Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Корнеева Вера Анатольевна

• Корнеева Вера Анатольевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Корнеева Вера Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз

1.2. Контактный путь активации свертывания

1.2.1. Активация фактора XII

1.2.2. Физиологическая роль фХ11

1.2.3. Роль контактной активации в патологии

1.3. Ингибиторы контактной активации

1.3.1. Плазменные ингибиторы фХ11а

1.3.2. Белковые ингибиторы фХ11а неплазменного происхождения

1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз

1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Используемые реактивы

2.2. Подбор праймеров, полимеразная цепная реакция и сайт-направленный мутагенез

2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями

2.4. Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов

2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов

2.6. Измерение ингибирующей активности

2.7. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга

2.8. Молекулярная динамика

2.9. Подготовка модельной структуры фактора Х11а на основе гомологии

2.10. Белок-белковый докинг

2.11. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного СНР1

3.2. Измерение ингибирующей активности

3.3. Моделирование взаимодействия протеаза-связывающей петли СНР1 с ингибируемыми протеазами

3.3.1. Подготовка пространственных структур СНБ1 и его мутантов для проведения докинга

3.3.2. Моделирование структуры фХ11а. Докинг

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Благодарности

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы»

Введение

Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К ним относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. Эти ферменты участвуют в различных процессах, таких как пищеварение, оплодотворения, активации комплемента, апоптоз, иммунный ответ и т.д. [1].

Плазменное звено свертывания крови также находится под управлением каскада сериновых протеаз, активирующих друг друга путем протеолитического расщепления. Плазменное свертывание может активироваться по двум путям: внешнему или пути тканевого фактора и внутреннему или контактному пути. Внешний путь активируется в результате попадания трансмембранного белка -тканевого фактора в кровоток в месте повреждения сосуда. Такая активация является физиологической и обеспечивает остановку кровотечений.

Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фХ11) при взаимодействии с отрицательно-заряженными поверхностями: in vivo - при контакте поверхностью активированного тромбоцита или бактериальной клетки [2-4], внеклеточными нуклеиновыми кислотами и т.д., ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечно-легочного шунтирования и in vitro - при заборе крови в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок [5,6].

Участие фХ11 в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясно, а его вклад в патологическое тромбообразование был показан экспериментально на животных моделях FeCb-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9].

Таким образом, активный фактор XII (фХ11а) представляет собой многообещающую мишень для создания новых антитромботических препаратов, т.к. подавление работы данного фактора не сказывается на поддержании

гемостаза, но позволяет предотвратить патологическое тромбообразование при гиперкоагуляционных состояниях. Следовательно, исследование механизмов ингибирования фактора XIIa и особенностей взаимодействия данной протеазы с лучшими из существующими ингибиторов - очевидный и необходимый шаг на пути создания новых антитромботических препаратов.

Ингибитора трипсина из кукурузы (corn trypsin/factor XIIa inhibitor, CHFI) -канонический ингибитор сериновых протеаз, широко применяемый для подавления контактной активации свертывания. В данной работе будет исследована роль протеаза-связывающей петли данного ингибитора в специфическом взаимодействии с активированным фактором свертывания XII.

Целью данной работы было выявление роли протеазы-связывающей петли CHFI и его непетельных участков во взаимодействии с фХПа. В задачи исследования входило

1. получить рекомбинантный CHFI и серию его укороченных мутантов; разработать протокол экспрессии CHFI и его мутантов в E. coli в растворимой форме для последующей однофазной очистки;

2. измерить константы ингибирования полученных мутантов по отношению к фХПа;

3. построить модельную структуру фХПа на основе гомологии;

4. на основе известной рентгеновской структуры CHFI построить модельные структуры мутантов CHFI методом молекулярной динамики;

5. провести моделирование взаимодействия CHFI и его мутантов с трипсином, фХПа и фХ!а методом докинга.

Научная новизна. В работе обнаружено, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI (синтетический пептид, С- и N-концы которого соединены дисульфидной связью) не может подавлять активность фактора X IIa,

сохраняя при этом способность ингибировать фактор XIa и трипсин. Таким образом, было показано, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI способна действовать как независимый структурный элемент и подавлять активность некоторых протеаз (фактор XIa и трипсин). В работе было также показано, что минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХПа, содержит аминокислотные остатки 12-108 (код 1BEA в базе данных PDB). Полученные результаты позволили сделать предположения о механизме ингибирования фактора XIIa CHFI: ингибирование происходит по стандартному механизму [10], но с обязательным участием некоторых участков CHFI вне протеаза-связывающей петли.

Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание взаимодействия ингибиторов сериновых протеаз с подавляемыми ферментами и механизма ингибирования фактора XIIa ингибитором трипсина из кукурузы (CHFI) в частности. Разработанный в ходе данной работы протокол получения рекомбинантного CHFI (глобулярный белок, массой 14 кДа, содержащий 5 дисульфидных связей) в растворимой форме в культуре Escherichia coli. также имеет научно-практическое значение. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых ингибиторов фХПа и других сериновых протеаз.

Положения, выносимые на защиту:

1. Минимальный фрагмент СНР1, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фХ11а, содержит аминокислотные остатки 12-108 (1ББЛ, РОБ).

2. Протеаза-связывающая петля СНР1 принимает участие во взаимодействии с фХ11а, но не полностью определяет ингибирующую активность в отношении этого фактора свертывания.

3. Изолированная протеаза-связывающая петля СНР1 действует как независимый структурный элемент и ингибирует некоторые сериновые протеазы - трипсин и фХ1а.

