Инженерия каталитических свойств и термостабильности оксидазы D-аминокислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Комарова, Наталья Владимировна

• Комарова, Наталья Владимировна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Комарова, Наталья Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения об оксидазе Б-аминокислот.

2.2. Первичная структура оксидазы О-аминокислот.

2.3. Трехмерная структура оксидазы О-аминокислот.

2.4. Основные свойства оксидазы О-аминокислот.

2.4.1. Субстратная специфичность оксидазы О-аминокислот.

2.4.2. Стабильность оксидазы О-аминокислот.

2.5. Строение активного центра БААО и механизм катализируемой реакции

2.6. Клонирование и экспрессия генов йаао.

2.7. Химическая модификация оксидазы О-аминокислот.

2.8. Иммобилизация оксидазы О-аминокислот.

2.9. Белковая инженерия оксидазы О-аминокислот.

2.10. Практическое применение оксидазы О-аминокислот.

2.10.1. Определение О-аминокислот.

2.10.2. Получение физиологически активных соединений.

2.10.3. Биокаталитическое получение 7-АЦК из цефалоспорина С.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.2. Рестрикция ДНК.

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.

3.2.4. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.5. Трансформация клетокЕ. соИ.

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.7. Направленный мутагенез.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Экспрессия TVDAAO и ее мутантов в клетках Е. coli.

3.2.10. Очистка фермента.

3.2.11. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях.

3.2.12. Определение концентрации белков.

3.2.13. Определение активности TvDAAO.

3.2.14. Определение кинетических параметров.

3.2.15. Изучение стабильности при различных температурах.

3.2.16. Определение констант скорости термоинактивации.

3.2.17. Определение кинетических параметров TvDAAO в реакции с цефалоспорином С.

3.2.18. Анализ структуры и компьютерное моделирование.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Инженерия в области межсубъединичного контакта.

4.1.1. Анализ межсубъединичных контактов в димере TvDAAO.

4.1.2. Получение мутантных TvDAAO R220E и R169A/R220A.

4.1.3. Субстратная специфичность TvDAAO R220E и R169A/R220A.

4.1.4. Температурная стабильность TvDAAO R220E и

TvDAAO R169A/R220A.

4.2. Инженерия кофермент-связывающего домена.

4.2.1. Анализ связывания FAD в активном центре TvDAAO.

4.2.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 32 и 33 положениях.

4.2.3. Субстратная специфичность мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.

4.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.

4.3. Гидрофобизация a-спиралей TvDAAO.

4.3.1. Анализ структуры TvDAAO и выбор остатков Ser для гидрофобизации а-спиралей.

4.3.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами S67A, S77A, S78A,

S105A, S270A, S277, S335A, S336A.

4.3.3. Субстратная специфичность TvDAAO с заменами S67A, S77A,

S105A, S335A, S336A, S277.

4.3.4. Изучение температурной стабильности мутантных TvDAAO.

4.4. Повышение эффективности TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.

4.4.1. Анализ строения субстрат-связывающего домена.

4.4.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54A, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F и F54S/C108F.

4.4.3. Субстратная специфичность TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F, F54S/C108F.

4.4.4. Температурная стабильность TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F, F54S/C108F.

4.4.5. Каталитические свойства мутантных ферментов в реакции с цефалоспорином С.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Инженерия каталитических свойств и термостабильности оксидазы D-аминокислот»

Оксидаза О-аминокислот относится к классу БАО-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование О-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, ОААО). В микроорганизмах этот фермент окисляет экзогенные Б-аминокислоты, обеспечивая клетки легко утилизируемыми а-кетокислотами. В животных и человеке ОААО выполняет гораздо более важную роль - она отвечает за поддержание определенного уровня О-аминокислот, которые являются регуляторами важнейших процессов как в отдельных частях, так и во всем организме. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание О-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность ОААО в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание О-аланина. Пониженная активность ОААО характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза О-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.

На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефало-спорановую кислоту (7-АЦК) - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, ОААО активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении неприродных Ь-аминокислот и а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрения, амиотрофический боковой склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.

Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически к настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), поскольку по сравнению с известными аналогичными ферментами из других источников TvDAAO обладает самой высокой температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С. Создание высокоэффективных биокатализаторов на основе TvDAAO невозможно без проведения фундаментальных исследований по изучению взаимосвязи структуры и функции этого фермента и направленной инженерии его свойств, в частности, температурной стабильности и субстратной специфичности. Другой очень важной задачей по инженерии TvDAAO является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Одним из самых эффективных методов как для фундаментального исследования структуры и функции ферментов, так и для направленного изменения их каталитических свойств и стабильности, является метод рационального дизайна. Этот метод сочетает анализ трехмерной структуры фермента с последующим введением выбранных на основе анализа аминокислотных замен с помощью направленного мутагенеза. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество публикаций по белковой инженерии TvDAAO. Это связано с отсутствием у исследователей данных по трехмерной структуре фермента, хотя эксперименты по кристаллизации TvDAAO проводились во многих лабораториях более 20 лет. В 2007 году в нашей лаборатории была решена первая структура мутантной TvDAAO, которая остается единственной до настоящего времени. Наличие трехмерной структуры TvDAAO создает основу для проведения экспериментов по белковой инженерии этого фермента с помощью рационального дизайна.

Основной целью данной работы было изучение взаимосвязи структура-функция в оксидазе D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis методами белковой инженерии и получение мутантных TvDAAO с измененными свойствами, а именно, температурной стабильностью и субстратной специфичностью.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Комарова, Наталья Владимировна

V. выводы

1. Изучена роль водородных связей в стабильности димера TvDAAO. Показано, что остатки Arg 169 и Arg220 играют важную роль в поддержании димерной структуры фермента. Разрушение водородных связей, образованных этими остатками, приводит к получению активного, но нерастворимого фермента, и при этом происходит резкое снижение термостабильности.

2. Проведена оптимизация структуры кофактор-связывающего домена за счет замены остатков в 32-м и 33-м положениях. Получены мутантные TvDAAO, которые обладают как улучшенными каталитическими свойствами, так и повышенной температурной стабильностью.

3. Проведены эксперименты по стабилизации TvDAAO с помощью гидрофобизации a-спиралей. Получено 8 мутантных форм фермента. Показано, что замена Serl05Ala приводит к повышению стабильности фермента.

4. Изучена роль остатков Phe54 и Phe258, расположенных на входе в активный центр фермента. Показана важная роль этих остатков как в проявлении каталитических свойств, так и в термостабильности TvDAAO. Их замена на другие остатки позволяет резко сузить спектр субстратной специфичности. Кроме того, введение замен в 54 и 258 положении позволяет получить фермент с повышенной температурной стабильностью.

5. Показано, что остаток Phe в 54 положении играет важную роль в реакции окисления цефалоспорина С. Получены мутантные TvDAAO, обладающие более высокими каталитической активностью и каталитической эффективностью. Объединение замен в 54 и 108 положении привело к дальнейшему улучшению каталитических свойств TvDAAO в ходе окисления цефалоспорина С.

6. Изучена кинетика термоинактивации для всех полученных мутантных форм TvDAAO. Показано, что за исключением одного фермента, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает по двухстадийному диссоциативному механизму.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Комарова, Наталья Владимировна, 2012 год

1. Krebs, Н. A. Metabolism of amino-acids: Deamination of amino-acids. Biochem. J. 1935, v.29, N 7, p.1620-1644.

2. Pilone, M. S. D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci. 2000, v.57, N 12, p.1732-1747.

3. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D-amino acid oxidase.' FEBS Lett. 1988, v.238, N 1, p.180-184.

4. Pollegioni, L., Piubelli, L., Sacchi, S., Pilone, M. S., and Molla, G. Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans. Cell Mol. Life Sci. -2007, v.64, N 11, p.1373-1394.

5. Nishikawa, T. Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull. 2005, v.28, N 9, p. 1561-1565.

6. Corvin, A., Donohoe, G., McGhee, K., Murphy, K., Kenny, N., Schwaiger, S., Nangle, J. M., Morris, D., and Gill, M. D-amino acid oxidase (DAO) genotype and mood symptomatology in schizophrenia. Neurosci. Lett. 2007, v.426, N 2, p.97-100.

