Исследование биофизических процессов в сенсибилизированной жировой ткани при воздействии лазерного и светодиодного излучения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Янина, Ирина Юрьевна

• Янина, Ирина Юрьевна
• кандидат физико-математических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Янина, Ирина Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление:

Введение

Глава 1. Спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями

1.1 Введение

1.2 Материалы и методы

1.3 Результаты и обсуждение

1.4 Выводы 35 Глава 2. Материалы исследования и методы, красители, источники излучения, подготовка образцов, микроскоп, камера, обработка изображений2.1 Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.3 Фотодинамические красители

2.3.1 Трифенилметановые красители

2.3.2 Цианиновые красители

2.4 Источники излучения

2.5 Подготовка образцов

2.6 Характеристики микроскопа и камеры (аппроксимация и подбор коэффициентов)

2.6.1 Микроскоп

2.6.2 Камера

2.7 Статистическая обработка изображений

2.8 Математическая обработка изображений

2.9 Параметрические и непараметрические методы. Достоверное 1Ь результатов

2.10 Выводы 59 Глава 3. Тепловое воздействие

3.1 Введение

3.2 Материалы и методы

3.3 Результаты и обсуждение

3.4 Выводы 69 Глава 4. Фото динамическое воздействие на сенсибилизированную бриллиантовым зеленым жировую ткань в видимой области светодиодного излучения

4.1 Влияние облучения на спектры поглощения жировой ткани человека при

ее сенсибилизации бриллиантовым зеленым

4.1.1 Материалы и методы

4.1.2 Результаты и обсуждение

4.1.3 Выводы

4.2 Некроз и ano птоз жировой ткани

4.2.1. Введение

4.2.2. Результаты и обсуждение 76 4.2.3 Выводы

4.3 Кинетика оптических свойств жировой ткани in vitro как результат фотодинамического действия

4.3.1. Результаты и обсуждение

4.3.1.1 Экспериментальные результаты

4.3.1.2. Статистическая обработка изображений, их оптическая интерпретация

4.3.1.3. Обсуждение результатов. 89 4.3.2 Выводы

4.4 Регистрация пор в мембране жировой клетки на основе оптической цифровой микроскопии

4.4.1 Введение

4.4.2 Материалы и методы

4.4.3 Результаты и обсуждение

4.4.4 Выводы

4.5 Исследование изменения показателя преломления жировой ткани при фотодинамическом воздействии in vitro методом оптической когерешной томографии (ОКТ)

4.5.1 Экспериментальная установка

4.5.2 Исследуемые образцы и красители

4.5.3 Алгоритм обработки полученных данных

4.5.4 Результаты и их обсуждение

4.5.5 Выводы 118 Глава 5. Фото динамическое воздействие на сенсибилизированную индоцианиновым зеленым жировую ткань в ИК области лазерного излучения

5.1 Влияние облучения на спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации индоцианиновым зеленым

5.1.1 Материалы и методы

5.1.2 Результаты и обсуждение

5.1.3 Выводы

5.2 Некроз и апоптоз жировой ткани

5.2.1. Результаты и обсуждение

5.2.2 Выводы

5.3 Кинетика оптических свойств жировой ткани in vitro как результат фотодинамического действия

5.3.1. Материалы и методы

5.3.2. Результаты и обсуждение

5.3.2.1 Экспериментальные результаты

5.3.2.2. Статистическая обработка изображений, их оптическая интерпретация

5.3.3. Сравнение фотодинамического воздействия, оказываемого бриллиантовым зеленым и индоцианиновым зеленым

5.3.3 Выводы

5.4 Исследование изменения показателя преломления жировой ткани при фотодинамическом воздействии in vitro методом оптической когерентной

томографии (ОКТ)

5.4.1 Результаты и их обсуждение

5.4.2 Выводы 137 Глава 6. Гистологический анализ подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo

6.1. Введение

6.2. Материалы и методы

6.3. Результаты и обсуждение

6.3.1 Выбор параметров лазерного излучения

6.3.2 Гистологический анализ контрольных образцов

6.3.3 Гистологический анализ образцов

после инъекции красителя

6.3.4 Гистологический анализ образцов

после облучения источником

6.3.5 Гистологический анализ образцов после инъекции красителя и

последующего облучения источником

6.4 Выводы

Заключение

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование биофизических процессов в сенсибилизированной жировой ткани при воздействии лазерного и светодиодного излучения»

Введение

Настоящая работа относится к фотобиологии животной клетки, она посвящена экспериментальному изучению влияния световых потоков видимого и ближнего ИК диапазонов на клетки сенсибилизированной жировой ткани in vitro и in vivo.

Исследования последних десятилетий позволили по-новому взглянуть на причины и механизмы развития многих заболеваний, прежде всего таких социально значимых, как атеросклероз и ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, сахарный диабет 2-го типа, болезни печени, ортопедических заболеваний, ряд онкологических заболеваний (липома, липосаркома и т.п.). Получены убедительные доказательства взаимосвязи этих заболеваний с избыточным накоплением жира в организме, т. е. с ожирением. В этой связи возрос интерес к изучению функций жировой ткани и их роли в норме и при патологии, а также к разработке способов удаления избыточных отложений [1, 2, 3]. В настоящее время общепризнано, что жировая ткань играет большую роль в метаболической регуляции как энергетического равновесия в организме, так и сосудистого гомеостаза. Однако она не пассивный проводник, служащий для сохранения и расходования энергии, отвечающий за сдвиги в энергетическом балансе. Несмотря на кажущуюся нежелательность жира, жировая ткань выполняет много очень важных физиологических функций [4, 5]. Знание этих функций необходимо не только для понимания патогенеза ожирения и связанных с ним заболеваний, но и для их эффективной профилактики и лечения.

Ожирение, как правило, лечится диетой, физическими упражнениями и уменьшением слоя подкожной жировой клетчатки с помощью пластической хирургии, липосакции, ультразвуковой и лазерной терапии. Благодаря быстрому темпу жизни современного общества, многим трудно поддерживать здоровую диету и регулярно заниматься спортом, чтобы предотвратить ожирение. В связи с этим предпочтение отдается инвазивным процедурам.

Инвазивные процедуры являются объектом риска для пациента из-за инфекций, кровотечения, риска здоровью при анестезии и других после -хирургических осложнений. Липосакция подразумевает введение в жировые слои зондов около 5 мм в диаметре через отверстия в коже для удаления жировой ткани. Недостатки липосакции включают создание видимых неоднородностей в виде углублений в зоне введения зонда, чрезмерное кровотечение и неселективное удаления клеток жира и стромы. В результате лазерной липосакции клетки гибнут по пути некроза и на теле могут остаться рубцы или синяки. Явным эффектом лазерного воздействия является нагрев не только жировой ткани, но и её окружения. Важным является вопрос поддержания физиологической температуры во время проведения процедур лазерной липосакции.

В настоящее время ведутся активные поиски новых оптических технологий, позволяющих селективно разрушать жировую ткань. Одним из самых простых способов физического воздействия на жировые клетки, является гипертермия [6, 7, 8, 9, 10, 11]. Известны методы селективного нагрева подкожной жировой ткани оптическим, в том числе лазерным, излучением [10]. В ряде случаев, оптический нагрев активизирует кровообращение и биологические рецепторы, в зону воздействия привлекаются макрофаги, которые утилизируют разрушенные жировые клетки [12, 13, 14]. Создание новых лазерных источников стимулирует интерес к исследованию взаимосвязей между параметрами лазерного излучения и оптическими свойствами жировой ткани.

ИК лазерное излучение обладает селективным тепловым воздействием на жировую ткань, что обусловлено достаточно сильными полосами поглощения липидов на 915, 1210 и 1720 нм. [10, И, 12, 13, 14, 15]

Лазерная липосакция / липопластика или лазерный липолиз является одним из современных способов удаления жировых отложений. Лазерный липолиз, основанный на тепловых процессах (селективный фототермолиз), позволяет локально нагревать и разрушать жировые клетки, оставляя их в сжиженном состоянии, что облегчает их удаление из тела с помощью специальных устройств

или за счет естественного метаболизма жиров. Процедура лазерной липосакции проводится с помощью тонкого оптико-волоконного лазерного зонда, который вводится под кожу [12, 13, 14, 15,16,17,18,19,20,21,22]. Головка эюго зонда излучает высоко интенсивное излучение. Под действием этого лазера происходит селективное разрушение жировых клеток.

Гистологический анализ воздействия Nd: YAG лазера (1060 им) и CW диодного лазера (980 нм) на жировой клетки человека показали обратимое повреждение клеток (набухание клеток), а также необратимые повреждения (лизис клеток) [20, 22].

Механизмы, приводящие к лазерному липолизу, зависят от температуры. Во-первых, при низкой энергии лазерного излучения и, следовательно, низкого повышения температуры, наблюдалось только набухание аднпоцитов [20]. При использовании более высокой энергии лазерного излучения, гистологическая оценка, выполненная в работе [17] на образцах ткани, взятых после воздействия, показала разрыв жировых клеток, а также коагуляцию мелких сосудов в жировой ткани. Так как тепло концентрируется внутри адипоцитов, это приводит к разрыву его мембраны. Эффект получается не только тепловой, но и термомеханический.

Более того, степень набухания и лизис изменялись пропорционально количеству накопленной энергии. Конвекционная липосакция вызывает больше необратимых повреждений, чем лазерный липолиз с использованием света с энергией 1000 Дж [20]. Для лазера с длиной волны 1064 нм и энергией лежащей в диапазоне от 1000 Дж до 12.000 Дж, было отмечено, что чем выше энергия, тем больший объем ткани был подвержен сокращению [16]. Обычно, сокращение объема 5 см3 жира наблюдается при 3000 Дж, 20 см3 при 12.000 Дж. Все эти исследования ясно показывают, что при лазерном липолизе должны учитываться два основных параметра: 1) длина волны, так как взаимодействие лазера с тканью достигается за счет поглощения лазерной энергии светочувствительными хромофорами, создавая достаточное количество тепла в жировой ткани, чтобы вызвать желаемые термические повреждения; 2) используемая энергия, так как

существует взаимосвязь доза-реакция [16, 23]. Тепловые эффекты па жировые клетки и внеклеточный матрикс вызывают как обратимые, так и необратимые повреждения клеток. Это делает лазерную липосакцию менее травматичной и с малыми кровопотерями, по сравнению с традиционной липосакцией. Основным результатом лазерного липолиза является некроз адипоциюв. Некроз - процесс необратимый, характеризуется разрывом цитоплазматической и внутри клеточных мембран [24, 25, 26, 27, 28, 29]. Это приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу цитоплазмы в межклеточное пространство. При относительно благоприятном исходе вокруг омертвевших тканей возникает реактивное воспаление, которое отграничивает мертвую ткань. В таких случаях образуется рубец. В отличие от некроза при ano птозе воспаления окружающих тканей не наблюдается. Ano птоз — это форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду [23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец ("апоптотические тельца"), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Другой метод оптического разрушения жировых тканей, а именно фотодинамический / тепловой метод (ФД / ТМ), может обеспечить снижение региональных или специфичных скоплений внутрибрюшпой или подкожной жировой ткани наименее инвазивным путем, вызывая апоптоз клеток или контролируемой некроз небольшого количества жировой ткани [36, 37]. В частности, это связано с использованием локализованного оптического (лазерного) излучения соответствующей длины волны и мощности, которые также могут быть объединены в сочетании с окрашиванием локализованных специфических жировых отложений и / или применением линолитических агентов, приводя к неинвазивному и не - или наименее разрушительному уменьшению объема жировой ткани и тем самым к изменению контура / формы

скоплений жировой ткани. Фото динамическое действие (ФДД) - это необратимое повреждение светом биологических структур (или функций) в присутствии кислорода, сенсибилизированное введенными в клетки или организмы хромофорами (например, красителями) [38, 39]

Принцип оптического метода разрушения жировой ткани заключается в том, что за счет предварительной обработки биоткани красителем, увеличивается поглощательная способность объекта.

В видимой и ближней ИК областях спектра жировая ткань является слабо поглощающей и поэтому необходима ее окраска для увеличения эффективности взаимодействия со светом. В видимой области основным поглотителем является гемоглобин крови (сильная полоса Соре на 405-430 нм и более слабые а и (3 -полосы на 540 и 575 нм за счет снабжения кровью каждой жировой клетки через кровеносную капиллярную сеть), кроме того Р - каротин с основной полосой на 465 нм также может давать некоторый вклад в поглощение [40].

Существуют два способа локального увеличения поглощения свега тканью и запуска фототепловых или фотобиохимических реакций. Подбором длины волны излучения использовать поглощение 1) эндогенными (собственными) хромофорами ткани [41] или 2) экзогенными хромофорами - красители или фотосенсибилизаторы. В случае применения экзогенных хромофоров эффективность взаимодействия света с тканью может быть существенно более высокой. Существует много фотосенсибилизаторов (ФС), но предметами данного исследования явились индоцианиновый зеленый (ИЗ) и бриллиантовый зеленый (БЗ). Применение ИЗ обусловлено его сильным поглощением в ближней ИК области спектра, низкой токсичностью и быстрым выводом из организма. При внутривенном введении ИЗ эффективно связывается с альбумином плазмы крови и быстро выводится из плазмы паренхиматозными клетками печени, выделяясь полностью в желчь. При местном введении он связывается с белками в тканях и выводится с трудом [42, 43, 44]. Показано, что сильное поглощение лазерного излучения на длине волны 810 нм окрашенной ИЗ опухолевой ткани индуцирует ее локальный нагрев и последующее разрушение [45, 46, 47, 48, 49, 50],

и

обусловленное фотодинамичееким действием, оказываемым ИЗ [45-50]. В оптических технологиях гораздо реже используется такой краситель, как БЗ ¡ 51], однако он обладает бактерицидными свойствами, его спектр лежит в видимой области, следовательно, возможно его возбуждение источниками видимого света [51, 52].

Узкие пики поглощения красителей позволяют эффективно использовать их для селективной лазерной деструкции ткани, однако при окраске взаимодействие молекул красителя с органическими молекулами ткани может изменить спектр поглощения красителя [45-47].

