Иммунологические аспекты диагностики и прогноза течения возрастной макулярной дегенерации и диабетической ретинопатии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Марных Сергей Анатольевич

• Марных Сергей Анатольевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Марных Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Патогенез диабетической ретинопатии

1.1. Роль хронического воспаления, полиольного пути, протеинкиназы С и ростовых факторов в развитии микрососудистых осложнений сахарного диабета

1.2. Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры

прогрессирования диабетической ретинопатии

Глава 2. Иммунные механизмы возрастной макулярной

дегенерации

2.1. Основные факторы патогенеза возрастной макулярной дегенерации

2.2. Система комплемента и возрастная макулярная дегенерация

2.3. Роль паравоспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации

2.4. Активация инфламмасом при возрастной макулярной дегенерации

2.5. Системные иммунологические маркеры прогрессирования возрастной

макулярной дегенерации

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Изменения системных иммунологических показателей у больных диабетической ретинопатией

1.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных диабетической ретинопатией

1.2. Концентрации ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией

ретинопатией

Глава 2. Изменения системных иммунологических показателей у больных возрастной макулярной дегенерацией

2.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2.2. Концентрации ТЫ/^2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ЛИТЕРАТУРА

ВМД - возрастная макулярная дегенерация

ДАГ - диацилглицерин

ДР - диабетическая ретинопатия

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

МКА - моноклональные антитела

МПК - мононуклеары периферической крови

СД - сахарный диабет

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

AGE - конечные продукты гликирования

CRP - C-реактивный белок

FITC - флюоресцеинизотиоцианат

Flt-3L - лиганд Flt-3

HbAlc - гликированный гемоглобин

IGF-1 - инсулиноподобный ростовой фактор-1

IL-1Ra - антагонист рецептора интерлейкина-1

IP-10 - интерферон-гамма-индуцированный белок-10

MCP-1 - моноцитарный хемоаттрактантный белок-1

MIP-1 - макрофагальный воспалительный белок-1

NK - естественные киллеры

NKT - естественные киллерные Т-клетки

NLR - NOD-подобные рецепторы

PBS - фосфатно-солевой буфер

PE - фикоэритрин

PKC - протеинкиназа C

RANTES - хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации

RAGE - рецепторы конечных продуктов гликирования sCD40L - растворимая формы лиганда CD40 sIL-2R - растворимая форма рецептора интерлейкина-2 SNP - единичный нуклеотидный полиморфизм Th - T-хелперы

TLR - Toll-подобные рецепторы

TNFR2 - рецептор-2 к фактору некроза опухоли

Tr1 - регуляторные Т-клетки, продуцирующие интрлейкин-10

Treg - регуляторные Т-клетки

VCAM-1 - молекула адгезии сосудистых клеток

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Сахарный диабет (СД) и его осложнения стремительно врываются в ряд наиболее значимых причин заболеваемости и смертности в мире [Дедов И.И. и др. 2011; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2003; Sayin N. et al, 2015]. Распространённость СД быстро растет как в развитых, так и развивающихся странах, и может достичь масштабов эпидемии в ближайшем будущем [Whiting D.R. et al, 2011]. Этим заболеванием страдает более 240 миллионов человек во всем мире, а к 2030 году это число, по прогнозам специалистов, достигнет 370 миллионов [International Diabetes Federation, 2011].

Одним из наиболее частых осложнений СД являются поражения глаз, такие как диабетическая ретинопатия (ДР), диабетическая папиллопатия, глаукома и катаракта [Threatt J. et al, 2013]. ДР является наиболее распространенным микрососудистым осложнением СД и постепенно трансформируется в основную причину слепоты у работающего населения [Дедов И.И., 2001; Aiello L.M., 2003]. Среди больных СД 1 и 2 типов с длительностью заболевания более двадцати лет распространенность ДР составляет 95% и 60%, соответственно [Garg S., Davis R.M., 2009]. Вместе с тем при СД 2 типа отмечают более высокий процент пациентов с потерей зрения [Kumari S. et al, 2008]. В течение 10 лет примерно у 64% людей с исходной ДР развиваются более тяжелые формы заболевания, а у 17% -пролиферативная ДР, при которой существенно увеличивается риск ухудшения зрения и слепоты [Klein R., 2008].

Патогенез ДР тесно связан с гипергликемией, которая запускает каскад

событий, ведущий к нарушению функции эндотелия сосудов и

нейродегенерации [Heng L.Z. et al, 2013]. В качестве важнейших механизмов

прогрессирования ДР рассматриваются неоваскуляризация, хроническое

окислительное повреждение, хроническое воспаление и лейкостаз [Tarr J.M.

et al, 2013]. Эти процессы связаны или, по крайней мере, сопровождаются не

только местными, но и системными иммунными расстройствами [Ahsan H.,

6

2015]. Достаточно четко описан ряд иммунопатологических событий, лежащих в основе развития пролиферативной ДР, в частности повышение внутриглазных концентраций ростовых факторов, растворимых форм молекул межклеточной адгезии, некоторых хемокинов и провоспалительных цитокинов [Chernykh V.V. et al, 2015; Jonas J.B. et al, 2010]. Однако информация о том, могут ли системные иммунологические показатели отражать неоангиогенез и нейродегенеративные процессы в сетчатке, крайне противоречива [Караулов А.В. и др., 2006; Караулов А.В. и др., 2008] и не позволяет выделить четкие критерии ранней диагностики и прогноза развития пролиферативной формы этого заболевания.

Рост средней продолжительности жизни неминуемо оказывает влияние на увеличение распространённости заболеваний, связанных с пожилым возрастом, в частности возрастной макулярной дегенерации (ВМД) [Khandhadia S. et al, 2012]. ВМД является одной из ведущих причин слепоты в развитых странах, уступая в этом отношении только катаракте и глаукоме и обусловливая 8,7% всех зарегистрированных случаев потери зрения [Resnikoff S. et al, 2004]. В настоящее время выделяют сухую и влажную формы ВМД [Cheung L.K., Eaton A., 2013]. Ключевыми событиями на ранних этапах этого заболевания являются накопление экстрацеллюлярных депозитов, так называемых друз, между мембраной Бруха и пигментным эпителием сетчатки и атрофия последнего, что соответствует сухой форме ВМД [Jager R.D. et al, 2008]. Появление участков хориоидальной неоваскуляризации, сопровождающееся экссудацией и расширением зоны поражения, характеризует развитие влажной формы ВМД, при которой многие патогенетические процессы становятся необратимыми [Zarbin M.A., 2004]. Достаточно большое число работ посвящено изучению иммунных механизмов патогенеза ВМД. Показано, что развитие влажной ВМД ассоциировано с повышением внутриглазных концентраций ряда хемокинов, растворимых форм молекул адгезии [Jonas J.B. et al, 2010], фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [Ng E.W., Adamis A.P., 2005] и некоторых

7

провоспалительных цитокинов [Jonas J.B. et al, 2012]. Вместе с тем данные о системных иммунологических сдвигах, отражающих прогрессирование ВМД, менее однозначны [Караулов А.В. и др., 2007, Караулов А.В. и др., 2009].