4. Разработанный нами протокол экспрессии СЖ! и его мутантов в Е.свИ впервые позволяет получать данный рекомбинантный ингибитор в функционально активной форме.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз

Сериновые протеазы - одна из наиболее распространенных групп протеолитических ферментов. Название "сериновые» данное семейство протеаз получило вследствие того, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра данных протеаз и принимает непосредственное участие в расщеплении субстрата. Сериновые протеазы обнаружены у представителей всех царств живых организмов. Данные ферменты могут выполнять множество различных функций, как в эу-, так и прокариотах, участвуют в процессах метаболизма, клеточной сигнализации и т.д [1]. Каскад сериновых протеаз, активирующих друг друга путем протеолитического расщепления контролирует свертывание крови и систему комплемента.

Сериновые протеазы расщепляют субстрат специфически: по определенным аминокислотам. Активный сайт сериновой протезазы имеет форму щели, в которую заходит субстрат. Согласно [11] аминокислотные остатки в активном сайте протеазы, с которыми связывается субстрат, обозначают Б3, Б2, Бь Бь 32', 83',..., БД Аминокислотные остатки субстрата обозначаются (Рь ..., Р3, Р2, Рь Р1', Р2', Р3', ..., Pj); нумерация производится в направлении от К- к С-концу субстрата (рис. 1). Расщепляемая связь в субстрате находится между Р1 и Р1'. Типичная каталитическая триада сериновой протеазы формируется боковыми цепями серина, гистидина и аспартата.

Рисунок 1. Схема связывания субстрата с сериновой протеазой. Протеаза показана светло коричневым цветом, а аминокислотные остатки субстрата -оливковым, по [12] с незначительными изменениями.

Механизм действия сериновых протеаз представляет собой ковалентный катализ, где ковалентная связь формируется между субстратом и аминокислотным остатком серина каталитической триады протеазы. Протеолиз проходит в два этапа (рис. 2).

Е Е

Рисунок 2. Механизм действия сериновых протеаз. Протеолиз осуществляется в два этапа. Воспроизведено из [13].

На первом этапе реакции каталитический остаток серина производит нуклеофильную атаку карбонильного атома углерода P1-аминокислотного остатка

субстрата. Происходит образование промежуточного продукта - ацил-фермента и формируется новый К-конец субстрата на Р1 '-аминокислотном остатке субстрата. На втором этапе реакции молекула воды проводит вторую нуклеофильную атаку: происходит гидролиз ацил-фермента. Каталитический серин приходит в первоначальное состояние (происходит регенерация свободной сериновой протеазы, а на Р1-аминокислотном остатке субстрата формируется новый С-конец [11].

Каталитические аспартат и гистидин так же участвуют в процессе протеолиза [14]. Под действием гистидина из молекулы воды формируется гидроксид-анион, который проводит вторую нуклеофильную атаку, а также гистидин выступает в роли кислоты переносящей протон на отделяющуюся группу на обоих этапах реакции. Предполагают, что боковая цепь аспартата стабилизирует протеонированный остаток гистидина, однако детали данного взаимодействия все еще не вполне ясны [15,16].

1.2. Контактный путь активации свертывания 1.2.1. Активация фактора XII

Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фХ11) при взаимодействии с отрицательно-заряженными поверхностями. Это может иметь место, как in vitro - при заборе крови в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок, так и ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечно -легочного шунтирования [5,6], а также in vivo при контакте поверхностью активированного тромбоцита или бактериальной клетки,

глюкозоаминогликанами, коллагеном, внеклеточными нуклеиновыми кислотами, полифосфатами и т.д [2-4].

ФХ11 также может быть активирован высокомолекулярным кининогеном (HMWK) [17], [18]. Положительно заряженный гистидин-богатый домен HMWK в присутствии ионов цинка опосредует связывание комплекса HMWK-фХП с поверхностью [19,20].

Плазменная концентрация неактивного фХ11 составляет около 0,3 мкМ. В неактивной форме фХ11 представляет собой одноцепочечный пептид массой 80 кДа. ФХ11 состоит из нескольких доменов (рис. 3). Домен, обеспечивающий связывание с отрицательно заряженной поверхностью, а также регуляторные домены расположены на N-конце фактора (52 кДа), а каталитический домен (28 кДа) - на С-конце.

Рисунок 3. Доменная структура фХ11а. Схема доменной структуры фХ11а построена исходя из гомологии аминокослотной последовательности с эпидермальным фактором роста (ЕСР): эпидермальный фактор роста; тип I и тип II домены, гомологичные доменам фибронектина; крингл-домен, аналогичный подобному домену фибронектина. Расщепление фХ11 в результате активации калликреином или автоактивации переводит его в протеолитически активную форму, для которой фХ1 и прекалликреин являются субстратами. С NH2-концом фХ11 могут связываться как эндогенные, так и экзогенные отрицательно заряженные вещества (поверхности).

Независимо от способа активации переход неактивного фактора XII в активный (активированный фактор XII - фХ11а) осуществляется посредством гидролиза пептидной связи между аминокислотными остатками Арг 353 и Вал 354. В результате чего белок разделяется на тяжелую и легкую цепи длиной 353 и 243 аминокислотных остатка, соответственно. Тяжелая и легкая цепи остаются связанными посредством дисульфидной связи между цистеинами 359 и 486 [21]. Так происходит образование альфа-фХПа, который, в свою очередь, связывается с отрицательно заряженной поверхностью и активирует фактор XI (фХ!), а также переводит прекалликреин в калликреин (активная форма). Образовавшийся калликреин активирует фХП с получением альфа-формы, а также переводит альфа- фХП в бета-форму (28 кДа каталитический домен) путем

протеолитического расщепления. Бета-фХ11а не способен активировать фактор XI (следующий фактор в каскаде ферментативных реакций плазменного свертывания), но сохраняет способность активировать калликреин [18].

Увеличение концентрации активных фХ11 и калликреина происходит экспоненциально и сдерживается плазменными ингибиторами, такими как С-1 ингибитор [22,23].