Интенсивность и положение пиков поглощения красителей зависят от используемых растворителей [53, 54, 55]. При использовании в качестве растворителя физиологического раствора, краситель имеет тенденцию к образованию больших агрегатов. Это также приводит к сдвигу пика поглощения. Растворы, имеющие сложный состав, например, такие как вода-спиртдлицерин, стабилизируют пики поглощения [54].

Спиртовая составляющая в растворе также удобна, чтобы сделать клеточную мембрану более проницаемой для красителя за счет растворения липидной компоненты биологической мембраны [56, 57, 58]. Следующий шаг взаимодействия красителя с клеткой связан с воздействием излучения ис точника. Биологический ответ сенсибилизированной клетки на воздействие света может привести к большим областям повреждений в клеточной мембране и их последующем преобразовании в фактические поры как выход из клетки для свободных жирных кислот (FFAs), потому что молекулярный размер FFAs не превышает диаметр 1-2 нм [59].

Метод основан на том, что молекулы фотосенсибилизатора прикрепляются к мембране клеток. Облучение светом с определенной длиной волны, соответствующей пику поглощения фото сенсибилизатор а, приводит к образованию атомарного (синглентного) кислорода, который нарушает целостность мембран клеток, приводя к увеличению их пористости. Была показана возможность запуска ano птоза в следствие ФДТ [60, 61]. Клеточный

липолиз может наблюдаться как процесс оптического просветления образцов при фотодинамическом воздействии на жировую ткань, основные этапы действия приведены на диаграмме.

а §

§ &

3

I

•е.

t

1) а

о ^

у а

I. Сенсибилизация красителем жировой ткани (местная обработка или подкожная инъекция раствора)

л

£

0

1

<3

§

43 Jo

К st

О"

I

о

b¿

о £

с-

л Х

VO*

Диаграмма.

II. Облучение источником сенсибилизированную ткань

III. Поглощение излучения тканыо

IVa. Фототермическое IV6. Фотохимические действие реакции

л /

V. Обратимое и необратимое повреждение

клеточной мембраны

■ ■ ■ ife ■ ■ ; ,íí

VI. Порообразование в клеточной мембране

<У

VII. Липолиз

VIII. Апонтоз, некроз

W

п

п

5

rt>

ft> о п сг

Е1

о -S-

сз

л

<т

г,

3 "О

О

¿ч4

п>

Г) п сг

(¿макрофаги являются показателями воспалительной реакции) Механизм воздействия источника излучения

на

сенсибилизированную жировую ткань

Анализ литературы показывает, что действие света на сенсибилизированную ткань, в том числе и жировую, является вполне актуальной задачей как с точки зрения теоретической (фундаментальная «фотобиология животной клетки»), так и прикладной, например, фототерапия. Особый интерес вызывают задачи подбора типа фотосенсибилизатора для различных биотканей, изучение механизмов действия.

Из краткого обзора следует, что изучение воздействия источников оптического излучения на сенсибилизированную жировую ткань является малоизученным и перспективным для приложений направлением в фотомедицине. Существует ряд нерешенных проблем, в том числе малоисследованны спектральные характеристики сенсибилизированной жировой ткани, особенности их изменения в зависимости от параметров излучения [62, 63], несмотря на то, что знание этих данных является принципиально важным для обеспечения хорошо контролируемой послойной лазерной деструкции ткани при лечении ожирения и целлюлита [41, 64, 65, 66]. В литературе отсутствуют рекомендации и критерии для выбора параметров источников излучения и самих источников, способных вызвать щадящую послойную деструкцию сенсибилизированной подкожной жировой клетчатки без её полного разрушения.

Недостаточно внимание исследователей уделено изучению теплового воздействия на сенсибилизированную жировую ткань, а также комбинированному фотодинамическому и тепловому влиянию на сенсибилизированную жировую ткань. В литературе нет данных о влиянии фотодинамического действия (ФДД) на подкожную жировую клетчатку in vivo, не известны пути гибели адпноцитов в данном случае.

Поэтому актуальным является поиск методов минимально пшзазивных процедур, в результате которых клетки гибели по апоптотическому сценарию, без воспалительного ответа. Также, до конца нераскрыты механизмы действия лазерного и светодиодного излучения на сенсибилизированную жировую т кань.

Решение вышеописанных проблем и вопросов является ак1уальным и определило цель настоящей диссертационной работы.

Цель диссертационной работы состояла в экспериментальном исследовании биофизических процессов при воздействии оптического излучения на клетки жировой ткани при ее сенсибилизации красителями.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• исследования спектральных характеристик подкожной жировой клетчатки, красителей различной концентрации и сенсибилизированной этими красителями жировой ткани как до, так и после облучения биообъекта,

• подбор источника излучения для обеспечения эффективного действия на биоткань в видимой и ИК областях спектра с учетом используемого красителя,

• исследование воздействия лазерного и светодиодного излучения на сенсибилизированную жировую ткань

• исследование теплового и комбинированного (фотодинамическое / тепловое) воздействия на жировую ткань,

• исследование кинетики изменения оптических свойств жировой ткани, сенсибилизированной красителями, in vitro как результат фотодинамического действия, а также определение биофизических механизмов взаимодействия химических агентов со структурными компонентами жировой ткани,

• исследование механизмов, приводящих к липолизу адппоцитов, с помощью цифровой микроскопии и оптической когерентной томографии, на основе анализа изображений сенсибилизированной и облученной светом жировой ткани

• анализ патоморфологических изменений в подкожной жировой клетчатке при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo

Научная новизна работы:

• исследована кинетика изменения оптических свойств сенсибилизированной красителями жировой ткани in vitro как результат фотодинамического/фотохимического действия. Впервые экспериментально продемонстрирован эффект оптического иммерсионного просветления сенсибилизированной жировой ткани в результате фотодипамического воздействия.

• впервые на основе анализа изображений жировой ткани, сенсибилизированной красителями, при фотодинамическом воздействии in vitro выдвинута гипотеза о механизме, вызывающем липолиз адипоцитов. На основе оптической цифровой микроскопии впервые зарегистрированы небольшие образования (структуры) в проекции мембраны жировой клетки, наличие которых при фотодинамическом действии на ткань статистически достоверно связаны с ее просветлением.

• впервые показано увеличение эффективности процесса просветления сенсибилизированной жировой ткани после облучения при нагреве в пределах от 40 до 50 °С температур.

• впервые сделан анализ патоморфологических изменений подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения п списка литературы.

Во введении обоснована актуальность темы, изложена цел г. и задачи исследования, кратко изложено содержание работы и сформ) лировапы основные положения, выносимые на защиту.

Впервой главе получены спектральные характеристики подкожной жировой ткани, индоцианинового зеленого и бриллиантового зелено! о. Измерены спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями. На основе полученных спектров рассчишны концентрации красителей в ткани.

Во второй главе рассмотрены материалы и методы исследования, красители, источники излучения, подготовка образцов, микроскоп, камера, обработка изображений.

В третьей главе описаны воздействия, оказываемые на жировую жань при нагреве и фотодинамическом действии на нее, а также синергизм этих явлений.

В четвертой и пятых главах описаны воздействия видимою и ИК излучения на жировую ткань при ее сенсибилизации бриллиантовым зеленым и индоцианиновым зеленым, соответственно. Обсуждено влияние облучения на

спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями. Проанализирована кинетика оптических свойств жировой чкани in vitro как результат фотодинамического действия. Зарегистрированы поры в мембране жировой клетки на основе оптической цифровой микроскопии. Проведено исследование изменения показателя преломления жировой i чани при фотодинамическом воздействии in vitro методом оптической когерентной томографии.

В шестой главе представлен гистологический анализ подкожной жировой клетчатки при фото динамическом воздействии на кожу крыс in vivo. В заключении приведены основные результаты работы. Основные результаты и положения, выносимые на защиту:

1. Анализ кинетики изменения оптического пропускания слоя жировой ]кани, сенсибилизированной водно-спиртовым раствором бриллиантового зеленого при концентрации 6 мг/мл, при фотовоздействии на длинах волн 442 и 51)7 им с общей плотностью мощности излучения не превышающей 75 мВт/ем~, по ню л ил предложить метод «мягкой» редукции объема ткани путем липолизл жировых клеток без их существенной деструкции.

2. Вблизи поверхности мембран клеток жировой паши впервые экспериментально зарегистрированы небольшие образования [с ¡руктуры), размерами от 2 до 8 мкм, которые характеризуются изменяющимся во времени оптическим пропускание и трактуются как капельки внутриклеточной жидкости, секретируемой через образованные поры в мембране. Исследовано кичпчесто и размеры этих образований (структур) в зависимости от условий фото воздействия. Среднее количество наблюдаемых образований на одну клетку составляло 5-10 без фотовоздействия и 15-30 при облучении сенсибилизированных; водно-спиртовым раствором бриллиантового зеленого жировых клеток. Ко -ффициент корреляции между временными зависимостями пропускания Т и количества образований (пор) составил 0.87

3. Экспериментальное обнаружение и исследование оптического просветления при фотовоздействии на сенсибилизированную жировую ткань, что связывается с

повышением оптической однородности ткани за счет иммерсии компонентов ткани продуктами липолиза.

4. При in vivo подкожном введении водно-спиртовых растворов бриллиантового зеленого и индоцианинового зеленого и чрезкожпом облучении излучением диодной лампы (625 нм, плотность энергии 720 Дж/см2) и диодного лазера (808 нм, плотность энергии 960 Дж/см ) у экспериментальных животных в коже, жировой и мышечной ткани развиваются выраженные изменения, в том числе в подкожной жировой клетчатке наблюдается распространенная чеетрукция клеток.

Научная и практическая значимость работы

Результаты диссертационной работы развивают и дополняют теорешческие и экспериментальные основы фотобиологии животной клетки и ел>жаг для разработки эффективных методов коррекции жировых отложений, борьбы с опухолевыми новообразованиями, для выяснения механизмов клеточной гибели (апоптоз или некроз). Результаты работы открывают новые возможности для изучения мембраны жировых клеток.

В работе предложен оптический метод фотодинамического/геплового воздействия на жировые клетки, способный обеспечить минимально пнвашвное уменьшение объема подкожной жировой ткани путем контролируемого липолиза.

Основные результаты работы докладывались на Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофпшке (20082012), на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Молодежь и наука, итоги и перспективы» (2008, 2009), на международной конференции Optics in f issue Engineering and Regenerative Medicine III (San Jose, USA, 2009), па научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» (2010-2011), на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», на международных конференциях Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics, Mechanisms for Low-Light Therap> VI (San

Francisco, California, USA) (2010-2013), Medical Laser Applications and Laser-Tissue Interactions V (Munich, Germany) (2011, 2013), на студенческой научно-практической конференции в рамках первой Всероссийской неде ш науки с международным участием, посвященной дню российской науки «Молодые ученые - здравоохранению» (2012), на международной конференции Biophotonics: Photonic Solutions for Better Health Care (Brussels, Belgium) (2012), на Российско-китайском семинаре по биофотонике и биомедицинскоп опшке 2012 и на международной конференции 1st International Biophotonics Meeting in batel (Tel Aviv, Israel) (2012).

Основные результаты работы опубликованы в 35 печашых работах, из которых 17 научных статей - в рецензируемых журналах из списка ИЛК, 18 статей в трудах международных конференций.

В ходе работы над диссертационным исследованием соискателем принято участие в научно-исследовательских грантах в качестве исполнителя-

1. «Оптические методы диагностики нано- и мезос конических сред», Аналитическая ведомственная целевая профамма «Развитие научного потенциала высшей школы (2009 - 2011 гг.)»; № 2.1.1/4989.

2. «Развитие научно-образовательной структуры по когерентной оптике и биофотонике», Аналитическая ведомственная целевая программа «Нашнше научного потенциала высшей школы (2009 - 2011 гг.)»; № 2.2.1.1/2950.

3. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных меыдов медицинской диагностики и фототерапии», Тематический план на>чно-исследовательских работ СГУ по заданию Минобразпаукп на 2005 - 2014 годы; № 1.4.09.

4. 7-ая Рамочная Программа Евросоюза в области технических и ее тес j венных наук, грант № 224014 Network of Excellence Гот Biophotonics (Photonics4Life), 2008-2012.

5. «Разработка оптических методов исследования и мониторинга изменений параметров биологических тканей и цельной крови при изменении

содержания глюкозы в тканях организма человека и животных», госконтракт № 02.740.11.0770; ФЦП «Научные и научпо-педы 01 пческие кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

6. «Разработка новых фотонных технологий анализа биофизических процессов в живых организмах на субклеточном, клеючном и тканевом уровнях для задач неинвазивной и минимально-инвазишюй диагноз шки и терапии», госконтракт № 02.740.11.0879; ФЦП «Налчные п наушо-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 11.

7. «Исследование оптических свойств биологических тканей и крови, направленное на создание фундаментальных основ он ыч ее кой медицинской диагностики и лазерной терапии» (2012 - 2013 п) 1 р.шт Президента Российской Федерации для государственной подк-ржки ведущих научных школ Российской Федерации НШ-1177.2012.2

8. «Разработка компьютерного диагностического комплекса для выявления ранних патологических изменений в кровотоке мозга», 2012 - 20!;., си !Д «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развшия научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы», тс. кошракт 11.519.1 1.2035. В рамках международного договора с Австралией.

9. «Разработка оптических методов и средств контроля параметров микро- и макроструктуры биологических сред» в рамках государе шешкь о задания Министерства образования и науки (2011 - 2014)

Ю.«Развитие физических основ и приложений высокора^реп ающей томографической и поляризационной микроскопии для субмпкрошьк'.о анализа объемной структуры объектов технического и биочи! пческого происхождения», 2012 - 2013, ФЦП "Научные и научно-педа! огические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, юс. кошракт 14.В37.21.0728.

11. «Разработка когерентно-оптических биосенсоров на генетическом, клеточном и организменном уровнях организации», 2012 - 2013. ФЦП

"Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 1 на 2009 -2013 годы, гос. контракт 14.В37.21.0563.