VEGF рассматривается как основной ангиогенный регулятор хориоидальной неоваскуляризации [Leung D.W. et al, 1989] и важный фактор, увеличивающий проницаемость сосудов при ВМД [Keck P.J. et a!, 1989; Senger D.R. et al, 1990]. Успехи последних лет в лечении влажной формы заболевания связаны с внедрением в клиническую практику анти-VEGF-препаратов [Campa C., Harding S.P., 2011]. Однако эти средства имеют ограниченный потенциал в плане улучшения зрения пациентов. В этой связи выявление новых и уточнение раннее описанных иммунных механизмов прогрессирования ВМД имеет большое практическое значение и с точки зрения разработки патогенетически обоснованных методов лечения, обеспечивающих восстановление зрения [Ishikawa M., 2015].

В поиске критериев ранней диагностики пролиферативной ДР и влажной ВМД мы придерживались единого алгоритма, ориентируясь на наиболее важные и интегральные системные иммунологические показатели: иммунофенотип лимфоцитов, концентрации в сыворотке крови цитокинов, характеризующих функцию хелперных/регуляторных субпопуляций CD4+-клеток, а также растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток.

Цель работы - установить особенности системных иммунологических сдвигов при разных формах диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа и возрастной макулярной дегенерации для выявления лабораторных критериев прогрессирования этих глазных болезней.

Задачи исследования:

1) Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных СД 2 типа с препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией.

2) Определить концентрации ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови у больных СД 2 типа с препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией.

3) Изучить уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови у больных СД 2 типа с разными формами диабетической ретинопатии.

4) Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных сухой и влажной возрастной макулярной дегенерацией.

5) Изучить концентрации ТЫ/ТИ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных сухой и влажной возрастной макулярной дегенерацией.

6) Определить уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови пациентов с разными формами возрастной макулярной дегенерации.

7) Выявить дополнительные иммунологические критерии диагностики и прогноза развития пролиферативной диабетической ретинопатии и влажной формы возрастной макулярной дегенерации. Научна новизна

Модернизированы представления о характере изменений ряда системных иммунологических показателей при различных формах ДР у больных СД 2 типа и ВМД:

1) иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови;

2) концентрации цитокинов, характеризующих функцию хелперных/регуляторных субпопуляций СВ4+-клеток, в сыворотке крови;

3) уровня растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови.

Выявлены новые иммунологические критерии прогрессирования ДР: снижение в периферической крови числа СЭ25+-лимфоцитов, повышение количества СЭ95 - и -клеток, а также содержания бНЬЛ-1 и бСВ8 в

сыворотке крови.

Установлены новые иммунологические маркеры развития влажной ВМД: увеличение в периферической крови количества СЭ3+-, СЭ8+- и СВ38+-лимфоцитов, а также содержания бСВ25 и бСВ54. Практическая значимость работы

Практическая ценность работы состоит в формулировке четких рекомендаций по мониторингу системных иммунологических показателей у больных препролиферативной ДР для оптимизации раннего выявления прогрессирования заболевания с развитием его пролиферативной формы.

Кроме того, установлены наиболее информативные системные иммунологические критерии, дополняющие и облегчающие своевременную верификацию влажной формы ВМД, что имеет высокий потенциал для практического использования.

Работа имеет практическую ценность и в связи с тем, что ее результаты могут предопределить рациональный поиск эффективных средств патогенетической, в том числе специфической, иммунотерапии ДР и ВМД. Положения, выносимые на защиту:

1) В периферической крови больных ДР выявлены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания хелперных/регуляторных цитокинов и растворимых форм мембранных антигенов, отражающие разные клинические фенотипы заболевания.

2) Установлены изменения иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови, уровня ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов и растворимых форм мембранных антигенов, характерные для сухой и влажной ВМД.

3) Мониторинг ряда системных иммунологических показателей у больных препролиферативной ДР может использоваться для раннего выявления прогрессирования заболевания и прогноза развития его пролиферативной формы.

4) У больных сухой ВМД дополнительным предиктором прогрессирования заболевания с развитием его влажной формы является рост

в периферической крови количества СБ3+-, СБ8+- и СБ38+-лимфоцитов, а также содержания бСВ25 и бСВ54. Личный вклад автора

Автор лично сформулировал цель и задачи работы, подобрал адекватные методы для решения поставленных задач, провел анализ данных литературы по теме диссертации, выполнял клинико-инструментальные исследования и наблюдение за всеми включенными в работу пациентами, осуществлял отбор образцов крови, принимал непосредственное участие в изучении иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови, а также содержания цитокинов и растворимых форм мембранных молекул, лично провел математическую обработку и интерпретацию результатов диссертационной работы, сформулировал выводы и практические рекомендации. Отдельные исследования проведены совместно с сотрудниками НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина (г. Москва) и НИИ молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского (г. Нижний Новгород). Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на на 10-й Научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Офтальмоиммунология: итоги и перспективы» (Москва, 2007), Юбилейной конференции КБ № 85 ФМБА России «60 лет в науке и практике» (Москва, 2008), 5-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2008), Всемирном форуме по иммунорегуляции (Давос, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Иммунопатология и иммунореабилитация: от теории к практике» (Пенза, 2015).

Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры

клинической иммунологии и аллергологии и кафедры микробиологии,

11

вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России 13 мая 2015 года. Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунологические аспекты диагностики и прогноза течения возрастной макулярной дегенерации и диабетической ретинопатии»

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Список литературы содержит 36 отечественных и 103 иностранных источников. Материалы диссертации изложены на 106 страницах машинописного текста и включают 52 рисунка, 4 схемы и 3 таблицы.

1.1. Роль хронического воспаления, полиольного пути, протеинкиназы С и ростовых факторов в развитии микрососудистых осложнений

сахарного диабета

Воспаление играет ключевую роль в развитии микрососудистых осложнений СД, в том числе ДР [Nguyen D.V. et al, 2012]. При СД в различных биологических образцах пациентов выявляют высокий уровень провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) и ИЛ-6, и С-реактивного белка (CRP). При хронической гипергликемии цитокины проникают в ткани сосудов, подавляют их функцию и репаративные процессы.

