Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Григорьев, Илья Владимирович

• Григорьев, Илья Владимирович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Григорьев, Илья Владимирович

Оглавление

1 Список сокращений

2 Введение

3 Обзор литературы

3.1 Способы трансфекции ДНК

3.1.1 Доставка ДНК в клетки при помощи ПАВ

3.2 Рекомбинантные системы на основе ретровирусов

3.2.1 Жизненный цикл ВИЧ

3.2.2 Взаимодействие с рецепторами и проникновение в клетку

3.2.3 Репликация и транскрипция ВИЧ

3.2.4 Сборка и выход новых вирусных частиц

3.2.5 Лентивирусные векторы для доставки ДНК в клетки

3.2.6 Конструкция биобезопасных и высокоэффективных векторов на основе ВИЧ-1

3.2.7 Получение репликационно-дефектных лентивирусных препаратов

3.2.8 Преобразование вируса в вектор

3.2.9 Эволюция дизайна векторов

3.2.10 Структура используемой трехплазмидной лентивекторной системы

3.2.11 Упаковочная кассета экспрессии (Вспомогательная / хелперная плазмида)

3.2.12 Векторные кассеты (Трансферный вектор)

3.2.13 Вектор экспрессии вирусной оболочки

3.2.14 Псевдотипирование лентивирусных векторов

3.2.15 Структура используемой в исследовании трехплазмидной псевдолентивирусной системы и функции различных компонентов вектора

3.3 Ингибиторы ВИЧ

3.4 Ингибиторы ВИЧ на основе интерферирующих РНК

3.4.1 Расщепление дцРНК

3.4.2 Регулирование транскрипции

3.5 Заключение обзора литературы

4 Материалы и методы

4.1 Реактивы, используемые в работе

4.1.1 Приготовление электрокомпетентных клеток культуры JM109

4.1.2 Электропорация бактериальных клеток с использованием ячеек Bio-Rad

4.1.3 Электропорация клеток линии МТ-4 с использованием ячеек Bio-Rad

4.1.4 Протокол выделения плазмид из бактериальной культуры с помощью набора Pure Yield Plasmid Maxiprep system

4.2 Получение псевдотипированных лентивирусных препаратов и исследование их свойств

4.2.1 Исследуемые соединения для трансфекции

4.2.2 Трансфекция ДНК с помощью новых соединений

4.2.3 Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии НЕК293Т

4.2.4 Определение эффективности формирования комплексов катионный трансфектант - ДНК

4.2.5 Анализ трансфекции клеток методом проточной цитометрии

5 Результаты и обсуждение

5.1.1 Стабильность выделенных очищенных лентивекторов

5.1.2 Инфекционность для разных культур клеток. Исследование стабильности получаемых препаратов, определение оптимального метода проведения инфицирования

5.1.3 Ингибирование псевдолентивирусной инфекции в лимфоидных клетках линии МТ-4 и моноцитах линии И-937

5.2 Новые катионные липидные трансфектанты как средства доставки плазмидной ДНК в клетки

5.2.1 Формирование комплексов исследуемых соединений с ДНК

5.2.2 Определение цитотоксичности соединений на клетках линииНЕК293Т

5.2.3 Определение эффективности трансфекции клеток НЕК293Т

5.3 Оценка эффективности антиретровирусных препаратов на основе интерферирующих РНК с применением псевдолентивирусной системы в клетках81

5.3.1 Выбор мишеней для РНК-интерференции

5.3.2 Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК

5.3.3 Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ зЫША

6 Заключение

7 Выводы

8 От автора

9 Список литературы

1 Список сокращений

ATP - аденозин-5'-трифосфат

att Attachment sites сайты связывания интегразы

B-CLL B-cell chronic lymphocytic leukemia Хронический лимфоцитарный лейкоз

bGHpA bovine growth hormone polyadenylation последовательность

полиаденилирования гормона роста коров ВМИ В lymphoma Mo- MJ1V insertion region 1 homolog ген, кодирующий репрессорный белок, влияющий на регуляцию белков р16 и р19, являющихся ингибиторами клеточного цикла CD46 рецептор системы комплемента

CD50 Концентрация, при которой 50% популяции клеток погибают СНМР Комитет по производству лекарственных препаратов для человека cHS4 последовательность сайта гиперчувствительности 4 CMV Цитомегаловирус

CMVie ранний протеин, экспрессирующийся в зараженных цитомегаловирусом

CRM1 Главный кариоферин, экспортин, отвечающий за экспорт белков из ядра.

СТЕ Конститутивный транспортный элемент

CTS Central Termination Sequence центральная терминирующая

последовательность DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-grabbing Non-integrin Рецептор лектинов С-типа, представленный как в дендритных клетках, так и макрофагах dGTP - дезозксирибогуанозин-5'-трифосфат DMSO - диметилсульфоксид dNTP - дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат dTTP - дезоксириботимидин-5'-трифосфат EGF Epidermal growth factor Эпидермальный фактор роста Env ген поверхностного вирусного белка

FACS Fluorescence-activated cell sorting Проточная цитометрия

флуоресцентно активированных клеток FIV Вирус иммунодефицита кошек

Flp От "flip" рекомбиназа дрожжей, используемая в сайт-направленной

рекомбинации FM fusion molecule молекула для слияния

FSC Forward Scattering прямое светорассеяние

gag Один из трех главных генов ВИЧ. Кодирует 4 структурных белка,

формирующих вирусный капсид GFP Green fluorescent protein Зеленый флуоресцентный белок gp120 Поверхностный гликопротеин ВИЧ gpt ген гуанинфосфорибозилтрансферазы

Hepes - М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота hSCF фактор стволовых клеток человека

HSPCs hematopoietic stem progenitor cells гематопоэтические стволовые/

прогениторные клетки HTLV Human T-lymphotropic virus Т-лимфотропный вирус человека НХВ2 Молекулярный клон ВИЧ

l-Scel site-specific homing enzyme Нуклеаза рестрикции, расщепляющая

ч

75

ДНК после специфического фрагмента длиной 18 п.н. IDLVs integration-deficient lentiviral vectors лентивирусные векторы,

неспособные к интеграции LB Lysogeny broth medium. Среда для наращивания бактерий

LEDGF/p lens epithelium-derived growth factor Фактор роста, полученный из

эпителия хрусталика LEF/TCF Lymphoid enhancer-binding factors-cell specific factor Семейство

транскрипционных факторов LM02 LIM domain only 2 (rhombotin-like 1) Ромботин-подобный белок 1 LTR - длинные концевые повторы (long terminal repeat)

MOI Multiplicity of Infection отношение инфекционных агентов (в данном

случае вирусов) к мишеням инфекции (в данном случае клеткам) MPMV Mason-Pfizer вирус обезьян

МТТ 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-тетразолия бромид.

Реагент, использующийся для определения цитотоксичности клеток MV Edmonson measles virus Вирус кори Эдмонстона

Nef Nef -Негативный регуляторный фактор

NF-kB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells

Универсальный ядерный транскрипционный фактор NFAT Nuclear factor of activated T-cells, ядерный транскрипционный

фактор активированных Т-клеток NILVs nonintegrating lentiviral vectors неинтегрирующиеся лентивирусные векторы

OD Optical density оптическая плотность

ORF Открытая рамка считывания PBS primer-binding site сайт связывания праймера PEG - полиэтиленгликоль PPT Полипуриновый тракт

PRE посттранскрипционный регуляторный элемент RAC Консультативный комитет по рекомбинантным ДНК RCLs Репликационно компетентные лентивирусы RD114 Поверхностный гликопротеин для псевдотипирования Rev Ген регуляторного белка, связывающего РНК

RHSA Recombinant Human Serum Albumin Рекомбинантный сывороточный альбумин человека

RRE Rev-response element Взаимодействует с Rev. Необходим для

процессинга и транспорта вирусных РНК RSV Вирус саркомы Рауса

RTC Reverse transcription complex Комплекс обратной транскрипции

SD Регуляторный элемент, последовательность Шайна-Дальгарно

SDS - додецилсульфат натрия

SFV Вирус леса Семлики

shPHK Small hairpin РНК малые шпилечные РНК

SIN Self-inactivating Самоинактивирующиеся модифицированные LTR

SIV Вирус иммунодефицита обезьян

SLAM signaling lymphocyte activation molecule сигнальная молекула активации лимфоцитов- семейство рецепторов, участвующих в регуляции некоторых типов клеток иммунной системы SP1 Specificity Protein 1, транскрипционный фактор человека

SSC Side Scattering Боковое светорассеяние U3 - U3 нетранслируемый регион LTR

U5 - U5 нетранслируемый регион LTR

UTR Vpr

VSV-G

WHV

WPRE

X-SCID1

ZFNs aCD20

ВИЧ-1 кДа MCK ПАВ ПИК c-KIT (CD117) СПИД ТЕ/мл Трис ЦГАБ ЦТАБ

Untranslated region нетранслируемая область

Viral Protein R, вирусный протеин R, регулирующий ядерный импорт

преинтеграционного комплекса

G-белок оболочки вируса везикулярного стоматита

Woodchuck hepatitis virus Вирус гепатита сурка

Woodchuck post-transcriptional regulatory element

Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита

сурка

X-linked severe combined immunodeficiency связанный с X-хромосомой тяжелый комбинированный иммунодефицит Zinc-finger nucleases Химерные нуклеазы типа цинкового пальца Клетки, экспрессирующие моноспецифические поверхностные иммуноглобулины для CD20

- вирус иммунодефицита человека 1-го типа

- килодальтон

Мезенхимальные стволовые клетки Поверхностно-активные вещества Преинтеграционный комплекс

proto-oncogene c-Kit or tyrosine-protein kinase Kit рецептор цитокинов

- Синдром приобретенного иммунодефицита Трансдуцирующих единиц в миллилитре

- трис(гидроксиметил)аминометан Цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромид Цетилтриметиламмоний бромид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов»

2 Введение.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вместе с несколькими сходными представителями класса ретровирусов выделены в особую группу - семейство лентивирусов. Одно из главных смыслов перевода "ленти" - "медленный".

Первый описанный лентивирус (выделенный от коз) [1], удивил ученых непривычным для вируса поведением: он почти ничем не выдавал своего присутствия, и инфицированные на протяжении длительного времени с виду были здоровы. И лишь спустя несколько лет у животных проявлялось вызванное вирусом заболевание, которое становилось смертельным. Сходную картину представляет патогенез иммунодефицита, вызываемого ВИЧ: инфицированные люди могут годами являться носителями вируса. Анализ крови такого человека может дать высокую концентрацию вирусных частиц.

Фундаментальные исследования, направленные на выяснение молекулярных механизмов патогенеза ВИЧ, а также разрешение многих вопросов терапевтического плана, необходимое для успешной борьбы с этой ретровирусной инфекцией, не всегда требуют использования инфекционных вирусов, относящихся к природным изолятам ВИЧ. Развитие в понимании структуры и биологии ВИЧ привело к появлению безопасных и эффективных псевдовирусов на их основе. Термин псевдовирусы появился для описания вирусных частиц, образованных при совместной инфекции клеток двумя разными вирусами, при этом образовывались вирусные частицы, содержащие кор одного вируса, а поверхностные белки от другого [2-4]. Позднее этот термин стал употребляться для описания искусственно созданных вирусов, получаемых в результате трансфекции клеток различными плазмидами, экспрессирующими белки кора и оболочки различных вирусов. Наибольшее распространение получили псевдовирусы на основе ретровирусов. Основным преимуществом псевдовирусов служит возможность создания на их основе так называемых вирусов одного цикла (single cycle virus) - вирусов, способных только к одному циклу размножения, что обеспечивает безопасность работы с такими вирусами [5].

Одной из основных проблем при создании псевдовирусов является обеспечение эффективной трансфекции ДНК в различные типы клеток. Для доставки ДНК используются многочисленные химические [6] и физические подходы, но их эффективность сильно различается, и в значительной степени

зависит от типа трансфицируемых клеток. В целом эта проблема решена для фибробластов, эпителиальных клеток, но до настоящего времени не удается обеспечить эффективную трансфекцию лентивирусных векторов в лимфоидные и макрофагальные клетки.