12.Biophotonic technologies for novel diagnostic and therapeutic appli ;ntions, FiDiPro (Finland Distinguished Professor) Program, awarded by IKKES, №40111/1 (2011-2014), V.V. Tuchin - FiDiPro.

13.«Лазерная трансфекция клеток и тканей, меченных зо„,о; ыми нано об о дочками». Проект по совместному конкурсу исследован льсл:лх проектов РФФИ - Лондонское Королевское Общество (20 J 2-2013);

И.Грант фонда «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по программе У.М.Н.И.К.: юс. г-лль^лкт №8761р/14002 от 14 января 2011 г «Разработка ошическою мек^да разрушения жировой ткани» (2009-2011)) Личный вклад автора диссертации

В ходе работы над диссертационным исследованием соискателем:

- принято участие в разработке экспериментальной установки, выявлены ее метрологические характеристики и проведена калибровка;

- разработана методика проведения экспериментов, состоящая в подборе концентраций красителя, доз облучения, способных вызвать шачшедьл.ле изменения в биоткани;

- осуществлена постановка экспериментов, проведенных еовмесшых с сотрудниками Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и Саратовского государственного медицинского \ипвереи! jra имениВ.И. Разумовского;

- проведена статистическая, компьютерная обработка эксперимсшальпых результатов;

- принято участие в обсуждении экспериментальных результатов и гракы.лчИ наблюдаемых эффектов.

Разработка и отладка установки осуществлялась с помощью профессора, д.ф.-м.н. Симоненко Г.В. Спектральные измерения были проведены совмести с профессором той же кафедры д.ф.-м. н. Кочубеем В.И. Эксперименты па

оптическом когерентном томографе проводились совместно с аспиранткой кафедры оптики и биофотоники СГУ Труниной Н.А. Эксперимсп ты и обсу жч едие результатов по фотодинамического действия на подкожную жировую к'кччатку in vivo проведены совместно с сотрудниками кафедры Патоло! пческоп анатомии СГМУ - зав. кафедрой, д.м.н., проф. Маслякова Г.Н.

Формулировка темы диссертационной работы, нос ¡ .¡п^.дса исследовательских задач, обсуждение результатов, объяснение набчю,¡.аемых явлений, подготовка статей к публикации и обсуждение текст дпссеркииюмпой работы, ее основных положений и выводов, осуществлялись Тучиным В В — руководителем диссертационной работы от СГУ.

Совместно с доцентом, к.ф.-м.н. Дубровским В.А:

были выявлены метрологические характеристики и проведена ь.иь,бровка экспериментальной установки, предложены методики проведения эксперимсп ов и обработки экспериментальных результатов по ряду задач, учае i ие в обсулаеити экспериментальных результатов и трактовки наблюдаемых эффектов нод-оюьке совместных статей и обсуждении текста диссертационной работы.

Достоверность полученных в работе результатов и выводов оиуедоь на адекватностью используемых методов измерения, обработки и анализа экспериментальных данных. Результаты проведенных исследовании подверглись статистической обработке. Все оригинальные результаты воспроизводятся при повторении экспериментов.

Работа выполнена на кафедре оптики и биофоюнькн Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и на гаф: !,ре медбиофизики им. проф. В.Д. Зернова Саратовского 1оеударс i венного медицинского университета им. В.И. Разумовского.

Все необходимые для работы биоиоматериалы были предос ¡'-.вчеды сотрудниками кафедр патологической анатомии и оперативной хирургии и топографической анатомии СГМУ.

1 Спектры поглощения жировой ткани чел опеки при ге сенсибилизации красителями

1.1 Введение

Оптические параметры окрашенной жировой ткани осгамнея в налоги je время малоизученными, несмотря на многочисленные исследования в лллеги оптики биотканей [62, 63] и то, что знание этих параметров явш^ся принципиально важным для обеспечения хорошо контролируемой послойной лазерной деструкции ткани при лечении ожирения и целлюлша ¡4 ! 6?, 64, с;", ,6, 67].

Целью настоящего исследования является сравнение спекфов по! ..онилня фотосенсибилизаторов: ИЗ и БЗ в жировой ткани человека и расiворах в спектральном диапазоне 250-900 нм, а также расчет изменений копце^^м. ,ги фотосенсибилизаторов в растворе и в образцах жировой ткани.

1.2 Материалы и методы

В качестве объекта исследования в рамках данной рабы и была вио.лна подкожная жировая ткань женщины в возрасте 42 лег и весом 85 кг, нзв ¡лкл,< ш при пластической операции. Количество образцов 12. г!олщипл .»Лм'л.ов варьировалась 150-200 мкм. Размеры образцов составляли 25 мм' I прение жировых клеток проводилось in vitro.

После замораживания, с помощью микротомного ножа делатпсл ткани. Затем приготовленный образец помещался на цхдмипое легло, окрашивался в течение 10 мин.

В экспериментах для окрашивания жировой ткани использована. [%-спиртово-водный раствор БЗ (1.05, 1.16, 1.5, 1.68, 2.1 "40" мо.пло и л'о-спиртово-водный раствор ИЗ (1.6, 1.8, 3.2, 6.45, 12.9 *10"1 мольл). Для илл^лия спектров поглощения использовались кюветы толщиной 100 мкм.

Исследование оптических свойств жировой ткани бы ю ввил ы^.о в спектральном диапазоне 250-900 нм на спектрофотометре Perkiii 1 hnei 1лл^(1а 950 с интегрирующей сферой, представляющем собой дв)\kaiu и»ь.»ш

дифракционный монохроматор со встроенной системой > прав "е..;, и регистрации сигнала. В качестве источника излучения использоиачась ; а.к>| еп^ая лампа накаливания. Размеры пучка света, падающего на образец - 3x5 мм

Изменения концентраций красителей в растворе и образце жпривои и.. т производился сравнительным методом с использованием закона .... >а-Ламберта-Беера.

1.3 Результаты и обсуждение

Для оценки оптических параметров жировой ткани был вино ни. ^дд спектрофотометрических измерений. На основе полученных зкеперп уенгалыилх данных были построены спектры оптической плотности подкожной жпроьой ткани, растворов БЗ и ИЗ, а также окрашенных БЗ и ИЗ образцов полк^ж-.ой жировой ткани.

На рис. 1.1 и 1.2 показаны типичные спектры полною протеките и диффузного отражения образца подкожной жировои ткани, не о^р^Н-Ю; пои красителем и окрашенной красителем (ИЗ), а на рис. 1.3 и Ы 1С же V пек ¡р. 1 с красителем (БЗ). Форма спектров неокрашенной ткани в видимом диапазоне д .лн волн определяется полосами поглощения оксигемоглобина кропи Н0~1--н5 им), локализованного в кровеносных капиллярах жировой ¡каши ¡.-д^, > лм поглощением у£-каротина, а также спектральной зависимоепло ко^ффь. .... га рассеяния [62, 63]. Основными рассеивателями в жировой псапи в иидк.^ой области являются сферические липидные неоднородное I и (и основном триглицериды) [62].

Как в видимой, так и ИК спектральных областях форма епек:ра з.*> .... го пропускания достаточно хорошо коррелирует с формой спектра дпфф;, отражения, т.е. с ростом длины волны наблюдается одновременной -над коэффициентов диффузного отражения и полного пропускания о.-Очим.. с резкими провалами в области полос поглощения гемоглобина, ¡зоды и ппч' . „

84-

о4-

аГ 80-

s У? j

г

та

^ о 76- е.

>> гл

с: о о. 72- №

с

68-

8,5л

400 500 600 700 800 900

длина волны, нм

Рисунок 1.1 - Спектры пропускания образца подкожной жировой ткани. ■ - неокрашенной ткани, о -окрашенная ИЗ и А - окрашенная ИЗ и отмытая в спиртово-водном растворе. Толщина 150 мкм. Концентрация ИЗ составляла 1.6 * 10 моль/л.

-4

400 500 600 700 800

длина волны, нм

Рисунок 1.2 - Спектры отражения образца подкожной жировой ткани. ■ - неокрашенная ткань, о - окрашенная ИЗ и А - окрашенная ИЗ и отмытая в спиртововодном растворе. Толщина 150 мкм. Концентрация ИЗ составляла 1.6 *10"4 моль/л

400 500 600 700 800

длина волны, нм

Рисунок 1.3 - Спектры пропускания образца подкожной жировой ткани. ■ - неокрашенная ткань, о -окрашенная БЗ и А - окрашенная БЗ и отмытая в спиртово-водном растворе. Толщина 150 мкм. Концентрация БЗ составляла 1.05 *10"4 моль/л

длина волны, нм

Рисунок 1.4 - Спектры отражения образца подкожной жировой ткани. ■ - неокрашенная ткань, о - окрашенная БЗ и А - окрашенная БЗ и отмытая в спиртоводном растворе. Толщина 150 мкм. Концентрация БЗ составляла 1.05 *10~4 моль/л

При измерениях спектров поглощения биологических объектов могут возникнуть искажения, причиной которых могут быть: а) эффект многократного отражения и рассеяния на частицах и б) эффект сита (или проскока).

В качестве нулевого приближения можно считать поглощение и рассеяние света независимыми процессами, т.е. измеряемая оптическая плотность D есть сумма оптической плотности, обусловленной светорассеянием Dp, и оптической плотности, обусловленной истинным поглощением Z>n,

D = DP+Dn. (1.1)

Чтобы найти D„ = f (I), нужно знать зависимость Dp от длины волны.

Известно, что для суспензии частиц в отсутствии поглощения Dp - рА/1, где [5 и п - константы, причем в зависимости от формы и размеров частиц п может иметь значения от 0 до 4.

В нашем случае производилась аппроксимация спектров окрашенной ткани с использованием программы Microsoft Origin с помошью функции Fit Multi-peaks

Л=П I 2S Ж

(Lorentzian: ^ л/л 0 ^ , /со\2 , где Dc - постоянная

р 4(Л-Л0) + {ОЛ)

составляющая сигнала, ),0 - длина волны, соответствующая максимуму, S -площадь под кривой, Ы - полуширина). Полученная кривая принималась за Dn, т.к. мультипиковое разложение приводит к автоматическому вычету Френелевского рассеяния. На рисунках 1.5 и 1.6 приведены спектры поглощения ИЗ и истинные спектры поглощения жировой ткани /)П(Д) (восстановленные с учетом рассеяния света) окрашенной ИЗ, а на рисунках 1.7 и 1.8 - спектры поглощения БЗ и истинные спектры поглощения жировой ткани />П(А), окрашенной БЗ, соответственно. В таблицах 1.1 и 1.2 приведены основные параметры спектров поглощения ИЗ и БЗ в растворах и в жировой ткани.

Из таблиц 1.1 и 1.2 видно, что при окраске происходит сдвиг максимумов поглощения. Смещения максимумов полос поглощения для длинноволновых и коротковолновых пиков красителей: у ИЗ равно 17.9 нм и 12.7 нм, а у БЗ приблизительно 3 нм и 11 нм, соответственно.

- 3-1

Н 2-

600 700 800 900

длина волны нм

. 0,6-,

о О X

н о с с

к

го

^

о ф

т

03

с о

0,0

о<

о

о

, о

V О

^о8

■ ■■■

дДЛддЛ^ ■■...........

500 600 700 800

длина волны, нм

900

Рисунок 1.5 - Спектры поглощения 40%-спиртово-водного раствора ИЗ концентрации 1.6 *10'4 моль/л - а, 1.8*10"4 моль/л - о, 3.2*10"4 моль/л -А, 6.45* 10"4 моль/л - V и 12.9*10"4 моль/л - 0, где йо - оптическая плотность раствора ИЗ.

о

а

.а

о -3

о

х

I-°2 с: к

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Янина, Ирина Юрьевна

5.5.2 Выводы

Наблюдаемые изменения эффективного показателя преломления можно интерпретировать как уменьшение относительного показателя преломления рассеивателей, которые указывают на иммерсионное оптическое просветление. Эти данные подтверждают гипотезу, что фотодинамическая терапия вызывает липолиз жировых клеток в течение некоторого периода времени после воздействия и в случае использования в качестве фотосенсибилизатора — индоцианинового зеленого, а в качестве источника излучения - ИК лазера.

6 Гистологический анализ подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo

6,1 Введение

Существует большое количество методов для удаления нежелательных жировых отложений. Лазерная липосакция является новой разработанной технологией для удаления жировых отложений [17, 18]. Применение этого метода приводит к некрозу адипоцитов, которые разрушаются, но не удаляются при липосакции [18].

Лазерный липосакция была описана в 1994 г. [19]. Эта инвазивная технология, однако, менее травматична по сравнению с традиционной липосакцией [21]. Гистологический анализ воздействия 1064 HM-Nd:YAG лазера и CW 980 нм-диодного лазера на подкожную жировую клетчатку человека показал как обратимые, так и необратимые клеточные повреждения [20, 22].

В исследованиях [22] использовался импульсный NdiYAG-лазер с длиной волны 1064 нм. Он генерирует очень короткие импульсы и характеризуется исключительно высокой пиковой мощностью (до 1000 Вт). Лазерная энергия подавалась в подкожную жировую клетчатку с помощью 300-микронного оптического волокна, проходящего через микроканюлю из нержавеющей стали диаметром 1 мм. Параметры излучения для всех пациентов были одинаковыми: длительность импульса 150 мкс, частота повторения 40 Гц и энергия 150 мДж (при мощности 6 Вт). Дистальный участок оптического волокна выступал из дистального конца канюли на 2 мм. Для визуализации в траекторию луча вводили гелий-неоновый источник. Благодаря пилотному красному лучу можно было получить точное представление о том, где работает лазер. Для введения канюли было достаточно разреза длиной 1 мм.

Фотомеханический и термальный эффекты играют важную роль в лизисе клеток. Мембрана адипоцита разрушается при быстрой абсорбции и нагреве клетки. Лазерная обработка имела разную продолжительность, а общая поданная энергия (накопленная энергия) зависела от размера обрабатываемого участка плотности ткани. Продукты распада клеток удаляли с помощью канюли-аспиратора диаметром 2,5 мм, к которой прикладывали отрицательное давление от 350 до 450 мм рт. ст.