Ожирение, являющееся основным фактором риска СД 2 типа, стимулирует воспаление за счет активации Toll-подобных рецепторов (TLR) и последующей выработки провоспалительных цитокинов и хемокинов [Беспалова И.Д. и др., 2013; Калюжин В.В. и др., 2013; Kwon E.Y. et al, 2012]. В этом плане белая жировая ткань не только служит депо энергетических запасов, но также продуцирует различные биологически активные факторы, так называемые адипокины, обладающие про- и противовоспалительной активностью. При ожирении многие адипокины, в том числе лептин, резистин и ФНО, образуются в избыточном количестве и поддерживают низкоуровневое хроническое воспаление [St^pien M. et al, 2014]. Известно, что некоторые продукты жировой ткани (ФНО и ИЛ-6) способствуют развитию резистентности к инсулину [Rajala M.W., Scherer P.E., 2003; Suganami T. et al, 2005]. Наоборот, выработка противовоспалительных адипокинов, таких как адипонектин, уменьшается с увеличением степени ожирения [Jackson M.B. et al, 2005]. Подчеркнем, что на ранних стадиях

13

роста объема жировой ткани выработка адипонектина может даже усиливаться, что отражается повышением поглощения глюкозы и выработки оксида азота. Однако дальнейшее прогрессирование ожирения сопровождается падением уровня адипонектина и приводит к осложнениям, наблюдаемым при СД 2 типа [Matsuzawa У., 2005].

Висцеральное ожирение в большей степени связано с метаболическими нарушениями и хроническим низкоуровневым воспалением, чем подкожное ожирение [Дедов И.И. и др., 2004; Осихов И.А. и др., 2013]. Это объясняется тем, что висцеральная жировая ткань более уязвима к потере иммунной регуляции и, следовательно, имеет больший потенциал приобретения провоспалительных функций. Инфильтрация тучными клетками и пропорциональное снижение числа регуляторных Т-клеток (Тге§) более выражены в висцеральной, чем подкожной жировой ткани лиц, страдающих ожирением [Нап 1.М., Levings М.К., 2013].

Некоторые механизмы, лежащие в основе развития хронического воспаления при ожирении, в том числе ведущем к СД 2 типа, детально описаны. В этом отношении доказана роль клеток-эффекторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета.

Характерной чертой является накопление в жировой ткани макрофагов, причем преимущественно их провоспалительного М1 -подтипа, которые окружают адипоциты, образуя так называемые короноподобные структуры [Мигапо I., 2008]. Кроме того, жировая ткань инфильтрируется мастоцитами, дендритными клетками и нейтрофилами. Продукция последними эластазы вносит вклад в развитие воспаления и является непосредственной причиной резистентности к инсулину [Машиу-АиЬеГ: V. et а1, 2013].

В висцеральной жировой ткани также выявляется большое число В- и Т-лимфоцитов [ВеБипа I et а1, 2013]. При ожирении среди Т-клеток преобладают субпопуляции с провоспалительным фенотипом. СЭ4+- и СЭ8+-Т-клетки экспрессируют маркеры эффекторных клеток памяти и продуцируют большое количество ИФН-у. СЭ8+-Т-клетки, кроме того,

14

вырабатывают целый ряд хемокинов (CCL5, CXCL1 и др.), привлекающих макрофаги [Yang H. et al, 2010].

При увеличении объема жировой ткани происходят расстройства механизмов иммунорегуляции: снижение числа и функции ИЛ-10-продуцирующих М2-макрофагов, инвариантных NKT-клеток и CD4+Foxp3+ Treg-клеток [Han J.M., Levings M.K., 2013].

Схема 1. Общий путь прогрессирования диабетических микрососудистых

осложнений [Nguyen D.V. et al, 2012]

AGE-RAGE

Окислительный стресс

Гипоксия

i

Каскад воспалительных сигналов

Локальная активация провоспалительных цитокинов

i

Воспаление

i

Нефропатия

Ретинопатия

Неропатия

Ожирение также ассоциируется с гиперлипидемией, в частности с повышенными уровнями холестерина и триглицеридов, что также способствует хроническому воспалению. По одним данным гиперлипидемия стимулирует развитие ДР [Dodson P.M. et al, 1981]; по другим - четкой взаимосвязи между уровнем липидов в сыворотке и ДР не обнаружено [Chew E.Y. et al, 2010].

На фоне персистирующего метаболического синдрома и низкоуровневого воспаления, существенный вклад в развитие микрососудистых осложнений СД вносят окислительный стресс, гипоксия, образование конечных продуктов гликирования (AGE), дисбаланс AGE и их рецепторов (RAGE) [Иванникова Е.В. и др., 2013, Vincent A.M., 2011].

Nguyen D.V. и соавторы представили общую схему патогенеза диабетических микрососудистых осложнений (Схема 1.).

Несмотря на то, что многие интимные механизмы развития ДР остаются открытыми, в качестве связующих цепочек между гипергликемией и этим микрососудистым осложнением СД рассматриваются несколько биохимических путей, в том числе активация протеинкиназы C (РКС) и полиольного пути утилизации глюкозы, повышение экспрессии факторов роста (фактора роста эндотелия сосудов /VEGF/ и инсулиноподобного ростового фактора-1 /IGF-1/), активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Tarr J.M. et al, 2013].

Значение полиольного пути в патогенезе ДР представлено на Схеме 2.

Накопление сорбитола при активации этого пути утилизации глюкозы имеет несколько разрушительных последствий для клеток сетчатки, в том числе за счет их осмотического повреждения [Gabbay K.H., 1973]. Кроме того, еще один продукт полиольного пути - фруктоза - может фосфорилироваться с образованием фруктозо-3-фосфата, который в свою очередь трансформируется в 3-дезоксиглюкозон. Оба продукта превращения фруктозы являются сильными гликирующими агентами и увеличивают уровень AGE [Szwergold B.S. et al, 1990].

Альдозоредуктаза

Сорбидтолдегидрогеназа

Глюкоза

Сорбитол

NADPH NADP NAD NADH

Ф

РКС представляет собой семейство из 10 ферментов. С развитием ДР связывают pi/2-изоформу РКС. Этот фермент является серин-треониновой киназой, участвующей в трансдукции сигналов в ответ на специфические гормональные, нервные и ростовые стимулы. Гипергликемия приводит к увеличению утилизации глюкозы путем гликолиза, который, в свою очередь, увеличивает синтез de novo диацилглицерина (ДАГ) - ключевого активатора PKC [Wang Q.J., 2006]. В клинике и эксперименте установлено повышение экспрессии ДАГ и активации PKC при СД [Koya D., King G.L., 1998]. РКС является важной молекулой в регуляции многочисленных физиологических процессов. Активации этого фермента имеет каскадный стимулирующий эффект на нескольких других биологических путей, которые вызывают увеличение эндотелиальной проницаемости, расстройства гемодинамики в сетчатке, повышение экспрессии VEGF в сетчатке, а также активацию и

Схема 3. Протеинкиназа C в регуляции патофизиологических процессов при диабетической ретинопатии [Tarr J.M. et б1, 2013]

Синтез/экспансия белков экстрацеллюлярного матрикса

Лейкостаз

Активация и пролиферация эндотелиальных клеток

Проницаемость эндотелия

f

Ретинальный кровоток (гемодинамика)

Не вызывает сомнений роль ростовых факторов в развитии ДР. В этом отношении обсуждается патогенетическое значение IGF-1, эпидермального ростового фактора, ангиопоэтинов-1 и -2, трансформирующего ростового фактора-р2, тромбоцитарного ростового фактора, эритропоэтина и некоторых других факторов роста. Наибольшее внимание ученых привлекает VEGF, который вызывает нарушение гематоретинального барьера, стимулирует рост эндотелия и неоваскуляризацию, а также увеличивает проницаемость сосудов сетчатки [Wirostko B., 2008]. Признание патофизиологической роли этой молекулы отражается во внедрении анти-VEGF-препаратов в лечение ДР [Gupta N. et al., 2013, Cheung N. et al, 2014].