7. Chung, S., Jung, J., Chung, H. Y., Yoo, H. K., Kim, C. Y., Joo, Y. H., Choi, S. E., and Hong, J. P. No association between polymorphisms of DAO and DAOA genes and homicidal behaviors in Korean schizophrenia. Psychiatr. Genet. 2007, v. 17, N 5, p.313.

8. Paul, P. and de, Belleroche J. The role of D-amino acids in amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: a review. Amino. Acids 2012, v.43, N 5, p.1823-1831.

9. Fisher, G., Lorenzo, N., Abe, H., Fujita, E., Frey, W. H., Emory, C., Di Fiore, M. M., and D' Aniello, A. Free D- and L-amino acids in ventricular cerebrospinal fluid from Alzheimer and normal subjects. Amino Acids 1998, v. 15, N 3, p.263-269.

10. Huang, J. L., Chen, X. L., Guo, C., and Wang, Y. X. Contributions of spinal D-amino acid oxidase to bone cancer pain. Amino Acids 2012, v.43, N 5, p.1905-1918.

11. Khoronenkova, S. V. and Tishkov, V. I. D-amino acid oxidase: physiological role and applications. Biochemistry (Mosc.) 2008, v.73, N 13, p.1511-1518.

12. Pilone, M. S. D-amino acid oxidase as an industrial biocatalyst. Biocatal.Biotransform. 2002, v.20, N 145-159.

13. He, J., Baldini, R. L., Deziel, E., Saucier, M., Zhang, Q., Liberati, N. T., Lee, D., Urbach, J., Goodman, H. M., and Rahme, L. G. The broad host range pathogen

14. Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004, v.101, N 8, p.2530-2535.

15. Subramani, S. Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu. Rev. Cell Biol. 1993, v.9, N 445-478.

16. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. 1996, v.120, N 1, p.14-17.

17. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. 1996, v.120, N 1, p.14-17.

18. Todone, F., Vanoni, M. A., Mozzarelli, A., Bolognesi, M., Coda, A., Curti, B., and Mattevi, A. Active site plasticity in D-amino acid oxidase: a crystallographic analysis. Biochemistry 1997, v.36, N 19, p.5853-5860.

19. Pollegioni, L., Diederichs, K., Molla, G., Umhau, S., Welte, W., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Yeast D-amino acid oxidase: structural basis of its catalytic properties. J. Mol. Biol. 2002, v.324, N 3, p.535-546.

20. Kawazoe, T., Tsuge, H., Imagawa, T., Aki, K., Kuramitsu, S., and Fukui, K. Structural basis of D-DOPA oxidation by D-amino acid oxidase: alternative pathway for dopamine biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, v.355, N 2, p.385-391.

21. Dib, I., Slavica, A., Riethorst, W., and Nidetzky, B. Thermal inactivation of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis occurs via three parallel paths of irreversible denaturation. Biotechnol. Bioeng. 2006, v.94, N 4, p.645-654.

22. Хороненкова, С. В. Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структрурно-функциональные исследования. Дис.канд.хим.наук.М.-МГУ. -2008, 162 с.

23. Piubelli, L., Caldinelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Conversion of the dimeric D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis to a monomeric form. A rational mutagenesis approach. FEBSLett. 2002, v.526, N 1-3, p.43-48.

24. Pilone, M. S. D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci. 2000, v.57, N 12, p.1732-1747.

25. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Studies on the inactivation of the flavoprotein D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. -1996, v.45, N 4, p.458-464.

26. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Properties and chemical modification of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Arch. Microbiol. 1996, v. 165, N 41-47.

27. Molla, G., Sacchi, S., Bernasconi, M., Pilone, M. S., Fukui, K., and Polegioni, L. Characterization of human D-amino acid oxidase. FEBS Lett. 2006, v.580, N 9, p.2358-2364.

28. Pollegioni, L., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Studies on the active centre of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase and comparison with pig kidney enzyme. Biochem. J. 1992, v.286 ( Pt 2), N 389-394.

29. Pollegioni, L., Buto, S., Tischer, W., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Characterization of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Biochem. Mol. Biol. Int. -1993, v.31, N 4, p.709-717.