1.2.2. Физиологическая роль фХ11

Образовавшийся в результате активности альфа-фХ11а активный фактор XI (фХ1а) опосредует активацию следующих протеаз в каскаде плазменного свертывания (фактор IX, фактор X и тромбин [24,25]), начиная с фактора IX (ф1Х) (рис. 4). Тромбин расщепляет растворимый плазменный белок фибриноген с образованием фибрина и переводит в активную форму фактор XIII (фХШ). Фибрин полимеризуется с образованием длинных белковых нитей - фибрилл, которые ковалентными сшивками соединяются в сеть активным фХШ. Благодаря формированию пространственной сети фибриновых фибрилл и образуется гелеобразный сгусток [26].

Тем не менее, при повреждении кровеносного сосуда, т.е. в «физиологических» условиях, активация плазменного свертывания происходит по пути тканевого фактора (ТФ) (рис. 4, справа). ТФ или тромбопластин - это трансмембранный гликопротеин, который присутствует на поверхности всех клеток, за исключением клеток крови и эндотелиальных клеток. Таким образом, при повреждении сосуда кровь приходит в контакт с ТФ. Образуется комплекс внешней теназы - ТФ-активный фактор VII (фактор VII (фVII) автоактивируется при взаимодействии с ТФ), который далее активирует факторы IX и X, в результате чего в месте повреждения сосуда формируется фибриновый сгусток [27,28].

Рисунок 4. Схема каскада плазменного свертывания. Слева путь контактной активации (желтые стрелки), справа - путь тканевого фактора (оливковые стрелки), общая часть каскада (зеленые стрелки) по [29] с небольшими изменениями.

Связь между двумя путями запуска плазменного свертывания (контактным путем и путем тканевого фактора) осуществляется через способность альфа - и бета-формы фХ11а активировать фУП [30,31]. При физиологических температурах (около 37 °С) такая активация предотвращается плазменным С1 -ингибитором (С1ШН), который теряет активность вблизи 0 °С. Это объясняет эффект «холодовой» активации свертывания при пониженных температурах.

Еще одна физиологическая роль фХПа заключается в его влиянии на плотность сгустка. Альфа-фХПа может изменять структуру фибринового сгустка, связываясь с фибрином своей тяжелой цепью, что приводит к образованию более плотного сгустка, защищенного от фибринолиза [32]. Кроме того, фХПа опосредованно принимает участие в фибринолизе - процессе деградации фибринового сгустка. Обе (альфа и бета) формы активного фХП способны активировать плазминоген с образованием плазмина - ключевого фермента системы фибринолиза. Плазминоген протеолитически расщепляет фибриновые нити сгустка, что приводит его к деградации [33].

ФХП также вовлечен в ангиогенез - процесс образования новых сосудов. N концевой домен фХП и альфа-фХПа может связываться с рецептором эпидермального фактора роста (БОБЯ), что приводит к его активации и, как следствие, к стимуляции роста эндотелиальных клеток [20].

Вклад контактной активации в поддержании плазменного гемостаза до сих пор не вполне ясен. Дефицит фХП впервые был обнаружен Ратноффом и Колопи в 1955 г в крови Джона Хагемана (в честь которого фXII также называют фактором Хагемана), которая не сворачивалась в стеклянной пробирке [34]. Однако, дефицит фХП не оказывает заметного влияния на гемостаз, а пациенты и экспериментальные животные с дефицитом фХП не страдают от кровотечений [7,35].

1.2.3. Роль контактной активации в патологии

Если участие фXII в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясна, то его участие в патологическом тромбообразовании было показано экспериментально на животных моделях FeQ3-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9]. Мыши с дефицитом фXII (нок-аут по соответствующему гену или животные дикого типа после введения ингибитора фXII) по результатам ногтевого и хвостового кровотечения не отличались от контрольных животных дикого типа, что говорит об отсутствии нарушений гемостаза. В то же время в экспериментах с индуцированным тромбозом мыши, дефицитные по фXII, были частично защищены от развития тромбоза: размер тромба, объем ткани, поврежденной вследствие тромбоза, и смертность были значительно ниже, чем у животных контрольной группы. Повышение концентрации фXII в плазме экспериментальных животных до типичных значений приводило к развитию обширного тромбоза [7]. Выше описанные эксперименты позволяют говорить об участии фXII в патологическом формировании тромбов при гиперкоагуляционных состояниях системы гемостаза

[4].

1.3. Ингибиторы контактной активации 1.3.1. Плазменные ингибиторы фХ11а

Контактная активация свертывания в кровеносном русле блокируется рядом ингибиторов. К ним относятся С1-ингибитор (С1ШН) [23,36], антитромбин (АТ), а2-антитромбин, а2-макроглобулин [37] и гистидин-богатый гликопротеин [38,39].

Антитромбин и С1-ингибитор представляют собой серпины, относящиеся к семейству 104.001 а-1- ингибиторов протеаз [40]. Ингибирование сериновых протеаз серпинами необратимо и происходит с изменением конформации как ингибитора, так и протеазы. К-концевая петля ингибитора заходит в активный сайт протеазы. Далее происходит протеолитический гидролиз пептидной связи в петле ингибитора, что вызывает резкое изменение конформации ингибитора. Такое конформационное изменение приводит к изменению структуры активного центра протеазы, как следствие, гидролиз ацил-фермента не происходит, а ингибитор с протеазой остаются ковалентно связанными [41]. В отличие от С1ШН антитромбину для ингибирования фХПа требуется присутствие кофактора - гепарина [22]. Гепарин - отрицательно заряженный сульфатированный глюкозаминогликан, имеющий специфические АТ -связывающие сайты [42]. Несвязанный с антитромбином гепарин напротив - провоцирует автоактивацию фХП [43]. В экспериментах было показано, С1ШН подавляет активность фХПа при т.н. поверхностной активации каолином или стеклом [44]. Если фХП связывается с поверхностью активированных тромбоцитов (что также вызывает его автоактивацию) или клетками эндотелия, это защищает фХП от ингибирования С1-ингибитором, но не антитромбином [45].