Однако значение VEGF и медиаторов воспаления на разных стадиях заболевания требует уточнения. Так, A.Blum и соавторы продемонстрировали, что у больных СД 2 типа без ДР или с непролиферативной ДР уровень VEGF, растворимой формы молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (sVCAM-1) и С-реактивного белка, определяемого высокочувствительным методом, действительно выше, чем у здоровых доноров, но при развитии пролиферативной ДР содержание этих молекул снижается практически до нормальных значений [Blum A. et al, 2012].

Отсутствие линейной закономерности возрастания биомаркеров воспаления и ангиогенеза при прогрессировании заболевания, затрудняет их использование в диагностических и прогностических целях и говорит о необходимости дальнейшего поиска надежных лабораторных предикторов развития пролиферативной формы ретинопатии у больных СД 2 типа.

1.2. Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры прогрессирования диабетической ретинопатии

Некоторые ключевые системные механизмы иммунопатогенеза микрососудистых осложнений СД 2 типа, которые связаны с поддержанием хронического низкоуровневого воспаления в белой жировой ткани, были рассмотрены в предыдущем параграфе.

В ряде исследований установлено изменения общего числа лейкоцитов и иммунофенотипа гранулоцитов и лимфоцитов в периферической крови больных СД 2 типа с ДР. Повышение количества лейкоцитов и изменения их популяционного/субпопуляционного состава у тучных лиц рассматривается как одно из проявлений хронического воспаления [Rimmele T. et al, 2013] и, по мнению некоторых ученых, отражает пониженную секрецию инсулина и развитие резистентности к этому гормону [Vozarova B. et al, 2002].

У пациентов с СД 2 типа продемонстрирована значительная отрицательная корреляционная связь между числом TLR4+CD4+-Т-клеток и уровнем гипергликемии, а также между количеством TLR4+-В-клеток и индексом массы тела. Кроме того, установлено снижение содержания ГЬ-21R+CD4+-Т-клеток. В противоположность этому, число Т^ зависело не от особенностей метаболического статуса, а от возраста больных [Cucak К et а1, 2014].

У больных СД 1 типа с ДР обнаружено повышение относительного числа CD54+-гранулоцитов и лимфоцитов, больше выраженное у пациентов активной неоваскуляризацией [Кочемасова Т.В. и др., 2001].

Достаточно большое количество работ посвящено локальным патофизиологическим событиям при ДР, происходящим непосредственно внутри глаза. В этом отношение внимание ученых привлекают различные субпопуляции иммунокомпетентных клеток, про- и противовоспалительные цитокины, хемокины, растворимые формы молекул адгезии, ростовые (ангиогенные) и антиангиогенные факторы, растворимые формы рецепторов провоспалительных и ангиогенных медиаторов [Abcouwer S.F., 2013, Ahsan Н., 2015].

В стекловидном теле больных пролиферативной ДР выявляли большое число макрофагов/гистиоцитов, CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов, но не CD19+-B-лимфоцитов. Количество Т-клеток увеличивалось с повышением тяжести заболевания. Любопытно, что интравитреальное соотношение CD4/CD8 более чем в 2 раза превышало таковое в периферической крови. Внутриглазное относительное количество макрофагов/гистиоцитов также было выше, чем в системном кровотоке. Это свидетельствует о том, что воспалительные клетки в стекловидном теле находятся под влиянием локальных хемотаксических факторов M. et al, 2013].

Сходные данные были получены А.СаПюп и соавторами, которые показали увеличение процентного содержания CD4+- и CD28+-Т-лимфоцитов

в стекловидном теле в сравнении с периферической кровью у больных пролиферативной ДР [Cantón A. et al, 2004].

Однако в трактовке установленных фактов авторы двух вышеуказанных работ существенно разошлись. M.UrbanciC и соавторы делали заключение о патогенетическом значении Т-клеточной инфильтрации тканей глаза, тогда как A.Cantón с коллегами рассматривали это как саногенетическое (протективное) событие при прогрессировании ДР.

На наш взгляд, более аргументированной является интерпретация первой группы ученых, которые проводили параллели в патогенезе ДР и развитии аутоиммунного увеита, при котором также установлена патогенетическая роль С04+-Т-лимфоцитов и выявлено 4-кратное увеличение соотношения CD4/CD8 в сравнении с таковым в периферической крови [Davis J.L. et al, 2012]. Увеличение же доли CD8+-Т-лимфоцитов связывают, наоборот, с регрессией аутоиммунного внутриглазного воспаления [Калюжин О.В. и др., 2011, Дикинов З.Х. и др., 2014].

N.Dong и соавторы сравнили с помощью мультиплексного анализа

концентрации 27 цитокинов в водянистой влаге у больных СД 2 типа и

недиабетических пациентов для того, чтобы установить связь этих цитокинов

с развитием ДР [Dong N. et al, 2013]. Образцы водянистой влаги были

получены от 102 пациентов без диабета (102 глаз) и 136 больных СД (136

глаз), которые были разделены на девять групп в соответствии с тяжестью

ДР. По сравнению с недиабетическим контролем, диабетические пациенты

имели значительно более высокие концентрации KH-1ß, ИЛ-6, ИЛ-8,

моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1), ИФН-у-

индуцированного белка-10 (IP-10) и VEGF. Наоборот, содержание ИЛ-10 и

ИЛ-12 было значительно ниже у больных СД. Уровень других цитокинов

существенно не различался между диабетическими пациентами и

контрольной группой. Внутриглазные концентрации KH-1ß, ИЛ-6, ИЛ-8

MCP-1 и IP-10 возрастали с увеличением тяжести ДР. В этом исследовании,

как и в описанной в параграфе 1.1 работе [Blum A. et al, 2012], не выявлено

21

прямой связи уровня VEGF с тяжестью ДР. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-12 в водянистой влаге уменьшалась по мере увеличения выраженности ДР.