30. Gabler, M., Hensel, M., and Fischer, L. Detection and substrate selectivity of new microbial D-amino acid oxidases. Enzyme Microb. Technol. 2000, v.27, N 8, p.605-611.

31. Sarower, M. G., Okada, S., and Abe, H. Catalytic and structural characteristics of carp hepatopancreas D-amino acid oxidase expressed in Escherichia coli. Comp Biochem. Physiol B Biochem. Mol. Biol. 2005, v.140, N 3, p.417-425.

32. Geueke, B., Weckbecker, A., and Hummel, W. Overproduction and characterization of a recombinant D-amino acid oxidase from Arthrobacter protophormiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, v.74, N 6, p. 1240-1247.

33. Pollegioni, L., Caldinelli, L., Molla, G., Sacchi, S., and Pilone, M. S. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin C bioconversion: a comparison between proteins from different sources. Biotechnol. Prog. 2004, v.20, N 2, p.467-473.

34. Pollegioni, L., Sacchi, S., Caldinelli, L., Boselli, A., Pilone, M. S., Piubelli, L., and Molla, G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolution approach. Curr. Protein Pept. Sci. 2007, v.8, N 6, p.600-618.

35. Harris, C. M., Pollegioni, L., and Ghisla, S. pH and kinetic isotope effects in D-amino acid oxidase catalysis. Eur. J. Biochem. 2001, v.268, N 21, p.5504-5520.

36. Caligiuri, A., D'Arrigo, P., Rosini, E., Tessaro, D., Molla, G., Servi, S., and Pollegioni, L. Enzymatic conversion of unnatural amino acids by yeast D-amino acid oxidase. Adv. Synth. Catal. 2006, v.348, N 2183-2190.

37. Sacchi, S., Lorenzi, S., Molla, G., Pilone, M. S., Rossetti, C., and Pollegioni, L. Engineering the substrate specificity of D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. -2002, v.277, N 30, p.27510-27516.

38. Rosini, E., Molla, G., Ghisla, S., and Pollegioni, L. On the reaction of D-amino acid oxidase with dioxygen: 02 diffusion pathways and enhancement of reactivity. FEBSJ. 2011, v.278, N 3, p.482-492.

39. Pollegioni, L., Molla, G., Sacchi, S., Rosini, E., Verga, R., and Pilone, M. S. Properties and applications of microbial D-amino acid oxidases: current state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, v.78, N 1, p. 1-16.

40. Fukui, K. and Miyake, Y. Molecular cloning and chromosomal localization of a human gene encoding D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. 1992, v.261, N 26, p.18631-18638.

41. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D-amino acid oxidase. FEBS Lett. 1988, v.238, N 1, p.180-184.

42. Fukui, K., Watanabe, F., Shibata, T., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs encoding porcine kidney D-amino acid oxidase. Biochemistry 1987, v.26, N 12, p.3612-3618.

43. Momoi, K., Fukui, K., Tada, M., and Miyake, Y. Gene expression of D-amino acid oxidase in rabbit kidney. J. Biochem. 1990, v. 108, N 3, p.406-413. .

44. Tada, M., Fukui, K., Momoi, K., and Miyake, Y. Cloning and expression of a cDNA encoding mouse kidney D-amino acid oxidase. Gene 1990, v.90, N 2, p.293-297.

45. Konno, R. Rat D-amino-acid oxidase cDNA: rat D-amino-acid oxidase as an intermediate form between mouse and other mammalian D-amino-acid oxidases. Biochim. Biophys. Acta 1998, v. 1395, N 2, p. 165-170.

46. Konno, R., Kurabayashi, A., Tsuchiya, M., and Niwa, A. Guinea pig D-amino-acid oxidase cDNA and phylogenetic position. DNA Seq. 1999, v. 10, N 2, p.85-91.

47. Tsuchiya, M., Kurabayashi, A., and Konno, R. Hamster D-amino-acid oxidase cDNA: rodents lack the 27th amino acid residue in D-amino-acid oxidase. Amino Acids 2003, v.24, N 1-2, p.223-226.