В работе [22] обсуждаются физические принципы воздействия лазерного излучения на адипоцит и окружающие ткани, анестезия, методика применения лазера, конкретные случаи, преимущества, ограничения, новые показания, недостатки, осложнения и отдаленные результаты. Кроме того, путем гистологического исследования продемонстрированы принципы действия лазерного липолиза — фототермический и фотомеханический эффекты, оказываемые на жир и соседние ткани. Обработку жировой ткани (а также потовых желез и дермы) проводили контактным способом с помощью оптического волокна, проходящего через канюлю диаметром 1 мм. Попадая в предварительно инфильтрированную жировую ткань, световая энергия, вырабатываемая лазером, абсорбируется и превращается в тепло. Содержимое адипоцита расширяется, и его мембрана разрушается [17]. Вследствие быстрой абсорбции и нагрева клетки в лизисе может играть роль и фотоакустический эффект.

Липолиз можно определить как частичное или полное разрушение жировых клеток с высвобождением их содержания в межклеточное пространство [170, 176]. Смерть клетки может происходить под действием различных физических, химических и биологических факторов. В зависимости от индуктора, происходит клеточный ano птоз или некроз. Эти две формы клеточной гибели различаются по биохимическим и морфологическим признакам [184].

Другой оптический метод разрушения жировой ткани, а именно, фотодинамический / тепловой метод, может обеспечить минимально инвазивное удаление на клеточном уровне региональных и местных специфических скоплений абдоминальной или подкожной жировой ткани, вызывая апоптоз клеток и контролируемый некроз небольших количеств жировой ткани [23, 36, 37,

184, 185, 186, 187, 188]. В частности, эффект неинвазивного и без- или минимально-разрушающего объема жировой ткани связан с действием направленного оптического (лазерного) излучения соответствующей длины волны и мощности совместно с локальным селективным окрашиванием жировой ткани и/или обработкой липолитическим агентом и таким образом изменяет контур/форму местной конкретной жировой ткани.

Целью данной работы явилось гистологическое исследование подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo. В ходе исследования необходимо найти оптимальные дозы воздействия и технологию окраски, чтобы обеспечить контролируемый липолиз жировых клеток с минимальным влиянием на организм.

6.2 Материалы и методы

Группу 2-летних крыс-самцов из 30 особей содержали 14 суток, кроме стандартного рациона получали 5 г сахара, 5 г сухого молока, 5 г подсолнечного масла и 5 г яичного порошка с тем, чтобы вызвать алиментарное ожирение. Ожирение для крыс-самцов считается при весе >400 г. На 15 сутки крыс декапитировали. Группу разбивали на 3 подгруппы по 10 особей. На каждой особи в области ребер удалялся волосяной покров, и делалась разметка (рисунок 6.1). Зона 1 была контрольная и данная область не подвергалась никакому воздействию (ни окраска, ни облучение). В зону 2 делалась инъекция красителя. Первой подгруппе подкожно вводился краситель бриллиантовый зеленый, растворенный в физиологическом растворе (концентрация 1мг/мл) (раствор 1). Второй подгруппе - индоцианиновый зеленый, растворенный в физиологическом растворе (концентрация 1мг/мл) (раствор 2). Третьей подгруппе индоцианиновый зеленый, растворенный в специальной смеси, состоящей из 25% спирта, 25% глицерина и 50% дистиллированной воды (раствор 3). Зона 3 подвергалась воздействию облучения источника. Для первой подгруппы использовалась диодная лампа с длиной волны 625 нм. Длительность облучения

10 мин. Для второй и третей подгрупп диодный лазер LS-2-N-808 -10000 с длиной волны 808 нм. Плотность энергии варьировалась в пределах 480-1440 Дж/см2. Длительность облучения 0.5-8 мин. В зону 4 сначала делалась инъекция красителя, а затем (через 10-15 мин) производилось облучения источником. Крысы всё время воздействия находились под действием местного наркоза (золетил). Через 1 час после воздействия крыс декапитировали. Кусочки кожи и подкожной жировой клетчатки фиксировали в 10% растворе формалина. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. С помощью этих препаратов определяли изменения, происходящие в подкожной жировой клетчатке после фотодинамического воздействия.

Рисунок 6.1 - Экспериментальное животное с нанесенными зонами воздействия

В последующем был произведен патоморфологический анализ срезов. Статистический анализ данных был выполнен с использованием пакета "Statistics 6.0", в частности, Q критерий Кохрана, являющийся непараметрическим критерием, применяемым для сравнения двух связанных выборок, где переменная может иметь только два возможных значения (закодированные как 0 и 1). Этот критерий позволяет достаточно быстро определить какое из к воздействий эффективнее [148].

6.3 Результаты и обсуждение

6.3.1 Выбор параметров лазерного излучения

На начальном этапе, искали дозу излучения, которая привела бы к минимальным повреждениям в тканях.

В результате было обнаружено, что при режимах работы лазера следующих: 24 Вт/см и 8 мин и больше - в препаратах определяется участок выраженной деструкции неправильной формы, в котором границы между клетками эпидермиса и жировой ткани стерты, ядра клеток фрагментированы. Отмечается слущивание рогового слоя. В дерме видны выраженные признаки деструкции соединительной ткани: гомогенизация и набухание волокон, разрушение ядер клеток. При режимах 24 Вт/см2 и 1.2 мин и менее признаки повреждения кожи и жировой ткани выражены гораздо в меньшей степени. Основные изменения локализуются в дерме и представлены набуханием волокон соединительной ткани и их бесструктурностъю. Наименьшие изменения наблюдаются при минимальном воздействии (16 Вт/см , 0.5 мин) на образцы.

Аналогично проведены оптимальный режим работы диодной лампы -длительность облучения 10 мин.

6.3.2 Гистологический анализ контрольных образцов

Образцы состояли из срезов кожи с подкожной жировой клетчаткой. В контрольных образцах (зона 1) изменений в эпидермисе и дерме (рисунок 6.2), и подкожной жировой ткани (рисунок 6.3) не наблюдалось. Эпидермис тонкий, клетки не имеют дистрофических изменений. Дерма представлена коллагеновыми волокнами, распределенными по различным направлениям и расположенными близко друг к другу. Контуры жировых клеток четкие. Мышечные волокна с хорошо выраженной поперечной исчерченностью. Придатки кожи не изменены.

6.3.3 Гистологический анализ образцов после инъекции красителя

Первой подгруппе животных были сделаны подкожные инъекции БЗ в физиологическом растворе (раствор 1), второй подгруппе - ИЗ в физиологическом растворе (раствор 2), а третьей - в специальной спиртовой смеси (раствор 3). В образцах, соответствующих зоне 2, т.е. подкожной инъекции раствора 2 ИЗ, существенных изменений в эпидермисе и дерме не наблюдалось (рисунок 6.4аб). В дерме присутствуют очаги разволокнения коллагеновых волокон. Вероятно, это связано с механическим воздействием осмоса воды через мембрану клетки. В большинстве случаев жировая клетчатка не изменена. Жировые клетки имеют вид оптически пустых вакуолей с тонкой оболочкой и только в одном случае - цитоплазматическая мембрана утолщена и имеет двухконтурный вид (рисунок 6.5, рисунок 6.6а). На отдельных участках мембраны разрушены. Для животных второй подгруппы характерен нормальный эпидермис. В отличие от третьей группы животных, в образцах которых заметно уменьшение толщины эпидермиса и коллаген-эластинового матрикса под действием раствора 3, содержащего спирт (рисунок 6.66). Инъекция раствора 3 ИЗ приводит к разбуханию адипоцитов, а в некоторых случаях - к их некрозу (рисунок 6.66). В дерме имеется отек, сопоставимый по выраженности с предыдущей группой. В образцах присутствуют очаги некроза. В одном случае среди некротизированных жировых клеток обнаруживаются клеточные инфильтраты из лейкоцитов, плазматических клеток, эозинофилов, макрофагов (рисунок б.бв) [189, 190]. Большинство клеток локализуется вокруг полнокровных сосудов. В месте введения раствора красителя отслеживается разволокнение коллагеновых волокон в дерме и образование оптических пустот (рисунок 6.7).

5ЖЭ- ^^аашжшх мегь ш^

• * • г дерм« V* Ж

О.ЧШ'^МН ЖП|>0|ШЯ а"'1'«»' *• ч I

V®* 1

Рисунок 6.2 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи с подкожной жировой клетчаткой и мышечным слоем не подверженная никакому воздействию. Контрольный образец. Объектив 4*

Г'г

Рисунок 6.3 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки не подверженная никакому воздействию.

Контрольный образец. Объектив 40х .

ШШ. зк , X.% »«гчК ?т ■

Рисунок 6.4 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи (эпидермис и дерма) при подкожном введения раствора 2 ИЗ (0.5 мг/мл в физиологическом растворе): (а) объектив 10х и объектив 4х (б).

Рисунок 6.5 - Гистология (окраска Ц, гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном введении раствора 1 БЗ (10~4 мг/мл)

Рисунок 6.6 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном введении раствора ИЗ (0.5 мг/мл): (а) - раствор 2 (ИЗ в физиологическом растворе); (б) и (в) - раствор 3 (спирт: глицерин: вода= 0.25: 0.25: 0.5). На (в) выделены области некроза (прямоугольник) с клеточной инфильтрацией лейкоцитов, плазматических клеток, эозинофилов, макрофагов. Объектив 40х.

Описанная морфология изменения жировых клеток связана с подкожным введением спиртоглицериновой смеси. Это подтверждает гипотезу о том, что спирт вызывает обратимые/необратимые повреждения в мембране клеток с образованием пор [56, 57, 58].

Рисунок 6.7 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи при подкожном введении раствора 3 ИЗ (ИЗ 0.5 мг/мл; спирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5). Объектив 40х.

6.3.4 Гистологический анализ образцов после облучения источником

В образцах зоны 3, после облучения диодным лазером (плотность энергии, 960 Дж/см2 и времени облучения 1 мин) или диодной лампой (плотность энергии,

720 Дж/см и время облучения 15 мин), наблюдались незначительный отек и изменение эпидермиса, в виде деструкции клеток - акантоз (рисунок 6.8). Эпидермис сохранен. В дерме отек не выражен. Коллагеновые волокна располагаются компактно и несколько утолщены. Жировые клетки увеличены в размерах, имеют более вытянутую форму, чем в контроле. Клеточный матрикс четко и интенсивно окрашен гематоксилином (рисунок 6.9). По сравнению с контрольным образцом (см. рисунок 6.96) изменения в жировой ткани значительные. В связи с трансмембранным клеточным липолизом жировые клетки изменены в размерах. Присутствие макрофагов свидетельствует о воспалительном процессе (рисунок 6.9а) [189, 190].

Рисунок 6.8 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи с признаками деструкции эпидермиса и образованием клеточных инфильтратов после лазерного облучения. Диодный лазер, 808 нм; плотность энергии, 960 Дж/см2. Длительность облучения, 1 мин. а) Объектив 4х, б) Объектив 40х.

Рисунок 6.9 - а) Гистология (о кр ас ка гемато кс илин-эоз ином) подкожной жировой клетчатки после лазерного облучения. Диодный лазер, 808 нм; плотность энергии, 960 Дж/см2. Длительность облучения, 1 мин. Объектив 40х. б) Гистология (окраска гемато кс илин-эоз ино м) подкожно й жировой клетчатки не подверженная никакому воздействию. Контрольный образец. Объектив 40*

Рисунок 6.11 - Гистология (окраска гематоксилин- Рисунок эозином) кожи при подкожном введении раствора ИЗ (0.5 мг/мл): а) - раствор 2 (ИЗ 0.5 мг/мл в

6.12

Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи при подкожном физиологическом растворе) и б) - раствор 3 (ИЗ 0.5 введении раствора 3 ИЗ мг/мл; спирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5) и последующем лазерном облучении (плотность

ИЗ 0.5 мг/мл; спирт: глицерин: вода = 0.25:

0.25: 0.5) и энергии, 960 Дж/см2, время облучения 1 мин), последующем лазерном

Объектив 4х. облучении (плотность энергии, 960 Дж/см , время облучения 1 мин). Объектив 40х

I ' л ¿'/""«аир®

Г Ч Щ

• Л 1 м чр'^Ч »11 » • шмкЯ *

Рисунок 6.13 - Гистология (окраска Рисунок 6.14 - Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном жировой клетчатки при подкожном введении раствора 3 ИЗ (ИЗ 0.5 мг/мл; введении раствора БЗ (10"4 мг/мл в спирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5) физиологическом растворе) и и последующем лазерном облучении последующем облучении диодной плотность энергии, 960 Дж/см2, время лампой. Диодная лампа, 625 нм; облучения 1 мин). Объектив 40х плотность энергии, 720 Дж/см .

Длительность облучения, 15 мин.

Объектив 40х.

В образцах, соответствующих зоне 4, при введении подкожно спиртового раствора индоцианинового зеленого и последующем облучении диодным лазером (плотность энергии 960 Дж/см и длительность облучения 1 мин) наблюдались изменения в подкожной жировой клетчатке. Зарегистрирован некроз в эпидермисе и подлежащей дермы, а также образование сосочковых выростов в эпидермисе, которые затем слущиваются (рисунок 6.116 и рисунок 6.12). Эти процессы подобны работе [191]. При больших значениях плотности энергии с одного импульса в коже возникал абляционный кратер; при меньших значениях с одного импульса происходило выдавливание вещества; при самых малых значениях происходило интенсивное высушивание, и формировался прогиб поверхности. Некроз распространяется до дермы (рисунок 6.96) и жировой ткани (рисунок 6.13).

Благодаря сенсибилизации ИЗ жировых клеток происходило селективное поглощение лазерного излучения, вызывающего фотодинамические изменения, приводящие к гибели клеток. Эти экспериментальные данные также подтверждают предложенную гипотезу.

