Использование клеточных культур при изучении действия Т-2 токсина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.04, кандидат биологических наук Тертичная, Мария Вадимовна

• Тертичная, Мария Вадимовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тертичная, Мария Вадимовна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы 10 1.1. Общая характеристика микотоксинов 10 1.1.1 Механизм действия микотоксинов на животный организм 1.1.2 Т-2 токсин и его метаболиты

1.2 Использование клеточных культур в токсикологии

1.2.1 Культуры клеток как альтернативные модели в токсикологических исследованиях

1.2.2 Методы оценки цитотоксичности 22 1.3. Исследования токсичности микотоксинов на культурах клеток

2. Собственные исследования

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Материалы исследований

2.1.2 Методы исследований

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Исследование цитотоксичности Т-2 токсина in vitro

2.2.2 Изучение видовых особенностей токсичности Т-2 токсина in vivo и in vitro

2.2.3 Исследование цитотоксичности НТ-2 токсина in vitro

2.2.4 Исследование динамики пролиферативной активности в культуре клеток при внесении Т-2 токсина

2.2.5 Цитотоксичность Т-2 токсина in vitro на фоне воздействия различных фармакологических средств

2.2.6 Определение перекисного окисления липидов

2.2.7 Изучение эффективности натрия селенита в качестве потенциального антидота Т-2 токсина

2.2.8 Изучение профилактической эффективности ксимедона в экспериментальном Т-2 токсикозе

2.2.9 Токсичность Т-2 токсина при постановке кожной пробы на кроликах

3. Обсуждение результатов собственных исследований

3.1 Цитотоксичность Т-2 и НТ-2 токсинов и роль при этом перекисного окисления липидов в механизме гибели клеток

3.2 Возможность использования культур клеток в качестве биопробы при Т-2 токсикозе

3.3 Возможность применения культур клеток для предварительного скрининга потенциальных антидотов при

Т-2 токсикозе

Выводы

Практические предложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование клеточных культур при изучении действия Т-2 токсина»

Актуальность темы. Вопросы этического, разумного и экономного использования животных в современных биологических исследованиях привлекают все большее внимание специалистов и общественности. На сегодня они вполне решаемы, поскольку существуют достаточные возможности не только для сведения количества подопытных животных к минимуму, но и к полной или частичной их замене (Червонская Г.П. и др., 1998; Дядищев Н.Р. и др., 1998; Еропкин М.Ю., 1999; Botham P., Lewis R., 1996; Hurna Е., 1997; Combes R., Balls M., 2001 и др.).

На практике подобное можно осуществить благодаря широкому внедрению в эксперимент альтернативных биологических моделей, в том числе культуральных. Последние высокочувствительны к воздействию малых количеств испытуемых веществ, эффект которых на организменном уровне может проявиться лишь при больших дозировках и спустя значительное время (Червонская Г.П. и др., 1998; Афиногенова А.Г. и др., 1999; Еськов А.П. и др., 2003; Flint О., 1996; Louekari К., 1996 и др.).

Культуры клеток занимают все более заметное и важное место в токсикологических, фармакологических и других исследованиях. При этом сфера применения расширяется, а техника культивирования in vitro совершенствуется и автоматизируется. Использование культуральных тестов является свидетельством высокого уровня эксперимента в любой сфере как фундаментальных, так и прикладных народно-хозяйственных отраслях (Червонская Г.П. и др., 1998).

Между тем, дороговизна общепринятых химических методов анализа микотоксинов и изучения их токсических свойств на животных вынуждает к поиску и разработке новых более чувствительных и быстрых тестов. Биологические методы в этом плане перспективны и, несмотря на неспецифичность при идентификации микотоксинов, позволяют выявлять их присутствие в исследуемом субстрате (Watson D., Lindsay D., 1982; Buckle A., Sanders M., 1990; Babich H., Borenfreund E., 1991 и др.).

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение возможности использования клеточных культур (КК) как альтернативы традиционной методике кожной пробы при экспериментальном Т-2 токсикозе и для предварительного скрининга антидотов. В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. Сравнить различные методы оценки цитотоксичности in vitro;

2. Определить токсические дозы Т-2 и НТ-2 токсинов на перевиваемых культурах клеток почек различных видов животных: крупного рогатого скота (MDBK), свиньи (СПЭВ), овцы (ППЭО) и собаки (MDCK);

3. Изучить коррелятивные отношения токсических доз исследуемых микотоксинов in vivo и in vitro;

4. Провести сравнительную оценку определения токсического действия Т-2 токсина биологической пробой на кроликах и культуральным методом;

5. Охарактеризовать in vivo и in vitro эффективность препаратов с потенциально антидотными свойствами при Т-2 токсикозе.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование цитотоксичности Т-2 токсина и его метаболита - НТ-2 токсина in vitro на перевиваемых культурах клеток различных видов животных. Определены цитотоксические дозы Т-2 и НТ-2 токсинов для клеточных линий MDBK, СПЭВ, ППЭО и MDCK. Показана дозозависимость цитотоксического эффекта данных микотоксинов, выражаемого изменением ростовых и пролиферативных характеристик клеточных культур, снижением жизнеспособности клеток in vitro. Изучены коррелятивные отношения между тестами in vivo и in vitro. Оценена возможность применения клеточных линий в качестве биологической пробы, а также для скрининга потенциальных антидотов при экспериментальном Т-2 токсикозе. Установлено значительное увеличение Т-2 токсином в дозе IC50 содержания малонового диальдегида (МДА) в культуре клеток MDBK, свидетельствующее о роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в механизме гибели клеток in vitro при данном воздействии.