Также проводилось исследование уровня 27 цитокинов в слезной жидкости больных СД 2 типа с ДР или без нее [Liu J. et al, 2010]. Образцы слезы были собраны у 15 больных СД без ретинопатии, 15 пациентов с ДР и 15 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными. Мультиплексный анализ показал, что IP-10 был преобладающим цитокином, выявляемым в слезной жидкости. Уровни IP-10 и МСР-1 были значительно выше у пациентов с ДР по сравнению с контрольной группой и больных СД без ДР. Содержание IL-1Ra существенно увеличивалось у пациентов с СД без ретинопатии. Соотношение ТЫ/^2-цитокинов - ИФН-у/ИЛ-5 и ИЛ-2/ИЛ-5 - было значительно выше у больных СД с ДР по сравнению с недиабетическим контролем и диабетиками без ДР. Баланс антиангиогенных/проангиогенных цитокинов - ИФН-у/МСР-1 и ИЛ-4/MCP-l - существенно снижался по сравнению с контролем у диабетиков вне зависимости от наличия/отсутствия ДР. Коэффициенты ИЛ-4/^-8 и ИЛ-12р70/ИЛ-8 у больных с ретинопатией были значительно ниже, чем в контроле. Не установлено связи между концентрациями цитокинов в слезной жидкости и уровнями гликированного гемоглобина или глюкозы в плазме крови натощак. Таким образом, в слезной жидкости больных СД 2 типа обнаружено преобладание проангиогенных цитокинов над антиангиогенными медиаторами, а развитие ДР сопровождалось повышением концентрации IP-10 и МСР-1, а также сдвигом функционального баланса Th1/Th2 в направлении Th1.

Большой интерес вызывают исследования, в которых внутриглазные концентрации факторов воспаления и ангиогенеза сопоставляются с таковыми в сыворотке или плазме крови. Данные таких работ привлекают внимание с точки зрения выявления в более доступных биологических образцах системных иммунологических показателей, которые не только

отражают внутриглазные патогенетические/саногенетические события, но и могут использоваться для диагностики и прогноза течения ДР.

R.Maier и соавторы определяли концентрации в стекловидном теле и сыворотке крови IP-10, МСР-1, макрофагальных воспалительных белков-1а и -1ß (MIP-1a и -1ß), хемокина, экспрессируемого и секретируемого T-клетками при активации (RANTES) и VEGF у 36 больных СД 2 типа и 69 недиабетических пациентов контрольной группы [Maier R. et al, 2008]. У больных СД интравитреальные уровни IP-10, MCP-1 и VEGF были значительно выше по сравнению с контролем. При этом концентрация VEGF коррелировала с таковыми IP-10 и МСР-1. Содержание в сыворотке крови MIP-1ß, RANTES и VEGF также существенно возрастало у пациентов с СД, а концентрации IP-10, MCP-1 и MIP-1a статистически значимо не изменялись. Таким образом, интравитреальный уровень VEGF коррелировал с таковым в сыворотке, тогда как концентрации IP-10 и MCP-1 возрастали только внутри глаза, а MIP-1ß и RANTES - лишь в системном кровотоке.

Повышение уровней провоспалительных и ангиогенных факторов в стекловидном теле может быть результатом трех путей. Во-первых, это прорыв гематоретинального барьера, приводящий к повышению внутриглазного уровня воспалительных и ангиогенных факторов у диабетиков [Yoshida S. et al, 2004]. Вторым вариантом является экспрессия воспалительных и ангиогенных факторов клетками (макрофагами, моноцитами, глиальными клетками, пигментными эпителиоцитами) непосредственно внутри стекловидного тела. В-третьих, хемокины и ангиогенные факторы индуцируются в сетчатке в результате гипоксии, что было показано на модели ретинальной ишемии-реперфузии [Jo N. et al, 2003]. Наличие различных путей объясняет отличия уровней некоторых медиаторов воспаления и ангиогенеза в сыворотке крови и стекловидном теле [Maier R. et al, 2008].

Целью работы H.Chen и соавторов было изучение роли различных субпопуляций Th-клеток в патогенезе ДР. Для этого в сыворотке крови 29

23

больных СД 2 типа с ретинопатией и 30 здоровых доноров определяли концентрации Th-продуктов: ИФН-у, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 , ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, p70 ИЛ-13, ИЛ-17А, ИЛ-22 и ФНО-а с помощью технологии FlowCytomix [Chen H. et al, 2012]. Обнаружено, что сывороточный уровень ИЛ-22 у больных СД с ДР был выше, чем в контрольной группе. Иммуноферментный анализ содержания ИЛ-22 в надосадочной жидкости культур мононуклеаров периферической крови (МПК) установил значительное повышение этого показателя у больных пролиферативной ДР по сравнению с таковым у пациентов с непролиферативной ДР, больных СД без ретинопатии, а также здоровых доноров. Кроме того, концентрации ИЛ-22 в сыворотке крови и культуре МПК положительно коррелировали с длительностью диабета. Уровни других цитокинов в сыворотке крови больных СД 2 типа с ДР существенно не изменялись по сравнению с контрольной группой. Эти результаты указывают на патогенетическое значение Th22-клеток в ДР. Вероятно, ИЛ-22 участвует в развитии пролиферативной формы заболевания.

Мультиплексный анализ очень широкого спектра цитокинов и ассоциированных с ними молекул (антагонистов, растворимых форм рецепторов) - всего 39 факторов - в плазме крови больных СД с ретинопатией и без таковой проведен другой группой ученых [Hang H. et al, 2014]. В исследование включено 59 пациентов с СД 2 типа и 19 здоровых добровольцев. Уровни цитокинов оценивались с учетом стадии ДР. Плазменные концентрации десяти цитокинов - MCP-1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ -9, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L), sIL-2Ra и ФНО-ß - значительно увеличились в диабетической группе по сравнению с контрольной. Наоборот, уровень лиганда Flt-3 (Flt-3L), антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra), ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-12 (p40) у больных СД был ниже контроля. Содержание ФНО-а в плазме было значительно выше у пациентов с пролиферативной ДР по сравнению с таковым у пациентов с непролиферативной формой ДР и пациентов без манифестных форм этого

24

микрососудистого осложнения СД. Авторы делают вывод, что ФНО-а может быть вовлечен в прогрессировании ДР, особенно в патогенез пролиферативной формы заболевания, и может быть как критерием прогноза течения ДР, так и терапевтической мишенью.

M.Roy и соавторы изучили 28 биомаркеров воспаления, в том числе ростовые факторы, хемокины, про- и противовоспалительные цитокины, их антагонисты и растворимые рецепторы, растворимые формы молекул адгезии, в плазме крови 412 больных СД с разными стадиями ДР [Roy M. et al, 2013]. Установлено, что уровень E-селектина и ФНО-а отражает прогрессирование ДР и развитие пролиферативной формы заболевания, а сочетанное повышение концентраций sICAM-1 и ФНО-а ассоциировано с макулярным отеком. Обращает на себя внимание, что только 3 из 28 тщательно подобранных биомаркеров, которые по данным литературы вовлечены в патогенез микрососудистых осложнений СД, имели прогностическое значение при ДР.