Эффективная трансфекция плазмид - важный этап при получении псевдовирусов, и для его реализации применяются самые разнообразные подходы. Исторически в 70-е годы стал использоваться простой и недорогой кальций-фосфатный метод трансфекции, потом последовало использование положительно заряженных комплексов с ДНК DEAE-декстрана, полиэтиленимина, расширен метод электропорации, использованы катионные липоплексы и различные биополимеры [7]. Катионные агенты защищают ДНК от деградации нуклеазами и являются посредником при проникновении в клетку и последующем высвобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции. Применение катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), несмотря на очевидные преимущества (простота синтеза и доступные реагенты, низкие концентрации, высокая комплексообразующая способность) имеет существенный недостаток, кроющийся в низкой эффективности трансфекции, в связи с чем поиск новых систем-переносчиков является актуальной задачей.

Тест-система оценки активности противовирусных соединений, построенная на основе псевдолентивирусной технологии имеет преимущество перед системой на основе изолированных вирусных ферментов, поскольку последняя не пригодна для оценки проникновения соединений в клетку и оценки активности т.н. пролекарств, для которых необходимо метаболические преобразования в клетке. Примером может служить азидотимидин, из которого должен образоваться трифосфат азидотимидина для проявления его ингибиторной активности в отношении обратной транскриптазы. Псевдолентивирусная технология по сравнению с вирус-клеточной системой обладает значительно более высокой биобезопасностью, а также позволяет вычленить и изучить отдельные стадии вирусного цикла. Это может быть необходимо при изучении активности, механизмов действия и специфики антиретровирусных препаратов различных классов, в том числе новосинтезированных и ранее не изучавшихся. С другой стороны преимуществом системы является совпадение жизненных стадий вируса и псевдовируса от проникновения в клетку до продукции вирусных частиц, что недостижимо при исследовании ингибиторов на изолированных ферментах in vitro.

Целью настоящей работы являлся поиск и изучение эффективных антиретровирусных препаратов с использованием псевдовирусных векторов.

В задачи настоящего исследования входило:

■ Разработать модельную систему для оценки активности антиретровирусных соединений, построенной на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии и проверить эффективность системы с использованием известных ингибиторов.

■ Проверить эффективность геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой для проведения трансфекции в различные типы клеток, определить оптимальные условия для проведения трансфекции.

■ С использованием разработанной тест-системы оценить эффективность новых антиретровирусных соединений на основе интерферирующих РНК, направленных против консервативных сайтов-мишеней в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Хотя существует значительное продвижение в исследовании ретровирусных инфекций, доступные терапевтические соединения обладают рядом недостатков (токсичность, недостаточная селективность, короткая продолжительность действия, возникновение устойчивых к препаратам вариантов вирусов). Одним из необходимых этапов на пути к созданию более эффективных антиретровирусных препаратов является получение адекватной модельной тест-системы. Проведена оптимизация модельной лентивекторной псевдовирусной системы и проверка малых органических соединений и новых shPHK в качестве антиретровирусных агентов.

В первой части работы на полученной и оптимизированной нами тест-системе оценки активности противовирусных соединений были исследованы известные антиретровирусные препараты. Данная система дает возможность оценивать эффективность кандидатных препаратов еще до стадии доклинических испытаний.

Впервые найдена и испытана группа соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной

головной группой. Изучены эффективности трансфекции с помощью соединений и цитотоксичность. Соединения, обладающие трансфекционной способностью, находятся в стадии патентования.

В заключительной части работы были изучены новые антиретровирусные препараты на основе интерферирующих РНК по отношению к эффективности ингибирования лентивирусной инфекции. Наибольшую активность показали бЬРНК, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы. Получены данные о влиянии числа замен в нукпеотидной последовательности мишени на эффективность ингибирования продукции псевдовируса.

Результаты исследовательской работы и наработанные методики активно применяются в учебном процессе у студентов 3-го курса Медицинского факультета НГУ на практических занятиях по предмету «Микробиология и Вирусология»

3 Обзор литературы

Псевдовирусные системы с применением лентивирусов впервые были описаны в конце 80-х годов [2-4], [8, 9]. Основным принципом создания безопасных псевдовирусов служит использование комбинации плазмид, кодирующих различные гены вируса (вирусов) и последующая трансфекция этими плазмидами клеток, в результате чего образуются дефектные вирусные частицы, не способные к многократной репликации. Таким образом, ключевыми этапами при создании псевдовирусных систем служат: 1) выбор белков, которые необходимы для сборки псевдовируса; 2) обеспечение эффективной трансфекции плазмидных конструкций, кодирующих выбранные белки; 3) оптимизация системы экспрессии этих белков в различных клеточных культурах. В результате развития псевдовирусных систем появились мультиплазмидные системы, в частности, трехплазмидная система, используемая в данном исследовании: упаковочная кассета экспрессии (вспомогательная / хелперная плазмида), векторные кассеты (Трансферный вектор), вектор экспрессии вирусной оболочки [10].

3.1 Способы трансфекции ДНК

С 60-х годов прошлого века стоит задача эффективной трансфекции ДНК в различные типы клеток. За прошедшее время были использованы многочисленные реагенты и методы, но их эффективность сильно различается, и в значительной степени зависит от типа клеток для трансфекции.

В 70-е годы для трансфекции плазмид стал использоваться простой и недорогой кальций-фосфатный метод, затем последовало использование положительно заряженных комплексов с ДНК ОЕАЕ-декстрана, полиэтиленимина, доработан метод электропорации, использованы катионные липоплексы и другие.

Катионные агенты защищают ДНК от деградации нуклеазами и являются посредником при проникновении в клетку и последующем высвобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции. Для получения псевдовирусов обычно используется кальций-фосфатный метод трансфекции [11]. Также применяются методы электропорации, нукпеофекции, широкий ряд коммерческих трансфектантов на основе соединений различной природы. Следует отметить, что существующие методы трансфекции обеспечивают достаточно высокий уровень трансфекции на клетках почечного эпителия НЕК293, гепатоцеллюлярной карциномы линии Нерв2, но проблема эффективной

трансфекции на лимфоидных культурах клеток и макрофагах/моноцитах до настоящего времени не решена и эффективность трансфекции для таких культур остается низкой [12, 13]. Между тем, именно лимфоидные клетки служат основной мишенью для ВИЧ, поэтому при оценке антиретровирусных препаратов целесообразно использовать и лимфоидные клетки.

Ш I

125% ® 100% 75% 50% 25% 0%

8 I

о

_и С] jh

Jf

/ /

i?

чг

Reagents

Рис. 1 Эффективность трансфекции НТЕ (клетки эпителия трахеи) различными коммерческими реагентами (черные столбики) и количество клеток в пробе, нормализованное к нетрансфицированному контролю через 48 ч после проведения эксперимента [14]

3.1.1 Доставка ДНК в клетки при помощи ПАВ

ПАВ называются амфифильные молекулы, состоящие, по крайней мере, из

двух частей, одна из которых растворима в предлагаемой жидкости (лиофильная часть), а другая является нерастворимой (лиофобная часть). Когда используемым растворителем является вода, то это, соответственно, гидрофильная головная группа и гидрофобный хвост [15].

Сравнительный размер частей молекулы ПАВ определяет их физико-химические свойства в растворителе. Гидрофобная часть может быть разветвленной или линейной, а длина цепи варьироваться от 8 до 18 атомов углерода. Полярная часть может быть ионной или неионной. ПАВ характеризуется по тенденции адсорбироваться на поверхностях благодаря понижению свободной энергии системы в результате взаимодействия и упорядочивания на разделе фаз. Другими словами, уменьшается поверхностное натяжение при нахождении или расположении молекулами ПАВ граничной области между водой и воздухом. Еще одним качеством свободных или неассоциированных молекул ПАВ является тенденция к формированию различных агрегатов или мицелл в растворе. Мицеллообразование может быть рассмотрено в качестве механизма для

возможно достижимого уменьшения контакта гидрофобной части с водой и оптимизации энергии системы при адсорбции на поверхности. Пропорции между различными агрегатными состояниями определяются концентрацией ПАВ в растворе. Константы скорости обмена мицеллярной формы молекул ПАВ могут варьироваться на порядки и зависят от размера, формы и состава исследуемых соединений [16].

Мицеллы образуются при очень низких концентрациях поверхностно-активного вещества в воде. Концентрация, при которой мицеллы начинают формироваться, называется критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Эта концентрация зависит как от химической структуры поверхностно-активного вещества, так и от дополнительно растворенных веществ, меняющих ионную силу раствора, например, соли в случае ионных поверхностно-активных веществ, или температуры для неионных соединений. ККМ могут быть получены из измерений физико-химических свойств водного раствора ПАВ в зависимости от используемой эффективной концентрации. Примером может служить определение поверхностного натяжения, проводимости, самодиффузии, осмотического давления, мутности, растворимости [15]. Гидрофобные взаимодействия являются движущей силой для мицеллообразования или самосборки. Процесс мицеллообразования обычно обсуждается в рамках двух термодинамических моделей. В модели фазового разделения формирование мицеллы считается похожим на разделение фаз.

Слабым местом синтетических катионных ПАВ являются цитотоксичность и низкой стабильностью этих комплексов при изменении окружающей среды. Тем не менее, четвертичные азотные амфифилы могут использоваться в небольших количествах для обеспечения заряда нейтральным липосомам, следовательно, улучшая их трансфекционную эффективность [17] [18, 19].

После доставки ДНК в клетки следующим процессом заключается высвобождение ДНК из комплекса с трансфектантом и обеспечение биологической доступности для взаимодействия с ферментативным аппаратом в мишени. Известно, что липидные комплексы препятствуют работе, по крайней мере, некоторых ферментов, к примеру, ДНКазы [20-22]. Соответственно, трансфицированная ДНК может стать активной только по освобождении от липидного комплекса. В лабораторных условиях это может быть достигнуто изменением полярности растворителя благодаря использованию поверхностно-активных веществ, подходящих для связывания катионных липидов и

освобождения ДНК. Было показано, что такой механизм может играть роль также и в естественных условиях, по крайней мере, для олигонуклеотидов [23]. В связи с растущим интересом в этой области и многочисленным приложениям систем ДНК с ПАВ продолжается исследование этой темы [24, 25].

Взаимодействие катионных поверхностно-активных веществ с ДНК похоже на взаимодействие других полиэлектролитов и систем с противоположным зарядом, и происходит при концентрациях значительно ниже ККМ раствора сурфактанта без ДНК. Изотермы связывания имеют сигмовидную форму [23], [26], что указывает на кооперативность. Основное взаимодействие между ДНК и поверхностно-активными веществами является электростатическим, возникающим между отрицательно заряженными фосфатными группами и головной группой поверхностно-активного вещества.

Ассоциация происходит, как и в случае других полиэлектролитов -противоположно заряженных поверхностно-активных веществ из-за увеличения энтропии ДНК и поверхностно противоионов, когда они меняются на ПАВ и ДНК соответственно. Это было проверено при помощи ЯМР заменой натрия в поверхностно-активном веществе на ядрах изотопа Ма-23 [27]. Причиной эффективной конденсации молекул поверхностно-активных веществ являются то, что они самостоятельно собираются в мицеллы в непосредственной близости от молекул ДНК. Были использованы флуоресцентно-меченые молекулы для исследования окружающей среды комплексов ДНК-ПАВ и показано наличие гидрофобных участков наподобие мицелл [28]. Однако, молекула ДНК является гораздо более жесткой, чем другие широко изученные полиэлектролиты. Поэтому они не могут легко быть обернуты вокруг поверхности мицеллы, как в случае синтетических полимеров. В данном случае это скорее мицеллы ПАВ, которые размещают ДНК [29].

Предполагается следующий механизм связывания ПАВ с ДНК: на первом этапе при небольшой концентрации поверхностно-активного вещества есть некоторые связи отдельных молекул ПАВ с ДНК, но это не влияет на конформацию ДНК. При такой концентрации связывание линейно зависит от концентрации ПАВ в растворителе. При превышении концентрации ККМ мицеллы будут формироваться в окрестностях ДНК, которые не только нейтрализуют, но и вызовут эффективное притяжение между различными частями ДНК и вызовут уплотнение цепей. Если концентрация ДНК является достаточно высокой, некоторые ДНК-ПАВ комплексы будут выпадать из раствора в виде осадка [29].

Взаимодействия между ДНК и катионных поверхностно-активных веществ высоко кооперативно, что следует из резкого снижения электрофоретической подвижности в узком диапазоне концентрации ПАВ, и возникновения осадков при малых концентрациях поверхностно-активных веществ [30].