Практическая ценность работы. Результаты проведенных экспериментов расширяют сферу использования культур клеток в токсикологии. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения их в качестве биологического теста при выявлении микотоксинов. Клеточная модель - линия MDBK - проявила высокую чувствительность к исследованным лекарственным средствам (натрия селениту и ксимедону) при одновременном внесении с Т-2 токсином и может быть использована в дальнейшем поиске потенциальных антидотов.

Результаты исследования использованы при разработке «Методики по определению цитотоксичности медицинских металлических изделий», утвержденную директором ФГНУ ВНИВИ и генеральным директором ГУП ВНИПИМИ, 21.03.2002; «Методических указаний по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов», утвержденных директором ФГНУ ВНИВИ, 19.11.2003; «Методических рекомендаций по диагностике отравлений животных микотоксинами», утвержденных директором ФГНУ ВНИВИ, 20.12.2004.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 70-летию Казанского медико-инструментального завода (Казань, 2001); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы агропромышленного комплекса» (Казань, 2004), Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат» «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» (Щелково, 2004),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту: метод расчета цитотоксичности in vitro; использование клеточных культур для оценки токсического действия Т-2 и НТ-2 токсинов; возможность использования КК для предварительного скрининга препаратов с потенциально антидотными свойствами при Т-2 токсикозе.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 стр, содержит 23 таблицы, проиллюстрирована 5 рисунками, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения. Список литературы включает 180 библиографических источников, в т.ч. 119 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная фармакология с токсикологией», Тертичная, Мария Вадимовна

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод расчета цитотоксичности через отношение живых клеток, оставшихся после экспозиции с препаратом к числу живых клеток в контроле.

2. Установлена меньшая токсичность НТ-2 токсина, по сравнению с Т-2 токсином для перевиваемых культур клеток MDBK, MDCK, СПЭВ и ППЭО, а именно 1С5о для Т-2 токсина составляла в среднем 10"9 М, тогда как для НТ-2 - 10"6 М.

3. Выявлена слабая видовая зависимость токсичности Т-2 и НТ-2 токсинов in vitro и in vivo. Корреляция показателей LDioo, LD50, ПДК в кормах для различных видов животных и 1Сюо> IC50, МПД для культур клеток этих же видов существенно не различалась. Коэффициент корреляции для крупного рогатого скота, свиней и овец составил 0,63 (р<0,01), а для овец - 0,59 (р<0,01).

4. Показано увеличение содержания МДА в культуре клеток MDBK Т-2 токсином, что свидетельствует о значительной роли индукции ПОЛ в механизме гибели клеток in vitro при воздействии данного токсина.

5. Биоиндикация Т-2 токсина с использованием клеточных культур обладает рядом преимуществ перед кожной пробой на кроликах: минимальная цитотоксическая концентрация токсина для культуры клеток на порядок ниже; в 2-3 раза сокращаются сроки исследования; перевиваемые культуры клеток относительно дешевы, доступны и т.д.

6. Выявлено снижение токсического действия Т-2 токсина ксимедоном и натрия селенитом на животных (белые крысы) и клеточной модели (MDBK). Данные препараты в дозах эквивалентных терапевтическим, повышали выживаемость клеток in vitro при воздействии Т-2 токсина на 15 и 20%, а также снижали содержание

МДА на 33 и 57%, соответственно. В экспериментах in vivo выживаемость увеличивалась, соответственно, на 30 и 20%.

Экспериментально показана возможность использования клеточных культур для первичного скрининга препаратов с потенциальным лечебно-профилактическим действием при Т-2 токсикозе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Показана принципиальная возможность скрининга препаратов -потенциальных антидотов Т-2 токсина с помощью клеточных культур, а также использование их для диагностики микотоксикозов.

Результаты исследований вошли в следующие разработанные и утвержденные нормативные документы:

1. Методика по определению цитотоксичности медицинских металлических изделий, утвержденная' директором ФГНУ ВНИВИ и генеральным директором ГУП ВНИПИМИ, 21.03.2002.

2. «Методические указания по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов», утвержденные директором ФГНУ ВНИВИ 19.11.2003 г.;

3. Методические рекомендации по диагностике отравлений животных микотоксинами, утвержденные директором ФГНУ ВНИВИ, .

20.12.2004.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тертичная, Мария Вадимовна, 2005 год

1. Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Дерябина В.И. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические: Справочник. / Под ред. Антонова Б.И. М.: Агропромиздат, 1991. -287 с.

2. Ашельрод А.А., Шибаева З.В. Реакция иммуноприлипания стафилококков и ее использование в токсикологическом эксперименте. // Гигиена труда и проф. заболевания, 1984. №12. - С. 47 - 48.

3. Барабой В.И., Брехман И.И., Глотин В.Г. Кудряшов Ю.Б. Перекисное Ф окисление и стресс. СПб., 1992. 160 с.

4. Бенюмович М.С. Действие афлатоксинов на животные клетки в культуре тканей. // Фармакология и токсикология, 1973. №4. - С. 497 -501.

5. Березовская И.В., Иванова В.М., Спасский Ю.А. Альтернативные методы в лекарственной токсикологии в настоящем и будущем. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998. —С.269.