В этом исследовании не разделяли фотодинамические и фототермические реакции, потому что целью было поиск биологических эффектов, таких как повреждение клетки с последующим липолизом и некрозом. На основе предыдущих in vitro исследований [111], где тонкие срезы жировой ткани, сенсибилизированные водно-спиртовым раствором ИЗ (1 мг/мл) облучались в течение 1 мин лазером с длиной волны 808 нм и плотность энергии 960 Дж/см2 при постоянной температуре (термостат, Т = 40°С), и где происходил липолиз клеток в течение 50 минут, развивающийся после лазерного облучения можно выдвинуть гипотезу, что у фото динамического действия также может иметь место в повреждении клетки в наших исследованиях in vivo. Эти эксперименты нелегко сравнивать, однако, необходимо обосновать намного более высокую плотность энергии в экспериментах in vivo по сравнению с in vitro, на поверхности кожи на конце оптоволокна излучателя и в глубине ткани плотность энергии намного меньше, а также температура тела животных 35°С. Эти две причины позволяют рассматривать и in vitro и in vivo эксперименты в одинаковом диапазоне параметров, которые делают возможным фотодинамическую реакцию на фоне возможно более сильной фототермической реакции. Очевидно, некоторая синергетика этих двух реакций также возможна как на уровне основных фотофизических/фотохимических процессов, так же как и на уровне биологического ответа. Поскольку все ключевые процессы, такие как краситель и обеспеченность кислородом, увеличение проницаемости клеточной мембраны, являются зависимыми от температуры, и повреждение клетки в результате фотодинамического действия, может помочь для повреждения вызванного нагревом и наоборот.

Заключение

На основе анализа измеренных спектров поглощения можно утверждать о сдвиге положения максимумов полосы поглощения фотосенсибилизаторов в жировой ткани по сравнению с их спектрами в растворах. Сдвиг обусловлен взаимодействием молекул ИЗ и БЗ с коллагеном и другими белковыми молекулами, входящими в основном в состав межклеточного матрикса (септа, диаметр волокон порядка 50-200 нм). Анализируя спектры красителей в растворах и в тканях, важно отметить также изменение формы спектров. Интенсивность пика, соответствующего вкладу молекул-мономеров, существенно снижается и становится сравнимой с интенсивностью пика от вклада молекул-димеров. На основе полученных спектров были рассчитаны концентрации красителей в ткани.

Для эффективного возбуждения используемых в работе молекул красителей были подобраны выпускаемые промышленностью и применяемые для медицинских целей источники излучения со спектрами излучения, максимально возможно соответствующими спектрам поглощения, используемых красителей. Например, широкополосные линии испускания диодной лампы (442 и 597 нм) достаточно хорошо соответствуют также широким полосам поглощения бриллиантового зеленого (440 и 650 нм). Максимум испускания диодного лазера (808 нм) попадает в полосу поглощения молекул индоцианинового зеленого, находящихся в связанном состоянии с белками в биоткани (805-810 нм).

Экспериментально обнаружено повышение оптического пропускания сенсибилизированной водно-спиртовым раствором бриллиантового зеленого при концентрации 6 мг/мл жировой ткани человека после ее облучения на длинах волн 442 и 597 нм с общей плотностью мощности излучения не превышающей 75 мВт/см. Расчет временного и пространственного изменения оптического пропускания жировой ткани на основе статистической обработки цифровых изображений, полученных в проходящем свете, позволяет количественно оценить степень и кинетику процессов в жировой ткани в ответ на фотодинамическое действие. Анализ кинетики оптического пропускания сенсибилизированной жировой ткани после ее облучения позволил предложить метод «мягкой» редукции объема ткани путем липолиза жировых клеток без их существенной деструкции.

Вблизи поверхности мембран клеток жировой ткани впервые экспериментально зарегистрированы небольшие образования (структуры), размерами от 2 до 8 мкм, которые характеризуются изменяющимся во времени оптическим пропусканием и трактуются как капельки внутриклеточной жидкости, секретируемой через образованные поры в мембране.

На основе цифровой микроскопии экспериментально показано, что характер изменения оптических характеристик селективно облученной жировой ткани различен для различных сенсибилизаторов. Показано, что выравнивание пропускания по площади биообъекта имело место как в случае сенсибилизатора БЗ, так и ИЗ, однако, просветление жировой ткани наступало лишь для БЗ. Показано, что отличие оптического отклика на фотодействие на сенсибилизированную жировую ткань обусловлено спектрами поглощения света красителями и спектральным составом источников облучения ткани.

Показано увеличение эффективности процесса просветления жировой ткани, вызванного фотодинамическим эффектом, при нагреве ткани до температур 40-50 °С.

Впервые сделан анализ патоморфологических изменений подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo. Было показано, что выбором красителя (концентрации, способа введения в ткань) и параметров светового облучения (длина волны, плотность энергии) можно обеспечить контролируемую редукцию жировой ткани вплоть до ее полной деструкции. Например, при подкожном введении водно-спиртовых растворов бриллиантового зеленого и индоцианинового зеленого и чрезкожном облучении

-у излучением диодной лампы (625 нм, плотность энергии 720 Дж/см ) и диодного лазера (808 нм, плотность энергии 960 Дж/см ) соответствующих областей на теле экспериментальных животных в коже, жировой и мышечной ткани животных развивались выраженные изменения, в том числе в подкожной жировой клетчатке наблюдалась распространенная деструкция.

По результатам работы опубликованы статьи в реферируемых изданиях и журналах:

1. Янина И.Ю., Симоненко Г.В., Кочубей В.И., Тучин В.В. Спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями // Оптика и спектроскопия. — 2010. — Т. 109, №2. — С. 1303-1311

2. Tuchin V.V., Altshuler G.B., Yanina I.Yu., Kochubey V.I., Simonenko G.V. Fat tissue staining and photodynamic/photothermal effects // Proc. SPIE. Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics VII, San Francisco, California, USA. — 2010. — V.7563. — P. 75630V1-7.

3. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Inhomogeneity of photo-induced fat cell lip о lysis // Proc. SPIE. — 2011. — V. 7999. — P. 7999-21

4. Дубровский В.А., Дворкин Б.А., Янина И.Ю., Тучин В.В. Фотовоздействие на клетки жировой ткани человека in vitro II Цитология. —2011. — Т.53, №5. — С. 423-432.

5. Yanina I.Y., Orlova T.G., Tuchin V.V., Altshuler G.B. The morphology of apoptosis and necrosis of fat cells after photodynamic treatment at a constant temperature in vitro II Proc.SPIE Mechanisms for Low-Light Therapy VI, edited by Michael R. Hamblin, Ronald W. Waynant, Juanita Anders. — 2011. — V.7887. — P. 78870X-1-7.

6. Yanina I.Yu., Bochko V.A., Alander J.T., and Tuchin V.V. Optical image analysis of fat cells for indocyanine green mediated near-infrared laser treatment // Laser Phys Lett. —2011. —V.8, No.9. —P. 684-690.

7. Yanina I.Yu., Tuchin V.V., Suleymanova L.V., Bycharskaya A.B., Maslyakova G.N. Fat tissue histological study at NIR laser treatment of the human skin in vitro II Proc. SPIE. — 2011 — Vol.8092. — P. 809215-1-8.

8. Дубровский B.A., Янина И.Ю., Тучин B.B. Кинетика оптических свойств жировой ткани in vitro как результат фотодинамического действия // Биофизика — 2012. — Т.57,№1.—С. 115-119.

9. Yanina I.Yu., Tuchin V.V., Navolokin N. A., Matveeva O.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G.N., Altshuler G.B. Fat tissue histological study at ICG- mediated photothermal/photodynamic treatment of the skin in vivo II JBO — 2012. — V.17, No.5.—P. 058002-1-9

10. Yanina I.Yu., Kochubey V.l., Tuchin V.V., Portnov S.A., Svenskaya Yu.I., Gorin D.A., Ponomareva E.G., Nikitina V.E. Effect of bacterial lectin on acceleration of fat cell lipolysis at in vitro diode laser treatment using encapsulated ICG // Proc. SPIE. — 2012. — V. 8337. — P. 83370F-1-7.

11. Yanina I.Yu., Navolokin N.A., Nikitina V.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G.N., and Tuchin V.V. Studies of lipid peroxidation of rat blood after in vivo photodynamic treatment // Proc. SPIE. —2012. — V. 8337. — P. 83370G-1-7.

12. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Temporal change of adipose tissue refractive index at photodynamic treatment: in vitro study using OCT // Proc. SPIE. — 2012. — Vol. 8222. — P. 82221G- 1-6.

13. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Porosity of photo-induced fat cell lipolysis // Proc. SPIE. — 2012. — Vol. 8427. — P. 842748-1-9.

14. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical coherence tomography of adipose tissue at photo dynamic/photo thermal treatment in vitro // Journal of Innovative Optical Health Sciences on Advances. — 2013. — V. 6, No.2. — P. 1350010-1-7

15. Yanina I.Yu., Doubrovsky V.A., Tuchin V.V. Control of optical transmittance of fat tissue slices at NIR photodynamic action mediated by indocyanine green // Proc. SPIE. — 2013. — V. 8699. — P. 86990C-1-7.

16. Янина И.Ю., Дубровский В.А., Тучин B.B. Оптическая регистрация пор в мембране жировой клетки / И. Ю. Янина, В. А. Дубровский, В. В.Тучин // Оптика и спектроскопия — 2013. — Т. 115, №2. — С. 62-67.

17. Ганилова Ю.А., Долмашкин A.A., Дубровский В.А., Янина И.Ю., Тучин В.В. Оптическая цифровая микроскопия для цито- и гематологических исследований in vitro II Оптика и спектроскопия. — 2013 — Т. 115, №2. — С. 6874.

Статьи в материалах международных и российских конференциях:

1. Genina E.A., Zubkova E.A., Korobko A.A., Yanina I.Yu., Bashkatov A.N., Kamenskikh T.G., Galanzha V.A., Tuchin V.V. Diffusion of Cortexin and Retinalamin in eye sclera // Saratov Fall Meeting 2006: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VIII, edited by Valeiy V. Tuchin, Proc. SPIE. — 2007. — Vol. 6535. — P. 65351Y- 1-6

2. Tuchin V.V., Yanina I.Yu., Simonenko G.V. Destructive fat tissue engineering using photodynamic and selective photothermal effects // Proc SPIE. — 2009. — V.7179. — P.71790C.1-11

3. Янина И.Ю., Симоненко Г.В., Тучин B.B. Физические способы воздействия на жировую ткань // Проблемы оптической физики, Материалы 11-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. —2008. — С. 64-76

4. Тучин В.В., Дубровский В.А., Янина И.Ю. Статистическая обработка цифровых фотографий как метод анализа фотодинамической деструкции жировой ткани in vitro II Проблемы оптической физики, Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2009. — С. 40-45

5. Бочко В.А., Аландер Я.Т., Тучин В.В., Янина И.Ю. Медицинская визуализация и терапия с использованием индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов.

2009. — С. 56-63

6. Yanina I.Yu., Bochko V.A., Simonenico G.V., Välisuo P.O., Alander J.T., and Tuchin V.V. Photo analysis methods for fat cell destructive engineering // Proc. SPIE.

2010. — Vol. 7547. — P. 754708-1-8

7. Дубровский B.A., Янина И.Ю., Тучин B.B. Регистрация неравномерности фотоиндуцированного липолиза жировых клеток методом цифровой микрофотографии действия // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. —2011. — С. 96-105

8. Янина И.Ю., Симоненко Г.В., Тучин В.В., Медведев Б.А. Лабораторная работа «Фотодинамическая терапия жировой ткани» // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2011. — С. 122-130

9. Козина A.M., Янина И.Ю., Свенская Ю.И., Генина Э.А., Портнов С.А., Башкатов А.Н., Тучин В.В. Фотодинамический липолиз с использованием индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2011. — С. 113-118

10. Ганилова Ю.А., Дубровский В.А., Янина И.Ю., Тучин В.В. Особенности методики оптической цифровой микроскопии для биомедицинских исследований in vitro // Проблемы оптической физики, Материалы 14-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2012. — С. 30-38

11. Янина И. Ю. Фотодинамическое локальное разрушение жировой ткани in vitro II Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием. Молодежь и наука, итоги и перспективы YSRP'08. — 2009. — С. 7

12. Янина И. Ю. Выявление фотодинамической деструкции жировой ткани с помощью непараметрических статистических критериев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием. Молодежь и наука, итоги и перспективы YSRP'09. —2010. — С. 59

13. Янина И. Ю. Статистическая обработка цифровых фотографий как метод анализа фотодинамической деструкции жировой ткани in vitro II Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» МУ-ЗР'09. —2010. — С. 238-239.

14. Янина И. Ю. Изменение оптических свойств жировой ткани в результате фотодинамического действия in vitro II Материалы 71 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» МУ-ЗР' 10. — 2011.

С. 265-266.

15. Козина A.M., Янина И.Ю. Фотодинамический липолиз с использованием индоцианина зеленого // Материалы 71 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» МУ-ЗР' 10. — 2011. — С. 259.

16. Янина И.Ю., Ганилова Ю.А. Опыт цитологических исследований на основе оптической цифровой микрофотографии // Материалы 72 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые - здравоохранению региона» МУ-ЗР' 11. — 2012.

С. 268

17. Янина И.Ю., Гордеев A.B., Дахчуков Ш.Р. Исследование фотохимического образования пор в мембране жировой клетки на основе цифровой микроскопии // Материалы 73-й студенческой научно-практической конференции в рамках первой Всероссийской недели науки с международным участием, посвященной дню российской науки «Молодые ученые - здравоохранению», Издательство Саратовского медицинского университета. —2012. —С. 192

18. Янина И.Ю., Симоненко Г.В., Тучин В.В. Инженерия жировой ткани при фотодинамической и фототермической деструкции in vitro / И. Ю. Янина, Г. В. Симоненко, В. В. Тучин // 111 Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» 21-25 июня 2010. Сборник материалов. Москва, Секция Оптико-информационные технологии и биомедицинская фотоника. Устные доклады. — 2010. —Т.З. —С. 35-37

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Янина, Ирина Юрьевна, 2013 год

Список литературы

1 Бутрова С. А. Фармакотерапия: Современные подходы к лечению ожирения // Фармацевтический вестник. — 2005. — №7. — С. 370.