Построение фазовых диаграмм представляется основным подходом при систематическом получении данных о взаимодействии полиэлектролитов и ПАВ. Формирование осадка используется для разделения и очистки ДНК. В некоторых протоколах требуется осаждение ДНК, в то время как для других протоколов образование осадка нежелательно и приводит к потере результатов всей предшествующей цепочки экспериментов. В группе Риты Диас и Бьерна Линдмана проведены систематические исследования на изучение выпадения ДНК с ЦТАБ12 [31], [32]. Естественно, электростатические взаимодействия в водном растворе между противоположно заряженными частями ДНК и катионных ПАВ приводят к сильной ассоциации. Роль поверхностно-активных веществ здесь сводится к доступному уменьшению суммарного заряда комплекса [33], [34].

В отличие от других полиэлектролитов - ПАВ [35], [36] осадок не растворяется при избытке поверхностно-активного вещества в рассмотренном интервале концентраций. Это возможно благодаря высокой плотности заряда ДНК. Как было отмечено ранее, комплексы, состоящие из высокозаряженных полимеров, плохо растворяются после осаждения [36], [33, 37, 38], [39].

Из изучения двухфазной области смеси показало, что осадок формируется при очень низких концентрациях ДНК и низкой концентрации ПАВ. Исследование было проведено в рамках двухфазной области, чтобы установить зависимость количества осадка от изменения соотношения ЦТАБ к ДНК, в дальнейшем Р-фактор. Было отмечено, что осадок начинает формироваться при очень низких концентрациях (как показано в исследованиях фазовой диаграммы) и далее постепенно увеличивается до достижения плато. Максимальное количество осадка соответствует точке, близкой к нейтрализации заряда, эквивалентной положительно заряженной частице поверхностно-активного вещества на ДНК для каждого отрицательного заряда. Наблюдалось, что комплексы ДНК-ЦТАБ12 (или ДНК-ЦТАБ16) электронейтральны [40], [41].

При добавлении избыточного количества поверхностно-активного вещества осадок остается в надосадочной жидкости в виде свободных мицелл [32], [42]. Это хорошо согласуется с полученной плохой растворимостью комплексов ДНК-ПАВ при избытке ПАВ. Из-за электронейтральности ДНК-ПАВ комплекса после

формирования нет связывания с избытком ПАВ и, соответственно, инверсии суммарного заряда комплекса не наблюдается, в отличие от картины в других аналогичных системах [35], [37],[43], [44].

При помощи люминесцентной микроскопии, позволяющей добиться прямой визуализации больших молекул ДНК в растворе, было исследовано поведение комплексов соединений с ДНК. Одним из состояний таких молекул ДНК в водном растворе было мигрирование в растворе с совершением относительно медленных червеобразных движений, то есть условно можно представить «тонущий канат» с раскрученной катушки [45]. Выбор растворителя для трансфекции существенно ограничен из-за токсичности большинства органических растворителей для клеточных культур.

По химическим структурам наиболее эффективные трансфектанты относятся к классу поверхностно-активных веществ, но могут быть использованы и другие химические соединения, образующие комплекс с ДНК, имеющий склонность также к обратимой реакции диссоциации с переносимой в клетки ДНК, т.е. константа равновесия данного комплекса, находится в пределах физиологических условий.

3.2 Рекомбинантные системы на основе ретровирусов

Темин и Балтимор в 1975 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие обратной транскрипции [46]. Впоследствии стало понятно, что эта корректировка центральной догмы молекулярной биологии имеет чрезвычайно обширное применение. Например, как было описано выше, обратная транскрипция осуществляет один из ключевых моментов жизненного цикла ВИЧ. После попадания частицы вируса внутрь клетки обратная транскриптаза синтезирует ДНК, комплементарную вирусной РНК, а потом с этой последовательности ДНК, используя ее как матрицу, достраивает вторую цепь. В отсутствие обратной транскриптазы вирусный геном не будет включен в геном клетки-хозяина, что приведет к утрате способности к саморепликации [47].

3.2.1 Жизненный цикл ВИЧ

С момента открытия ВИЧ прошло более 30 лет. Этот вирус в современной истории обратил на себя внимание из-за случаев скоропостижной смерти гомосексуалистов и наркоманов в США в 1981 году [48], [49], [50]. Впоследствии выяснилось, что вирус на первом этапе был распространен всего несколькими инфицированными людьми, имевшими большое число контактов.

По проблемам ВИЧ-СПИД и связанным вопросам написано бесчисленное количество обзоров и научных статей, а схематичный рисунок со строением вируса был перенесен на страницы учебников по биологии и является примером для изучения обратной транскрипции и функционирования вирусов с РНК-геномом, а также модельным вирусом при построении научных моделей [51], [52].

Host ceil

iff-— Matrix protein

HIV core

сияи.шв

' Hast cell mambtäüs

Migration to ceil surface

• New virus

* protein

budding

Virus assembly

Рис. 2. Жизненный цикл ВИЧ. Показаны ключевые события цикла: присоединение вируса к клетке-хозяину, слияние с клеточной мембраной, обратная транскрипция вирусной РНК, интеграция в геном клетки-хозяина, транскрипция прогена, трансляция вирусной РНК, отпочковывание новых вирусных частиц из клетки-хозяина [53]

3.2.2 Взаимодействие с рецепторами и проникновение в клетку

Вирус проникает в клетки иммунной системы, экспрессирующие рецепторы CD4. посредством взаимодействия с вирусным белком др120 и связывания с ним. Проникновению содействуют корецепторы CCR5 и CXCR4. Данная стадия предполагает высокое сродство крепления CD4 связывающих доменов др120 с CD4. После др120 связывается с белком CD4, комплекс претерпевает структурные изменения, выставляя домены связывания хемокинов др120, позволяя им взаимодействовать с рецепторами хемокинов мишени. Это позволяет создать более стабильное связывание, которое позволяет N-концевым пептидам др41 проникать в клеточные мембраны. Повторы в последовательности

в gp41, HR1 и HR2, взаимодействуя, вызывают превращение внеклеточной части др41 в шпильку. Шпилечные структуры притягивают вирусные и клеточные мембран близко друг к другу, что приводит к слиянию мембран и последующему входу вирусного капсида [54, 55].

После связывания ВИЧ с клеткой-мишенью в клетку попадают РНК ВИЧ и вирусные ферменты, в том числе обратной транскриптазы, интегразы, рибонукпеазы, и протеазы. Вирусная одноцепочечная геномная РНК транскрибируется в двуцепочечную ДНК, которая затем интегрируется в геном клетки-хозяина [55].

ВИЧ способен проникать в дендритные клетки (ДК) по такому же CD4-CCR5 маршруту, но также может использовать маннозо-специфичные лектиновые рецепторы С-типа, такие как DC-SIGN. Дендритные клетки являются одними из первых клеток, с которыми ВИЧ сталкивается при передаче через половые контакты. В настоящее время считается, что они играют важную роль в передаче ВИЧ к Т-кпеткам, когда вирус сохраняется в слизи дендритных клеток. Предполагается, что наличие FEZ-1, который естественно встречается в нейронах предотвращает заражение клеток ВИЧ [56, 57].

3.2.3 Репликация и транскрипция ВИЧ

Вскоре после проникновения вирусного капсида в клетку, фермент, называемый обратной транскриптазой, освобождает одноцепочечную (+) геномную РНК от обеспечивающих стабильность вирусных белков и транскрибирует его в комплементарную (кДНК). Процесс обратной транскрипции имеет большую частоту включения нуклеотидных несоответствий во время синтеза кДНК, и в результате многочисленных мутаций может привести к лекарственной устойчивости или позволяют ВИЧ уклониться от иммунной системы организма. У обратной транскриптазы также есть рибонуклеазная активность, которая расщепляет вирусную РНК в процессе синтеза кДНК. ДНК-зависимая полимеразная активность создает смысловую ДНК из антисмысловой кДНК. Соответственно, кДНК и ее комплементарная форма образуют двуцепочечную вирусную ДНК, которая впоследствии транспортируется в ядро клетки. Включение вирусной ДНК в геном клетки-хозяина осуществляется под действием специфической интегразы [58], [59].

Интегрированная вирусная ДНК может затем находиться в латентной стадии ВИЧ-инфекции, т.е. без активной транскрипции. Для активной продукции

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Григорьев, Илья Владимирович

6 Заключение

Несмотря на значительный прогресс в исследовании ретровирусных инфекций, существующие в настоящие время терапевтические агенты обладают рядом недостатков (токсичность, недостаточная селективность, короткая продолжительность действия, возникновение устойчивых к препаратам вариантов вирусов). Одним из необходимых этапов на пути к созданию более эффективных антиретровирусных препаратов является получение адекватной модельной тест-системы. Целью настоящей работы была оптимизация модельной лентивекторной псевдовирусной системы и проверка малых органических соединений и бИРНК в качестве антиретровирусных агентов.

В первой части настоящей работы на полученной и оптимизированной нами тест-системе оценки активности противовирусных соединений нами были исследованы известные антиретровирусные препараты. При получении системы использовались псевдолентивирусные технологии и метод проточной цитометрии. Данная система позволила проверять вновь синтезированные химические препараты на специфическую активность в культуральных клеточных системах. Эффективность тест-системы подтверждена количественным анализом ингибирования обратной транскриптазы с применением стандартных ингибиторов кТТ, Н-фосфоната А2Т. Для линии клеток-мишеней НЕК293Т при использовании А2Т полученная концентрация 1С50 составила 0,8 мкМ, для Н-фосфоната А2Т 1С50 - 5 мкМ, что хорошо согласуется с литературными данными [231]. В лимфоидных клетках при подавлении инфекции качественно сохраняется отношение, полученное для клеток линии НЕК293Т, то есть ингибирующие концентрации А2ГГ приблизительно на порядок ниже, чем у фосфоната А2ГГ. Другие данные получены для моноцитарной линии, где препараты Аи начинают демонстрировать ингибирующий эффект в концентрации 100 нМ. Степень ингибирования инфекции обоими препаратами в равной мере нарастает в диапазоне концентраций от 1 до 50 мкМ. При использовании А2Т активной является фосфорилированная форма, ее доля коррелирует с активностью клеточных систем фосфорилирования [257]. Данные согласуются с низкими результатами по эффективности нуклеозидных ингибиторов в клетках линии 11937 СаБво!, 2006 #285}. Незначительная активность в этих клетках связана с низким уровнем внутриклеточного фосфорилирования, необходимого для активации

препарата-предшественника [238]. Данная система дает возможность оценивать эффективность кандидатных препаратов еще до стадии доклинических испытаний. Ввиду того, что клинические испытания связаны с вопросами этики, человеческим фактором, большой длительностью по времени и требуют многочисленных затрат на организацию и поддержание эксперимента, принятие решения об испытаниях меньшего количества потенциальных препаратов является желательным.

Во второй части работы исследовали цитотоксичность и способность трансфицировать плазмидную ДНК в различные типы клеток у группы соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой. Было установлено, что они образуют комплекс с молекулами ДНК [247], [248], причем их цитотоксичность в комплексе с НК снижается от 20% до нескольких раз. Была оптимизирована процедура трансфекции, позволившая достигнуть на клетках НЕК293Т значения эффективности свыше 80%. Полученные нами результаты показали, что данный препарат обеспечивает эффективность трансфекции, сравнимую с эффективностью, достигаемую при использовании коммерческого препарата Ме1а!ес1епе. Соединения с длинным алкильным линкером и большей гидрофобностью показали более эффективное комплексообразование с доставляемой плазмидной ДНК. В частности, наибольшая эффективность получена при использовании соединения 16-12-16(ОН), имеющего боковую цепь С16, тогда как соединения типа Ю-х-10 значительно уступали в эффективности трансфекции. Это свидетельствует о том, что, наряду со стехиометрическими электростатическими взаимодействиями, в образование липоплексов вносит вклад кооперативный заряд агрегированных ПАВ. Ранее было показано, что преорганизация в мицеллы оказывается важной для эффективной компактизации в микрочастицы-носители. Плазмидная ДНК, вероятно, служит «липкой лентой», наматывая и собирая вместе позитивно заряженные частицы [240], [249]. По сравнению с существующими зарубежными аналогами охарактеризованные нами вещества обладают рядом преимуществ: 1. Позволяют добиться трансфекции очень большой доли популяции на некоторых линиях клеток. 2. Имеют низкую цитотоксичность, 3. Синтезируются в отечественной лаборатории и имеют более низкую стоимость по сравнению с коммерческими трансфектантами, 4. Известный состав соединений и буферов позволяет прогнозировать характер их

взаимодействия с используемыми препаратами и средами, что невозможно для доступных многокомпонентных коммерческих трансфектантов.