6. Бойко О.В., Салько В.Н., Бойко А.В. и др. Влияние токсических веществ на условно-патогенные микроорганизмы. // Гигиена и санитария, 2002. № 1. - С. 54 - 56.

7. Бойко Т.В. Использование культуры тканей в токсикологической оценке гербицида Хармони. // Ветеринария, 1999. №7. - С. 48 - 49.

8. Валеева И.Х. Фармакологическая коррекция нарушений перекисного окисления липидов, вызываемых ксенобиотиками. Автореф. дис. . докт. биол. наук. Казань, 2004. 36 с.

9. Василос А.Ф., Шройт И.Г., Дмитриенко В.Д., Тодорова Е.А. Действие пестицидов на эксплактированные клетки. // Гигиена труда и профессиональные заболевания, 1982. №6. - С.21-24.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972. — С.127 138.

11. Гончаренко М.С, Латинова A.M. Метод оценки перекисного окисления липидов. // Лабораторное дело, 1985. №1. - С. 60.

12. ГОСТ Р ИСО 10993.5 99. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. М., ИПК Издательство стандартов, 2000.

13. Дядищев Н.Р., Рыбалкин С.П., Марченко А.И. Биологические модели in vitro в токсикологии. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998.-С.276.

14. Еропкин М.Ю. Модели, альтернативные использованию лабораторных животных в токсикологии. Достижения и проблемы. // Токсикологический вестник, 1999. №5 - С.7-13.

15. Еропкин М.Ю., Афиногенов Г.Е., Еропкина Е.М. Некоторые биохимические показатели цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре под действием природных и синтетических поликатионов. // Вопр. мед. химии, 1995. — т. 41, №2. С. 36 - 39.

16. Еськов А.П., Каюмов Р.И. Соколов А.Е. Токсикологические испытания. Альтернативные методы. // Токсикологический вестник, 2003. -№5. -С. 25-29.

17. Завьялов Н.В., Червонская Г.П., Панкратова Г.П. и др. Ускоренное изучение цитотоксического действия в экспресс-тестах in vitro. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998. 0,2.19.

18. Информационный бюллетень ассоциации клеточных культур, С-Пб.,1997. -№12

19. Каган В.Е., Савов В.М., Диденко В.В. и др. Кальций и перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий и микросом сердца. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины, 1983. №4. - С. 46 - 48.

20. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии (обзор). // Вопр. мед. химии, 1985. т.35., №5. - С. 2 - 7.

21. Козлов А. В. Изучение механизмов активации перекисного окисления липидов при патологических процессах. Роль эндогенного железа: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1985.

22. Колесникова Г.Г., Слободенюк А.В., Глинских Н.П. Клеточные культуры как тест-система оценки качества новых фитопрепаратов. // Цитология, 1994. т. 36, №6. - С. 555.

23. Котелевцев С.В., Стволинский C.JL, Бейм A.M. Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран. М., 1986.

24. Котик А.Н., Труфанова В.А. Микотоксины (продуценты, химия, биосинтез, определение, действие на организм). Оренбург: Оренбургский медицинский институт, 1977. С. 89 - 90.

25. Кравченко JI.B., Авреньева Л.И. Ферментная характеристика алиментарного токсикоза, вызванного зерном, зараженным Fusarium sporotrichiella. // Вопросы питания, 1984. №1. - С. 61 - 64.

26. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Действие Т-2 токсина на активность органеллоспецифических ферментов различных органов крыс. // Вопр. мед. химии, 1983 а. №4. - С. 113 - 117.

27. Кравченко JI.B., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Уменьшение содержания SH-глутатиона и активности глутатионтрансферазы в печени как фактор, усиливающий токсичность Т-2 токсина. // Вопр. мед. химии, 1983 б. №5. - С. 135 - 137.

28. Кравченко Л.В., Кузьмина Э.И., Авреньева Л.И. и др. Защитное действие селена при остром Т-2 токсикозе. // Вопр. мед. химии, 1990. -т. 36, №5. -С. 36-38.

29. Красовский Г.Н., Егорова Н.А., Антонова М.Г. Обоснования использования альтернативных биологических моделей в гигиенической токсикологии. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998.-С.8.

30. Кузнецов А.Ф. Ветеринарная микология. СПб.: Лань, 2001.-416 с.

31. Куликова К.С. // Тезисы докладов 2 научной конференции МНИИВП, М., 1960.-С.57.

32. Лаппо В.Г., Тимохина В.И., Яценко В.П. и др. Некоторые результаты и перспективы использования метода тканевых культур в токсикологии медицинских полимеров. // Гигиена и санитария, 1981. №6. - С. 54 -56.

33. Леванова Г.Ф., Кашников Е.Ю. Оценка качества воды с помощью биотестирования индикаторными штаммами бактерий. // Гигиена и санитария, 2002. №4. - С. 68-70.

34. Лукьянов А.С., Лукьянова Л.Л., Чернавская Н.М., Гилязов С.Ф. Биоэтика. Альтернативы экспериментам на животных. М.: Изд-во МГУ, 1996.-253 с.

35. Любимов Ю.А., Саватеев А.В., Комяк К.И. Автоматизированный цитотоксический тест для изучения материалов медицинского назначения. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998. С.294.

36. Малышева М.В., Рязанова Р.А. Клеточные культуры — модельная тест-система в токсикологических исследованиях. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998. С.297.

