейн М.Д.). М.: ВИНИТИ, 1979. Т. 15. С. 6-41.

42. Aphasizheva I.Yu., Dolgikh D.A., Abdullaev Z.K., Uversky V.N., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. «Can grafting of an octapeptide improve the structure of de novo proteinЪ> IIFEBS Lett., 1998. Vol. 425. P. 101-104.

43. Ptitsyn O.B. «Molten globule and protein folding.» I I Ad. Protein Chem., 1995. Vol. 47. P. 83-229.

44. Бычкова B.E. «О функциональной роли ненативных белков.» II Успехи биол. хим., 1997. Т. 37. С. 49-99.

45. Долгих Д.А., Габрилян А.Е., Наволоцкая Е.В., Чемерис В.В., Кирпичников М.П. «Искусственный белок с заданной пространственной структурой и биологической активностью.» // Биофизика, 1993. Т. 38. С. 59-65.

46. Kostanyan, I. A., Astapova, М. V., Starovoytova, Е. V., Dranitsina, S. М., Lipkin, V. М. «А new human leukemia cell 8.2 kDa differention factor: isolation and primary structure.» U FEBSLett., 1994. V. 356. P. 327-329.

47. Barnes Е., Webster G., Jacobs R., Dusheiko G. «Long-term efficacy of treatment of chronic hepatitis С with alpha interferon or alpha interferon and rebavirin.» // J. Hepatol., 1999. Suppl. 1. P. 244-249.

48. Krown S.E. «Interferon and other biologic agents for the treatment of Karposi's sarcoma.» // Hematol. Oncol. Clin. North Am., 1991. Vol. 5. P. 311-322.

49. Zinzani P.L., Lauria F., Salvucci M., Rondelli D., Raspadori D., Bendandi M., Magagnoli M., Tura S. «Hairy- cell leukemia and alfa interferon treatment: long-term responders.» // Hematologics 1997. Vol. 82. P. 152-155.

50. Horisberger M.A., Di Marco S. «Interferon alfa gibrids.» // Farmacol. Ther., 1995. Vol. 66. P. 507-534.

51. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Braznikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S. Yu., Ptitsyn O.B. «а-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure?» // FEBSLett., 1981. Vol. 136. P. 311-315.

52. Птицын О.Б. « Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул.» // Докл. АН СССР, 1973. Т. 210. С. 1213-1215.

53. Bychkova V.E., Ptitsyn О.В. «The molten globule in vitro and in vivo.» // Chemtracts-Biochem. Mol. Biol., 1993. Vol. 4. P. 133-163.

54. Lee J.W., Kim H. «Apomyoglobin forms a micellar complex with phospholipid at low рН.» II FEBS Lett., 1988. Vol. 241. P181-184.

55. Griko Yu. V., Privalov P.L., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. «Thermodynamic study of the apomyoglobin structure.» // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 202. P. 127-138.

56. Finley D., Chau D. «Ubiquitination.» IIAnnu. Rev. Cell Biol., 1991. Vol. 7. P. 2569.

57. Zhuang Z., Marks В., McCauleu R.B. « The insertion of monoamine oxidase A into the outer membrane of rat liver mitochondria.» II J. Biol Chem., 1992. Vol. 267. P. 591-596.

58. Herold M., Kirshner K. «Reversible dissociation and unfolding of aspartate aminotransferase from Escherichia coli: characterization of a monomeric intermediate.» И Biochemistry, 1990. Vol. 29. P.1907-1913.

59. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson С. M. «Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofllaments and fibrils.» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. V. 96. P. 3590-3594.

60. Goers J., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Uversky V.N., Fink A.L. «Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation.» // Biochemistry,2002. V. 41. P. 12546-12551.

61. Chamberlain A.K., MacPhee C.E., Zurdo J., Morozova-Roche L.A., Hill H.A., Dobson C.M., Davis J.J. «Ultrastructural organization of amyloid fibrils by atomic force microscopy.» // Biophys. J., 2000. V. 79. P. 3282-3293.

62. Uversky V.N., Lee H.J., Li J., Fink A.L., Lee S.J. «Stabilization of partially folded conformation during alpha-synuclein oligomerization in both purified and cytosolic preparations.» II J. Biol. Chem., 2001. Vol. 276. P. 43495-43498.