48. Sarower, M. G., Okada, S., and Abe, H. Molecular characterization of D-amino acid oxidase from common carp Cyprinus carpio and its induction with exogenous free D-alanine. Arch. Biochem. Biophys. 2003, v.420, N 1, p. 121-129.

49. Gholizadeh, A. and Kohnehrouz, B. B. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of an active fused Zea mays L. D-amino acid oxidase. Biochemistry (Mosc.) 2009, v.74, N 2, p.137-144.

50. Chen, Y.-H., Chen, W.-L., Wang, Y.-H., Huang, M.-Y., and Chern, M.-K. Spatiotemporal expression of zebrafish D-amino acid oxidase during early embryogenesis. Fish Physiology and Biochemistry 2007, v.33, N 1, p.73-80.

51. Isogai, T., Ono, H., Ishitani, Y., Kojo, H., Ueda, Y., and Kohsaka, M. Structure and expression of cDNA for D-amino acid oxidase active against cephalosporin C from Fusarium solani. J. Biochem. 1990, v.108, N 6, p.1063-1069.

52. Liao, G. J., Lee, Y. J., Lee, Y. H., Chen, L. L., and Chu, W. S. Structure and expression of the D-amino-acid oxidase gene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998, v.27 ( Pt 1), N 55-61.

53. Yurimoto, H., Hasegawa, T., Sakai, Y., and Kato, N. Characterization and highlevel production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, v.65, N 3, p.627-633.

54. Horner, R., Wagner, F., and Fischer, L. Induction of the d-Amino Acid Oxidase from Trigonopsis variabilis. Appl. Environ. Microbiol. 1996, v.62, N 6, p.2106-2110.

55. Kubicek-Pranz, E. M. and Rohr, M. D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis. J. Appl. Biochem. 1985, v.7, N 2, p.104-113.

56. Wei, C. J., Huang, J. C., and Tsai, Y. P. Study on the synthesis of D-amino acid oxidase in Trigonopsis variabilis in continuous culture. Biotechnol. Bioeng. 1989, v.34, N 4, p.570-574.

57. Gabler, M. and Fischer, L. Production of a new D-amino acid oxidase from the fungus Fusarium oxysporum. Appl. Environ. Microbiol. 1999, v.65, N 8, p.3750-3753.

58. Molla, G., Motteran, L., Piubelli, L., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Regulation of D-amino acid oxidase expression in the yeast Rhodotorula gracilis. Yeast 2003, v.20, N 12, p.1061-1069.

59. Abad, S., Nahalka, J., Bergler, G., Arnold, S. A., Speight, R., Fotheringham, I., Nidetzky, B., and Glieder, A. Stepwise engineering of a Pichia pastoris D-amino acid oxidase whole cell catalyst. Microb. Cell Fact. 2010, v.9, N 24.

60. Abad, S., Nahalka, J., Winkler, M., Bergler, G., Speight, R., Glieder, A., and Nidetzky, B. High-level expression of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase in Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2011, v.33, N 3, p.557-563.

61. Lin, S.-Y., Wang, J.-D., and Lin, J. S. Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase in transgenic rice for cephalosporin production. Botanical Studies 2008, v.50, N 2, p. 181-192.

62. Lin, L., Chien, H. R., Wang, W., Hwang, T., Fu, H., and Hsu, W. Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase gene in Escherichia coli and characterization of its inactive mutants. Enzyme Microb. Technol. 2000, v.27, N 7, p.482-491.

63. Molla, G., Vegezzi, C., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Overexpression in Escherichia coli of a recombinant chimeric Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Protein Expr. Purif. 1998, v. 14, N 2, p.289-294.

64. Dib, I., Stanzer, D., and Nidetzky, B. Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase: control of protein quality and opportunities for biocatalysis through production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2007, v.73, N 1, p.331-333.

65. Gupta, N., Gundampati, R. K., and Debnath, M. Optimization of media composition for D-amino acid oxidase production by Trigonopsis variabilis using biostatistical analysis. Indian J. Biochem. Biophys. 2012, v.49, N 4, p.272-278.