37. Меркулов А.И. Модифицированный метод определения активности изоферментов лактатдегидрогеназы в сыворотке крови. // Лабораторное дело, 1984. №12. - С. 766 -767.

38. Митрохин Н.М., Жигачева И.В., Чаморовская Л.Т. Активация перекисного окисления липидов в митохондриях печени и острая токсичность химических соединений. // Гигиена и санитария, 1991. -№1.-С. 49-51.

39. Ников П.С., Парзян М.С. Некоторые аспекты влияния факторов питания на метаболизм и механизмы биологического действия афлатоксина Bj в печени крыс. // Вопр. мед. химии, 1985. т. 31, № 4. -С.94-99.

40. Петрович С.В. Микотоксикозы животных. М.: Росагропромиздат, . 1991. С.105-117.

41. Покровский А.А., Безпрозванный Б.К. Афлатоксикозы. // Советская медицина, 1972. №2. - С. 79 - 88.

42. Покровский А.А., Мешков Н.В., Кравченко Л.В. Ранние изменения печени при воздействии афлатоксина. // Архив патологии, 1973. — т. 35, вып. 8.-С. 57-60.

43. Пол Д. Культура клеток и ткани. М.: Медгиз, 1963. - 347 с.

44. Пшеничнов А.В., Конюхов В.А., Лымарь В.Т. Ингибирующее влияние противовирусных химиопрепаратов на суспензионную культуру клеток. // Вопросы вирусологии, 1989. т. 34, №3. - С. 330 -333

45. Саркисов А.Х. Микотоксикозы. М.: Сельхозиздат, 1954. 216 с.

46. Сидорин Г.И., Фролова А.Д., Луковникова Л.В. Об «альтернативных» методах исследования в токсикологии. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998.-С.317.

47. Спиридонов Н.А., Архипов В.В. Цитотоксическое и цитостатическое действие лекарственных растений и растительных препаратов на культуру лимфобластоидных клеток. // Цитология, 1994. т. 36, №6. -С.536 - 537.

48. Тремасов М.Я., Беляева Л.Л., Птицина О.В. Влияние микотоксинов на иммунитет.// Матер, научно произв. конф. по актуальным проблемам ветеринарии и животноводства. Казань, 1996.- С. 145.

49. Тутельян В.А., Кравченко JI.B. Микотоксикозы (медицинские и биологические аспекты). / АМН СССР, М.: Медицина, 1985. 320 с.

50. Хмелевский В.Н., Пилипец З.И., Малиновская JI.C. и др. Профилактика микотоксикозов животных. М.: Агропромиздат, 1985. С.114-135.

51. Хрипач JI.B. Определение свободнорадикальных методов для оценки влияния полихлорированных диоксинов и фуранов на состояние здоровья населения. // Гигиена и санитария, 2002. №2. - С. 72 - 76.

52. Червонская Г.П. Культура клеток биологическая модель в токсикологических исследованиях. // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. М., 1998. - С.328.

53. Червонская Г.П., Кравченко JI.T., Рунова В.Ф. и др. Цитотоксическое действие химических веществ, содержащихся в виде примесей в некоторых медицинских иммунобиологических препаратах // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1988. №12. - С. 85 - 90.

54. Червонская Г.П., Миронова JLJI. Этика медицинского эксперимента в доклинических исследованиях. // Тезисы докладов 4 Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». М., 1997. - С. 139.

55. Шабад Л.М., Колесниченко Т.С., Никонова Т.В. Исследование действия афлатоксина Bi in vitro и in vivo. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины, 1976.-№11.-С. 1349-1352.

56. Ames В., McCann J., Jamasaki Е. // Mutat. Res., 1975. V. 31, №3. - P. 347-364.

57. Annett В. The fund for the replasement of animals in medical experiments (FRAME) : the first 25 years. // ATLA, 1995. V.23. - P. 19-32.

58. Babich H., Borenfreund E. Cytotoxicity of T-2 toxin and its metabolites determined with the neutral red cell viability assay. // Appl. and Environ. Microbiol., 1991. 57, №1. - P. 2101 - 2103.

59. Balls M. Why modification of the LD50 test will not elong? // Lab. Anim., 1991.-V. 25,№3.-P. 11-23.

60. Balls M., Clothier R. Comments on the scientific validation and regulatory acceptance о in vitro toxicity test. // Toxicol, in vitro., 1991. V. 5, №5-6. -P. 535-538.

61. Bassi A., Piana S., Penco S. et al. Use of an established cell line in the evaluation of the cytotoxic effect of various chemicals. // Boll. Soc. ital. biol. sper., 1991. V. 67, №8. - P. 809 - 816.

62. Berlament V., Paillard F., Prenner A. Can in vitro models predict acute and subchronic toxicity in early phase compounds development. // ATLA, 1999. -V. 27, Spec. iss. — P.415.

63. Bertolotti L., Ferrari L., Barnaby R., Pellegatti M. Application of the MDCK cell line as an in vitro model for intestinal absorption. // ATLA, 1999. -V. 27, Spec. Iss. P. 307.

64. Blaauboer B. Recent development in in vitro toxicology. // Hum. and Exp. Toxicol., 1996.-V. 15,'№11. P. 928.

65. Blein O., Adolf M., Lakhdar B. et al. Correlation and validation of alternative methods to the draise eye irritation test (OPA1 project). // Toxicol, in vitro, 1991. V. 5, №5-6. - P. 555 - 557.