Возможность применения интерферирующих РНК достаточно широко обсуждается [258], [259], [260], [261], [262]. Тем не менее, достаточно серьезно стоит выбор мишеней. В заключительной части работы нами было проверено влияние shPHK на ингибирование лентивирусной инфекции. Предварительный скрининг анти-ВИЧ shPHK можно проводить в модельных клеточных линиях НЕК293Т, используя различные подходы. Они основаны на котрансфекции анти-ВИЧ shPHK и лентивирусных последовательностей-мишеней. В зависимости от используемой стратегии, они разделяются на синтезированные invitro и конструкции, продуцирующие shPHK под контролем различных промоторов. [250], [253], [254], [255]. С применением псевдолентивирус-клеточной системы исследована эффективность соединений, направленных против продукции псевдовируса. Мишенями являются консервативные сайты в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol). Наибольшую активность (до 90% ингибирования репродукции псевдовируса) показали shPHK, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы.

Получены данные о влиянии числа замен в нуклеотидной последовательности мишени на эффективность ингибирования продукции псевдовируса. Исследования анти-ВИЧ shPHK на использованной лентивекторной псевдовирусной системе позволили выявить уровень гомологии РНК с мишенью, необходимый для проявления ингибирующей активности. Было определено эффективное число нуклеотидных несоответствий, при котором сохраняется значительный ингибирующий эффект действия shPHK. Сравнение активностей анти-ВИЧ shPHK с наличием нуклеотидных замен между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени показало, что только shPHK с не более чем одним несоответствием между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени в сайте связывания проявляли высокую эффективность ингибирования. Применение shPHK с сильно вырожденными сайтами-мишенями (5 нуклеотидных замен) приводило к полному падению активности исследуемых соединений, тогда как 2 или 3 нуклеотидных замены вызывали снижение эффективности подавления экспрессии вируса на 10 - 30%.

Важным достоинством системы явилось использование одного цикла инфекции, что устранило сложности получения и поддержания генетической однородности вирусного изолята, неизбежные в стандартной вирусной системе.

Таким образом, показано, что данная псевдовирусная система может с успехом быть задействована для оценки активности антиретровирусных препаратов с использованием клеточных культур. Преимущества предложенной системы могут способствовать поиску новых антиретровирусных агентов и позволят полнее охарактеризовать уже имеющиеся препараты. Охарактеризованные агенты для доставки ДНК создают возможность для дальнейшего улучшения разработанной псевдовирусной системы. Важной особенностью системы является проверка эффективности новых препаратов против мутантных ферментов вируса, устойчивых к традиционным лекарственным средствам [263], [264], [265].

7 Выводы

1. Впервые испытана группа соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой на способность к трансфекции плазмидной ДНК в различные типы клеток и на цитотоксичность. Была оптимизирована процедура трансфекции и достигнуты значения эффективности свыше 50% клеток НЕК293Т.

2. Разработана тест-система оценки активности противовирусных соединений на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии. Оптимизирована процедура инфекции клеток псевдовирусными частицами.

Работоспособность тест-системы подтверждена методом ингибирования обратной транскриптазы с применением стандартных ингибиторов AZT, Н-фосфоната AZT. Для линии кпеток-мишеней НЕК293Т в случае AZT полученная концентрация IC50 составила 0,8 мкМ, для Н-фосфоната AZT IC50 - 5 мкМ.

3. Проведена оценка антиретровирусной активности в отношении псевдолентивирусной инфекции ВИЧ-1 соединений на основе коротких шпилечных shPHK. С применением псевдолентивирус-клеточной системы исследована эффективность этих соединений, направленная против продукции псевдовируса. Мишенями являются консервативные сайты в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol). Наибольшую активность (до 90% ингибирования репродукции псевдовируса) показали shPHK, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы.

4. Сравнение активностей анти-ВИЧ shPHK с наличием нуклеотидных замен между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени показало, что только эффекторные молекулы с не более чем одним несоответствием между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени в сайте связывания проявляли высокую эффективность ингибирования. Использование shPHK с сильно вырожденными сайтами-мишенями (5 нуклеотидных замен) приводило к полному подавлению активности

исследуемых соединений, в то время как 2 или 3 нуклеотидных замены вызывали снижение ее эффективности в отношении инфекции на 10 - 30%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Григорьев, Илья Владимирович, 2013 год

9 Список литературы

1. Mselli-Lakhal L., Favier C., Da Silva Teixeira M. F., Chettab K., Legras C., Ronfort C., Verdier G., Mornex J. F. and Chebloune Y. // Defective RNA packaging is responsible for low transduction efficiency of CAEV-based vectors Arch Virol. 1998. V.143. P. 681-95.

2. Sleat D. E., Turner P. C., Finch J. T., Butler P. J. and Wilson T. M. // Packaging of recombinant RNA molecules into pseudovirus particles directed by the origin-of-assembly sequence from tobacco mosaic virus RNA Virology. 1986. V.155. P. 299-308.

3. Gallie D. R., Plaskitt K. A. and Wilson T. M. // The effect of multiple dispersed copies of the origin-of-assembly sequence from TMV RNA on the morphology of pseudovirus particles assembled in vitro Virology. 1987. V.158. P. 473-6.

4. Gallie D. R., Sleat D. E., Watts J. W., Turner P. C. and Wilson T. M. // In vivo uncoating and efficient expression of foreign mRNAs packaged in TMV-like particles Science. 1987. V.236. P. 1122-4.

5. Blomer U., Ganser A. and Scherr M. // Invasive drug delivery Adv Exp Med Biol. 2002. V.513. P. 431-51.

6. Zakharova L. Y., Syakaev V. V., Voronin M. A., Semenov V. E., Valeeva F. G., Giniyatullin R. K., Latypov S. K., Reznik V. S. and Konovalov A. I. // Supramolecular catalytic systems based on bolaform pyrimidinic surfactants: the counterion effect Mendeleev Communications. 2010. V.20. P. 116-118.

7. Golub E. I., Kim H. and Volsky D. J. // Transfection of DNA into adherent cells by DEAE-dextran/DMSO method increases drastically if the cells are removed from surface and treated in suspension Nucleic Acids Res. 1989. V.17. P. 4902.

8. Sleat D. E., Gallie D. R„ Watts J. W., Deom C. M., Turner P. C., Beachy R. N. and Wilson T. M. // Selective recovery of foreign gene transcripts as virus-like particles in TMV-infected transgenic tobaccos Nucleic Acids Res. 1988. V.16. P. 3127-40.

9. Osbourn J. K., Watts J. W., Beachy R. N. and Wilson T. M. // Evidence that nucleocapsid disassembly and a later step in virus replication are inhibited in transgenic tobacco protoplasts expressing TMV coat protein Virology. 1989. V.172. P. 370-3.

10. Dull T., Zufferey R., Kelly M., Mandel R. J., Nguyen M., Trono D. and Naldini L. //A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system J Virol. 1998.

V.72. P. 8463-71.

11. Chen C. A. and Okayama H. // Calcium phosphate-mediated gene transfer: a highly efficient transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA Biotechniques. 1988. V.6. P. 632-8.

12. Pari G. S. and Keown W. A. // Experimental strategies in efficient transfection of mammalian cells. Calcium phosphate and DEAE-dextran Methods Mol Biol. 1997. V.62. P. 301-6.

13. Rose J. K. // Optimization of transfection Curr Protoc Neurosci. 2001. V.Appendix 1. P. Appendix 1B.

14. Maurisse R., De Semir D., Emamekhoo H., Bedayat B., Abdolmohammadi A., Parsi H. and Gruenert D. // Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages BMC biotechnology. 2010. V.10. P. 9.

15. Lindman B. and Wennerstrom H. Micelles. Springer, 1980.

16. NylanderT., Samoshina Y. and Lindman B. // Formation of polyelectrolyte-surfactant complexes on surfaces Adv Colloid Interface Sci. 2006. V.123-126. P. 10523.

17. Zuidam N. J. and Barenholz Y. // Electrostatic parameters of cationic liposomes commonly used for gene delivery as determined by 4-heptadecyl-7-hydroxycoumarin Biochim Biophys Acta. 1997. V.1329. P. 211-22.

18. Lasic D. D. Liposomes in gene delivery. CRC Pressl Lie, 1997.

19. Pinnaduwage P., Schmitt L. and Huang L. // Use of a quaternary ammonium detergent in liposome mediated DNA transfection of mouse L-cells Biochim Biophys Acta. 1989. V.985. P. 33-7.

20. Hanzlikova M., Soininen P., Lampela P., Mannisto P. T. and Raasmaja A. // The role of PEI structure and size in the PEI/liposome-mediated synergism of gene transfection Plasmid. 2009. V.61. P. 15-21.

21. Gao X. and Huang L. // Potentiation of cationic liposome-mediated gene delivery by polycations Biochemistry. 1996. V.35. P. 1027-36.

22. Zhang S., Zhao B., Jiang H., Wang B. and Ma B. // Cationic lipids and polymers mediated vectors for delivery of siRNA J Control Release. 2007. V.123. P. 1-10.

23. Gerasimov O. V., Boomer J. A., Quails M. M. and Thompson D. H. // Cytosolic drug delivery using pH-and light-sensitive liposomes Advanced drug delivery reviews. 1999. V.38. P. 317-338.

24. Grueso E., Cerrillos C., Hidalgo J. and Lopez-Cornejo P. // Compaction and decompaction of DNA induced by the cationic surfactant CTAB Langmuir. 2012. V.28. P. 10968-79.

25. Gonzalez-Perez A. and Dias R. S. // Different strategies for controlling DNA conformation: compaction and decompaction Front Biosci (Elite Ed). 2009. V.1. P. 22841.

26. Mel'nikov S. M., Sergeyev V. G. and Yoshikawa K. // Transition of double-stranded DNA chains between random coil and compact globule states induced by cooperative binding of cationic surfactant Journal of the American Chemical Society. 1995. V.117. P. 9951-9956.

27. Delville A., Laszlo P. and Schyns R. // Displacement of sodium ions by surfactant ions from DNA A< sup> 23</sup> Na-NMR investigation Biophysical chemistry. 1986. V.24. P. 121-133.

28. Spink С. H. and Chaires J. B. // Thermodynamics of the binding of a cationic lipid to DNA Journal of the American Chemical Society. 1997. V.119. P. 10920-10928.

29. Buckin V., Kudryashow E., Morrissey S., Dawson K. and Kapustina T. Do surfactants form micelles on the surface of DNA? Ред. Trends in Colloid and Interface Science XII, Springer, 1998. C.214-219

30. Jacquier J.-C., Gorelov A., McLoughlin D. and Dawson K. // Capillary electrophoretic study of the complex formation between DNA and cationic surfactants Journal of Chromatography A. 1998. V.817. P. 263-271.

31. Dias R., Antunes F., Miguel M., Lindman S. and Lindman B. // DNA-lipid systems. A physical chemistry study Braz J Med Biol Res. 2002. V.35. P. 509-22.

32. Dias R., Mel'nikov S., Lindman B. and Miguel M. G. // DNA phase behavior in the presence of oppositely charged surfactants Langmuir. 2000. V.16. P. 9577-9583.

33. Wettig S. and Verrall R. // Studies of the interaction of cationic gemini surfactants with polymers and triblock copolymers in aqueous solution Journal of colloid and interface science. 2001. V.244. P. 377-385.

34. Goddard E. // Polymer/surfactant interaction: interfacial aspects Journal of colloid and interface science. 2002. V.256. P. 228-235.

35. Carnali J. // (polymer/polymer)-like phase behavior in the system tetradecyltrimethylammonium bromide/sodium polyacrylate/water Langmuir. 1993. V.9. P. 2933-2941.

36. Goddard E. and Hannan R. // Polymer/surfactant interactions Journal of the American Oil Chemists' Society. 1977. V.54. P. 561-566.