2 Боброва Т. Лишний вес не только греет // Санкт-Петербургские Ведомости. — 2001. —№ 165. — С. 2555.

3 Гинзбург М. М. Как победить избыточный вес. — Самара: Парус, 1999. — 110 с. 4Токин Б. П. Общая эмбриология — М: Высшая школа, 1970. — 508с.

5 Заварзин, А. А. Основы сравнительной гистологии / А. А. Заварзин — JI: Изд. Ленинградского университета, 1985. — 400 с

6Solarte Е., Gutierrez О., Neira R., Arroyave J., Isaza С., Ramirez H., Rebolledo A. F., Criollo W., Ortiz C. Laser-induced lipolysis on adipose cells // Proc. SPIE. — 2004. — V. 5622. —P. 5-10.

7Rohrich R. J., Beran S. J., Kenkel J. M. Ultrasound-Assisted Liposuction. —St. Louis, Missouri: Quality Medical Pub, 1998. — 412 p.

8Rabiner R., Hare B. Ultrasonic Medical Device for Tissue Remodelling. / Patent №1. EP20010955077. —2003.

9 Shmitt J.M, Gandbakhche A.H., Bonner R.F. Use of Polarized Light to Discriminate Short-Path Photons in a Multiply Scattering Medium // Appl. Opt. — 1992. — V.31. — P. 6535-6546

10Игнатьева Н.Ю., Гроховская Т.Е., Лунин В.В., Баграташвили В.Н., Свиридов А.П., Махмутова Г.Ш. Лаз ер но-индуцированные структурные и химические изменения жировой ткани // Журнал физической химии. — 2002. — Т. 76, № 8. — С. 1357-1364.

11 Смолянская О. А. Исследование термоиндуцированных изменений оптических свойств жировой ткани трансллюминационным, спектральным и флуоресцентным

методами: диссертация на соискание ученой степени кандидата физ.-мат. наук: 01.04.05. —Спб., 2007.— 167 с

12 Altshuler G. В., Anderson R. R., Manstein D., Zenzie H. H., Smirnov М. Z. Extended theory of selective photothermolysis // Lasers in Surgery and Medicine. — 2001. — V. 29. — P. 416-432

13 Anderson R. R., Farinelli W., Laubach H., Manstein D., Yaroslavsky A. N., Gubeli 111 J., Jordan K., Neil G. R., Shinn M., Chandler W., Williams G. P., Benson S. V., Douglas D. R., and Dylla H. F. Selective Photothermolysis of Lipid a Rich Tissues: A Free Electron Laser Study // Lasers in Surgery and Medicine. — 2006. — V.38. — P. 913-919

14 Salzman M. J. Laser lipolysis using a 1064/1319-nm blended wavelength laser and internal temperature monitoring // Semin. Cutan. Med. Surg. — 2009. — V.28. — P. 220 -225

15 Longo L. Non surgical laser and light in the treatment of chronic diseases: a review based on personal experiences // Laser Phys. Lett. — 2010. — V.7. —P. 771-786

16 Kim К. H., Geronemus R. G. Laser lipolysis using a 1064 nm Nd:YAG laser // Dermatol. Surg. — 2006. — V.32. — P.241-248.

17 Goldman A., Schavelzon D. E., Blugerman G. S. Laserlipolysis: Liposuction using Nd-YAG laser// Rev Soc Bras Cir Plast. — 2002. — V.17. —P. 17-26 18Zulmira, A., Badin E. D., Gondek L. В. E., Garcia M. J., do Valle L. C., and Flizikowski F. B. Z. Analysis of Laser Lipolysis Effects on Human Tissue Samples Obtained from Liposuction // Aesthetic Plastic Surgeiy. — 2005. — V.29, No.4. —P. 281-286

19 Apfelberg D. В., Rosenthal S., Hunstad J. P. Progress report on multicenter study of laser-assisted liposuction // Aesth Plast Surg. — 1994. — V. 18. — P. 259-264 20Zulmira A., Badin D., Moraes L. M., Gondek L., Chiaratti M. G., and Canta L. Laser Lipolysis: Flaccidity Under Control // Aesth. Plast. Surg. — 2002. — V.26. — P. 335339

21 Prado A., Andrades P., Danilla S., Leniz P., Castillo P., Gaete F. Controlled Clinical Trial Comparing Laser-Assisted Lipoplasty with Suction-As sis ted Lipoplasty // Plast. Reconstr. Surg. —2006. — V. 118. —P. 1032-1045

22Mordon S., Eymard-Maurin A., Wassmer В., Ringot J. Histologic evaluation of laser lipolysis: Pulsed 1,064 nm Nd:YAG laser versus CW 980nm diode laser // Aesth. Surg. J. — 2007. — V. 27. — P. 263-268

23 Ichikawa K., Miyasaka M., Tanaka R., Tanino R., Mizukami K., Wakaki M. Histologic and photonic evaluation of a pulsed Nd:YAG laser for ablation of subcutaneous adipose tissue // Lasers. Surg. Med. — 2005. — V.36. —P. 43-46 24Фильченков А.А., Стойка P.C. Апоптоз и рак / А. А. Фильченков, P. С. Стойка

— К.: Морион, 1999. — 524 с

25 Уманский С. Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы //

Молекулярная биология —1996. — Т.ЗО, Вып.З. — С.487-502

26Манских В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология.

— 2007. — Т. 49, № 11. — С. 909-915.

27 Душников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). —М.: Медицина, 2001. — 192 с.

28 Ray S.D., Corcoran G.B. Cell Death and Apoptosis. // In: "General and Applied Toxicology," B. Ballantyne, T. Marrs andT. Syversen, Eds —US A: Nature Publishers, 2009.—Vol. 1,—P. 247-312

29 Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death // Toxicol Pathol. — June 2007. — Vol. 35, No. 4. — P. 495-516

30 Banfalvi G. Apoptosis. // In: "Apoptotic Chromatin Changes", Springer, 2009. — P. 203-292

31 Gobe G., Harmon B. Apoptosis: Morphological Criteria and Other Assays [Электронный ресурс] // Encyclopedia of life sciences. —2008. — Режим доступа: www.els.net

32 Lawen A. Apoptosis - an introduction // BioEssays —2003. —V. 25 —P. 888-896

33 WuM., Ding H.-F., Fisher D.E. Apoptosis: Molecular Mechanisms [Электронный ресурс] // Encyclopedia of life sciences —2001— Режим доступа: www.els.net

34 Ярилин А. А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Патол.физиол.эксп. терап. — 1998. —№2. — С. 38-48

35 Ермолаева М. Инструктивный апоптоз и рецепторы смерти [Электронный ресурс] — Режим доступа: http У/www. vitaeauct.narod.ru/005/mrf/0300.htm

36 Yanina I.Yu., Simonenko G.V., Tuchin V.V. Destructive fat tissue engineering using photodynamic and selective photothermal effects // Proc SPIE. — 2009. — V.7179. — P.71790C.1-11

37Doubrovsky V.A., Yanina l.Yu., Tuchin V.V. Inhomogeneity of photo-induced fat cell lipolysis //Proc. SPIE. —2011. — V. 7999. —P. 7999-21.

38 Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. — М.: Дрофа, 2006. — 287 с

39 Biomedical Photonics Handbook / editor-in-chief Т. Vo-Dinh — London, New York, Washington, D.C.: CRC PRESS Boca Raton— 2003. — 1872 p.

40 Дарвин M.E., Застров Л., Гончуков С.А., Ладеманн Ю. Влияние инфракрасного излучения на содержание каротиноидов в коже человека // Оптика и спектроскопия. — 2009. — Т. 107, №6. — С. 967-971

41 Wanner М., Avram М., Gagnon D., Mihm Jr. М.С., Zurakowski D., Watanabe K., Tannous Z., Anderson R.R., and Manstein D. Effects of Noninvasive, 1210 nm Laser Exposure on Adipose Tissue: Results of a Human Pilot Study // Lasers in Surgery and Medicine. — 2009. — V. 41. — P.401-407

42 Yannuzzi L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting // Am J Ophthalmol. — 2011 May — Vol.151, No.5.—P. 745-751.el

43 Ebert B, Riefke B, Sukowski U, Licha K. Cyanine dyes as contrast agents for near-infrared imaging in vivo: acute tolerance, pharmacokinetics, and fluorescence imaging // Journal of Biomedical Optics — 2011 Jun — Vol. 16, No.6. — P. 066003

Genina E.A., Bashkatov A.N., Simonenko G.V., Odoevskaya O.D., Tuchin V. V., Altshuler G.B. Low-intensity indocyanine-green laser phototherapy of acne vulgaris: pilot study // Journal of Biomedical Optics. —2004. — V.9, No.4. — P. 828-834.

45 Chen W.R., Adams R.L., Heaton S., Dickey D.T., Bartels K.E., and Nordquist R.E. Chromophore-enhanced laser-tumor tissue photothermal interaction using an 808-nm diode laser // Cancer Lett. — 1995. — V. 88. — P. 15-19.

46 Chen W.R., Adams R.L., Higgins A.K., Bartels K.E., and Nordquist R.E. Photothermal effects on murine mammary tumors using indocyanine green and an 808-nm diode laser: an in vivo efficacy // Cancer Lett. — 1996. — V. 98. — P. 169-173.

47 Fickweiler S., Szeimies R.M., Baumler W., Steinbach P., Karrer S., Goetz A.E., Abels C., Hofstadter F., and Landthaler M. Indocyanine green: intracellular uptake and phototherapeutic effects in vitro // J. Photochem. Photobiol. В Biol. — 1997. — V. 38. — P. 178-183

48 Abels C., Fickweiler S., Weiderer P., Baumler W., Hofstadter F., Landthaler M., and Szeimies R.-M. Indocianine green (ICG) and laser irradiation induce photooxidation // Arch. Dermatol. Res. — 2000. — No.292. — P. 404-411

49 Baumler W., Abels C., Karrer S., Weis Т., Messmann H., Landthaler M., and Szeimies R.-M. Photo-oxidative killing of human colonic cancer cells using indocyanine green and infrared ligh // Br. J. Cancer. — 1999. —V.80, No3/4. — P. 360363

50 Shafirstein G., Baumler W., Hennings L.J., Siegel E.R., Friedman R., Moreno M.A., Webber J., Jackson C., Griffin R.J. Indocyanine green enhanced near-infrared laser treatment of murine mammary carcinoma // Int J Cancer. — 2012 — V. 130, No. 5. — P. 1208-15

51 Mane V.S., Vijay Babu P.V. Studies on the adsorption of Brilliant Green dye from aqueous solution onto low-cost NaOH treated saw dust // Desalination. — 2011. — V. 273, Is. 2-3. —P. 321-329

52 Мчедлов-Петросян H.O., Суров Ю.Н., Трофимов В.А., Цивадзе А.Ю. Колебательные спектры некоторых трифенилметановых красителей и их строение

в растворах // Теоретическая и экспериментальная химия. — 1990. — Т.26, №6. — С. 688-698

53 Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия. —2005. — Т. 99, № 4. — С. 582-588

54 Genina Е.А., Bashkatov A.N., Sinichkin Yu.P., Kochubey V.l., Lakodina N.A., Altshuler G.B., Tuchin V.V. In vitro and in vivo study of dye diffusion into the human skin and hair follicles // Journal of Biomedical Optics. — 2002. — V.7, No3. — P. 471-477

55 Engel E., Schraml R., Maisch Т., Kobuch К., König В., Szeimies R.-M., Hillenkamp J., Bäumler W., and Vasold R. Light-Induced Decomposition of Indocyanine Green // Invest Ophthalmol. Vis. Sei. — 2008. — V.49. — P. 1777-1783

56 Sznitowska M. The influence of Ethanol on Permeation Behavior of the Porous Pathway in the Stratum Corneum // Int. J. Pharmacol. — 1996. — V.137. — P. 137-140

57 Levang A.K., Zhao K., and Singh J. Effect of Ethanol/Propylene Glycol on the In Vitro Percutaneous Absorption of Aspirin, Biophysical Changes and Macroscopic Barrier Properties of the Skin // Int. J. Pharm. — 1999. — V. 181. — P. 255-263

58 Squier C.A., Kremer M.J., and Wertz P.W. Effect of Ethanol on Lipid Metabolism and Epidermal Permeability Barrier of Skin and Oral Mucosa in The Rat // J. Oral Pathol. Med. — 2003. — V. 32. — P. 595-599

59Краткая химическая энциклопедия. / Под ред. Кнунянц И.Л. — М., государственное научное издательство «Советская энциклопедия», 1961. —том. 1 — 631 с

6001einickN.L., Morris R.L. and Belichenko I. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how//Photochem. Photobiol. Sei. — 2002. —Vol. 1.—P. 1-21

61 Matsubara A., Nakazawa Т., Nöda К., She H., Connolly E., Young T.A., Ogura Y., Gragoudas E.S., Miller J. W. Photodynamic therapy induces caspase-dependent

apoptosis in rat CNV model // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2007 Oct. — Vol. 48, No. 10.—P. 4741-7

62 Башкатов A.H., Генина Э. А, Кочубей В.И., Тучин В.В. Оптические свойства подкожной жировой ткани в спектральном диапазоне 400-2500 нм // Оптика и спектроскопия. —2005. — Т.99, №5. — С. 868-874

63 Тучин, В. В. Оптика биологических тканей: методы рассеяния света в медицинской диагностике / Пер. с англ. — М., ИД Интеллект, 2010. — с 64Halpern A., Mancini М.С. Treatment of obesity: an update on anti-obesity medications // Obesity Reviews. — 2003. — V. 4. — P. 25-42

65 Trelles M.A., Mordon S.R. Adipocyte Membrane Lysis Observed After Cellulite Treatment Is Performed with Radiofrequency // Aesth Plast Surg. — 2009. —V.33. — P. 125-128.

66 Belikov A.V., Prikhodko C.V., Smolyanskaya O.A. Study of thermo-induced changes resulted in optical properties of fat tissue // Proc. SPIE. — 2003. — Vol. 5066.

— P.207-212

67 Ленинджер А. Основы биохимии — M.: Мир, 1985. — Том 3. — 320 с.