66. Bonsi P., Palmery M., Augusti-Tocco G. Aflatoxin Bi cytotoxicity in neurons in culture. // ATLA, 1996. V. 24, №4. - P. 533 - 540.

67. Botham P., Lewis R. Development of in vitro techniques for irritancy testing. // Hum. and Exp. Toxicol., 1996. V.15, №2. - P. 141.

68. Brogaard В., Clausen J. An in vitro system for evaluation of oxidative stress and the effects of antioxidants. // ATLA, 1996. V.24., Suppl. 1. - P. 251 -311.

69. Buckle A., Sanders M. An appraisal of bioassay methods for the detection of mycotoxins a review. // Lett. Appl. Microbiol., 1990. - V.10, №4. - P. 155-160.

70. Cairns J., Pratt J., Niederlehner В., McCormick P. A simple? Cost-effective multispecies toxicity test using organisms with a cosmopolitan distribution. // Environ. Monit. and Assesment, 1986. V. 6, №3. - P. 207 - 220.

71. Cannon M., Jimenez A., Vazques D. // Biochem. J., 1976. V. 160. - P. 137.

72. Charlton J., Simmons N. A human renal cultured cell line whuch may be useful for predictive toxicology. // Clin. Sci., 1992. V. 82, №3. - P. 14.

73. Chen Yang S., Yin — Chin H., Choon - Nam O. Inhibition of aflatoxin Bj-induced cell injury by selenium: An in vitro study. // Hum. and Exp. Toxicol., 1995.-V. 14, №1.-P. 55-60.

74. Chen Y. Effect of thyrotoxine on the immune response of mice in vivo and in vitro. // Immunol. Commun, 1980. V. 9. - p. 260-276.

75. Chunh C. et al. Rabbit skin test for estimation of T-2 toxin and other skin irritating toxins in contaminated corn. // J. Assoc. of Anal. Chem., 1974. -V. 57, №5.-P. 1121-1127.

76. Cigliano S., Remondelli P., Minichiello L. et al. Analysis of metal-regulated metallothionein and hat shock gene expression in Hela derived cadmium-resistant cells. // Exp. Cell. Res., 1996. - V. 228, №2. - P. 173 - 178.

77. Clothier R., Orme A., Walker T. et al. A comparison of three cytotoxicity endpoints in the corneal HCE-T model. // ATLA, 2000. V. 28, №2. - P. 293-302.

78. Clothier R., Sansom R. Effects of surfactant retreatment in vitro: A method to evaluate changes in cell functions and in cell viability. // ATLA, 1996. -V. 24, №5.-P. 859-865.

79. Combes R. FRAME and the pharmaceutical industry. // ATLA, 1997. V. 25, №1. —P. 61 -66.

80. Combes R., Balls M. Ethical investment what is it, and what are the implications for industry funding of research into alternatives? // ATLA, 2001.-V. 29, №1.-P. 55-62.

81. Cronin M., Clothier R., Dearden S. et al. Correlation of mammalian toxicity with in vitro toxicity. // J. Pharm. and Pharmacol., 1994. V. 46, Suppl. №2. -P. 1079.

82. Daston G. The theoretical and empirical case for in vitro developmental toxicity screens, and potential application. // Teratology, 1996. V. 53, №6. -P.'339-344.

83. De Nicola D., Rebor A., Carlton W. T-2 toxin mycotoxicosis in the guinea pig. // Food Cosmet. Toxicol., 1978.- P. 601-609.

84. Descampiaux В., Cotelle N., Caeteau J. et al. Cytotoxicity of lindane and paraquat to human hepatoma cell lines. // Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 1999. V. 62, №1. - P. 16 - 24.

85. Dimitrijevic D., Lamandin C., Uchegbu I. et al. The effect of monomers and mecellar and vesicular forms of non-ionic surfactants (Solutan C24 and Solutan 16) on CaCo-2 cell monolayers. // J. Pharm. and Pharmacol., 1997. -V. 49, №6.-P. 611-616.

86. Dininno V., Penman D., Bhatti A. et al. In vitro toxicity of T-2 mycotoxin in mouse lymphoid cells. // J. Gen. Microbiol., 1985. V. 131, №7. - P. 1833 - 1835.

87. Fautrel A., Chesne C., Guillouzo A. et al. A multicentre study of acute in vitro cytotoxicity in rat liver cells. // Toxicol, in vitro., 1991. V. 5, №5-6. -P. 543 - 547.

88. Ferraris M., Marafante E., Dosanih M. In vitro studies on the metabolism and toxicity of aflatoxin Bi in primary cultures of black catfish (Ictalurus melas). // ATLA, 1998. V. 26, №2. - P. 225 - 239.

89. Ferro M., Bassi A., Adamo D et al. Studies on a-hexachlorocyclohexane cytotoxocoty, genotoxicity and cytochrome P450 induction in primary hepatocytes and hepatoma cell lines from rodents and humans. // ATLA, 1997.-V. 25,№2.-P. 139- 152.

90. Flint O. Toxicity at the cellular level. //ATLA., 1996. V. 24, Spes.iss. - P. 103.

91. Gagne F., Blaise C. Differencec in the measurement of cytotoxicity of complex mixtures with rainbow trout hepatocytes and fibroblasts. // Chemosphere, 1998. V. 37, №4. - P. 753 - 769.