37. Thalberg K. and Lindman B. // Interaction between hyaluronan and cationic surfactants The Journal of Physical Chemistry. 1989. V.93. P. 1478-1483.

38. Chen L., Yu S., Kagami Y., Gong J. and Osada Y. // Surfactant binding of polycations carrying charges on the chain backbone: cooperativity, stoichiometry and crystallinity Macromolecules. 1998. V.31. P. 787-794.

39. Kim B., Ishizawa M., Gong J. and Osada Y. // Molecular and supramolecular structures of complexes formed by polyelectrolyte - surfactant interactions: effects of charge density and compositions Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1999. V.37. P. 635-644.

40. Leal C., Moniri E., Pegado L. and Wennerstrom H. // Electrostatic attraction between DNA and a cationic surfactant aggregate. The screening effect of salt The Journal of Physical Chemistry B. 2007. V.111. P. 5999-6005.

41. Dias R. S., Innerlohinger J., Glatter O., Miguel M. G. and Lindman B. // Coil-globule transition of DNA molecules induced by cationic surfactants: a dynamic light scattering study J Phys Chem B. 2005. V.109. P. 10458-63.

42. Dias R. S., Svingen R., Gustavsson B., Lindman B., Miguel M. G. and Akerman B. // Electrophoretic properties of complexes between DNA and the cationic surfactant cetyltrimethylammonium bromide Electrophoresis. 2005. V.26. P. 2908-2917.

43. Ilekti P., Piculell L., Tournilhac F. and Cabane B. // How to concentrate an aqueous polyelectrolyte/surfactant mixture by adding water The Journal of Physical Chemistry B. 1998. V.102. P. 344-351.

44. Goddard E. D. and Ananthapadmanabhan K. P. Interactions of surfactants with polymers and proteins. CRC press Boca Raton, FL, 1993.

45. Dias R. and Lindman B. DNA interactions with polymers and surfactants. Wiley-Interscience, 2008.

46. // Central dogma reversed Nature. 1970. V.226. P. 1198-9.

47. de Bethune M.-P. // Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), their discovery, development, and use in the treatment of HIV-1 infection: A review of the last 20 years (1989-2009) Antiviral Research. 2010. V.85. P. 75-90.

48. Gallo R. C., Sarin P. S., Gelmann E., Robert-Guroff M., Richardson E., Kalyanaraman V., Mann D., Sidhu G. D., Stahl R. E. and Zolla-Pazner S. // Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS) Science. 1983. V.220. P. 865-867.

49. Montagnier L., Barre-Sinoussi F. and Chermann J. // Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for AIDS Science. 1983. V.220. P. 868.

50. Gallo R. C., Salahuddin S. Z., Popovic M., Shearer G. M., Kaplan M., Haynes B. F., PalkerT. J., Redfield R., Oleske J. and Safai B. // Frequent detection and isolation of

cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS Science. 1984. V.224. P. 500-503.

51. Junqueira D. M., de Medeiros R. M., Matte M. C. C., Araujo L. A. L., Chies J. A. B., Ashton-Prolla P. and de Matos Almeida S. E. // Reviewing the History of HIV-1: Spread of Subtype B in the Americas PLoS One. 2011. V.6. P. e27489.

52. Gilbert M. T. P., Rambaut A., Wlasiuk G., Spira T. J., Pitchenik A. E. and Worobey M. // The emergence of HIV/AIDS in the Americas and beyond Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007. V.104. P. 18566-18570.

53.

54. Chan D. C. and Kim P. S. // HIV entry and its inhibition Cell. 1998. V.93. P. 681-4.

55. Wyatt R. and Sodroski J. //The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens Science. 1998. V.280. P. 1884-8.

56. Pope M. and Haase A. T. // Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for strategies to prevent infection Nat Med. 2003. V.9. P. 847-52.

57. Maturana A. D., Fujita T. and Kuroda S. // Functions of fasciculation and elongation protein zeta-1 (FEZ1) in the brain ScientificWorldJournal. 2010. V.10. P. 1646-54.

58. Stolp B. and Fackler O. T. // How HIV takes advantage of the cytoskeleton in entry and replication Viruses. 2011. V.3. P. 293-311.

59. Markovic I. and Clouse K. A. // Recent advances in understanding the molecular mechanisms of HIV-1 entry and fusion: revisiting current targets and considering new options for therapeutic intervention Curr HIV Res. 2004. V.2. P. 223-34.

60. Zheng Y. H., Lovsin N. and Peterlin B. M. // Newly identified host factors modulate HIV replication Immunol Lett. 2005. V.97. P. 225-34.

61. Sun S. C., Harhaj E. W., Xiao G. and Good L. // Activation of l-kappaB kinase by the HTLV type 1 Tax protein: mechanistic insights into the adaptor function of IKKgamma AIDS Res Hum Retroviruses. 2000. V.16. P. 1591-6.

62. Hiscott J., Kwon H. and Genin P. // Hostile takeovers: viral appropriation of the NF-kappaB pathway J Clin Invest. 2001. V. 107. P. 143-51.

63. Pollard V. W. and Malim M. H. //The HIV-1 Rev protein Annu Rev Microbiol. 1998. V.52. P. 491-532.

64. Wu X., Li Y., Crise B. and Burgess S. M. // Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration Science. 2003. V.300. P. 1749-51.

65. De Palma M., Montini E., Santoni de Sio F. R., Benedicenti F., Gentile A., Medico E. and Naldini L. // Promoter trapping reveals significant differences in integration site

selection between MLV and HIV vectors in primary hematopoietic cells Blood. 2005. V.105. P. 2307-15.

66. Tsukahara T., Agawa H., Matsumoto S., Matsuda M., Ueno S., Yamashita Y., Yamada K., Tanaka N., Kojima K. and Takeshita T. // Murine leukemia virus vector integration favors promoter regions and regional hot spots in a human T-cell line Biochem Biophys Res Commun. 2006. V.345. P. 1099-107.

67. Deichmann A., Hacein-Bey-Abina S., Schmidt M., Garrigue A., Brugman M. H., Hu J., Glimm H., Gyapay G., Prum B., Fraser C. C., Fischer N., Schwarzwaelder K., Siegler M. L., de Ridder D., Pike-Overzet K., Howe S. J., Thrasher A. J., Wagemaker G., Abel U., Staal F. J., Delabesse E., Villeval J. L., Aronow B., Hue C., Prinz C., Wissler M., Klanke C., Weissenbach J., Alexander I., Fischer A., von Kalle C. and Cavazzana-Calvo M. // Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy J Clin Invest. 2007. V.117. P. 2225-32.

68. Hacein-Bey-Abina S., Garrigue A., Wang G. P., Soulier J., Lim A., Morillon E., Clappier E., Caccavelli L., Delabesse E., Beldjord K., Asnafi V., Maclntyre E., Dal Cortivo L., Radford I., Brousse N., Sigaux F., Moshous D., Hauer J., Borkhardt A., Belohradsky B. H., Wintergerst U., Velez M. C., Leiva L., Sorensen R., Wulffraat N., Blanche S., Bushman F. D., Fischer A. and Cavazzana-Calvo M. // Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1 J Clin Invest. 2008. V.118. P. 3132-42.

69. Hacein-Bey-Abina S., von Kalle C., Schmidt M., Le Deist F., Wulffraat N., Mclntyre E., Radford I., Villeval J. L., Fraser C. C., Cavazzana-Calvo M. and Fischer A. // A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency N Engl J Med. 2003. V.348. P. 255-6.

70. // One of three successfully treated CGD patients in a Swiss-German gene therapy trial died due to his underlying disease: A position statement from the European Society of Gene Therapy (ESGT) J Gene Med. 2006. V.8. P. 1435.

71. Roe T., Reynolds T. C., Yu G. and Brown P. O. // Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis Embo J. 1993. V.12. P. 2099-108.

72. Lewis P. F. and Emerman M. // Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for the human immunodeficiency virus J Virol. 1994. V.68. P. 510-6.

73. Schroder A. R., Shinn P., Chen H., Berry C., Ecker J. R. and Bushman F. // HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots Cell. 2002. V.110. P. 521-9.

74. Mitchell R. S., Beitzel B. F., Schroder A. R., Shinn P., Chen H., Berry C. C., Ecker J. R. and Bushman F. D. // Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences PLoS Biol. 2004. V.2. P. E234.

75. Felice B., Cattoglio C., Cittaro D., Testa A., Miccio A., Ferrari G., Luzi L., Recchia A. and Mavilio F. // Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome PLoS One. 2009. V.4. P. e4571.

76. Laufs S., Guenechea G., Gonzalez-Murillo A., Zsuzsanna Nagy K., Luz Lozano M., del Val C., Jonnakuty S., Hotz-Wagenblatt A., Jens Zeller W., Bueren J. A. and Fruehauf S. // Lentiviral vector integration sites in human NOD/SCID repopulating cells J Gene Med. 2006. V.8. P. 1197-207.

77. Wang G. P., Levine B. L., Binder G. K., Berry C. C., Malani N., McGarrity G., Tebas P., June C. H. and Bushman F. D. //Analysis of lentiviral vector integration in HIV+ study subjects receiving autologous infusions of gene modified CD4+ T cells Mol Ther. 2009. V.17. P. 844-50.

78. Yang S. H., Cheng P. H., Sullivan R. T., Thomas J. W. and Chan A. W. // Lentiviral integration preferences in transgenic mice Genesis. 2008. V.46. P. 711-8.

79. Lewinski M. K., Yamashita M., Emerman M., Ciuffi A., Marshall H., Crawford G., Collins F., Shinn P., Leipzig J., Hannenhalli S., Berry C. C., Ecker J. R. and Bushman F. D. // Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection PLoS Pathog. 2006. V.2. P. e60.

80. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese B., Van Beeumen J., Engelborghs Y., De Clercq E. and Debyser Z. // HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells J Biol Chem. 2003. V.278. P. 372-81.

81. Engelman A. and Cherepanov P. // The lentiviral integrase binding protein LEDGF/p75 and HIV-1 replication PLoS Pathog. 2008. V.4. P. e1000046.

82. Ciuffi A. // Mechanisms governing lentivirus integration site selection Curr Gene Ther. 2008. V.8. P. 419-29.

83. Pfeifer A., KesslerT., Yang M., Baranov E., Kootstra N., Cheresh D. A., Hoffman R. M. and Verma I. M. // Transduction of liver cells by lentiviral vectors: analysis in living animals by fluorescence imaging Mol Ther. 2001. V.3. P. 319-22.

84. Zamule S. M., Strom S. C. and Omiecinski C. J. // Preservation of hepatic phenotype in lentiviral-transduced primary human hepatocytes Chem Biol Interact. 2008. V.173. P. 179-86.

85. Dagher I., Nguyen T. H., Groyer-Picard M. T., Lainas P., Mainot S., Guettier C., Pariente D., Franco D. and Weber A. // Efficient hepatocyte engraftment and long-term transgene expression after reversible portal embolization in nonhuman primates Hepatology. 2009. V.49. P. 950-9.

86. Reiser J., Harmison G., Kluepfel-Stahl S., Brady R. O., Karlsson S. and Schubert M. // Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P. 15266-71.

87. Ricks D. M., Kutner R., Zhang X. Y., Welsh D. A. and Reiser J. // Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells Stem Cells Dev. 2008. V.17. P. 441-50.

88. Santoni de Sio F. and Naldini L. // Short-term culture of human CD34+ cells for lentiviral gene transfer Methods Mol Biol. 2009. V.506. P. 59-70.

89. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F. H., Verma I. M. and Trono D. // In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector Science. 1996. V.272. P. 263-7.

90. Zufferey R., Nagy D., Mandel R. J., Naldini L. and Trono D. // Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo Nat Biotechnol. 1997. V.15. P. 871-5.

91. Veron P., Boutin S., Martin S., Chaperot L., Plumas J., Davoust J. and Masurier C. // Highly efficient transduction of human plasmacytoid dendritic cells without phenotypic and functional maturation J Transl Med. 2009. V.7. P. 10.

92. Naldini L., Blomer U., Gage F. H., Trono D. and Verma I. M. // Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P. 11382-8.

93. Blomer U., Naldini L., Kafri T., Trono D., Verma I. M. and Gage F. H. // Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector J Virol. 1997. V.71. P. 6641-9.