Гистидин-богатый гликопротеин (НЯО), подавляя контактную активацию, действует, предположительно, по другому механизму. Полагают [20,46], что НЯО ингибирует альфа-фХПа через связывание с экзосайтом на его поверхности. Т.к., с одной стороны, связывание гистидин богатого гликопротеина с фХПа в

присутствии ионов Zn2+ улучшается на 3 порядка, а с другой стороны, HRG не проявляет ингибирующей активности в отношении фXIIа при отсутствии гепарина [39], данное взаимодействие, вероятно, как и в случае гепаран-сульфата, происходит через К-концевой цистатин-домен [20,46]. Это подавляет активность альфа-фXIIа в отношении макромолекулярных субстратов, таких как фXII и фXI, но не хромогенного субстрата (олигопептид) [39].

1.3.2. Белковые ингибиторы фХ11а неплазменного происхождения

Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К сериновым протеазам относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. На данный момент в базе данных «MEROPS» зарегистрировано более 50 семейств сериновых протеаз [47]. Эти ферменты участвуют в различных процессах, таких как пищеварение, свертывания крови, оплодотворения, активации комплемента, апоптоз, иммунный ответ и т.д [1]. В частности было показано, что протеазы играют важную роль в приспособительных реакций прокариот к изменениям во внеклеточной среде [1], в питании и проникновение бактерий в клетку-хозяина (инвазии) [48]. Вирулентность многих патогенных бактерий также обеспечивается сериновыми протеазами [49,50]. Вероятно, этим может объясняться такое же широкое распространение ингибиторов сериновых протеаз в природе. Так в базе данных «MEROPS» [47] насчитывается 38 семейств ингибиторов сериновых протеаз, принадлежащих к 20 кланам. Сходство же каталитических сайтов сериновых протеаз позволяет находить ингибиторы факторов свертывания и фXIIa в частности в природных источниках: животных, растительных и бактериальных [51-57]. На данный момент описано 12 неплазменных ингибитора фXIIa, принадлежащие к 5 различным семействам ингибиторов, из которых только один очевидно связан с подавлением свертывания крови - четвертый домен белка инфестин (инфестин 4) из желудка кровососущего насекомого ТИМвша [52]. Другие ингибиторы в

естественной ситуации (в природе) не оказываются в контакте с кровью человека.

Природные белковые ингибиторы фXIIa представляют собой небольшие глобулярные белки с молекулярным весом от 3 до 16 кДа. Т.к. эволюционно данные ингибиторы появились не для выполнения функции подавления свертывания, их селективность по отношению к фХПа не высока, они также подавляют активность других плазменных протез: фХ1а, фХа, ф1Ха и тромбин.

Таким образом, из 12 неплазменных ингибиторов селективно подавляют активность фХ11а только ингибитор трипсина из кукурузы (corn Hageman factor inhibitor, CHFI) и инфестин 4 с константами ингибирования 2,5 нМ [58] и 78 пМ [52], соответственно. Данные ингибиторы подавляют активность протеаз по стандартному механизму [10], который будет рассмотрен подробнее.

1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз

Канонические ингибиторы сериновых протеаз, такие как СНБ1 и инфестин-4, действуют по стандартному механизму [10]. При этом ингибитор входит в протеазу, как ключ в замок (рис. 5). Канонические ингибиторы взаимодействуют с протеазой своей протеаза связывающей петлей. Петля входит в каталитический сайт протеазы, подобно субстрату и связывается там с теми же субсайтами (81, ...,83, 82, 81, 81', 82', 83', ... 8^), что и субстрат (рис. 1). Аминокислотные остатки ингибитора, которые связываются с субсайтами, обозначают так же, как и у субстрата (Ръ ...Л, Р2, Р1, Р1', Р2', Р3', ... Pj') [11].

Рисунок 5. Схема связывания канонического ингибитора с сериновой протеазой. Ингибитор связывается с активным сайтом фермента в субстрат -подобным образом. Боковые цепи аминокислотных остатков выступающей петли ингибитора связываются с субсайтами и каталитическим серином в активном сайте ингибитора. По [12] с незначительными изменениями.

Когда канонический ингибитор связывается с сериновой протеазой, а его петля заходит в каталитический сайт, связь Р1-Р1' подвергается гидролизу. Однако, гидролиз проходит очень медленно, а продукты реакции не

высвобождаются, в результате пептидная связь Р1-Р1' в петле ингибитора может быть восстановлена [13,59]. Важно отметить, что и гидролизованный (двухцепочечный) канонический ингибитор способен подавлять активность сериновой протеазы [10].

Рассмотрим подробнее строение протеаза связывающей петли. У канонических ингибиторов она значительно выступает из белкового скаффолда и представляет собой довольно простой мотив. Собственно эпитоп формируется шестью аминокислотными остатками Р3 - Р3', которые и связываются с активным сайтом протеазы. Аминокислотные остатки, более удаленные от расщепляемой связи Р1- Р1' (Р6 - Р4 и Р4'- Р6') могут формировать т.н. контактный регион, который также может вносить значительный вклад в энергию связывания ингибитора с протеазой [60-62].

Важно подчеркнуть, что у канонических ингибиторов, в отличие от ингибиторов сериновых протеаз другого типа: неканонических и серпинов (механизм работы серпинов описан в разделе 1.3.1.),- взаимодействие с протеазой происходит только через протеаза-связывающую петлю, при этом вторичные сайты связывания за пределами каталитического сайта протеазы не формируются (рис.6). Интересно, что ингибиторы Казаля с нарушенной конформацией протеаза-связывающей петли связываются с протеазой так же, как неканонические ингибиторы: связываются с каталитическим сайтом, но при этом формируют дополнительные сайты связывания с другими частями протеазы. Этими вторичными сайтами во многом определяется энергия связывания и специфичность данных ингибиторов [63].