92. George E., Murdock J., Westmoreland C. Toxicity of 5 standart hepatotoxin in rat and dog hepatocyte cultures. // Hum. and Exp. Toxicol., 1994. V. 13, №9.-P. 641.

93. Greenman S., Rutten M., Fowler W. et al. Herbicide / pesticide effects on intestinal epithelial growth. // Environ. Res., 1997. V. 75, №1. - P. 85 -93.

94. Grillo С., Seoane A., Dulout F. Protective affect of butylated hydroxytoluene (BHT) against the clastogenic activity of cadmium chloride and potassium dichromate in Chinese hamster ovary cells. // Genet, and Mol. Biol., 1999. V. 22, №1. - P. 59 - 64.

95. Grosse Y., Baudrimont I., Castegnaro M. et al. Formation of ochratoxin A metabolites and DNA-adducts in monkey kidney cells. // Chem.-Biol. Interact., 1995. V.95, №1-2. - P. 175- 187.

96. Guyomard C., Frifayre P., Hooyenboom L., Polman T. Aflatoxin B. effects on trout hepatocytes comparison with rat hepatocytes, result from an EU-project. //Rev. med. vet., 1998. № 6. - P.644.

97. Hayes M., Schiefer H. // J. Appl. Toxicol., 1982. V. 2. - P. 44

98. Heil J., Reifferscheid G., Waldmann P. et al. Genotoxicity of dental materials. // Mutat. Res. Genet. Toxicol., 1996. V. 368, №3 - 4. - P. 181 -194.

99. Holt P., Buckley S., Norman J., Deloach J. Cytotoxic effect of T-2 mycotoxin on cells in culture as determined by a rapid colorimetric bioassay. // Toxicon, 1988. V.26, №6. - P. 549 - 558.

100. Hughes J., Lindsay C., Griffits G. Morphology of ricin and abrin exposed endothelial cells in consistent with apoptotic cell death. // Hum. and Exp. Toxicol, 1996.-V. 15, №5. P. 443-451.

101. Hurna E. In vitro metody a ich vyuzitie v toxikologii. // Vet.med., 1997. V. 42, №7. - P. 213 - 215.

102. In vitro toxicology industrial platform (IVTIP) position paper, 9 February 2001: The role of an industrial platform in the area of in vitro testing. // ATLA, 2001. V. 29, №4. - P. 487 - 492.

103. Juranic Z., Stojiljkovic M., Bocarov-Stancic A. et al. T-2 toxin affects proliferation of three different neoplastic cell lines. // J. Exp. and Clin. Cancer Res., 1998.-V. 17, №1.-P. 33-40.

104. Khachatourians G. Metabolic effects of trichothecene T-2 toxin // Can. J. Physiol, and Pharmacol., 1990. V.68, N 7. - P. 1004 - 1008.

105. Khan Q., Agarwal R., Seidel A. et al. DNA adduct levels associated with p53 induction and delay of MCF-7 cells in S phase after exposure tobenzoG.chrysene dihydrodiol epoxide enantiomers. // Mol. Carcinogenes, 1998.-V. 23,№2.-P. 115-120.

106. Klein P., Buckner R., Kelly J., Coulombe R. Biochemical basis for the extreme sensivity of turkeys to aflatoxcin Bj. // Toxicol, and Appl. Pharmacol., 2000. №1. - P. 45-52.

107. Kuchowicz E., Rydzynski K. Can cytotoxic effects induced by industrial chemicals be time-dependent? // ATLA, 1999. V. 27. №3. - P. 367-377.

108. Lafarge -Frayssinet C., Decloitre F., Mousset S. et al. // Mut. Res., 1981.-V. 88.-P. 115-123.

109. Laufraite S., Parent-Massin D., Rio В., Hoellinger H. Comparison of toxicity induced by T-2 toxin on human and rat granulo-monoctic progenitors with an in vitro model. // Hum. and Exp. Toxicol., 1995. V. 14,№8.-P. 672-678.

110. Lawrence J., Dally J., Starkey S., Benford D. An evaluation of the skin irritation potential of four naturally occurring chemicals utilizing rat keratinocyte cultures. // Hum. and Exp. Toxicol., 1996. V. 15, №2. — P.159.

111. Leighton J., Nassaueur J., Tchao R. The chick embrio in toxicology: an alternative to the rabbit eye. // Food and Chem. Toxicol., 1985. V. 23, №2. -P. 293 -298.

112. Lopez de Cerain A., Gonzales C., Bello J. Intralaboratory variability in the assessment of the cytotoxic ranking of different surfactants. // J. Vet. Pharmacol, and Ther., 1997. V. 20, Suppl. №1. - P.288.

113. Louekari K. In vitro toxicology and the test guidelines. // ATLA., 1996. V. 24, №3. - P. 435 - 438.

114. Lutsky I., MorN. //Lab. Anim. Sci., 1981. V. 31. - P. 361 - 367.

115. Madin S., Darby N. // Proc. Soc. ExP. Boil. Med., 1958. V.98. - P. 574

116. Malich G., Markovich В., Winder C. Human cell line toxicity of binary and ternary chemical mixtures in comparison to individual toxic effects of their components. // Arch. Environ. Contam. and Toxicol., 1998. V. 35, №9.-P. 588-596.

117. Mann D., Buenind G. Effect of T-2 toxin on the bovine immune system humoral factors. // Infection and immunity., 1982. V. 36.