94. Wong L. F., Azzouz M., Walmsley L. E., Askham Z., Wilkes F. J., Mitrophanous K. A., Kingsman S. M. and Mazarakis N. D. //Transduction patterns of pseudotyped lentiviral vectors in the nervous system Mol Ther. 2004. V.9. P. 101-11.

95. Federici T., Kutner R., Zhang X. Y., Kuroda H., Tordo N., Boulis N. M. and Reiser J. // Comparative analysis of HIV-1 -based lentiviral vectors bearing lyssavirus glycoproteins for neuronal gene transfer Genet Vaccines Ther. 2009. V.7. P. 1.

96. Hioki H., Kuramoto E., Konno M., Kameda H., Takahashi Y., Nakano T., Nakamura K. C. and Kaneko T. // High-level transgene expression in neurons by lentivirus with Tet-Off system Neurosci Res. 2009. V.63. P. 149-54.

97. Watanabe S. and Temin H. M. // Construction of a helper cell line for avian reticuloendotheliosis virus cloning vectors Mol Cell Biol. 1983. V.3. P. 2241-9.

98. Mann R., Mulligan R. C. and Baltimore D. // Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus Cell. 1983. V.33. P. 1539.

99. Page K. A., Landau N. R. and Littman D. R. // Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity J Virol. 1990. V.64. P. 5270-6.

100. Landau N. R., Page K. A. and Littman D. R. // Pseudotyping with human T-cell leukemia virus type I broadens the human immunodeficiency virus host range J Virol. 1991. V.65. P. 162-9.

101. Negre D., Mangeot P. E., Duisit G., Blanchard S., Vidalain P. O., Leissner P., Winter A. J., Rabourdin-Combe C., Mehtali M., Moullier P., Darlix J. L. and Cosset F. L. // Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells Gene Ther. 2000. V.7. P. 1613-23.

102. Nakajima T., Nakamaru K., Ido E., Terao K., Hayami M. and Hasegawa M. // Development of novel simian immunodeficiency virus vectors carrying a dual gene expression system Hum Gene Ther. 2000. V.11. P. 1863-74.

103. Poeschla E. M., Wong-Staal F. and Looney D. J. // Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors Nat Med. 1998. V.4. P. 354-7.

104. Berkowitz R., lives H., Lin W. Y., Eckert K., Coward A., Tamaki S., Veres G. and Plavec I. // Construction and molecular analysis of gene transfer systems derived from bovine immunodeficiency virus J Virol. 2001. V.75. P. 3371-82.

105. Olsen J. C. // Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus Gene Ther. 1998. V.5. P. 1481-7.

106. Metharom P., Takyar S., Xia H. H., Ellem K. A., Macmillan J., Shepherd R. W., Wilcox G. E. and Wei M. Q. // Novel bovine lentiviral vectors based on Jembrana disease virus J Gene Med. 2000. V.2. P. 176-85.

107. Berkowitz R. D., lives H., Plavec I. and Veres G. // Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity Virology. 2001. V.279. P. 116-29.

108. Connolly J. B. // Lentiviruses in gene therapy clinical research Gene Ther. 2002. V.9. P. 1730-4.

109. Manilla P., Rebello T., Afable C., Lu X., Slepushkin V., Humeau L. M., Schonely K., Ni Y., Binder G. K., Levine B. L., MacGregor R. R., June C. H. and Dropulic B. // Regulatory considerations for novel gene therapy products: a review of the process leading to the first clinical lentiviral vector Hum Gene Ther. 2005. V.16. P. 17-25.

110. Sastry L. and Cornetta K. // Detection of replication competent retrovirus and lentivirus Methods Mol Biol. 2009. V.506. P. 243-63.

111. Barraza R. A. and Poeschla E. M. // Human gene therapy vectors derived from feline lentiviruses Vet Immunol Immunopathol. 2008. V.123. P. 23-31.

112. Zufferey R., Dull T., Mandel R. J., Bukovsky A., Quiroz D., Naldini L. and Trono D. // Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery J Virol. 1998. V.72. P. 9873-80.

113. Whitcomb J. M., Huang W., Fransen S., Limoli K., Torna J., Wrin T., Chappey C., Kiss L. D., Paxinos E. E. and Petropoulos C. J. // Development and characterization of a novel single-cycle recombinant-virus assay to determine human immunodeficiency virus type 1 coreceptor tropism Antimicrob Agents Chemother. 2007. V.51. P. 566-75.

114. Heiseth E., Kowalski M., Gabuzda D., Olshevsky U., Haseltine W. and Sodroski J. // Rapid complementation assays measuring replicative potential of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein mutants J Virol. 1990. V.64. P. 2416-20.

115. Poznansky M., Lever A., Bergeron L., Haseltine W. and Sodroski J. // Gene transfer into human lymphocytes by a defective human immunodeficiency virus type 1 vector J Virol. 1991. V.65. P. 532-6.

116. Parolin C., Dorfman T., Palu G., Gottlinger H. and Sodroski J. //Analysis in human immunodeficiency virus type 1 vectors of cis-acting sequences that affect gene transfer into human lymphocytes J Virol. 1994. V.68. P. 3888-95.

117. Clever J., Sassetti C. and Parslow T. G. // RNA secondary structure and binding sites for gag gene products in the 5' packaging signal of human immunodeficiency virus type 1 J Virol. 1995. V.69. P. 2101-9.

118. Akkina R. K., Walton R. M., Chen M. L., Li Q. X., Planelles V. and Chen I. S. // High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus

type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G J Virol. 1996. V.70. P. 2581-5.

119. Klimatcheva E., Rosenblatt J. D. and Planelles V. // Lentiviral vectors and gene therapy Front Biosci. 1999. V.4. P. D481-96.

120. Gibbs J. S., Regier D. A. and Desrosiers R. C. // Construction and in vitro properties of HIV-1 mutants with deletions in "nonessential" genes AIDS Res Hum Retroviruses. 1994. V.10. P. 343-50.

121. Kafri T., Blomer U., Peterson D. A., Gage F. H. and Verma I. M. // Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors Nat Genet. 1997. V.17. P. 314-7.

122. Mochizuki H., Schwartz J. P., Tanaka K., Brady R. O. and Reiser J. // High-titer human immunodeficiency virus type 1-based vector systems for gene delivery into nondividing cells J Virol. 1998. V.72. P. 8873-83.

123. Kim V. N., Mitrophanous K., Kingsman S. M. and Kingsman A. J. // Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1 J Virol. 1998. V.72. P. 811-6.

124. Ngumbela K. C., Ryan K. P., Sivamurthy R., Brockman M. A., Gandhi R. T., Bhardwaj N. and Kavanagh D. G. // Quantitative effect of suboptimal codon usage on translational efficiency of mRNA encoding HIV-1 gag in intact T cells PLoS One. 2008. V.3. P. e2356.

125. Kotsopoulou E., Kim V. N., Kingsman A. J., Kingsman S. M. and Mitrophanous K. A. //A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1 )-based vector that exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pol gene J Virol. 2000. V.74. P. 4839-52.

126. Bray M., Prasad S., Dubay J. W., Hunter E., Jeang K. T., Rekosh D. and Hammarskjold M. L. // A small element from the Mason-Pfizer monkey virus genome makes human immunodeficiency virus type 1 expression and replication Rev-independent Proc Natl Acad Sei USA. 1994. V.91. P. 1256-60.

127. Srinivasakumar N., Chazal N., Helga-Maria C., Prasad S., Hammarskjold M. L. and Rekosh D. // The effect of viral regulatory protein expression on gene delivery by human immunodeficiency virus type 1 vectors produced in stable packaging cell lines J Virol. 1997. V.71. P. 5841-8.

128. Rizvi T. A., Lew K. A., Murphy E. C., Jr. and Schmidt R. D. // Role of Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) constitutive transport element (CTE) in the propagation of MPMV vectors by genetic complementation using homologous/heterologous env genes Virology. 1996. V.224. P. 517-32.

129. Swartz J. E., Bor Y. C., Misawa Y., Rekosh D. and Hammarskjold M. L. //The shuttling SR protein 9G8 plays a role in translation of unspliced mRNA containing a constitutive transport element J Biol Chem. 2007. V.282. P. 19844-53.

130. Oh T., Bajwa A., Jia G. and Park F. // Lentiviral vector design using alternative RNA export elements Retrovirology. 2007. V.4. P. 38.

131. Wu X., Wakefield J. K., Liu H„ Xiao H„ Kralovics R„ Prchal J. T. and Kappes J. C. // Development of a novel trans-lentiviral vector that affords predictable safety Mol Ther. 2000. V.2. P. 47-55.

132. Kappes J. C., Wu X. and Wakefield J. K. // Production of trans-lentiviral vector with predictable safety Methods Mol Med. 2003. V.76. P. 449-65.

133. Pandya S., Boris-Lawrie K., Leung N. J., Akkina R. and Planelles V. // Development of an Rev-independent, minimal simian immunodeficiency virus-derived vector system Hum Gene Ther. 2001. V.12. P. 847-57.

134. White S. M., Renda M., Nam N. Y., Klimatcheva E., Zhu Y., Fisk J., Halterman M., Rimel B. J., Federoff H., Pandya S., Rosenblatt J. D. and Planelles V. // Lentivirus vectors using human and simian immunodeficiency virus elements J Virol. 1999. V.73. P. 2832-40.

135. Sachdeva G., D'Costa J., Cho J. E., Kachapati K., Choudhry V. and Arya S. K. // Chimeric HIV-1 and HIV-2 lentiviral vectors with added safety insurance J Med Virol. 2007. V.79. P. 118-26.

136. Kuate C., Gelisse P., Baldy-Moulinier M. and Crespel A. // [Bupropion-induced epileptic seizures] Rev Neurol (Paris). 2004. V.160. P. 701-3.

137. Del Vecchio D. // Breast reconstruction for breast asymmetry using recipient site pre-expansion and autologous fat grafting: a case report Ann Plast Surg. 2009. V.62. P. 523-7.

138. Chang L. J., McNulty E. and Martin M. // Human immunodeficiency viruses containing heterologous enhancer/promoters are replication competent and exhibit different lymphocyte tropisms J Virol. 1993. V.67. P. 743-52.

139. Soneoka Y., Cannon P. M., Ramsdale E. E., Griffiths J. C., Romano G., Kingsman S. M. and Kingsman A. J. // A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors Nucleic Acids Res. 1995. V.23. P. 628-33.

140. Iwakuma T., Cui Y. and Chang L. J. // Self-inactivating lentiviral vectors with U3 and U5 modifications Virology. 1999. V.261. P. 120-32.

141. Yu S. F., von Ruden T., Kantoff P. W., GarberC., Seiberg M., Ruther U., Anderson W. F., Wagner E. F. and Gilboa E. // Self-inactivating retroviral vectors

designed for transfer of whole genes into mammalian cells Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V.83. P. 3194-8.

142. Bukovsky A. A., Song J. P. and Naldini L. // Interaction of human immunodeficiency virus-derived vectors with wild-type virus in transduced cells J Virol. 1999. V.73. P. 7087-92.

143. Bokhoven M., Stephen S. L., Knight S., Gevers E. F., Robinson I. C., Takeuchi Y. and Collins M. K. // Insertional gene activation by lentiviral and gammaretroviral vectors J Virol. 2009. V.83. P. 283-94.

144. Montini E., Cesana D., Schmidt M., Sanvito F., Bartholomae C. C., Ranzani M., Benedicenti F., Sergi L. S., Ambrosi A., Ponzoni M., Doglioni C., Di Serio C., von Kalle C. and Naldini L. // The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy J Clin Invest. 2009. V.119. P. 964-75.

145. Evans J. T. and Garcia J. V. // Lentivirus vector mobilization and spread by human immunodeficiency virus Hum Gene Ther. 2000. V.11. P. 2331-9.

146. Levine B. L., Humeau L. M., Boyer J., MacGregor R. R., Rebello T., Lu X., Binder G. K., Slepushkin V., Lemiale F., Mascola J. R., Bushman F. D., Dropulic B. and June C. H. // Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V.103. P. 17372-7.

147. Mok H. P., Javed S. and Lever A. // Stable gene expression occurs from a minority of integrated HIV-1-based vectors: transcriptional silencing is present in the majority Gene Ther. 2007. V.14. P. 741-51.