Рисунок 6. Примеры комплексов "сериновая протеаза:ингибитор" для ингибиторов различных типов: канонический, неканонический и серпин. Протеаза-связывающая петля и боковая цепь Р1-аминокислотного остатка СМТ1 и альфа-1-антитрипсина, а также вконец орнитодорина показаны красным цветом, вторичные сайты связывания орнитодорина - оранжевым. Элементы вторичной структуры окрашены синим (бета-слои) и зеленым (альфа-спирали). По [63] с незначительными изменениями

Аминокислотные последовательности протеаза-связывающих петель канонических ингибиторов значительно варьируют, за исключением представителей двух семейств [64,65], однако при этом конформация петли остается канонической (рис. 7).

Рисунок 7. Суперпозиция основной цепи протеаза-связывающих петель (участок Р3-Р3') [63]: OMSVP3 (PDB: 2OVO) - светло-серый; SSI (3SSI) -серый и BPTI (PDB: 5PTI) - темно-серый.

Даже после расщепления конформация протеаза-связывающей петли остается практически неизменной, за исключением локальных структурных изменений около разрушенной пептидной связи Рг - Р^ [66,67]. Подвижность расщепленной петли также повышается, однако структура белка в целом остается неизменной [68,69].

1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы

Ингибитор трипсина из кукурузы (corn trypsin inhibitor / Corn Hageman factor inhibitor, CHFI) -канонический ингибитор сериновых протеаз с молекулярным весом 14 кДа. CHFI принадлежит к семейству злаковых ингибиторов сериновых протеаз I6, согласно классификации «MEROPS» [47]. Зрелый белок состоит из 127 аминокислотных остатков. Как и другие канонические ингибиторы, CHFI взаимодействует с протеазами посредством выступающей протеаза-связывающей петли. Пептидная связь Pi-Pi' у данного ингибитора находится междуАрг34 и Лей35 [70]. Согласно данным рентгенно-структурного анализа [71], CHFI имеет протеаза-связывающую петлю типичной формы, замкнутую дисульфидной связью между цистеинами 20 и 44 (рис. 8 ).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Корнеева Вера Анатольевна, 2015 год

Список литературы

1. Tripathi L.P., Sowdhamini R. Genome-wide survey of prokaryotic serine proteases: analysis of distribution and domain architectures of five serine protease families in prokaryotes. // BMC Genomics. 2008. Vol. 9. P. 549.

2. Smith S.A. et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 4. P. 903-908.

3. Kannemeier C. et al. Extracellular RNA constitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 15. P. 6388-6393.

4. Renne T. The procoagulant and proinflammatory plasma contact system. // Semin. Immunopathol. 2012. Vol. 34, № 1. P. 31-41.

5. Nossel H.L. et al. Inhibition of Hageman factor activation. // J. Clin. Invest. 1968. Vol. 47, № 5. P. 1172-1180.

6. Hsu L.C. Heparin-coated cardiopulmonary bypass circuits: current status. // Perfusion. 2001. Vol. 16, № 5. P. 417-428.

7. Renne T. et al. Defective thrombus formation in mice lacking coagulation factor XII. // J. Exp. Med. 2005. Vol. 202, № 2. P. 271-281.

8. Yau J.W. et al. Selective depletion of factor XI or factor XII with antisense oligonucleotides attenuates catheter thrombosis in rabbits. // Blood. 2014.

9. Leung P.Y. et al. Inhibition of Factor XII-Mediated Activation of Factor XI Provides Protection Against Experimental Acute Ischemic Stroke in Mice. // Transl. Stroke Res. 2012. Vol. 3, № 3. P. 381-389.

10. Laskowski Jr. M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Annu Rev Biochem. 1980/01/01 ed. 1980. Vol. 49. P. 593-626.

11. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. Vol. 27, № 2. P. 157-162.

12. Farady C.J., Craik C.S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors. // Chembiochem. 2010. Vol. 11, № 17. P. 2341-2346.

13. Zakharova E., Horvath M.P., Goldenberg D.P. Structure of a serine protease poised to resynthesize a peptide bond. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 27. P. 11034-11039.

14. Dodson G. Catalytic triads and their relatives // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23, № 9. P. 347-352.

15. Frey P., Whitt S., Tobin J. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases // Science (80-. ). 1994. Vol. 264, № 5167. P. 1927-1930.

16. Warshel A., Papazyan A. Energy considerations show that low-barrier hydrogen bonds do not offer a catalytic advantage over ordinary hydrogen bonds. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. Vol. 93, № 24. P. 13665-13670.

17. Ratnoff O.D., Davie E.W., Mallett D.L. Studies on the action of Hageman factor: evidence that activated Hageman factor in turn activates plasma thromboplastin antecedent. // J. Clin. Invest. 1961. Vol. 40, № 15. P. 803-819.

18. Fuhrer G. et al. FXII. // Blut. 1990. Vol. 61, № 5. P. 258-266.

19. Mutch N.J., Waters E.K., Morrissey J.H. Immobilized transition metal ions stimulate contact activation and drive factor Xll-mediated coagulation. // J. Thromb. Haemost. 2012. Vol. 10, № 10. P. 2108-2115.

20. Vanwildemeersch M. et al. The anti-angiogenic His/Pro-rich fragment of histidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate in a Zn2+-dependent manner. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 15. P. 10298-10304.

21. McMullen B.A., Fujikawa K. Amino acid sequence of the heavy chain of human alpha-factor Xlla (activated Hageman factor). // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 9. P. 5328-5341.

22. Ratnoff O.D. Studies on the inhibition of ellagic acid-activated Hageman factor (factor XII) and Hageman factor fragments. // Blood. 1981. Vol. 57, № 1. P. 5558.