63. Xu D., Tsai C.J., Nussinov R. «Mechanism and evolution of protein dimerization.» // Protein Sci., 1998. Vol. 7. P. 533-544.

64. Bennett M.J., Schlunegger M.P., Eisenberg D. «3D domain swapping: a mechanism for oligomer assembly.» Review. // Protein Sci., 1995. Vol. 4. P. 24552468.

65. Schlunegger M.P., Bennett M.J., Eisenberg D. «Oligomer formation by 3D domain swapping: a model for protein assembly and misassembly.» Review. // Adv. Protein Chem., 1997. Vol. 50. P. 61-122.

66. Riek R., Hornemann S., Wider G., Billeter M., Glockshuber R., Wuthrich K. «NMR structure of the mouse prion protein domain PrP (121-321).» II Nature, 1996. Vol.382. P. 180-182.

67. Jimenez J.L., Nettleton E.J., Bouchard M., Robinson C.V., Dobson C.M., Saibil H.R. «The protofilament structure of insulin amyloid fibrils.» H Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002. Vol. 99. P. 9196-9201.

68. Bauer H.H., Aebi U., Haner M., Hermann R., Muller M., Merkle H.P. «Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies produced by in vitro aggregation of human calcitonin.» И J. Struct. Biol., 1995. Vol. 115. P. 1-15.

69. Goldsbury C.S., Cooper G.J., Goldie K.N., Muller S.A., Saafi E.L., Gruijters W.T., Misur M.P., Engel A., Aebi U., Kistler J. «Polymorphic fibrillar assembly of human amylin.» II J. Struct. Biol., 1997. Vol. 119. P. 17-27.

70. Harper J.D., Lieber C.M., Lansbury P.T. Jr. «Atomic force microscopic imaging of seeded fibril formation and fibril branching by the Alzheimer's disease amyloid-beta protein.» // Chem. Biol, 1997. Vol. 4. P. 951-959.

71. Crowther R.A., Daniel S.E., Goedert M. «Characterisation of isolated alpha-synuclein filaments from substantia nigra of Parkinson's disease brain.» // Neurosci. Lett., 2000. Vol. 292. P. 128-130.

72. Serpell L.C. «Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly.» Review.// Biochim. Biophys. Acta., 2000. Vol. 1502. P. 16-30.

73. Stefani M. «What the use of disease-unrelated model proteins can tell us about the molecular basis of amyloid aggregation and toxicity.» Review. // Ital. J. Biochem., 2003. Vol. 52. P. 162-176.

74. Sirangelo I., Malmo C., Iannuzzi C., Mezzogiorno A., Bianco M.R., Papa M., Irace G. «Fibrillogenesis and cytotoxic activity of the amyloid-forming apomyoglobin mutant W7FW14F.» II J. Biol. Chem., 2004. Vol. 279. P. 13183-13189.

75. Bucclantini M., Glannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigi L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M., Stefani M. «Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.» // Nature, 2002. Vol. 416. P. 507-511.

76. Coughey В., Lunsbuiy P. «Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders.» // Annu. Rev. Neurosci., 2003. Vol. 26. P. 267-298.

77. Chromy B.A., Nowak R.J., Lambert M.P., Viola K.L., Chang L., Velasco P.T., Jones B.W., Fernandez S.J., Lacor P.N., Horowitz P., Finch C.E., Krafft G.A., Klein

78. W.L. «Self-assembly of Abeta(l-42) into globular neurotoxins.» // Biochemistry, 2003. Vol. 42. P. 12749-12760.

79. Ding T.T., Lee S.J., Rochet J.C., Lansbury P.T. Jr. «Annular alpha-synuclein protofibrils are produced when spherical protofibrils are incubated in solution or bound to brain-derived membranes.» // Biochemistry, 2002. Vol. 41. P. 10209-10217.

80. Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. «Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases.» Review. // Neuromol. Med., 2003. Vol. 4. P. 21-36.

81. Lashuel H.A., et al, Hartley D., Petre В. M., Walz Т., Lansbury P.T.Jr. «Amyloid pores from pathogenic mutations.» II Nature, 2002. Vol. 418. P. 291.

82. Harrison R.F., Hawkins P.N., Roche W.R., MacMahon R.F., Hubscher S.G., Buckels J.A. «'Fragile' liver and massive hepatic haemorrhage due to hereditary amyloidosis.» II Gut., 1996. Vol. 38. P. 151-152.

83. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. «Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors.» // Gene, 1985. V.33.P.103-113.