148. Logan A. C., Haas D. L., Kafri T. and Kohn D. B. // Integrated self-inactivating lentiviral vectors produce full-length genomic transcripts competent for encapsidation and integration J Virol. 2004. V.78. P. 8421-36.

149. Hanawa H., Persons D. A. and Nienhuis A. W. // Mobilization and mechanism of transcription of integrated self-inactivating lentiviral vectors J Virol. 2005. V.79. P. 841021.

150. Aiken C. // Pseudotyping human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by the glycoprotein of vesicular stomatitis virus targets HIV-1 entry to an endocytic pathway and suppresses both the requirement for Nef and the sensitivity to cyclosporin A J Virol. 1997. V.71. P. 5871-7.

151. Chazal N., Singer G., Aiken C., Hammarskjold M. L. and Rekosh D. // Human immunodeficiency virus type 1 particles pseudotyped with envelope proteins that fuse at low pH no longer require Nef for optimal infectivity J Virol. 2001. V.75. P. 4014-8.

152. Coil D. A. and Miller A. D. // Phosphatidylserine is not the cell surface receptor for vesicular stomatitis virus J Virol. 2004. V.78. P. 10920-6.

153. Carneiro F. A., Lapido-Loureiro P. A., Cordo S. M., Stauffer F., Weissmuller G., Bianconi M. L., Juliano M. A., Juliano L., Bisch P. M. and Da Poian A. T. // Probing the interaction between vesicular stomatitis virus and phosphatidylserine Eur Biophys J. 2006. V.35. P. 145-54.

154. Burns J. C., Friedmann T., Driever W., Burrascano M. and Yee J. K. //Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V.90. P. 8033-7.

155. Li Y., Drone C., Sat E. and Ghosh H. P. // Mutational analysis of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G for membrane fusion domains J Virol. 1993. V.67. P. 4070-7.

156. Chen S. T., lida A., Guo L., Friedmann T. and Yee J. K. // Generation of packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors of the G protein of vesicular stomatitis virus by using a modified tetracycline inducible system Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. V.93. P. 10057-62.

157. Ory D. S., Neugeboren B. A. and Mulligan R. C. // A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P. 11400-6.

158. Farson D., Witt R., McGuinness R., Dull T., Kelly M., Song J., Radeke R., Bukovsky A., Consiglio A. and Naldini L. // A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors Hum Gene Ther. 2001. V.12. P. 981-97.

159. Kafri T., van Praag H., Ouyang L., Gage F. H. and Verma I. M. // A packaging cell line for lentivirus vectors J Virol. 1999. V.73. P. 576-84.

160. Ni Y., Sun S., Oparaocha I., Humeau L., Davis B., Cohen R., Binder G., Chang Y. N., Slepushkin V. and Dropulic B. // Generation of a packaging cell line for prolonged large-scale production of high-titer HIV-1 -based lentiviral vector J Gene Med. 2005. V.7. P. 818-34.

161. Cockrell A. S., Ma H., Fu K., McCown T. J. and Kafri T. // A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors Mol Ther. 2006. V.14. P. 276-84.

162. Broussau S., Jabbour N., Lachapelle G., Durocher Y., Tom R., Transfiguración J., Gilbert R. and Massie B. // Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture Mol Ther. 2008. V.16. P. 500-7.

163. DePolo N. J., Reed J. D., Sheridan P. L., Townsend K., Sauter S. L., Jolly D. J. and Dubensky T. W., Jr. // VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum Mol Ther. 2000. V.2. P. 218-22.

164. Higashikawa F. and Chang L. // Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors Virology. 2001. V.280. P. 124-31.

165. Croyle M. A., Callahan S. M., Auricchio A., Schumer G., Linse K. D., Wilson J. M., Brunner L. J. and Kobinger G. P. // PEGylation of a vesicular stomatitis virus G pseudotyped lentivirus vector prevents inactivation in serum J Virol. 2004. V.78. P. 91221.

166. Verhoeyen E. and Cosset F. L. // Surface-engineering of lentiviral vectors J Gene Med. 2004. V.6 Suppl 1. P. S83-94.

167. Cronin J., Zhang X. Y. and Reiser J. // Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping Curr Gene Ther. 2005. V.5. P. 387-98.

168. Frecha C., Szecsi J., Cosset F. L. and Verhoeyen E. // Strategies for targeting lentiviral vectors Curr Gene Ther. 2008. V.8. P. 449-60.

169. Buchholz C. J., Muhlebach M. D. and Cichutek K. // Lentiviral vectors with measles virus glycoproteins - dream team for gene transfer? Trends Biotechnol. 2009. V.27. P. 259-65.

170. Buchschacher G. L., Jr. and Panganiban A. T. // Human immunodeficiency virus vectors for inducible expression of foreign genes J Virol. 1992. V.66. P. 2731-9.

171. Zhang X. Y., La Russa V. F. and Reiser J. // Transduction of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells by using lentivirus vectors pseudotyped with modified RD114 envelope glycoproteins J Virol. 2004. V.78. P. 1219-29.

172. Mazarakis N. D., Azzouz M., Rohll J. B., Ellard F. M., Wilkes F. J., Olsen A. L., Carter E. E., Barber R. D., Baban D. F., Kingsman S. M., Kingsman A. J., O'Malley K. and Mitrophanous K. A. // Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery Hum Mol Genet. 2001. V. 10. P. 2109-21.

173. Frecha C., Costa C., Negre D., Gauthier E., Russell S. J., Cosset F. L. and Verhoeyen E. // Stable transduction of quiescent T cells without induction of cycle progression by a novel lentiviral vector pseudotyped with measles virus glycoproteins Blood. 2008. V.112. P. 4843-52.

174. Frecha C., Costa C., Levy C., Negre D., Russell S. J., Maisner A., Salles G., Peng K. W., Cosset F. L. and Verhoeyen E. // Efficient and stable transduction of resting B

lymphocytes and primary chronic lymphocyte leukemia cells using measles virus gp displaying lentiviral vectors Blood. 2009. V.114. P. 3173-80.

175. Funke S., Maisner A., Muhlebach M. D., Koehl U., Grez M., Cattaneo R., Cichutek K. and Buchholz C. J. // Targeted cell entry of lentiviral vectors Mol Ther. 2008. V.16. P. 1427-36.

176. Froelich S., Ziegler L., Stroup K. and Wang P. //Targeted gene delivery to CD117-expressing cells in vivo with lentiviral vectors co-displaying stem cell factor and a fusogenic molecule Biotechnol Bioeng. 2009. V.104. P. 206-15.

177. Yang L., Bailey L., Baltimore D. and Wang P. // Targeting lentiviral vectors to specific cell types in vivo Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V.103. P. 11479-84.

178. Ziegler L., Yang L., Joo K., Yang H., Baltimore D. and Wang P. //Targeting lentiviral vectors to antigen-specific immunoglobulins Hum Gene Ther. 2008. V.19. P. 861-72.

179. Yang L., Yang H., Rideout K., Cho T., Joo K. I., Ziegler L„ Elliot A., Walls A., Yu D., Baltimore D. and Wang P. // Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization Nat Biotechnol. 2008. V.26. P. 326-34.

180. Yang H., Joo K. I., Ziegler L. and Wang P. // Cell type-specific targeting with surface-engineered lentiviral vectors co-displaying OKT3 antibody and fusogenic molecule Pharm Res. 2009. V.26. P. 1432-45.

181. Chang L. J. and Gay E. E. // The molecular genetics of lentiviral vectors-current and future perspectives Curr Gene Ther. 2001. V.1. P. 237-51.

182. Logan A. C., Lutzko C. and Kohn D. B. // Advances in lentiviral vector design for gene-modification of hematopoietic stem cells Curr Opin Biotechnol. 2002. V.13. P. 42936.

183. Barry S. C., Harder B., Brzezinski M., Flint L. Y., Seppen J. and Osborne W. R. // Lentivirus vectors encoding both central polypurine tract and posttranscriptional regulatory element provide enhanced transduction and transgene expression Hum Gene Ther. 2001. V. 12. P. 1103-8.

184. Klimatcheva E., Planelles V., Day S. L., Fulreader F., Renda M. J. and Rosenblatt J. // Defective lentiviral vectors are efficiently trafficked by HIV-1 and inhibit its replication Mol Ther. 2001. V.3. P. 928-39.

185. Pandya S., Klimatcheva E. and Planelles V. // Lentivirus and foamy virus vectors: novel gene therapy tools Expert Opin Biol Ther. 2001. V.1. P. 17-40.

186. Dropulic В., Hermankova M. and Pitha P. M. //A conditionally replicating HIV-1 vector interferes with wild-type HIV-1 replication and spread Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P. 11103-8.

187. de Bethune M. P. // Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), their discovery, development, and use in the treatment of HIV-1 infection: a review of the last 20 years (1989-2009) Antiviral Res. 2010. V.85. P. 75-90.

188. D'Andrea G., Brisdelli F. and Bozzi A. // AZT: an old drug with new perspectives Curr Clin Pharmacol. 2008. V.3. P. 20-37.

189. Borrelli F. and Izzo A. A. // Herb-drug interactions with St John's wort (Hypericum perforatum): an update on clinical observations AAPS J. 2009. V.11. P. 710-27.

190. Arribas J. R. // [Role of the new molecules in antiretroviral therapy. Position of raltegravir] Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008. V.26 Suppl 12. P. 53-9.

191. Tenore S. B. and Ferreira P. R. //The Place of protease inhibitors in antiretroviral treatment Braz J Infect Dis. 2009. V.13. P. 371-4.

192. Tilton J. C. and Doms R. W. // Entry inhibitors in the treatment of HIV-1 infection Antiviral Res. 2010. V.85. P. 91-100.

193. Pang W., Tam S. C. and Zheng Y. T. // Current peptide HIV type-1 fusion inhibitors Antivir Chem Chemother. 2009. V.20. P. 1-18.

194. McKinnell J. A. and Saag M. S. // Novel drug classes: entry inhibitors [enfuvirtide, chemokine (C-C motif) receptor 5 antagonists] Curr Opin HIV AIDS. 2009. V.4. P. 5137.

195. Makinson A. and Reynes J. // The fusion inhibitor enfuvirtide in recent antiretroviral strategies Curr Opin HIV AIDS. 2009. V.4. P. 150-8.

196. Soriano V., Perno C. F., Kaiser R., Calvez V., Gatell J. M., di Perri G., Pillay D., Rockstroh J. and Geretti A. M. //When and how to use maraviroc in HIV-infected patients AIDS. 2009. V.23. P. 2377-85.

197. Gatell J. M. // The use of integrase inhibitors in treatment-experienced patients Eur J Med Res. 2009. V.14 Suppl 3. P. 30-5.

198. Lehner В., Fraser A. G. and Sanderson С. M. // Technique review: how to use RNA interference Brief Funct Genomic Proteomic. 2004. V.3. P. 68-83.

199. Daneholt B. // RNA interference The Nobel Assembly at Karolinska Institutet, Oficial website Nobel Foundation. 2006. P.

200. Bagasra O. and Prilliman K. R. // RNA interference: the molecular immune system J Mol Histol. 2004. V.35. P. 545-53.

201. Siomi H. and Siomi M. C. // On the road to reading the RNA-interference code Nature. 2009. V.457. P. 396-404.

202. Vermeulen A., Behlen L., Reynolds A., Wolfson A., Marshall W. S., Karpilow J. and Khvorova A. // The contributions of dsRNA structure to Dicer specificity and efficiency RNA. 2005. V.11. P. 674-82.

203. Zamore P. D., Tuschl T., Sharp P. A. and Bartel D. P. // RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell. 2000. V.101. P. 25-33.

204. Castanotto D. and Rossi J. J. // The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics Nature. 2009. V.457. P. 426-33.

205. Qiu S., Adema C. M. and Lane T. // A computational study of off-target effects of RNA interference Nucleic Acids Res. 2005. V.33. P. 1834-47.

206. Ahlquist P. // RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing Science. 2002. V.296. P. 1270-3.

207. den Boon J. A., Diaz A. and Ahlquist P. // Cytoplasmic viral replication complexes Cell Host Microbe. 2010. V.8. P. 77-85.

208. Baulcombe D. C. // Molecular biology. Amplified silencing Science. 2007. V.315. P. 199-200.

209. Pak J. and Fire A. // Distinct populations of primary and secondary effectors during RNAi in C. elegans Science. 2007. V.315. P. 241-4.