23. De Agostini A. et al. Inactivation of factor XII active fragment in normal plasma. Predominant role of C-1-inhibitor. // J. Clin. Invest. 1984. Vol. 73, № 6. P. 15421549.

24. Akiyama H. et al. Mechanism of activation of coagulation factor XI by factor XIIa studied with monoclonal antibodies. // J. Clin. Invest. 1986. Vol. 78, № 6. P. 1631-1637.

25. Di Scipio R.G., Kurachi K., Davie E.W. Activation of human factor IX (Christmas factor). // J. Clin. Invest. 1978. Vol. 61, № 6. P. 1528-1538.

26. Muszbek L. et al. Factor XIII: a coagulation factor with multiple plasmatic and cellular functions. // Physiol. Rev. 2011. Vol. 91, № 3. P. 931-972.

27. Hoffman M., Monroe D.M. A cell-based model of hemostasis. // Thromb. Haemost. 2001. Vol. 85, № 6. P. 958-965.

28. Davie E.W., Fujikawa K. Basic mechanisms in blood coagulation. // Annu. Rev. Biochem. 1975. Vol. 44. P. 799-829.

29. Anisuzzaman et al. Longistatin, a plasminogen activator, is key to the availability of blood-meals for ixodid ticks. // PLoS Pathog. 2011. Vol. 7, № 3. P. e1001312.

30. Stormorken H., Gjoennaess H., Laake K. Interrelations between the clotting and kinin systems. Activation of factor VII involving prekallikrein-kallikrein. A review. // Haemostasis. 1973. Vol. 2, № 6. P. 245-252.

31. Suontaka A.M. et al. Occurrence of cold activation of transfusion plasma during storage at +4 degrees C. // Vox Sang. 2005. Vol. 88, № 3. P. 172-180.

32. Konings J. et al. Factor XIIa regulates the structure of the fibrin clot independently of thrombin generation through direct interaction with fibrin. // Blood. 2011. Vol. 118, № 14. P. 3942-3951.

33. Ichinose A., Fujikawa K., Suyama T. The Activation of Pro-urokinase by Plasma Kallikrein and Its Inactivation by Thrombin // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 3486-3489.

34. Ratnoff O.D., Colopy J.E. A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction of plasma. // J. Clin. Invest. 1955. Vol. 34, № 4. P. 602-613.

35. Lammle B. et al. Thromboembolism and bleeding tendency in congen ital factor XII deficiency--a study on 74 subjects from 14 Swiss families. // Thromb. Haemost. 1991. Vol. 65, № 2. P. 117-121.

36. Wagenaar-Bos I.G. a, Hack C.E. Structure and function of C1-inhibitor. // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2006. Vol. 26, № 4. P. 615-632.

37. Pixley R. a, Schapira M., Colman R.W. The regulation of human factor XIIa by plasma proteinase inhibitors. // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 3. P. 1723-1729.

38. Vestergaard A.B. et al. Histidine-rich glycoprotein inhibits contact activation of blood coagulation. // Thromb. Res. 1990. Vol. 60, № 5. P. 385-396.

39. MacQuarrie J.L. et al. Histidine-rich glycoprotein binds factor Xlla with high affinity and inhibits contact-initiated coagulation. // Blood. 2011. Vol. 117, № 15. P. 4134-4141.

40. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № Database issue. P. D343-D350.

41. Huntington J. a, Read R.J., Carrell R.W. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. // Nature. 2000. Vol. 407, № 6806. P. 923-926.

42. Sanchez J. et al. Control of contact activation on end-point immobilized heparin: the role of antithrombin and the specific antithrombin-binding sequence. // J. Biomed. Mater. Res. 1995. Vol. 29, № 5. P. 655-661.

43. Sanchez J. et al. Studies of adsorption, activation, and inhibition of factor XII on immobilized heparin. // Thromb. Res. 1998. Vol. 89, № 1. P. 41-50.

44. Bäck J. et al. Distinctive regulation of contact activation by antithrombin and C1-inhibitor on activated platelets and material surfaces. // Biomaterials. 2009. Vol. 30, № 34. P. 6573-6580.

45. Schousboe I. Binding of activated Factor XII to endothelial cells affects its inactivation by the C1-esterase inhibitor. // Eur. J. Biochem. 2003. Vol. 270, № 1. P. 111-118.

46. Simantov R. et al. Histidine-rich glycoprotein inhibits the antiangiogenic effect of thrombospondin-1. // J. Clin. Invest. 2001. Vol. 107, № 1. P. 45-52.

47. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors // Nucleic Acids Res. 2011/11/17 ed. 2012. Vol. 40, № Database issue. P. D343-D350.

48. Cheng Q. The Group B Streptococcal C5a Peptidase Is Both a Specific Protease and an Invasin // Infect. Immun. 2002. Vol. 70, № 5. P. 2408-2413.

49. Makinoshima H., Glickman M.S. Site-2 proteases in prokaryotes: regulated intramembrane proteolysis expands to microbial pathogenesis. // Microbes Infect. 2006. Vol. 8, № 7. P. 1882-1888.

50. Carruthers V.B., Blackman M.J. A new release on life: emerging concepts in proteolysis and parasite invasion. // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 55, № 6. P. 16171630.

51. Krishnamoorthi R., Gong Y.X., Richardson M. A new protein inhibitor of trypsin and activated Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds. // FEBS Lett. 1990. Vol. 273, № 1-2. P. 163-167.

52. Campos I.T.N. et al. Infestin, a thrombin inhibitor presents in Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector: gene clonin g, expression and characterization of the inhibitor. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. Vol. 32, № 9. P. 991-997.

53. Delaria K.A. et al. Characterization of placental bikunin, a novel human serine protease inhibitor. // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, № 18. P. 12209-12214.