68 Лёвшин Л.В., Горшков В.К. Изучение природы сил связи ассоциированных красителей в концентрированных растворах // Оптика и спектроскопия. — 1961.

— Т. 10, №6.—С. 759-766

69 Деркачева Л. Д. Концентрационные эффекты в растворах красителей цианинового ряда // Изв. АН СССР. Сер.физ. — 1956. — Т.20, №4. — С. 410-418 70Краснов К.С., Шилова Г.В. Спектрофотометрическое исследование ассоциации в водных растворах трифенилметановых красителей // Изв. вузов. Химия и химическая технология. — 1965. — Т.7, №6. — С. 915-920

71 Левшин Л.В., Славнова Т.Д. Спектроскопическое изучение природы, межмолекулярных взаимодействий в концентрированных растворах красителей // Журнал прикладной спектроскопии. — 1967. —Т.7, №.2. —С. 234-239

72 Nagasawa Y., Ando Y., OkadaT. Solvent dependence of ultrafast ground state recovery of the triphenylmethane dyes, brilliant green and malachite green // Chemical Physics Letters. — 1999. — Vol.312. — P.161-168

73 Usacheva M.N., Teichert M.C., Biel M. A. The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. — 2003. — V.71. — P. 87-98

74 Urbanska K., Romanowska-Dixon В., Matuszak Z., Oszajca Ja., Nowak-Sliwinska P., Stoche G. Indocyanine green as a prospective sensitizer for photodynamic therapy of melanomas // ActaBiochimica Polonica. —2002. — Vol. 49, No. 2. — P. 387-391

75 Kirchherr A.-K., Briel A., and Mader K. Stabilization of Indocyanine Green by Encapsulation within Micellar Systems / A.-K. Kirchherr, A. Briel, and K. Mad er // Molecular Pharmaceutics. — 2009. — Vol.6, No.2. — P. 480-491

76Gathje J., Steuer R.R., Nicholes K.R.K. Stability studies on indocyanine green dye // J. Appl. Physiol. — 1970. — Vol.29. —P.181-185

77 Björns son O.G., Murphy R., Chadwick V.S., Björnsson S. Physicochemical studies on indocyanine green: molar lineic Absorbance, pH tolerance, activation energy and rate of decay in various solvents // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. — 1983. — Vol.21. — P. 453-458

78 West W., Pearce S. The dimeric state of cyanine dyes // J. Phys. Chem. — 1965. — Vol.69. —P.1894-1903

79 Zhou J.F., Chin M.P., Schafer S.A. Aggregation and degradation of indocyanine green // SPIE Proceedings in Laser Surgery: Advanced Characterization, Therapeutics, and Systems IV, edited by R. R. Anderson, A. Katzir. — 1994. — Vol.2128. — P.495-505

80Генина Э.А., Башкатов A.H., Кочубей В.И., Тучин В.В., Альтшуллер Г.Б. In vivo исследование взаимодействия индоцианина зеленого с эпидермисом человека // Письма в ЖТФ. — 2001. — Т.27, №14. — С. 63-67 81 Rosenberg I. М. Protein analysis and purification: benchtop techniques — CRC Press. Birkhauser, 2005. — 490p

82 Walker J. M. The protein protocols handbook.— Humana Press, 2002. — 1092p

83 Rodriguez V.B., Henry S.M., Hoffinan A.S., Stayton P.S., Li X., Pun S.H. Encapsulation and stabilization of indocyanine green within poly(styrene-alt-maleic anhydride) block-poly(styrene) micelles for near-infrared imaging // Journal of Biomedical Optics. —2008. — Vol.13, Nol. — P. 1-10.

84 Landsman M.L.J., Kwant G., MookG.A., Zijlstra W.G. Light-absorbing properties, stability and spectral stabilization of indocyanine green // J. Appl. Physiol. — 1976. — Vol.40. — P. 575-583

85 Malicka J., Giyczynski I., Geddes C.D., Lakowicz J.R Enhanced Emission From indocyanine Green: A New Approach to In Vivo Imaging // Journal of Biomedical Optics. — 2003. — Vol.8, No.3. — P. 472-478

86RompeP.C.B., dos Anjos F.H., Martin A.A., Mansanares A.M., da Silva E.C., Acosta-Avalos D., and Barja P.R. Characterization of human skin through photoacoustic spectroscopy //Proc. SPIE. — 2004. — Vol.5325. — P. 136-142

87 Van Den Biesen P.R., Jongsma F.H., Tangelder G.J., and Slaaf D.W. Yield of fluorescence from indocyanine green in plasma and flowing blood // Ann. Biomed. Eng.

— 1995. — Vol.23. — P.475-481

88 Yuan B., Chen N.G., Zhu Q. Absorption and Emission Properties of Indocyanine Green in Intralipid Solution // Journal of Biomedical Optics. — 2004. — Vol.9, No3. — P.497-503

89 Yaqoob Z., Fingler J.P., Lintner S., Applegate B.E., Changhuei Y. Pump-probe scheme for optical coherence tomography using indocyanine green mixed with albumin or human plasma // Lasers and Electro-Optics (CLEO). — 2005. — Vol. 3. — P.2055-2057

90 March C., Adams M.H., Garnett W., Karnes H.T. Stability of indocyanine green in human serum stored at -20 and -70 degrees C //Therapeutic Drug Monitoring. — 1994.

— Vol.16, Issue 6. — P.588-591

91 Philip R., Penzkofer A., Baumler W., Szeimies R.M. and Abels C. Absorption and fluorescence spectroscopic investigation of indocyanine green // Journal of

Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. — 1996. — Vol.96, Issues 1-3. —P. 137-148

92Holzer W., Mauerer M., Penzkofer A., Szeimies R.-M., Abels C., Landthaler M., Baumler W. Photostability and thermal stability of indocyanine green // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1998. — V. 47 — P. 155-164

93 Rajagopalan R., Uetrecht P., Bugaj J.E., Achilefu S.A., and Dorshow R.B. Stabilization of the Optical Tracer Agent Indocyanine Green Using Noncovalent Interactions //Photochemistry and Photobiology. —2000. —Vol.71, No.3. — P. 347350.

94 Duxbury D.F. The photochemistry and photophysics of triphenylmethane dyes in solid and liquid media // Chemical Reviews. —1993. —Vol. 93, No. 1. — P. 381-433

95 Kim M.H., Kim Y., Park H.J., Lee J.S., Kwak S.N., Jung W.H., Lee S.G., Kim D., Lee Y.C. and Oh Т.К. Structural insight into bioremediation of triphenylmethane dyes by Citrobacter sp. triphenylmethane reductase // Journal of Biological Chemistry. — 2008. —Vol.283. —P. 31981

96Генина Э. А., Башкатов A. H., Чикина E. Э., Тучин В. В. Диффузия метиленового синего в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи человека // Биофизика. — 2007. —Т.52, №6. — С. 1104-1111

97 Coppey-MoisanM., Delie J., Magdelenat H. and Coppey J. Principle of Digital imaging Microscopy // Methods in Molecular Biology. —1995. —V. 33. In Situ Hybridization Protocols, II. — P. 359-393

98 Corley R. B. A Guide to Methods in the Biomedical Sciences. / R. B. Coriey — Berlin: Springer, 2005.— 125 p

99 Wingate R. J. T. Microscopy and Photomicrography Techniques in Methods in Molecular Biology // Methods in Molecular Biology. —1999. —V. 97. Molecular Embryology, VIII. — P. 711-733

100 Bhaskar H., Sing S. Live cell imaging: a computational perspective // J. Real-Timelmage Proc. — 2007. — Vol.1. — P. 195-212

101 Athanasiou Т., Debas H. and Darzi A. Key Topics in Surgical Research and Methodology — Berlin: Springer, 2010. — 119 p

102 de la Rosette J.J.M.C.H., Manyak M.J., Harisinghani M.G. and Wijkstra H. Imaging in Oncological Urology, Part VIII. — Berlin: Springer, 2009. —443 p.

103 Kohnen T. and Koch D.D. Cataract and Refractive Surgery — Berlin: Springer, 2009. —122 p

104Tuchin, V.V. Advanced Optical Cytometry: Methods and Disease Diagnoses / (ed.).

— WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2011. — 701 p

105 Robb R. A. Medical imaging and virtual reality: a personal perspective // Virtual Reality. — 2008. — Vol. 12. — P. 235-257

106 Fung D.C., Theriot J. A. Imaging techniques in microbiology // Current Option in Microbiology. — 1998. — Vol.1. — P. 346-351

107 Gray A.J., Young D., Martin N.J., Glasbey C.A. Cell identification and sizing using digital image analysis for estimation of cell biomass in High Rate Algal Ponds // Journal of Applied Phycology. — 2002. — V. 14, No.3. —P. 193-204

108 Wessels D.J., Kuhl S. and Soil D.R. Light microscopy to image and quantify cell movement // Methods in Molecular Biology. — 2009. — V. 571. Chemotaxis. — P. 455-471

109 Mosig A.. Jager C., Wang S., Nath I., Ersoy K., Palaniappan P. and Chen S.-S. Tracking cells in life cell imaging videos using topological alignments // Algorithms for Molecular Biology. — 2009. — V. 4, No. 10. — P. 1 -9

110 Дубровский B.A., Янина И.Ю., Тучин B.B. Кинетика оптических свойств жировой тканит vitro как результат фотодинамического действия // Биофизика.

— 2012. — Т.57,№1.— С. 115-119

111 Дубровский В.А., Дворкин Б.А., Янина И.Ю., Тучин В.В. Фото воздействие на клетки жировой ткани человека in vitro // Цитология. —2011. — Т.53, №5. — С. 423-432

112 Дубровский В.А., Янина И.Ю., Тучин В.В. Регистрация неравномерности фотоицдуцированного липолиза жировых клеток методом цифровой

микрофотографии // Сб. «Проблемы оптической физики и биофотоники», Саратов Изд-во "Новый ветер" — 2011. — С. 96-105

113 Huang D., Swanson Е. A., Lin С. P., Schuman J. S., Stinson W. G., Chang W., Нее M. R., Flotte Т., Gregory K., Puliafito C. A., and Fujimoto J. G. Optical coherence tomography / D. Huang, // Science. — 1991. — Vol.254, No.5035. — P. 1178-1181

114 Salinas-Alaman A., Garcia-Layana A., Maldonado M.J., Sainz-Gomez C., Alvarez-Vidal A. Using Optical Coherence Tomography to Monitor Photodynamic Therapy in Age Related Macular Degeneration // Am J Ophthalmol. — 2005. —Vol. 140, No.l. —P. 23.el-23.e7

115 Rogers A.H., Martidis A., Greenberg P.B., Puliafito C.A. Optical coherence tomography findings following photodynamic therapy of choroidal neovascularization // Am J Ophthalmol. — 2002. — Vol.134, No.4. — P. 566-76

116 Costa R.A., Farah M.E., Cardillo J.A., CalucciD., Williams G.A. Immediate indocyanine green angiography and optical coherence tomography evaluation after photodynamic therapy for subfoveal choroidal neovascularization // Retina. — 2003. — Vol. 23,N0.2.—P. 159-65.

117 Garcia-Layana A., Salinas-Alaman A., Maldonado M.J., Sainz-Gomez C., Fernandez-Hortelano A. Optical coherence tomography to monitor photodynamic therapy in pathological myopia // Br J Ophthalmol. — 2006. — Vol. 90 — P. 555-558

118 Mennel S., Liu F., and Meyer C.H. Optical coherence tomography in photodynamic therapy // Br J Ophthalmol. — 2005. — Vol. 89, No.7. — P. 928-929

119 Witkin A. J., Duker J.S. Optical coherence tomography of the vitreomacular interface in photodynamic therapy // Br J Ophthalmol. — 2005. — Vol. 89, No.7. —P. 929

120 Park C.H., Smith B.T., Oh M., Fekrat S. Optical coherence tomography following photodynamic therapy with verteporfin for subfoveal predominantly classic choroidal neovascularization // Ann Ophthalmol (Skokie). — 2006. — Vol. 38, No.2. — P. 121125

121 EterN., Spaide R.F. Comparison of fluorescein angiography and optical coherence tomography for patients with choroidal neovascularization after photodynamic therapy // Retina. — 2005. —Vol. 25, No. 6. — P. 691-696

122 Sahni J., Stanga P., Wong D., Harding S. Optical coherence tomography in photodynamic therapy for subfoveal choroidal neovascularisation secondary to age related macular degeneration: a cross sectional study // Br J Ophthalmol. — 2005. — Vol.89. —P. 316-320

123 Ozdemir H., Arf Karacorlu S., Karacorlu M. Early Optical Coherence Tomography Changes After Photodynamic Therapy in Patients With Age-Related Macular Degeneration // Am J Ophthalmol. — 2006. — Vol. 141, No.3. — P. 574-576 1240samura R.Y., Kajiya H., Takei M., Egashira N., Tobita M., Takekoshi S., and Teramoto A. Pathology of the human pituitary adenomas // Histochem Cell Biol. — 2008 September. — V. 130, No. 3. — P. 495-507

125 Владимирова Л.Ю., Кит О.И., Шолохова E.A. Роль гистологического и молекулярного анализа в выборе метода лечения немелко клеточного рака легкого поздних стадий // Фарматека. — 2012. —№ 8. — С. 9-22

126 Zagariya A., Bhat R., Uhal В., Navale S., Freidine M., Vidyasagar D. Cell death and lung cell histology in meconium aspirated newborn rabbit lung // European Journal of Pediatrics. —2000. —V. 159, Is. 11. —P. 819-826

127 Buis D.R., van der Valk P., De Witt Hamer P.C. Subcutaneous tumor seeding after biopsy in gliomatosis cerebri // Journal of Neuro-Oncology. —2012. —V. 106, Is. 2. — P. 431-435

128 Vázquez M.E. R., Díaz Román T.M., Cabarcos M.R., Botta C.Z., García N.D., Cuesta M.G., Dopico M.J.S., Díaz S.P., Núñez C.A. Apoptosis in fresh and cryopreserved cardiac valves of pig samples // Cell and Tissue Banking. — 2008— V. 9, Is. 2. —P. 101-107

129Барсуков Н.П., Шаповалова Е.Ю., Барсуков A.H., Юней Г.А., Промская Ю.И. Перспективы применения нового метода контрастирования микро препарата в гематоксилином и эозином // Морфология. —2008. —Т. 133, № 2. — С. 16-17

130Коржевский Д. Э. Применение гематоксилина в гистологической технике // Морфология. — 2007. — Т. 132, № 6. — С. 77-82

131 Манджини А. Цвет и красители / (перевод с итал.). — М: Знание, 1983г. — 64 с.