В сыворотке крови больных СД типа 2 выявлено повышение содержания растворимых форм мембранных молекул: sCD38 и sCD54 (sICAM-1) и sHLA-I. При развитии ДР, кроме того, обнаружен рост уровня растворимых форм различных в функциональном отношении групп мембранных антигенов: адгезионных молекул (sCD50 /sICAM-3/ и sCD54 /sICAM-1/), маркеров активации (CD38, sCD95, sHLA-DR), а также молекул главного комплекса гистосовместимости I класса (sHLA-I). Степень этих изменений увеличивалась у больных с пролиферативной ДР [Караулов А.В., 2006].

Таким образом, несмотря на достаточно большое число работ, посвященных иммунным механизмам ДР, данных о системных иммунологических показателей, которые могли бы четко свидетельствовать о прогрессировании заболевания и развитии его пролиферативной формы, мало. Более того, зачастую результаты разных авторов противоречат друг другу.

2.1. Основные факторы патогенеза возрастной макулярной дегенерации

В развитии ВМД, помимо возраста, большое значение играют различные экологические и эпидемиологические факторы. Это нейродегенеративное поражение глаз ассоциировано с курением, действием света, сердечно-сосудистыми заболеваниями, ожирением, факторами питания, а также этнической принадлежностью [^ш L.S. е1 а1, 2012]. Недавние генетические исследования указывают на роль иммунной системы, в частности расстройств системы комплемента, в патогенезе ВМД. Хотя у пациентов с ВМД отсутствуют признаки выраженного внутриглазного воспаления, установлена связь атрофических поражений и неоваскуляризации сетчатки с присутствием макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток и фибробластов [РепМё РХ. е1 а1, 2001].

Экстрацеллюлярные депозиты (друзы) между мембраной Бруха и пигментным эпителием сетчатки, являющиеся маркерами развития ВМД, содержат липиды, компоненты комплемента и другие потенциально иммунологически активные вещества, которые могут действовать как дополнительные триггеры иммунных реакций в глазу. Другими инициаторами воспаления являются окислительный стресс и вторичные флогогенные медиаторы, такие как цитокины. Вероятно, что, по крайней мере, некоторые из воспалительных внутриглазных реакций, наблюдаемых при ВМД, могут иметь защитно-приспособительный характер. Актуальность выявления четких данных о роли иммунной системы в патогенезе ВМД связана с их практической востребованностью с позиций разработки новых методов модуляции иммунного ответа для комплексного лечения этого заболевания.

Экологические факторы Врожденный иммунитет Адаптивный иммунитет Фото-оксидативные продукты

Курение Действие света (|) Масса тела (|) Гиперхолестери-немия Комплемент Инфламмасомы ТЬЯ-зависимые сигналы Инфильтрация иммуноцитами Паравоспаление Антитела к антигенам сетчатки и продуктам деградации Клеточная активация и иммунокомплексное повреждение Побочные продукты зрительного цикла Липофусцин Бис- ретинилиден-этаноламин

Повреждение пигментного эпителия, образование друз

Избыточная активация комплемента по альтернативному пути и других генетически обусловлен ных провоспалительных путей

Избыточное ретинальное воспаление в ответ на повреждение

ВОЗРАСТНАЯ МАКУЛЯРНАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ

Степень, в которой врожденные и адаптивные иммунные реакции обусловливают развитие ВМД, и возможность управления этими реакциями для эффективного лечения заболевания, остаются предметом дискуссии.

Сложность интерпретации иммунологических исследований при ВМД определяется не только многогранностью выявляемых сдвигов показателей, но и неясностью вопроса о причинно-следственных связях местных и системных иммунных нарушений [Whitcup S.M. et al, 2013].

Известные и вероятные патогенетические факторы ВМД представлены на Схеме 4.

2.2. Система комплемента и возрастная макулярная дегенерация

Участие системы комплемента в развитии ВМД сегодня не вызывает сомнений. При этом заболевании выявлена избыточная активация комплемента по альтернативному пути [Khandhadia S., Cipriani V. et al, 2012].

Считается, что передача предрасположенности к ВМД по наследству примерно на 50% обусловлена единичным нуклеотидным полиморфизмом (SNP) в экзоне, кодирующем фактор комплемента H [Klein R.J. et al, 2005].

Фактор Н представляет собой гликопротеин, который в основном производится в печени и действует в качестве регулятора альтернативного пути активации комплемента. В связи с этим, он играет важную роль в предотвращении повреждения от случайного осаждения C3b в тканях хозяина. Фактор H связывается с полианионами тканей хозяина и выполняет функцию кофактора для протеолитической дезактивации C3b фактором I. Одним из семейств полианионных молекул являются гликозаминогликаны -вездесущие полисахариды, обнаруживаемые как на поверхности клеток, так и во внеклеточном матриксе тканей млекопитающих [Meri S., Pangburn M.K., 1990].

Аллельный вариант 402H (присутствие гистидина в позиции 402) не

позволяет фактору H также эффективно подавлять альтернативный путь

28

активации комплемента, как 402Y (тирозин в позиции 402). Замена тирозина на гистидин в указной аминокислотной позиции нарушает связывание фактора H с сульфатированными полисахаридами, в частности глюкозаминогликанами мембраны Бруха, что имеет драматические последствия в виде гиперактивации комплемента, в свою очередь ведущей к локальному хроническому воспалению [Clark S.J. et al, 2010].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Марных Сергей Анатольевич, 2015 год

□ □

□

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

МеС1ап 25%-75% I Мт-Мах

Не установлено межгрупповых различий по числу СЭ20+-клеток (В-лимфоцитов), тем не менее следует отметить тенденцию к его увеличению в обеих группах больных ДР (Рис. 7).

0

Неоднозначные данные были получены при изучении зависимости экспрессии на лимфоцитах различных активационных маркеров от клинической формы заболевания.

Установлено повышение количества -клеток в группе

пациентов с пролиферативной ДР (Рис. 8). Их число у этих больных превышало таковое как в контроле, так и в группе пациентов с препролиферативной ДР (подтверждено при парном сравнении с использованием критерия Манна-Уитни).

Рисунок 8. Число ИЬЛ-ВЯ+-лимфоцитов в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

500

450

£

400

§

со 350

о

н

^

300

о

250

с;

+ ОН а 200

<

_1 X 150

о

с;

о ^ 100

!Т

50

0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

МесМап 25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,036 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,035 (критерий Манна-Уитни) или р=0,052 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - р=0,027 (критерий Манна-Уитни) или р=0,139 (критерий Данна)

Наоборот, количество СЭ71+-лимфоцитов статистически значимо увеличивалось только у больных с препролиферативной ДР; при пролиферативной форме заболевания число этих клеток не отличалось от показателей здоровых доноров (Рис. 9).

260

240

220

200

§

180

§

160

о

н

ф 140

+ 120

а о 100

о

с; о 80

^

!Т 60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,006 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,003 (критерий Манна-Уитни) или р=0,004 (критерий Данна)

Количество СЭ25+-лимфоцитов у больных препролифетивной ДР было сходным с таковым в контрольной группе и вдвое превышало число этих клеток у пациентов с пролиферативной формой болезни (Рис. 10). Указанное различие подтверждалось с помощью критерия Манна-Уитни, тогда как множественное межгрупповое сравнение с использованием критерия Краскела-Уоллиса и парное сравнение с помощью критерия Данна не опровергали нулевую гипотезу.