118. Matsumoto H., Ito Т., Ueno Y. // Japan. J. Exp. Med., 1978. V. 48. - P. 393-399.

119. Mayek J., Talapkova D., Repka V. et al. The possibility of the evaluation of toxic and mutagenic effects of combustion products with the aid Drosophilae melanogaster flies. // Fire and Mater., 1985. V. 9, №4. - P. 157-158.

120. Mazumder P., Reddy B. Alternative methodologies to animal testing. // Everyman's Sci., 2000. V.34, №1. - P. 30 - 32.

121. Mcintosh J., Heffron J. In vitro toxicological assessment of mixtures of organic solvents of industrial importance. // Biochem. Soc. Trans., 1998. -V.26,№L-P. 859.

122. Mead C., Pentreath V. Comparison of rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells for in vitro indicators of gliotoxicity. // Hum. and Exp. Toxicol, 1996. V. 15, №8. - P. 663.

123. Middlebrook J., Leatherman D. Differential association of T-2 and T-2 tetraol with mammalian cells. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1989 (a). -V.250, №3. P. 810-816.

124. Middlebrook J., Leatherman D. Specific association of T-2 toxin with mammalian cells. // Biochem. Pharmacol., 1989 (6). V. '38, №18. - P. 3093-3102.

125. Mirocha C. In: Conference on mycotoxins in animal feeds and grains related to animal health. FDA / BVM, 1979. P. 289 - 373.

126. Miyagawa C., Wu C., Kennedy D. et al. Protective effect of green tea extract and tea polyphenols against the cytotoxicity of 1,4-naphthoquinone in isolated rat hepatocytes. // Biosci., Biotechnol. and Biochem., 1997. V. 61, №11.-P. 1901 - 1905.

127. Neldon-Ortiz D., Qureshi M. Direct and microsomal activated aflatoxin Bj exposure and its effect on turkey peritoneal macrophage function in vitro. // Toxicol, and Appl. Pharmacol., 1991. V. 109, №3. - P. 432-442.

128. Ohno T. Validation study on five different cytotoxicity assays in Japan. // ATLA, 1996. V. 24, Spec. iss. - P. 142.

129. Orlans F. the three R in research and education: A long road ahead in the Unated State. //ATLA, 1996. -V. 24, №2. P. 151-158.

130. Oswald I.P. Immunotoxicity of mycotoxins. // Rev. med. vet., 1998. -V.149, № 6. -P. 585.

131. Pang V. et al. The toxicity of T-2 toxin in swine following topical application.//Fund and Appl. Toxicol., 1987.-V. 91.-P. 50-59.

132. Pelagalli A., Belisario M., Squillacioti C. et al. The mycotoxin fumonisin B. inhibits integrin-mediated cell-matrix adhesion. // Biochimie, 1999. V. 81, №10. - P. 1003 - 1008.

133. Pelagalli A., Squllacioti C., Amorena M. et al. Inhibition of cell-matrix adhesion by fumonisin Bb // Rev. med. vet, 1998. V. 149, №6. - P. 648.

134. Pieckova E., Jesenska Z. Ciliostatic activity in day old chicks indicated microscopic fungi toxicity in vitro. //Ann Agr. and Environ. Med., 1997.- V. 4, №1.-P. 35-36.

135. Pier A.C., Richard J.L., Thurston J.R. Effects of mycotoxins onthimmunity and resistance of animals. // Natur. Toxins. Proc. 6 . Int. Symp. Anim., Plant and Microbiol. Toxins. Uppsala - 1979. Oxford e.a. - 1980. -P. 691-699.

136. Ponsoda X., Gomes Lechon M., Castell J. Toxicity and cell density monitoring in monolayer and three-dimensional cultures with the XTT assay. // ATLA, 1998. - V. 26, №3. - P. 331 - 342.

137. Ranjan Kumar S., Sinha Ashok K. Effect of aflatoxin Bi on meiotic index in quinea pigs. //Microbios Left., 1989.- V.41, №162. P. 83 - 85.

138. Rizzo A., Atroshi F., Ahotupa M. et al. Protective effect of antioxidants against free radicals mediated lipid peroxidation induced by DON and T-2 toxin. //J. Vet. Med. A. 1994. - V. 41, №2. - P. 81 - 90.

139. Robb J., Norval M. The use of a cytotoxicity test as a screening test for mycotoxis. // «Trichothecenes and other mycotoxins». Proc. Int. mycotoxin Symp., Sydney, Aug., 1984. Chuchester e.a., 1985. P. 375 -380.

140. Roberfroid M., Goethals F. In vitro toxicology: A challenge for the 21st century.//ATLA, 1990.-V.18,№11.-P. 19-22.

141. Rodiella V., Miles A., Jenner W., Hawks Worth G. Bismuth -induced metallothionein in cultured human proximal tubular cells failed to protect against metal-induced toxicity. // Hum. and Exp. Toxicol, 1997. — V. 16, №7.-P. 413.

142. Rosenstein Y., Lafarge -Frayssinet C. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 1983.-V. 70.-P. 283 -288.

143. Russel W., Birch R. The principles of humane experimental technique. Methuen, London, 1959. 253 P.

144. Saito M., Ecomoto M., Tatsuno T. // Microbial. Toxins, 1971. V. 6. -P. 299-380.

145. Santa M., Pozuelo J., Lopez A., Sanz F. Toxicity of potential irritants in mammalian cells in vitro. // Ecotoxicol. and Environ Safety, 1996. — V. 34, №1.-P. 56-58.