84. Studier F.W., Moffatt B.A. «Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.» II J. Mol. Biol., 1986. V. 189. P. 113130.

85. Hanahan D. «Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.» И J. Mol. Biol, 1983. V.166. P. 687-714.

86. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. «Молекулярное клонирование.» // Москва, "Мир", 1984.108. «А handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins.» // Qiagen, 1997.

87. Laemmli U.C. «Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Т4.» II Nature, 1970. V. 227. P.680-685.

88. Schagger H., Jagow G. «Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.» // Anal. I Biochem., 1987. V. 166. P. 368-379.

89. Levine H. «Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution.» // Protein Sci., 1993. V. 2. P. 404-410.

90. Olabarrieta I., L'Azou В., Yurie S., Cambar J., Cajaraville M.P. «In vitro effects of cadmium on two different animal cell models.» II Toxicology in Vitro, 2001. Vol. 15. P. 511-517.

91. Darke C., Gay E. «An evaluation of the ethidium bromide microcytotoxicity test.» II J. Immunol. Methods, 1974. Vol. 4. P. 161-172.

92. Sabate R., Gallardo M., Estelrich J. «An autocatalytic reaction as a model for the kinetics of the aggregation of beta-amyloid.» // Biopolymers, 2003. Vol. 71. P. 190195.

93. Levine H. «Thioflavine-T interaction with amyloid p-sheet structures.» II Amyloid, 1995. Vol. 2. P. 1-6.

94. Munishkina L.A., Henriques J., Uversky V.N., Fink A.L. «Role of protein-water interactions and electrostatics in alpha-synuclein fibril formation.» // Biochemistry, 2004. Vol. 43. P. 3289-3300.

95. Lopez De La Paz M., Goldie K., Zurdo J., Lacroix E., Dobson С. M., Hoenger A., Serrano L. «De novo designed peptide-based amyloid fibrils.» // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002. Vol. 99. P. 16052-16057.

96. Otzen D. E., Kristensen О., Oliveberg M. «Designed protein tetramer zipped together with a hydrophobic Alzheimer homology: a structural clue to amyloid assembly.» // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2000. Vol. 97. P. 9907-9912.

97. Hirota-Nakaoka N., Hasegawa K., Naiki H., Goto Y. «Dissolution of P2-microglobulin amyloid fibrils by dimethylsulfoxide.» // J. Biochem., 2003. Vol. 134. P.159-164.

98. Uversky V.N., Li J., Bower K., Fink A.L. «Synergistic effects of pesticides and metals on the fibrillation of alpha-synuclein: implications for Parkinson's disease.» // Neurotoxicology, 2002. V. 23. P. 527-536.

99. Goers, J., Uversky, V.N., Fink, A.L. «Polycation-induced oligomerization and accelerated fibrillation of human alpha-synuclein in vitro.» II Protein Sci., 2003. Vol. 12. P. 702-707.

100. Dobson С. M. «Protein folding and misfolding.» // Nature, 2003. V. 426. P. 884890.

101. Bychkova V.E., Pain R.H., Ptitsyn O.B. «The 'molten globule' state is involved in the translocation of proteins across membranes?» // FEBS Lett., 1988. Vol. 238. P. 231-234.

102. Jeffery W. Kelly J.W. «Mechanisms of amyloidogenesis.» // Nature Struct. Biol., 2000. Vol. 7. P. 824-826.

103. Sousa M.M., Cardoso I., Fernandes R., Guimaraes A., Saraiva M.J. «Deposition of transthyretin in early stages of familial amyloidotic polyneuropathy: evidence for toxicity of nonfibrillar aggregates.» I I Am. J. Pathol, 2001. Vol. 159. P. 1993-2000.

104. Andersson K., Olofsson A., Nielsen E.H., Svehag S.E., Lundgren E. «Only amyloidogenic intermediates of transthyretin induce apoptosis.» II Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002. Vol. 294. P. 309-314.

105. Svensson M., Hakansson A., Mossberg A.K., Linse S., Svanborg C. «Conversion of alpha-lactalbumin to a protein inducing apoptosis.» II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000. Vol. 97. P. 4221-4226.

106. Conway K.A., Rochet J.C., Bieganski R.M., Lansbury P.T.Jr. «Kinetic stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine-alpha-synuclein adduct.» II Science, 2001. Vol. 294. P. 1257-1258.