Число лимфоцитов, экспрессирующих поздний активационный маркер (СЭ95), свидетельствующий о готовности клеток, выполнивших свою функцию, к апоптозу, возрастало по мере прогрессирования заболевания (Рис. 11). У больных препролиферативной ДР количество этих клеток превышало контроль вдвое, а в пролиферативной фазе заболевания дополнительно увеличивалось еще в полтора раза.

о

140

120

100

m

о

J

о

ю Ol

а о

о с;

о

80

60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,073 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # -p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,102 (критерий Данна)

Рисунок 11. Число СЭ95+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

0

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,047 (критерий Данна), ** - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p<0,001 (критерий Данна); в сравнении c больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,548 (критерий Данна)

Если количество СВ11Ь+-клеток увеличивалось в сравнении со здоровыми донорами только у пациентов с препролиферативной ДР (Рис. 12), то число СЭ38+- и, особенно, СЭ54+-лимфоцитов повышалось примерно в равной степени при обеих формах заболевания. Значимость указанных изменений, несмотря на достаточно высокую индивидуальную вариативность показателей, подтверждалась при разных вариантах математической обработки данных.

Рисунок 12. Число СЭ11Ь+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией 1600

1400

ь2 1200

,11

* 1000 о н

<и

+ | 800 .а

§ 600

о с;

о

^ 400 200 0

МесМап

_,_,_,_ 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I М1п-Маж

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,050 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,021 (критерий Манна-Уитни) или р=0,043 (критерий Данна)

о

н

ф

1000 900 800 700 600 500

оо со

О 400

О о

5 300 s Iг

200 100 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,022 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,057 (критерий Данна), ** - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,041 (критерий Данна)

Рисунок 14. Число СЭ54+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

700

600

500

400

ю 300

а о

о

" 200

100

**

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

Median 25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p<0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,002 (критерий Данна), ** - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,001 (критерий Данна)

0

диабетической ретинопатией

У пациентов с ДР установлены разные по направленности тренды изменения концентрации в сыворотке крови ИЛ-2 и ИФН-у - цитокинов, отражающих функциональную активность ТЫ-субпопуляции СЭ4+-лимфоцитов.

Уровень ИЛ-2 у больных препролиферативной ДР практически не отличался от такового здоровых доноров; в группе пацеиентов с пролиферативной формой заболевания отмечена тенденция к снижению этого показателя (Рис. 15). Подчеркнем, что во всех группах, особенно у больных пролиферативной ДР, достаточно часто содержание ИЛ-2 в сыворотке крови было ниже уроня детекции используемой высокочувствительной тест-системы.

Рисунок 15. Концентрация ИЛ-2 (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

5

4

3

2

о

Медианы концетрации ИФН-у, наоборот, возрастали примерно в полтора раза в обеих группах больных ДР, при этом зависимости степени повышения уровня этого цитокина от формы заболевания не обнаружено (Рис. 16).

Рисунок 16. Концентрация ИФН-у (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,004 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,006 (критерий Манна-Уитни) или p=0,014 (критерий Данна), ** - p=0,002 (критерий Манна-Уитни) или p=0,013 (критерий Данна)

Продемонстриована тенденция к снижению содержания в сыворотке крови Th2-продукта - ИЛ-4 - у пациентов с препролиферативной ДР; у больных с пролиферативной формой заболевания этот тренд достигал статистически значимого уровня (Рис. 17). При парном сравнении уровня ИЛ-4 в группах с разными клиническими фенотипами ДР отличий не выявлено.

Установлена обратная корреляционная связь между концентрациями ИЛ-4 и ИФН-у.

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,039 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р<0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,034 (критерий Данна)

Рисунок 18. Концентрация ИЛ-10 (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Контроль

Препролиф. ДР

Пролиферат. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,002 (критерий Манна-Уитни) или p=0,004 (критерий Данна), ** - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,006 (критерий Данна)

9

8

7

6

5

4

3

2

0

Что касается ИЛ-10 - противовоспалительного продукта ^^-клеток, представляющих собой отдельную субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, - то его содержание прямо коррелировало с концентрацией ИФН-у - провоспалительного Th1-цитокина. При этом медиана уровня ИЛ-10 у больных ДР вне зависимости от формы заболевания была примерно вдвое выше таковой в контроле (Рис. 18).

1.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией

При изучении уровня растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных ДР не установлено линейной закономерности их возрастания или снижения по мере прогрессирования заболевания от препролиферативной к пролиферативной форме заболевания.

Рисунок 19. Концентрация sCD38 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Концентрации растворимых форм мембранных молекул адгезии бСВЗ8 и бСВ50, во многом благодаря высокой индивидуальной вариативности этих показателей, практически не отличались во всех группах обследованных пациентов с ДР и здоровых доноров (Рис.19 и 20).

Рисунок 20. Концентрация бСВ50 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Напротив, содержание растворимой формы другой адгезионной молекулы - бСВ54 - в сыворотке крови больных ДР возрастало. И хотя математически подтверждённых отличий между двумя группами пациентов с ДР не обнаружено, следует отметить тенденцию к снижению концентрации этой молекулы при переходе препролиферативной ДР в пролиферативную форму заболевания (Рис. 21).

Уровень бСВ8 - молекулы, мембранная форма которой является дифференцировочным маркером ЦТЛ и, взаимодействуя с ИЬЛ-1, ассоциированным с презентируемыми антигенами, обеспечивает распознавание этих антигенов Т-клеточным рецепторным комплексом, -повышался только у больных пролиферативной ДР (Рис. 22).

160

140

120

100

80

60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,004 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,005 (критерий Манна-Уитни) или p=0,004 (критерий Данна), ** - p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,049 (критерий Данна)

Рисунок 22. Концентрация sCD8 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

800

700

600

500

400

300

200

100

■ т □ *# □

Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,041 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,021 (критерий Манна-Уитни) или p=0,132 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,059 (критерий Данна)

0

Медиана концентрации бСВ8 была выше таковой не только в контроле, но и у больных препролиферативной формой заболевания.

В целом сходные закономерности изменения содержания в сыворотке крови отмечены и для бИЬА-! Концентрация этой молекулы у больных пролиферативной ДР была выше, чем в контрольной группе и у больных препролиферативной ДР (Рис. 23).

Рисунок 23. Концентрация бИЬА-1 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

Median 25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,021 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,010 (критерий Манна-Уитни) или р=0,030 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - р=0,028 (критерий Манна-Уитни) или р=0,085 (критерий Данна)

Уровень растворимых комплексов бИЬА-1+СВ8 статистически значимо не различался между группами (Рис. 24). Вместе с тем следует отметить тенденцию к снижению концентрации бИЬА-1+СВ8 у больных препролиферативной ДР и к повышению - у пациентов с пролиферативной формой болезни.