132 Elferink J.G.R, Booij H.L. The action of some triphenylmethane dyes on yeast and erythrocyte membranes // Arzneimittel-Forsch. — 1975. — V.25, №8. — P. 1248-1252

133 Mishra A., Behera R.K., Behera P.K., Mishra B.K., Behera G.B. Cyanines during the 1990s: A Review // Chem. Rev. — 2000. —V. 100. — P. 1973-2011

134 Green F. J. The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators. —Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wisconsin, 1990. —P. 407

135 Chen W. R., Zhu W.-G., Dynlacht J. R., Liu H, Nordquist R E. Long-term tumor resistance induced by laser photo-immunotherapy // Int. J. Cancer. —1999. — V. 81. — P. 808-12

136 Tuchin V.V., Genina E.A., Bashkatov A.N., Simonenko G.V., Odoevskaya O.D., and Altshuler G.B. A pilot study of ICG laser therapy of acne vulgaris: Photodynamic and photothermolysis treatment. // Lasers Surg. Med. — 2003. — V. 33, No.5. —P. 296-310.

137Tuchina E.S., Tuchin V.V. In vitro LED and laser light photoinactivation of Propionibacterium acnes II Saratov Fall Meeting 2007: Optical Technologies in Biophysics and Medicine IX. Ed. Tuchin V.V. Proc. SPIE. — 2008. — V. 6791. —P. 6791OR-6791OR-1 - 5.

138 Tuchina E.S., Tuchin V.V. Low-intensity LED (625 and 405 nm) and laser (805 ran) killing of Propionibacterium acnes and Staphylococcus epidermidis // Proc. SPIE. — 2009. —V. 7165. — P. 716501-1-7

139Pini R., Rossi F., Menabuoni L., Lenzetti I., Yoo S., and Parel J.-M. A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding // Ophthalmic Surg. Lasers Imaging. — 2008. — V. 39. — P. 260-261

140 Owens S.L., Bunce C., Brannon A.J., Xing W., Chisholm I.H., Gross M., Guymer R.H., Holz F.G., Bird A.C. Prophylactic laser treatment hastens choroidal

neovascularization in unilateral age-related maculopathy: final results of the drusen laser study // Am J Ophthalmol. — 2006 Feb —V.141, No.2. — P. 276-81

141 Riefke В., Licha K., Nolle D., Ebert В., Rinneberg H., Semmler W. In vivo characterization of cyanine dyes as contrast agents for near-infrared imaging // SPIE Proc. — 1996. — V. 2927. — P. 199-208

142 Khan H.M., Anwer M., Chaudhry Z.S. Dosimetric characterisation of aqueous solution of brilliant green for low-dose food irradiation dosimetry // Radiation Physics and Chemistiy. — 2002. — Vol. 63, Is. 3-6. — P.713-717

143 Chen W.R., Adams R.L., Bartels K.E., and Nordquist R.E. Chromophore-enhanced in vivo tumor cell destruction using an 808-nm diode laser // Cancer Lett. — 1995. — V. 94. —P. 125-131

144 Thompson J.H., Richter W.R. Hematoxylin-Eosin Staining Adapted to Automatic Tissue Processing // Biotechnic & Histochemistry. — 1960. — Vol. 35, No. 3. —P. 145-148

145 Гланц С. Медико-биологическая статистика — М.: Изд. Практика, 1999. — 459 с

146 Сидоренко Е. В. Методы математической обработки в психологии, —Спб.: ООО «Речь», 2003. — 350 с

147 Математические методы в психологии. — Барнаул, 2001. — 38 с 148Титкова Л. С. Математические методы в психологии. —Владивосток. Издат-во Дальневосточного университета, 2002. — 85 с

149 Вуколов Э. А. Основы статистического анализа — М: Форум, 2008. — 464 с.

150 Кобзарь А. И. Прикладная математическая статистика. Для инженеров и научных работников — М: Физматлит, 2006. — 816 с.

151 Баграташвили В.Н., Баграташвили Н.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Аверкиев С.В., Свиридов А.П., Шах Г.Ш. Структурные изменения в соединительных тканях при умеренном лазерном нагреве // Квант. Электроника. — 2002. — Т. 32, №10. —С. 913-916

152 Goldman A., Gotkin R.H. Laser-Assisted Liposuction // Clinics in Plastic Surgery. —2009. — V 36, No. 2. — P. 241-253

153 Goldman A., Wollina U., and de Mundstock E. C. Evaluation of Tissue Tightening by the SubdermalNd: YAG Laser-Assisted Liposuction Versus Liposuction Alone // J Cutan Aesthet Surg. — 2011. — Vol. 4, No.2. — P. 122-128

154 Тучин В. В., Башкатов А. Н., Генина Э. А., Синичкин Ю. П., Лакодина Н. А. In vivo исследование динамики иммерсионного просветления кожи человека// Письма в ЖТФ. — 2001. — Т.27, №12. — С. 10-14

155 Tuchin, V. V. Optical Clearing of Tissues and Blood — USA: SPIE Press Monograph Vol. PM154, SPIE Press, Bellingham, Wash, 2006 — 254 p.

156 Шурыгин Д.Я., Вядицкий П.О., Сидоров K.A. Ожирение — Ленинград: Медицина, 1975. — 263 с

157 Татонь Я. Ожирение: Патофизиология, диагностика, лечение — Варшава: Польское Мед. Изд., 1981. — 363 с

158 Prins J.B., Walker N.J., Winterford С.М., Cameron D.P. Human adipocyte apoptosis occurs in malignancy // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1994. — Vol.205, Nol. —P.625—630

159 Prins J.B., Walker N.J., Winterford C.M., Cameron D.P. Apoptosis of human adipocytes in vitro // Biochem.Biophys. Res. Commun. — 1994. — Vol.201, No.2. — P. 500—504

160 Черкасова О.А., Симоненко Г.В., Тучин B.B. Исследование жировой ткани при температурном воздействии // Проблемы оптической физики. — 2003. — Т. 5. — С. 32-38

161 Черкасова О.А., Тучин В.В., Пономарёва Е.Г., Никитина В.Е. Влияние бактериального лектина и роль его углеводсвязывающего центра при воздействии на адипоциты при повышенной температуре // Биофизика. — 2007. — Т. 52, Вып. 4. — С. 687-692

162 Bilyy R.O., Stoika R.S. Lectinocytochemical detection of apoptotic murine leukemia L1210 cells // Cytometry A. — 2003. — Vol.56. — P. 89-95

163 Porras F., Lascurain R., Chávez R., Ortiz В., Hernández P., Debray H. and Zenteno E. Isolation of the receptor for Amaranthus leucocarpus lectin from murine naive thymocytes // Glycobiology. — 2000. — Vol.10, No5. — P. 459-465

164 Neira R., Arrollave J.A., Solarte E., Ortiz C., Gutierrez C. Low-level laser assisted Liposuction // 70th Annual Scientific meeting of the American Society of Plastic Surgery, Orlando FL. — 2001

165Neira R., Arroyave J., Solarte E., Isaza C., Gutierrez O., Gutierrez M.I. In vitro culture of adipose cell after irradiating them with a low level laser device // the Bolivian Plastic Surgery meeting. Lima, Peru, 2001

166Neira R., Solarte E., Isaza C., Creole W., Rebolledo A., Arrogate J., Ramirez H. In vitro effects of 635 run low intensity diode laser irradiation on the fat distribution of one adipose cell // Proc. SPIE. — 2002. — Vol. 4829, No2. — P. 961-962 167 Niesler C., Siddle K., Prins J.B. Human preadipocytes display a depot-specific susceptibility to apoptosis // Diabetes. — 1998. — Vol.47. — P. 1365—1368 168Loftus T.M., Kuhajda F.P., Lane M.D. Insulin depletion leads to adipose-specific cell death in obese but not lean mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol.95, No. 24. — P. 14168-72

169 Alster T.S., and Tehrani M. Treatment of cellulite with optical devices: An overview with practical considerations // Lasers in Surgeiy and Medicine. — 2006. — V.38. —P. 727-730

170 Gurr M.I., Jung R.T., Robinson M.P. Adipose tissue cellularity in man: the relationship between fat cell size and number, the mass and distribution of body fat and the histoiy of weight gain and loss // Int. J. Obesity. — 1982. — V.6. — P. 419-436

171 Антонов В.Ф., Черныш A.M., Пасечник В.И., Вознесенский С.А., Козлова Е.К. Биофизика — Москва: Гуманитарный издательский центр ВЛАДОС, 2000. — 287 с

172 Bommannan D., Potts R.O., and Guy R.H. Examination of the Effect of Ethanol on Human Stratum Corneum In Vivo Using Infrared Spectroscopy // J. Control Release. — 1991. —V. 16.—P. 299-304

173 Lee S., Anderson Т., Zhang H., Flotte T.J., and Doukas A.G. Alteration of Cell Membrane by Stress Waves In // Ultrasound Med. & Biol. — 1996. — V. 22. — P. 1285-1293

174 Lee S., MeAuliffe D.J., Zhang H., Xu Z., Taitelbaum J., Flotte T.J., and Doukas A.G. Stress-Waves-Induced Membrane Permiation of Red Blood Cells is Faciliated by Aquaporins //Ultrasound Med. & Biol. — 1997. — V. 23. — P. 1089-1094.

175Lee S., MeAuliffe D.J., Kollias N., Flotte T.J., and Doukas A.G. Photomechanical Delivery of 100-nm Microspheres Through the Stratum Corneum: Implications for Transdermal Drug Deliveiy // Laser Surg. Med. — 2002. — V. 31. — P. 207-210 176MeAuliffe D.J., Lee S., Zhang H., Flotte T.J., and Doukas A.G. Stress-Waves-Assisted Transport through the Plasma Membrane In // Laser Surg. Med. — 1997. — V. 20. —- P. 216-222

177 Lukac M., Vizintin Z., Zabkar J., Pirnat S. QCW Pulsed Nd:YAG 1064 nm Laser Lipolysis // Journal of the Laser and Health Academy. — 2009. — No.4/1. — P. 5-17

178 Альберте Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки — М.: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с.

179 Ленинджер А. Основы биохимии— М.: Мир, 1985. — Т. 2. — 368 с

180 Страйер Л. Биохимия — М.: Мир, 1984. — Т. 2. — 325 с.

181 Simonenko G. V., Cherkasova О. V., Denisova Т. P., Tuchin V. V. Thermal action on the lipocells // USA, Washington, Bellingham, Proc SPIE. — 2003. — V. 5068. — P. 458-470

182 Yamaguchi Т., Omatsu N, Morimoto E., Nakashima H., Ueno K., Tanaka Т., Satouchi K., Hirose F., and Osumi T. CGI-58 facilitates lipolysis on lipid droplets but is not involved in the vesiculation of lipid droplets caused by hormonal stimulation // Journal of Lipid Research. — 2007. — V. 48, No. 5. — P.1078-1089

183 Tuchin V. V., Xu X., and Wang R.K. Dynamic optical coherence tomography in optical clearing, sedimentation and aggregation study of immersed blood // Appl. Opt — 2002. —V.41,No. 1. —P. 258-271

184 Бочко В.А., Аландер Я.Т., Тучин В.В., Янина И.Ю. Медицинская визуализация и терапия с использованием индоцианина зеленого // Сборник SFM'09. Проблемы оптической физики. — 2009. — С. 56-63

185 Tuchin V.V., Altshu 1er G.B., Yanina I.Yu., Kochubey V.I., Simonenko G.V. Fat tissue staining and photodynamic/photothermal effects // Proc. S PIE. Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics VII, San Francisco, California, USA. — 2010. — V.7563. —P. 75630V1-7

186 Yanina I.Yu., Orlova T.G., Tuchin V.V., Altshuler G.B. The morphology of apoptosis and necrosis of fat cells after photodynamic treatment at a constant temperature in vitro // Proc.SPIE Mechanisms for Low-Light Therapy VI, edited by Michael R. Hamblin, Ronald W. Waynant, Juanita Anders. — 2011. — V.7887. — P. 78870X-1-7.

187 Yanina I.Yu., Bochko V.A., Alander J.T., and Tuchin V.V. Optical image analysis of fat cells for indocyanine green mediated near-infrared laser treatment // Laser Phys Lett. — 2011. — V.8, No.9. — P. 684-690

188 Янина И.Ю., Симоненко Г.В., Кочубей В.И., Тучин В.В. Спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями // Оптика и спектроскопия. — 2010. — Т. 109, №2. —С. 1303-1311

189Cancello R., Henegar С., Viguerie N., Taleb S., Poitou С., Rouault С., Coupaye M., Pelloux V., Hugol D., Bouillot J.L., Bouloumié A., Barbatelli G., Cinti S., Svensson P.A., Barsh G.S., Zucker J.D., Basdevant A., Langin D., Clément K. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss // Diabetes. — 2005. — V.54. — p. 2277-2286

190Cancello R., Tordjman J., Poitou С. Increased infiltration of macrophages in omental adipose tissue is associated with marked hepatic lesions in morbid human obesity // Diabetes. — 2006. — V.55. — p. 1554-1561

191 Большунов A.B., Федоров A.A., Соболь Э.Н., Свиридов А. Г1., Воробьева Н.Н., Гамидов А.А., Бузыканова М.А., Родин А.С., Шехтер А.Б., Каменский В.А.,

Куранов Р.В. Неабляционное действие инфракрасного лазерного излучения на склеру глаза. Результаты морфологических исследований обратимых и необратимых изменений структуры //Рефракционная хирургия и офтальмология. — 2002. — Т. 2, № 2. — С. 33-38