54. Earl S.T.H. et al. Identification and characterisation of Kunitz-type plasma kallikrein inhibitors unique to Oxyuranus sp. snake venoms. // Biochimie. 2012. Vol. 94, № 2. P. 365-373.

55. Oliva M.L. et al. Leucaena leucocephala serine proteinase inhibitor: primary structure and action on blood coagulation, kinin release and rat paw edema. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477, № 1-2. P. 64-74.

56. Hayashi K. et al. Inhibition of serine proteases of the blood coagulation system by squash family protease inhibitors. // J. Biochem. 1994. Vol. 116, № 5. P. 10131018.

57. Ulmer J.S. et al. Ecotin is a potent inhibitor of the contact system proteases factor Xlla and plasma kallikrein. // FEBS Lett. 1995. Vol. 365, № 2 -3. P. 159-163.

58. Hazegh-Azam M. et al. The corn inhibitor of activated Hageman factor: purification and properties of two recombinant forms of the protein. // Protein Expr. Purif. 1998. Vol. 13, № 2. P. 143-149.

59. Luthy J.A. et al. Detailed mechanism of interaction of bovine -trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz). I. Stopped flow measurements. // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, № 5. P. 1760-1771.

60. Buczek O. et al. Analysis of serine proteinase-inhibitor interaction by alanine shaving. // Protein Sci. 2002. Vol. 11, № 4. P. 806-819.

61. Laskowski M., Qasim M.A. What can the structures of enzyme -inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477, № 1-2. P. 324-337.

62. Ardelt W., Laskowski M. Effect of single amino acid replacements on the thermodynamics of the reactive site peptide bond hydrolysis in ovomucoid third domain. // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 220, № 4. P. 1041-1053.

63. Krowarsch D. et al. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell Mol Life Sci. 2003/11/20 ed. 2003. Vol. 60, № 11. P. 2427-2444.

64. Nielsen K.J. et al. An 1H NMR determination of the three-dimensional structures of mirror-image forms of a Leu-5 variant of the trypsin inhibitor from Ecballium elaterium (EETI-II). // Protein Sci. 1994. Vol. 3, № 2. P. 291-302.

65. Beuning L.L., Spriggs T.W., Christeller J.T. Evolution of the proteinase inhibitor I family and apparent lack of hypervariability in the proteinase contact loop. // J. Mol. Evol. 1994. Vol. 39, № 6. P. 644-654.

66. Betzel C. et al. Structure of the proteinase inhibitor eglin c with hydrolysed reactive centre at 2.0 A resolution. // FEBS Lett. 1993. Vol. 317, № 3. P. 185-188.

67. Shaw G.L. et al. Backbone dynamics of chymotrypsin inhibitor 2: effect of breaking the active site bond and its implications for the mechanism of inhibition of serine proteases. // Biochemistry. 1995. Vol. 34, № 7. P. 2225-2233.

68. Liu J. et al. Internal mobility of reactive-site-hydrolyzed recombinant Cucurbita maxima trypsin inhibitor-V characterized by NMR spectroscopy: evidence for differential stabilization of newly formed C- and N-termini. // Biochemistry. 1996. Vol. 35, № 38. P. 12503-12510.

69. Krishnamoorthi R., Lin C.L., VanderVelde D. Structural consequences of the natural substitution, E9K, on reactive-site-hydrolyzed squash (Cucurbita maxima) trypsin inhibitor (CMTI), as studied by two-dimensional NMR. // Biochemistry. 1992. Vol. 31, № 21. P. 4965-4969.

70. Mahoney W.C. et al. Amino acid sequence and secondary structural analysis of the corn inhibitor of trypsin and activated Hageman Factor // J Biol Chem. 1984/07/10 ed. 1984. Vol. 259, № 13. P. 8412-8416.

71. Behnke C.A. et al. Structural determinants of the bifunctional corn Hageman factor inhibitor: x-ray crystal structure at 1.95 A resolution // Biochemistry. 1998/11/04 ed. 1998. Vol. 37, № 44. P. 15277-15288.

72. Wang Y. et al. Cn3D: sequence and structure views for Entrez. // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25, № 6. P. 300-302.

73. Hojima Y., Pierce J. V, Pisano J.J. Hageman factor fragment inhibitor in corn seeds: purification and characterization. // Thromb. Res. 1980. Vol. 20, № 2. P. 149-162.

74. Swartz M.J. et al. Isolation and characterization of trypsin inhibitor from opaque-2 corn seeds // J Biol Chem. 1977/11/25 ed. 1977. Vol. 252, № 22. P. 8105-8107.

75. Burkhard R.K. et al. Thermodynamic measurements on the interaction of porcine trypsin with single- and two-chain trypsin inhibitors from corn seeds // J Agric Food Chem. 1979/03/01 ed. 1979. Vol. 27, № 2. P. 452-454.

76. Lei M.G., Reeck G.R. Resynthesis by factor Xlla of the trypsin-cleaved peptide bond in the corn protease inhibitor // Thromb Res. 1987/01/01 ed. 1987. Vol. 45, № 1. P. 87-94.

77. Li J. et al. A small trypsin inhibitor from the frog of Odorrana grahami // Biochimie. 2008/05/13 ed. 2008. Vol. 90, № 9. P. 1356-1361.

78. Li J. et al. Multiple bombesin-like peptides with opposite functions from skin of Odorrana grahami // Genomics. 2007/01/06 ed. 2007. Vol. 89, № 3. P. 413-418.

79. Ho S.N. et al. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. 1989/04/15 ed. 1989. Vol. 77, № 1. P. 51-59.

80. Froger A., Hall J.E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method // J Vis Exp. 2008/11/11 ed. 2007. № 6. P. 253.

81. Berman H.M. et al. The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, № 1. P. 235-242.

82. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: visual molecular dynamics. // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, № 1. P. 33-38, 27-28.

83. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. // Biopolymers. 1983. Vol. 22, № 12. P. 2577-2637.

84. Phillips J.C. et al. Scalable molecular dynamics with NAMD // J Comput Chem. 2005. Vol. 26, № 16. P. 1781-1802.

85. Best R.B. et al. Optimization of the additive CHARMM all-atom protein force field targeting improved sampling of the backbone phi, psi and side-chain chi(1) and chi(2) dihedral angles // J Chem Theory Comput. 2012. Vol. 8, № 9. P. 32573273.

86. V. Sadovnichy Vl. Voevodin, and V. Opanasenko A.T. "Lomonosov": Supercomputing at Moscow State University. In Contemporary High Performance Computing: From Petascale toward Exascale (Chapman & Hall/CRC Computational Science) // CRC Press. Boca Raton, USA. 2013. P. 283-307.

87. Boratyn G.M. et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, № Web Server issue. P. W29-W33.

88. Consortium T.U. Update on activities at the Universal Protein Resource (UniProt) in 2013. // Nucl Acids Res. 2013. Vol. 41. P. 43-47.

89. Wu Y. et al. Structural insight into distinct mechanisms of protease inhibition by antibodies // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. Vol. 104, № 50. P. 19784-19789.

90. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // J. Mol. Biol. 1993. Vol. 234, № 3. P. 779-815.

91. Comeau S.R. et al. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № Web Server issue. P. W96-W99.

92. Comeau S.R. et al. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes // Bioinformatics. 2004. Vol. 20, № 1. P. 4550.

93. Raveh B., London N., Schueler-Furman O. Sub-angstrom modeling of complexes between flexible peptides and globular proteins // Proteins. 2010. Vol. 78, № 9. P. 2029-2040.

94. London N. et al. Rosetta FlexPepDock web server--high resolution modeling of peptide-protein interactions // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39, № Web Server issue. P. W249-W253.

95. Fradera X. et al. High-resolution crystal structures of factor XIa coagulation factor in complex with nonbasic high-affinity synthetic inhibitors // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2012. Vol. 68, № Pt 4. P. 404-408.

96. Chelliah V., Blundell T.L., Fernández-Recio J. Efficient restraints for proteinprotein docking by comparison of observed amino acid substitution patterns with those predicted from local environment. // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 357, № 5. P. 1669-1682.

97. Kozakov D. et al. How good is automated protein docking? // Proteins. 2013. Vol. 81, № 12. P. 2159-2166.

98. Cheng T.M., Blundell T.L., Fernandez-Recio J. pyDock: electrostatics and desolvation for effective scoring of rigid-body protein-protein docking // Proteins.

2007. Vol. 68, № 2. P. 503-515.

99. Jimenez-Garcia B., Pons C., Fernandez-Recio J. pyDockWEB: a web server for rigid-body protein-protein docking using electrostatics and desolvation scoring // Bioinformatics. 2013. Vol. 29, № 13. P. 1698-1699.

100. Bao W.-J. et al. Highly efficient expression and purification system of small-size protein domains in Escherichia coli for biochemical characterization. // Protein Expr. Purif. 2006. Vol. 47, № 2. P. 599-606.

101. Dahl A.C., Chavent M., Sansom M.S. Bendix: intuitive helix geometry analysis and abstraction // Bioinformatics. 2012. Vol. 28, № 16. P. 2193-2194.

102. McBride J.D. et al. Peptide mimics of the Bowman-Birk inhibitor reactive site loop // Biopolymers. 2002/09/27 ed. 2002. Vol. 66, № 2. P. 79-92.

103. Brauer A.B. et al. The (1)H-NMR solution structure of the antitryptic core peptide of Bowman-Birk inhibitor proteins: a minimal canonical loop // J Biomol Struct Dyn. 2002/07/30 ed. 2002. Vol. 20, № 1. P. 59-70.

104. Mucsi Z. et al. Structure-oriented rational design of chymotrypsin inhibitor models // Protein Eng. 2003/10/16 ed. 2003. Vol. 16, № 9. P. 673-681.

105. Chen Z.Y. et al. Inhibition of plant-pathogenic fungi by a corn trypsin inhibitor overexpressed in Escherichia coli // Appl Env. Microbiol. 1999/03/02 ed. 1999. Vol. 65, № 3. P. 1320-1324.

106. Tu B.P., Weissman J.S. Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences // J Cell Biol. 2004/02/06 ed. 2004. Vol. 164, № 3. P. 341-346.

107. Toledano M.B. et al. The system biology of thiol redox system in Escherichia coli and yeast: differential functions in oxidative stress, iron metabolism and DNA synthesis // FEBS Lett. 2007/07/31 ed. 2007. Vol. 581, № 19. P. 3598-3607.

108. Salinas G. et al. Tuned Escherichia coli as a host for the expression of disulfide-rich proteins // Biotechnol J. 2011/05/14 ed. 2011. Vol. 6, № 6. P. 686-699.

109. Faulkner M.J. et al. Functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways // Proc Natl Acad Sci U S A. 2008/05/06 ed.

2008. Vol. 105, № 18. P. 6735-6740.

Список сокращений и обозначений

C1INH С1-ингибитор

CHFI ингибитора трипсина из кукурузы (corn trypsin/factor XIIa inhibitor

EGF эпидермальным фактором роста

HEPES 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновая кислота

HMWK высокомолекулярным кининогеном

HRG Гистидин-богатый гликопротеин

OD оптическая плотность (optical density)

АТ Антитромбин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

МД молекулярная динамика

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР полимеразная цепная реакция

т.н. так называемый

ТФ тканевый фактор

фУП фактор VII

фХ1 фактора XI

фХ1а активированный фактор XI

фХ11 фактора XII

фХПа активированный фактор XII

фХШ фактор XIII

фХШа активированный фактор XIII