1400

1200

1000

800

600

400

200

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

0

Рисунок 25. Концентрация sHLA-DR (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20

Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,078 (критерий Данна), ** - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,001 (критерий Данна)

Содержание бНЬЛ-ВК в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной ДР превышало соответственно в два и полтора раза таковое в группе здоровых доноров (Рис. 25). Парное сравнение не выявило отличий по уровню бНЬЛ-ВК между группами с разными формами заболевания.

Концентрация бСВ25 возрастала только у больных препролиферативной ДР, однако из-за высокой вариативности указанного показателя это повышение подтверждалось лишь с помощью критерия Манна-Уитни при сравнении с контролем (Рис. 26). При множественном сравнении различия между группами опровергались.

Рисунок 26. Концентрация бСВ25 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

1200

1000

800

600

400

200

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,083 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,038 (критерий Манна-Уитни) или р=0,111 (критерий Данна)

Уровень бСВ95 в сыворотке крови увеличивался в полтора раза только у больных препролиферативной ДР (Рис. 27). В пролиферативную фазу заболевания содержание этой молекулы не отличалось от контроля и было в

0

ДР.

Установлена прямая корреляционная связь между концентрациями бСВ25 и вСВ95.

Рисунок 27. Концентрация бСВ95 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией 1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

□ Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,002 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,003 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,022 (критерий Данна)

2.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных возрастной макулярной дегенерацией

У больных с различными клиническими формами ВМД содержание лейкоцитов в периферичекой крови не отличалось от такового в контрольной группе и было в пределах общепринятых референсных значений нормы (Рис. 28).

Также не выявлено математически подтврежденных различий числа лимфоцитов в крови между группами обследованных больных и здоровых доноров (Рис. 29). Вместе с тем следует отметить тенденцию к возрастанию количества этих клеток в ряду: контрольная группа ^ больные сухой ВМД ^ пациенты с влажной ВМД.

Рисунок 28. Число лейкоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Рисунок 30. Число СЭЭ -лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,045 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными сухой ВМД: # - р=0,026 (критерий Манна-Уитни) или р=0,046 (критерий Данна)

Число СD3+-клеток (Т-лимфоцитов) при сухой ВМД не отличалось от такового у здоровых доноров (Рис. 30). У больных с влажной формой заболевания количество этих клеток существенно превосходило соответствующие показатели в группе пациентов с сухой ВМД.

Это было в значительной степени связано с увеличением числа СD8+-лимфоцитов у больных влажной ВМД (Рис. 31), тогда как межгрупповых различий по содержанию СD4+-клеток при разных вариантах статистической обработки полученных данных не обнаружено (Рис. 32).

Количество СD16+-лимфоцитов (МК-клеток) у больных обеими клиническими формами ВМД примерно вдвое превосходило контрольные значения (Рис. 33).

Рисунок 31. Число СD8+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,085 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными сухой ВМД: # - p=0,036 (критерий Манна-Уитни) или p=0,088 (критерий Данна)

Рисунок 33. Число СЭ16+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,013 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,038 (критерий Данна), ** - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,012 (критерий Данна)

Число В-лимфоцитов (СD20+-клеток) между группами не отличалось (Рис. 34). При этом следует отметить высокую индивидуальную вариативность содержания этих клеток у всех больных ВМД и, особенно, у больных с влажной формой заболевания.

Рисунок 34. Число СD20+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Не выявлено однотипных изменений числа лимфоцитов, экспрессирующих различные молекулы, свидетельствующие об активации клетки.

У больных сухой ВМД отмечены выраженные тенденции к снижению числа СD25+-лимфоцитов (Рис. 35) и к повышению - СD71+-клеток (Рис. 36). Количество этих субпопуляций лимфоцитов у пациентов с влажной ВМД и содержание HLA-DR+-клеток при обоих вариантах заболевания не отличалось от показателей контрольной группы (Рис. 37).

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,098 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,049 (критерий Манна-Уитни) или p=0,136 (критерий Данна)

Рисунок 36. Число СD71+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

400

350

300

250

200

150

100

50

□

□ □

—1- 1_ _!_

МесМап 25%-75% I Мт-Маж

0

900

800

700

600

500

400

300

200

100

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

0

Напротив, установлен линейный возрастающий тренд числа СЭ95+-лимфоцитов (клеток с поздним активационным маркером, свидетельствующим об их готовности к апоптозу) при прогрессировании заболевания от сухой к влажной форме ВМД (Рис. 38). И хотя парное сравнение не выявило различий между двумя группами больных, у пациентов сухой ВМД количество СЭ95+-клеток статистически значимо превышало контроль в полтора раза, а у пациентов с влажной формой заболевания - в два раза.

Содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулу адгезии СD11b, у больных ВМД не отличалось от такового здоровых доноров (Рис. 39). Однако при влажной ВМД отмечена выраженная тенденция к увеличению числа этих клеток.

При влажной форме заболевания медиана количества СЭ38+-лимфоцитов в периферической крови в 1,7 раз превышала соответствующий показатель в группе больных сухой ВМД и в 2,7 раза - в контрольной группе (Рис. 40).

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,025 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,018 (критерий Манна-Уитни) или р=0,074 (критерий Данна), ** - р=0,011 (критерий Манна-Уитни) или р=0,023 (критерий Данна)

Рисунок 39. Число СЭ11Ь+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

□

□ . 1 □

±

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,003 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,003 (критерий Данна); в сравнении с больными сухой ВМД: # - р=0,013 (критерий Манна-Уитни) или р=0,074 (критерий Данна)

Рисунок 41. Число СВ54+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

1200

1000

800

600

400

200

Т

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

0

Значимость различия при множественном сравнении: р<0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р<0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,001 (критерий Данна)

Число СD54+-лимфоцитов весьма значительно и примерно в равной степени (в 4,5 раза) повышалось при влажной и сухой формах ВМД в сравнении с контрольной группой (Рис. 41).

2.2. Концентрации ТЫ/ТИ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

У больных ВМД, также как и у пациентов с ДР (см. параграф 1.2. раздела «Результаты собственных исследований»), не выявлено корреляционной связи между уровнями цитокинов, отражающих функциональную активность ТЫ-клеток.

Концентрация ИЛ-2 в сыворотке крови больных сухой и влажной ВМД не отличалась от таковой в контрольной группе (Рис. 42), тогда как медиана содержания ИФН-у у пациентов с сухой ВМД почти в полтора раза превосходила соответствующий показатель у здоровых доноров и у больных влажной формой заболевания.

Рисунок 42. Концентрация ИЛ-2 (пг/мл) в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

Контроль

Сухая ВМД Влажная ВМД

□ МеС1ап

25%-75% I Мт-Маж

6

5

4

3

2

10

° МесМап

25%-75% I М1п-Маж

Контроль