66. Takahashi, S., Okada, H., Abe, K., and Kera, Y. D-Amino Acid-Induced Expression of D-Amino Acid Oxidase in the Yeast Schizosaccharomyces pombe. Curr. Microbiol. 2012, v.65, N 6, p.764-769.

67. Konno, R. Assignment of D-amino-acid oxidase gene to a human and a mouse chromosome. Amino. Acids 2001, v.20, N 4, p.401-408.

68. Alonso, J., Barredo, J. L., Diez, B., Mellado, E., Salto, F., Garcia, J. L., and Cortes, E. D-amino-acid oxidase gene from Rhodotorula gracilis {Rhodosporidium toruloides) ATCC 26217. Microbiology 1998, v.144 ( Pt 4), N 1095-1101.

69. Kim, S.-J., Kim, N. J., Chen, J.-H., and Kim, C.-W. Optimization of culture condition for the production of D-amino acid oxidase in a recombinant Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, v.13, N 2, p.144-149.

70. Liu, Y., Li, Q., Zhu, H., and Yang, J. High Soluble Expression of D-Amino Acid Oxidase in Escherichia coli Regulated by a Native Promoter. Appl Biochem Biotechnol 2009, v.158, N 2, p.313-322.

71. Romano, D., Molla, G., Pollegioni, L., and Marinelli, F. Optimization of human D-amino acid oxidase expression in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2009, v.68, N 1, p.72-78.

72. Cereghino, J. L. and Cregg, J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 2000, v.24, N 1, p.45-66.

73. Gisby, M. F., Mudd, E. A., and Day, A. Growth of transplastomic cells expressing D-amino acid oxidase in chloroplasts is tolerant to D-alanine and inhibited by D-valine. Plant Physiol 2012 Epub ahead of print.

74. Vanoni, M. A., Pilone, Simonetta M., Curti, B., Negri, A., and Ronchi, S. Phenylglyoxal modification of arginines in mammalian D-amino-acid oxidase. Eur. J. Biochem. 1987, v.167, N 2, p.261-267.

75. Gadda, G., Negri, A., and Pilone, M. S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidase from Rhodotorula gracilis. J. Biol. Chem. 1994, v.269, N 27, p.17809-17814.

76. Fitzpatrick, P. F. and Massey, V. The reaction of 8-mercaptoflavins and flavoproteins with sulfite. Evidence for the role of an active site arginine in D-amino acid oxidase. J. Biol. Chem. 1983, v.258, N 16, p.9700-9705.

77. D'Silva, C., Williams, C. H., Jr., and Massey, V. Electrophilic amination of a single methionine residue located at the active site of D-amino acid oxidase by 0-(2,4-dinitrophenyl)hydroxylamine. Biochemistry 1986, v.25, N 19, p.5602-5608.

78. Ramon, F., de, la Mata, I, Iannacone, S., Pilar, Castillon M., and Acebal, C. Chemical modification of histidyl residues in D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis. J. Biochem. 1995, v.118, N 5, p.911-916.

79. Gadda, G., Beretta, G. L., and Pilone, M. S. Chemical modification of lysyl residues of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biochem. Mol. Biol. Int. 1994, v.33, N 5, p.947-955.

80. Marcotte, P. and Walsh, C. Properties of D-amino acid oxidase covalently modified upon its oxidation of D-propargylglycine. Biochemistry 1978, v. 17, N 14, p.2864-2868.

81. Horiike, K., Nishina, Y., Miyake, Y., and Yamano, T. Affinity labeling of D-amino acid oxidase with an acetylenic substrate. J. Biochem. 1975, v.78, N 1, p.57-63.

82. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Evidence for the functional importance of Cys298 in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Eur. J. Biochem. 1993, v.218, N 2, p.735-744.

83. Bakke, M. and Kajiyama, N. Improvement in thermal stability and substrate binding of pig kidney D-amino acid oxidase by chemical modification. Appl. Biochem. Biotechnol. 2004, v.l 12, N 3, p.123-131.

84. Hsieh, H. C., Kuan, I. C., Lee, S. L., Tien, G. Y., Wang, Y. J., and Yu, C. Y. Stabilization of D-amino acid oxidase from Rhodosporidium toruloides by immobilization onto magnetic nanoparticles. Biotechnol. Lett. 2009, v.31, N 4, p.557-563.