146. Shanin M. Mutagenicity evaluation of nitroanilines and nitroaminophenols in Salmonella typhimurium. // Int. J. Cosmet. Sci., 1985. V.7, №6. - P. 277-289.

147. Shrivastava R., John G., Rispat G., Chevalier A., Massingham R. Can the in vivo maximum tolerated dose be predicted using in vitro techniques? // ATLA, 1991. V. 19, №4. - P. 393 - 401.

148. Smalley E., Strong F. In: Mycotoxin, Amsterdam, Elsevier, 1974. -P. 200-228.

149. Sorenson W., Gerberick G., Lewis D., Castranova V. Toxicity of mycotoxins for the rat pulmonary macrophage in vitro. // Environ. Health Respect., 1986. V. 42, №4. - P. 949 - 951.

150. Spielman H., Genschow E., Liebsch M., Hall W. Determination of the starting dose for acute oral toxicity (LD50) testing in the up and downprocedura (UDP) from cytotoxicity data. // ATLA, 1999. №6. - P. 957966.

151. Stammati A., Zampaglioni F., Zanetti C. The neutral red uptake assay: Comments on the results of the Instituto Superiore di Sanita in the EC/HO validation study.// ATLA, 1998. V. 26, №1. - P. 61-68.

152. Steyn P.S. The biosynthesis of mycotoxins. // Rev. med. vet., 1998. -V. 149, №6.- P.469-478.

153. Suzuki Т., Komatsu M., Isono H. Cytotoxocoty of paraquat and phospholipid peroxidation in rat hepatocytes. // Jap. J. Toxicol, and Environ Health, 1996. V. 42, № 1. - P. 10.

154. Tajima O., Verhagen F., Groten J. Application of in vitro bioassays for the screening of mixtures of trichothecenes. // Rev.med.vet. 1998. — V. 149, №6. - P.513.

155. Tanimura Т., Sakamoto M. Alternatives to animal experiments in developmental toxicity studies. // Acta med. / Kiki Univ., 1995. V. 20, №3. - P. 135-148.

156. Terao К., Kera K., Yazima T. // Virchows Arch. B. Cell. Path., 1978. -V. 27.-P. 359-370.

157. Trusal L. Metabolism of T-2 mykotoxin by cultured cells. // Toxicon, 1986. V.24, №6. - P. 597 - 603.

158. Ueno Y. // Ann. Nutr. Alim., 1977. V. 31. - P. 885 - 890.

159. Ueno Y. In: Trichothecenes — chemical, biological and toxicological aspects. Amsterdsam, Elsevier, 1983. P. 125 - 146.

160. Ueno Y., Sato N., Ishii K. et al. Biological and chemical detection of trichotecene mycotoxins of Fusarium species. // Appl. Microbiol., 1973. -V. 25.-P. 699-704.

161. Verma R., Raval P., Dube H. Effect of aflatoxin on liver and blood cells of rats. // Indian J. Microbiol., 1991. V. 31, № 1. - P. 87 - 89.

162. Waterfleld C., Westmoreland C., Asker D. et al. Ethionine toxicity in vitro: The correlation of data from rat hepatocyte suspensions and monolayers with in vitro observation. // Arch. Toxicol., 1998. V. 72, №9. - P. 588 -596.

163. Watson D., Lindsay D. A critical review of biological methods for the detection of fungal toxins in foods and foodstuffs. // Science of Food and Agriculture, 1982. V.33. - P. 59 - 67.

164. Wei R. et al. Improved skin test for detection on of T-2 toxin // Apll. Microbiol., 1972.-V. 23.-P. 1029-1030.

165. Worth A., Balls M. The importance of the prediction model in the validation of alternative tests. // ATLA., 2001. V. 29, №2. - P.l 35 - 143.

166. Yagen В., Bergmann F., Barel S., Sintov A. Metabolism of T-2 toxin by rat brain homogenate. // Biochem. Pharmacol., 1991. V. 42, №4. - P. 949-951.

167. Yang J., Yeh S., Chang C. Lead acetate mytegenicity and mutation spectrum in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase gene of Chinese hamster ovary K1 cells. // Mol. Carcinogeneses, 1996. V. 17, №4. -P. 181-191.

168. Yoshizawa H., Kubo R., Ueno Y. // J. Pharm. Dyn., 1981. V.4. -P.44

169. Younis S., Al Hakkak Z., Yousit H. Cytotoxicity and mytagenicity of two ice-cream colorants in Allium сера. // J. Biol. Sci. Res., 1986. - V. 17, №1.- P. 241-252.

170. Yu Z., Cheng Т., Igisu H. Effects of hupoxia? Soman and their combination on PC12 cells. // J. Med. Coll. PLA, 1997. V. 12, №3. - P. 173-176.

171. Zbinden G. Aussagemoglichkeit des Tierexperiments in der Risikobeurteilung beim Menschen. // Off. Gesundheitsw., 1990. V. 52, №1. - P. 16-18.

172. Zbinden G. Les methods alternatives, present et avenir. // Sci. et Techn. anim. Lab., 1991.-V. 16, №2.-P. 113 116.

173. Zucco F. Cell death in vitro acute toxicity testing. // ATLA, 1996. -V. 24, Spec. iss.-P. 90.