Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Николаева, Тамара Ивановна

• Николаева, Тамара Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Николаева, Тамара Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..

2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур

2.2.Структура коллагеновых фибрилл

2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели

2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл

2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл

2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo

2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, рН, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса

2.5.1. Состав ионов

2.5.2. Ионная сила

2.5.3. РН

2.5.4. Температура

2.5.5. Концентрация

2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса

2.5.6.1. Гликозаминогликаны

2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей

2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл

2.7.1. Метод электронной микроскопии

2.7.2. Метод рентгеновской диффракции

2.7.3. Метод поляризационной микроскопии

2.8. Метод калориметрии

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..

3.1. Материалы и реактивы

3.1.1. Объекты исследования.

3.1.2. Реактивы.

3.2. Выделение коллагена и очистка

3.2.1. Коллаген из кожи свиней

3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс

3.2.2.1. Коллаген с телопептидами

3.2.2.2. Коллаген без телопептидов.

3.3. Методы исследования

3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов

3.3.2. Определение концентрации коллагена

3.3.3.Оитические методы

3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия

3.3.3.2. Спектрофотометрия

3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия

3.3.4. Метод сканирующей калориметрии

3.3.5. Методы электронной микроскопии

3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии

3.3.5.2. Метод негативного контрастирования

3.4. Формирование коллагеновых фибрилл

3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул фибрилл

3.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4°С с изменением температуры до 25°С, 30°С, 35°С

3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса

3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I с удаленными телопептидами

4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл

4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул.

4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro»

Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагена -проколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.

Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.

Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.

Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.

Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.

Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.

Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа I в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:

1. Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.

2. Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.

3. Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.

4. Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Николаева, Тамара Ивановна

выводы

1. Оптимизация методов получения высокоочищенного коллагена типа I и оптимизация условий фибриллогенеза коллагена позволяет формировать фибриллы с плотной упаковкой молекул.

2. Выявлена степень влияния температуры на фибриллогенез коллагена типа I с целыми и удаленными телопептидами. Установлено, что при физиологической температуре 35°С значительно увеличивается скорость образования фибрилл. Для коллагена с телопептидами величины энтропии, энтальпии перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное при температуре 30°С максимальны, а при физиологической температуре 35°С минимальны.

3. Определено, что варьированием температуры и концентрации коллагеновых молекул можно регулировать процесс фибриллогенеза in vitro: скорость образования фибрилл и плотность упаковки фибрилл. В условиях, приближенных к физиологическим, возрастает степень упорядоченной упаковки молекул в фибриллах и увеличивается длина кооперативных участков в фибриллах.

4. Подобраны условия для связывания коллагена с хондроитин-4-сульфатом в трехмерную структуру коллагенового геля. Установлено, что образование комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом в геле приводит к повышению термостабильности фибрилл и их устойчивости к действию коллагеназы.

5. Показано, что метод калориметрии достаточно адекватен, чтобы следить за формированием структуры фибрилл с повышенной плотностью упаковки молекул в трехмерном геле при создании биоматериалов с целью применения их в практической медицине.

Благодарности:

Ю.А. Рочеву - научному руководителю Н.Н. Хечинашвили - научному консультанту Б.К. Гаврилюку - заведующему лабораторией

Е.И. Тиктопуло, Н.Г. Есиповой, Р.В. Полозову, Ю.А. Лазареву - за обсуждение работы и ценные замечания

А.И. Писаченко, И.И. Селезнёвой, С.В. Кузьмину, Ю.Ю. Скарге,

А.Г. Погорелову, М.Д. Шпагиной - сотрудникам лаборатории и института, принимавших участие в проведении экспериментов Л.П. Долгачевой, В.А. Печатникову, Л.Ф. Куньевой, A.M. Аксирову, Ф.Э. Ильясову - за техническую помощь в работе

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Николаева Т.И., Ееипова Н.Г. Связь ростовых свойств коллагенов с их физико-химическими характеристиками. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.55.

2. Файзутдинова Р.Н., Николаева Т.И. Роль коллагенового геля в адгезии и росте клеток. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.54.

3. Рочев Ю.А., Николаева Т.И., Кузьмин С.В. Агрегация клеток на коллагеновых подложках. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.52-53.

4. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.И. "Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи)". 1988, ОНТИ НЦБИ, Пущино, 123с.

5. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.И. Культура клеток в реконструкции ткани. Материалы III Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1992, Пущино, с.24-31.

6. Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл в процессе их образования. Биофизика, 1995, т.40, с.478-479.

7. Гаврилюк Б.К., Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Рябоконь П.П., Селезнева И.И. Коллагеновые гели, хондроитин-4-сульфат, устойчивость к протеолизу. Биофизика, 1995, т.40, с.1356-1357.

8. Селезнева И.И., Кузьмин С.В., Николаева Т.И., Рочев Ю.А. Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл. Биофизика, 1996, т.41, с.541-542.

9. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Анализ самосборки молекул коллагена типа I в фибриллы. Тезисы докладов II съезда биофизиков России, 1999, с.66-67.

10. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Изучение самосборки молекул коллагена типа I с удаленными телопептидами. Биофизика, 2000, т.45, № 6, с. 1146-1149.

11. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Полозов Р.В., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Исследование образования фибрилл коллагена типа I in vitro. Биофизика,

2001, т.46, № 4, с.612-618.

12. Николаева Т.И. Изучение упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 2001, Пущино, с. 84.

13. Николаева Т.И., Полозов Р.В., Рочев Ю.А. Исследование упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов III съезда биохимического общества,

2002, Санкт- Петербург, с. 505-506.

14. Селезнева И.И., Николаева Т.И., Давыдова Г.А., Ковалева М.А., Чайлахян Т.А., Чайлахян JI.M., Гаврилюк Б.К. Матрикс на основе коллагена типа I и хондроитин-4-сульфата: устойчивость к протеолизу, взаимодействие с культурами эмбриональных стволовых клеток. Тезисы докладов семинара-презентации научно-технических проектов "Биотехнология-2003", Пущино, 24-25 ноября, с. 32.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений в изучении фибриллогенеза in vitro может быть поиск условий образования фибрилл, содержащих возможно меньшее число параметров самосборки молекул и в то же время правильно отражающих основные свойства фибриллогенеза in vivo. В настоящей работе показано, что при физиологических значениях температуры, рН и ионной силы формируются фибриллы с плотной упаковкой молекул. До нашей работы существовало представление о структуре фибрилл с низкой плотностью упаковки молекул, которые были образованы при физиологических температурах и низких концентрациях коллагена.

Главным результатом выполненной работы следует считать то, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул можно регулировать как скорость процесса фибриллогенеза, так и плотность упаковки фибрилл.

Трудность в исследованиях фибриллогенеза коллагена связана с быстрым процессом самосборки молекул в условиях, близких к физиологическим. С помощью метода калориметрии можно исследовать структурное состояние фибрилл на начальных этапах их образования и можно проводить поиск существенных параметров фибриллогенеза. Выбор таких факторов образования фибрилл, как температура, концентрация и время, позволит формировать структуру фибрилл in vitro более близкой по структуре к биологической.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Николаева, Тамара Ивановна, 2004 год

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. 1975, Л., Наука.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж, Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, 1987, т.З, М., Мир, 296 с.

3. Бурджанадзе Т.В., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л. Энтальпия и энтропия денатурации коллагенов, различающихся по термостабильности. ДАН СССР. 1987, т.293, с.720-723.

4. Бурджанадзе Т.В., Ломая М.А., Бежитадзе М.О. Наличие термостабильного домена в спиральной части молекулы. Биофизика, 1989, т.34. с.377-383

5. Бурджанадзе Т.В., Тиктопуло Е.И. Энтальпия денатурации коллагена -незатухающая функция 4-оксипролина. Биофизика, 2001, т.46, с.607-611.

6. Есипова Н.Г., Лазарев Ю.А. Исследование структуры коллагена спектральными и диффракционными методами. В сб. "Конформационные изменения биополимеров в растворах". 1973, М., "Наука", с. 185-191.

7. Есипова Н.Г., Григолава М.В., Щеголева Т.Ю., Рогуленкова В.Н., Малеев В.Я. Почему температура денатурации коллагена должна быть близка к температуре развития вида? Биофизика, 1981, т.26, с.355-356.

8. Лазарев Ю.А. Стуктурообразование спирали коллагенового типа в синтетических олиго- и полипептидах. Докторская дисс., 1988, М.1

9. Михайлов А.Н. Коллаген кожного покрова и основы его переработки. М., Легкая индустрия, 1971,528 с.

10. Никитин В.Н., Перский Е.Э.,Утевская JI.A. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур, Киев, "Наукова думка", 1977.

11. Подлубная З.А. Влияние ионной силы на структуру паракристаллов легкого меромиозина. Биофизика, 1973, т. 18, с.593-599.

12. Привалов П.Л., Мревлишвили Г.М. Биофизика, 1967, т. 12, с.22-29.

13. Привалов П. Л. Исследование тепловой трансконформации проколлагена.1. Энтальпия денатурации проколлагенов с различным содержанием аминокислот. Биофизика, 1968, т. 13, с.955-963.

14. Привалов П.Л., Тиктопуло Е.И. Исследование тепловой трансконформации проколлагена.И. Субденатурационное теплопоглощение в растворе проколлагена в присутствии солей. Биофизика, 1969, т. 14, с.20-27.

15. Привалов П.Л. Калориметрические исследования растворов биополимеров. Итоги науки и техники. Молекулярная биология, 1975, т.6, с.7-33.

16. Сердюк И.Н., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л. Исследования растворов проколлагена методом светорассеяния. Молекулярная биология, 1971, т.5,. с.606-613.

17. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. М. 2002.

18. Хечинашвили Н.Н. Термодинамика конформационных превращений глобулярных белков. Докторская дисс., 1990, Л.

19. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Леменев В.Л. Коллаген и его применение в медицине. М, " Медицина", 1976,256 с.

20. Хромова Т.Б., Лазарев Ю.А. Связанная вода и стабильность трехспиральной структуры коллагенового типа. Биофизика, 1986, т.31, с.208-212.24