85. Kuan, I., Liao, R., Hsieh, H., Chen, K., and Yu, C. Properties of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase immobilized on magnetic beads through his-tag. J. Biosci. Bioeng. 2008, v.105, N 2, p.l 10-115.

86. Chien, L. J. and Lee, C. K. Biosilicification of dual-fusion enzyme immobilized on magnetic nanoparticle. Biotechnol Bioeng. 2008, v.100, N 2, p.223-230.

87. Nahalka, J., Dib, I., and Nidetzky, B. Encapsulation of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase and fast comparison of the operational stabilities of free and immobilized preparations of the enzyme. Biotechnol. Bioeng. 2008, v.99, N 2, p.251-260.

88. Dib, I. and Nidetzky, B. The stabilizing effects of immobilization in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. BMC. Biotechnol. 2008, v.8, N 72.

89. Dsouza, S. F. and Deshpande, A. Simultaneous purification and reversible immobilization of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis on a hydrophobic support. Appl. Biochem. Biotechnol. 2001, v.95, N 2, p.83-92.

90. Lemainque, A., Braun, J., and Le, Goffic F. Influence of polymerization of D-amino acid oxidase on the behavior of the enzyme immobilized on chitosan by covalent fixation., Eur. J. Biochem. 1988, v. 174, N 1, p. 171-176.

91. Parkin, K. and Hultin, H. O. Immobilization and characterization of D-amino acid oxidase. Biotechnol Bioeng. 1979, v.21, N 6, p.939-953.

92. Vikartovska-Welwardova, A., Michalkova, E., Gemeiner, P., and Wei ward, L. Stabilization of D-amino-acid oxidase from Trigonopsis variabilis by manganese dioxide. Folia Microbiol. (Praha) 1999, v.44, N 4, p.380-384.

93. Tanaka, A., Yasuhara, S., Osumi, M., and Fukui, S. Immobilization of yeast microbodies by inclusion with photo-crosslinkable resins. Eur. J. Biochem. 1977, v.80, N 1, p.193-197.

94. Johansson, E., Marko-Varga, G., and Gorton, L. Study of a reagent- and mediator-less biosensor for D-amino acids based on co-immobilized D-amino acid oxidase and peroxidase in carbon paste electrodes. J. Biomater. Appl. 1993, v.8, N 2, p.146-173.

95. Sacchi, S., Lorenzi, S., Molla, G., Pilone, M. S., Rossetti, C., and Pollegioni, L. Engineering the substrate specificity of D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. -2002, v.277, N 30, p.27510-27516.

96. Caligiuri, A., D'Arrigo, P., Rosini, E., Tessaro, D., Molla, G., Servi, S., and Pollegioni, L. Enzymatic conversion of unnatural amino acids by yeast D-amino acid oxidase. Advanced Synthesis & Catalysis 2006, v.348, N 15, p.2183-2190.

97. Boselli, A., Piubelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., Pollegioni, L., and Sacchi, S. Investigating the role of active site residues of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase on its substrate specificity. Biochimie 2007, v.89, N 3, p.360-368.

98. Boselli, A., Sacchi, S., Job, V., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Role of tyrosine 238 in the active site of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. A site-directed mutagenesis study. Eur. J. Biochem. 2002, v.269, N 19, p.4762-4771.

99. Pollegioni, L., Harris, C. M., Molla, G., Pilone, M. S., and Ghisla, S. Identification and role of ionizing functional groups at the active center of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. FEBSLett. 2001, v.507, N 3, p.323-326.

100. Boselli, A., Piubelli, L., Molla, G., Sacchi, S., Pilone, M. S., Ghisla, S., and Pollegioni, L. On the mechanism of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase: role of the active site serine 335. Biochim. Biophys. Acta 2004, v. 1702, N 1, p.19-32.

101. Caldinelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Tryptophan 243 affects interprotein contacts, cofactor binding and stability in D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis. FEBS J. 2006, v.273, N 3, p.504-512.

102. Campaner, S., Pollegioni, L., Ross, B. D., and Pilone, M. S. Limited proteolysis and site-directed mutagenesis reveal the origin of microheterogeneity in Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biochem. J. 1998, v.330 (Pt 2), p.615-621.