210. Sijen T., Steiner F. A., Thijssen K. L. and Plasterk R. H. // Secondary siRNAs result from unprimed RNA synthesis and form a distinct class Science. 2007. V.315. P. 244-7.

211. Gregory R. I., Chendrimada T. P., Cooch N. and Shiekhattar R. // Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing Cell. 2005. V.123. P. 631-40.

212. Lodish H. Molecular Cell Biology. W. H. Freeman, 2008.

213. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D. P. and Zamore P. D. // Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes Cell. 2005. V.123. P. 607-20.

214. Leuschner P. J., Ameres S. L., Kueng S. and Martinez J. // Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells EMBO Rep. 2006. V.7. P. 31420.

215. Sen G. L., Wehrman T. S. and Blau H. M. // mRNA translation is not a prerequisite for small interfering RNA-mediated mRNA cleavage Differentiation. 2005. V.73. P. 28793.

216. Hammond S. M., Bernstein E., Beach D. and Hannon G. J. //An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells Nature. 2000. V.404. P. 293-6.

217. Holmquist G. P. and Ashley T. // Chromosome organization and chromatin modification: influence on genome function and evolution Cytogenet Genome Res. 2006. V.114. P. 96-125.

218. Verdel A., Jia S., GerberS., SugiyamaT., Gygi S., Grewal S. I. and Moazed D. // RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex Science. 2004. V.303. P. 672-6.

219. Irvine D. V., Zaratiegui M., Tolia N. H., Goto D. B., Chitwood D. H., Vaughn M. W., Joshua-Tor L. and Martienssen R. A. // Argonaute slicing is required for heterochromatic silencing and spreading Science. 2006. V.313. P. 1134-7.

220. Volpe T. A., Kidner C., Hall I. M., Teng G., Grewal S. I. and Martienssen R. A. // Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi Science. 2002. V.297. P. 1833-7.

221. Volpe T., Schramke V., Hamilton G. L., White S. A., Teng G., Martienssen R. A. and Allshire R. C. // RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast Chromosome Res. 2003. V.11. P. 137-46.

222. Li L. C., Okino S. T., Zhao H., Pookot D., Place R. F., Urakami S., Enokida H. and Dahiya R. // Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V.103. P. 17337-42.

223. Noma K., Sugiyama T., Cam H., Verdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D. and Grewal S. I. // RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing Nat Genet. 2004. V.36. P. 1174-80.

224. Takaku H. // Gene silencing of HIV-1 by RNA interference Antivir Chem Chemother. 2004. V.15. P. 57-65.

225. Ma Y., Chan C. Y. and He M. L. // RNA interference and antiviral therapy World J Gastroenterol. 2007. V.13. P. 5169-79.

226. Zubler R. H. // Ex vivo expansion of haematopoietic stem cells and gene therapy development Swiss Med Wkly. 2007. V.137 Suppl 155. P. 31S-35S.

227. Wiznerowicz M. and Trono D. // Harnessing HIV for therapy, basic research and biotechnology Trends Biotechnol. 2005. V.23. P. 42-7.

228.

229.

230. Aquaro S., Perno C.-F., Balestra E., Balzarini J., Cenci A., Francesconi M., Panti S., Serra F., Villani N. and Calio R. // Inhibition of replication of HIV in primary monocyte/macrophages by different antiviral drugs and comparative efficacy in lymphocytes Journal of leukocyte biology. 1997. V.62. P. 138-143.

231. Nikolenko G. N.. Palmer S., Maldarelli F., Mellors J. W., Coffin J. M. and Pathak V. K. // Mechanism for nucleoside analog-mediated abrogation of HIV-1 replication: balance between RNase H activity and nucleotide excision Proc Natl Acad Sci USA.

2005. V.102. P. 2093-8.

232. Strang B. L., Ikeda Y., Cosset F. L., Collins M. K. and Takeuchi Y. // Characterization of HIV-1 vectors with gammaretrovirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells Gene Ther. 2004. V.11. P. 591-8.

233. Carmo M., Dias J. D., Panet A., Coroadinha A. S., Carrondo M. J., Alves P. M. and Cruz P. E. // Thermosensitivity of the reverse transcription process as an inactivation mechanism of lentiviral vectors Hum Gene Ther. 2009. V.20. P. 1168-76.

234. Spirin P. V., Vil'gelm A. E. and Prasolov V. S. // Lentiviral vectors Mol Biol (Mosk). 2008. V.42. P. 913-26.

235. Parikh U. M., Koontz D. L., Chu C. K., Schinazi R. F. and Mellors J. W. // In vitro activity of structurally diverse nucleoside analogs against human immunodeficiency virus type 1 with the K65R mutation in reverse transcriptase Antimicrob Agents Chemother. 2005. V.49. P. 1139-44.

236. Machado J., Salomon H., Oliveira M., Tsoukas C., Krayevsky A. A. and Wainberg M. A. // Antiviral activity and resistance profile of phosphazid~a novel prodrug of AZT Nucleosides Nucleotides. 1999. V.18. P. 901-6.

237. Aquaro S., Perno C. F., Balestra E., Balzarini J., Cenci A., Francesconi M., Panti S., Serra F., Villani N. and Calio R. // Inhibition of replication of HIV in primary monocyte/macrophages by different antiviral drugs and comparative efficacy in lymphocytes J Leukoc Biol. 1997. V.62. P. 138-43.

238. Cassol E., Alfano M., Biswas P. and Poli G. // Monocyte-derived macrophages and myeloid cell lines as targets of HIV-1 replication and persistence J Leukoc Biol.

2006. V.80. P. 1018-30.

239. Bagnacani V., Sansone F., Donofrio G., Baldini L., Casnati A. and Ungaro R. // Macrocyclic nonviral vectors: high cell transfection efficiency and low toxicity in a lower rim guanidinium calix[4]arene Org Lett. 2008. V.10. P. 3953-6.

240. Baldini L., Casnati A., Sansone F. and Ungaro R. // Calixarene-based multivalent ligands Chem Soc Rev. 2007. V.36. P. 254-66.

241. Sun X. and Zhang N. // Cationic polymer optimization for efficient gene delivery Mini Rev Med Chem. V.10. P. 108-25.

242. Stancanelli R., Guardo M., Cannava C., Guglielmo G., Ficarra P., Villari V., Micali N. and Mazzaglia A. // Amphiphilic cyclodextrins as nanocarriers of genistein: A spectroscopic investigation pointing out the structural properties of the host/drug complex system J Pharm Sci. 2010. V.99. P. 3141-9.

243. Won Y. W., Lim K. S. and Kim Y. H. // Intracellular organelle-targeted non-viral gene delivery systems J Control Release. 2011. V.152. P. 99-109.

244. Mintzer M. A. and Simanek E. E. // Nonviral vectors for gene delivery Chem Rev. 2009. V.109. P. 259-302.

245. Mel'nikov S. M., Sergeyev V. G. and Yoshikawa K. // Discrete coil-globule transition of large DNA induced by cationic surfactant J. Am. Chem. Soc. . 1995. V.117. P. 2401-2408.

246. Clamme J. P., Bernacchi S., Vuilleumier C., Duportail G. and Mely Y. // Gene transfer by cationic surfactants is essentially limited by the trapping of the surfactant/DNA complexes onto the cell membrane: a fluorescence investigation Biochim Biophys Acta. 2000. V.1467. P. 347-61.

247. Antara D., Das P., Dias R., Miguel M., Lindman В., Jadhav V., Gnanamani M. and Maiti S. // Effect of Headgroup on DNA-Cationic Surfactant Interactions J. Phys. Chem. B. 2007. V.111. P. 8502-8508.

248. Zakharova L., Voronin M., Semenov V., Gabdrakhmanov D., Syakaev V., Gogolev Y., Giniyatullin R., Lukashenko S., Reznik V., Latypov S., Konovalov A. and Zuev Y. // Supramolecular systems based on novel mono- and dicationic pyrimidinic amphiphiles and oligonucleotides: a self-organization and complexation study Chemphyschem. 2012. V.13. P. 788-96.

249. Rodik R. V., Klymchenko A. S., Jain N., Miroshnichenko S. I., Richert L., Kalchenko V. I. and Mely Y. // Virus-sized DNA nanoparticles for gene delivery based on micelles of cationic calixarenes Chemistry. 2011. V.17. P. 5526-38.

250. Чуриков H., Гашникова H., Кретова О. and Покровский A. // Сайленсинг генов ВИЧ-1 с помощью генетических конструкций, экспрессирующих siPHK Молекулярная биология. 2006. V.40. Р. 784-787.

251. Churikov N., Gashnikova N., Kretova O. and Pokrovskiï A. // Gene silencing of HIV-1 using genetic constructs expressing siRNAS J Mol Biol (Mosk). 2006. V.40. P. 784-7.

252. Zeichner S. L., Kim J. Y. and Alwine J. C. // Linker-scanning mutational analysis of thé transcriptional activity of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat J Virol. 1991. V.65. P. 2436-44.

253. ter Brake O., Konstantinova P., Ceylan M. and Berkhout B. // Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach Mol Ther. 2006. V.14. P. 883-92.

254. von Eije K. J., ter Brake O. and Berkhout B. // Stringent testing identifies highly potent and escape-proof anti-HIV short hairpin RNAs J Gene Med. 2009. V.11. P. 45967.

255. Gao Y., Lobritz M. A., Roth J., Abreha M., Nelson K. N., Nankya I., Moore-Dudley D. M., Abraha A., Gerson S. L. and Arts E. J. // Targets of small interfering RNA restriction during human immunodeficiency virus type 1 replication J Virol. 2008. V.82. P. 2938-51.

256. Westerhout E. M., ter Brake O. and Berkhout B. // The virion-associated incoming HIV-1 RNA genome is not targeted by RNA interference Retrovirology. 2006. V.3. P. 57.

257. Gao W. Y., Shirasaka T., Johns D. G., Broder S. and Mitsuya H. // Differential phosphorylation of azidothymidine, dideoxycytidine, and dideoxyinosine in resting and activated peripheral blood mononuclear cells J Clin Invest. 1993. V.91. P. 2326-33.

258. Lundberg C., Bjorklund T., Carlsson T., Jakobsson J., Hantraye P., Deglon N. and Kirik D. // Applications of lentiviral vectors for biology and gene therapy of neurological disorders Curr Gene Ther. 2008. V.8. P. 461-73.

259. Singh S. K. and Gaur R. K. // Progress towards therapeutic application of RNA interference for HIV infection BioDrugs. 2009. V.23. P. 269-76.

260. Barichievy S., Saayman S., Arbuthnot P. and Weinberg M. S. // RNA interference-based gene expression strategies aimed at sustained therapeutic inhibition of HIV Curr Top Med Chem. 2009. V.9. P. 1065-78.

261. Vrancken B., Lequime S., Theys K. and Lemey P. // Covering all bases in HIV research: unveiling a hidden world of viral evolution AIDS Rev. 2010. V.12. P. 89-102.

262. Hong-Geller E. and Micheva-Viteva S. N. // Functional gene discovery using RNA interference-based genomic screens to combat pathogen infection Curr Drug Discov Technol. 2010. V.7. P. 86-94.

263. Prokofjeva M. M., Spirin P. V., Yanvarev D. V., Ivanov A. V., Novikov M. S., Stepanov O. A., Gottikh M. B., Kochetkov S. N., Fehse B., Stocking C. and Prassolov V.

S. // Screening of Potential HIV-1 Inhibitors/Replication Blockers Using Secure Lentiviral in Vitro System Acta Naturae. 2011. V.3. P. 55-65.

264. Prokofjeva M. M., Valuev-Elliston V. T., Ivanov A. V., Kochetkov S. N., Novikov M. S. and Prassolov V. S. // Benzophenone derivatives of pyrimidines as effective non-nucleoside inhibitors of wild-type and drug-resistant HIV-1 reverse transcriptase Dokl Biochem Biophys. 2012. V.447. P. 280-1.

265. Prokofjeva M. M., Riecken K., Spirin P. V., Yanvarev D. V., Dusedau A., Ellinger B., Fehse B., Stocking C. and Prassolov V. S. // A new system for parallel drug screening against multiple-resistant HIV mutants based on lentiviral self-inactivating (SIN) vectors and multi-colour analyses AIDS Res Ther. 2013. V.10. P. 1.