103. Bakke, M., Setoyama, C., Miura, R., and Kajiyama, N. Thermostabilization of porcine kidney D-amino acid oxidase by a single amino acid substitution. Biotechnol. Bioeng. 2006, v.93, N 5, p. 1023-1027.

104. Pollegioni, L., Fukui, K., and Massey, V. Studies on the kinetic mechanism of pig kidney D-amino acid oxidase by site-directed mutagenesis of tyrosine 224 and tyrosine 228. J. Biol. Chem. 1994, v.269, N 50, p.31666-31673.

105. Raibekas, A. A., Fukui, K., and Massey, V. Design and properties of human D-amino acid oxidase with covalently attached flavin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2000, v.97, N 7, p.3089-3093.

106. Ju, S. S., Lin, L. L., Wang, W. C., and Hsu, W. H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. FEBSLett. 1998, v.436, N 1, p.l 19-122.

107. Lin, L. L., Wang, W. C., Ju, S. S., Chien, H. R., and Hsu, W. H. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol. Lett. 1999, v.176, N 2, p.443-448.

108. Frattini, L., Rosini, E., Pollegioni, L., and Pilone, M. S. Analyzing the D-amino acid content in biological samples by engineered enzymes. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2011, v.879, N 29, p.3235-3239.

109. Wang, S. J., Yu, C. Y., Lee, C. K., Chern, M. K., and Kuan, I. C. Subunit fusion of two yeast D-amino acid oxidases enhances their thermostability and resistance to H202. Biotechnol. Lett. 2008, v.30, N 8, p.1415-1422.

110. Nishikawa, T. Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull. 2005, v.28, N 9, p.1561-1565.

111. Sacchi, S., Rosini, E., Caldinelli, L., and Pollegioni, L. Biosensors for D-amino acid detection. Methods Mol. Biol. 2012, v.794, N 313-324.

112. Mohd, Zain Z., Ab, Ghani S., and O'Neill, R. D. Amperometric microbiosensor as an alternative tool for investigation of D-serine in brain. Amino. Acids 2012, v.43, N 5, p.1887-1894.

113. Maddess, M. L., Tackett, M. N., and Ley, S. V. Total synthesis studies on macrocyclic pipecolic acid natural products: FK506, the antascomicins and rapamycin. Prog. Drug Res. 2008, v.66, N 13, 15-13,186.

114. Findrik, Z. and Vasic-Racki, D. Biotransformation of D-methionine into L-methionine in the cascade of four enzymes. Biotechnol. Bioeng. 2007, v.98, N 5, p.956-967.

115. Tan, Q., Song, Q., Zhang, Y., and Wei, D. Characterization and application of D-amino acid oxidase and catalase within permeabilized Pichia pastoris cells in bioconversions. Appl. Biochem. Biotechnol. 2007, v. 136, N 3, p.279-289.

116. Seo, Y. M., Mathew, S., Bea, H. S., Khang, Y. H., Lee, S. H., Kim, B. G., and Yun, H. Deracemization of unnatural amino acid: homoalanine using D-amino acid oxidase and omega-transaminase. Org. Biomol. Chem. 2012, v. 10, N 12, p.2482-2485.

117. Patel, R. N. Enzymatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive drug. Biomol. Eng 2001, v. 17, N 6, p. 167-182.

118. Таранцева, К. P. and Яхкинд, M. И. Анализ технологий синтеза 7-аминоцефалосиорановой кислоты и выбор оптимальной безопасной промышленной технологии. М: Научный мир, 2009, 216 с.

119. Barber, М. S., Giesecke, U., Reichert, A., and Minas, W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem Eng Biotechnol -2004, v.88, N 179-215.

120. Sonawane, V. C. Enzymatic modifications of cephalosporins by cephalosporin acylase and other enzymes. Crit Rev. Biotechnol. 2006, v.26, N 2, p.95-120.

121. Полторак, O.M., Чухрай, E.C. Диссоциативная термоинактивация катализаторов. Итоги науки и техники. Биотехнология. 1986, v.5, р.50-86