Иммуногенные свойства и структура генома вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Яременко, Лилиана Ивановна

• Яременко, Лилиана Ивановна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яременко, Лилиана Ивановна

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ "Оспа птиц" ,

1. Общие сведения об оспе птиц

2. Характеристика возбудителя

2.1. Строение вир иона

2.2. Физико-химические свойства

2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты

2.4. Характеристика полипептидного состава вируса оспы кур

3. Молекулярно-биологические методы изучения структуры генома

3.1. Физическое картирование геномов

3.2. Молекулярно-биологическая характёристика ДНК различных представителей семейства Рохушс1ае

4. Некоторые аспекты формирования иммунитета при оспе птиц

5. Профилактика оспы кур

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

6. Материалы и методы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45 1. Изучения влияния дозы вакцинного вируса на динамику формирования и длительность иммунитета против оспы у цыплят разного

возраста, привитых аэрозольно

1.1. Выбор эффективной дозы культурального вируса оспы кур для аэрозольной иммунизации цыплят

1.2. Изучение динамики формирования иммунитета у цыплят 60-дневного возраста в первые дни после аэрозольной вакцинации

1.3. Динамика формирования иммунитета у цыплят, вакцинированных в возрасте 106 дней вирусом в дозе 1000 и 2000 ТЦД50

1.4. Динамика формирования иммунитета у цыплят, вакцинированных аэрозольно в 136-дневном возрасте

1.5. Сравнительные данные о влиянии возраста и дозы вакцинного вируса на эффективность аэрозольной вакцинации цыплят

i

1.6. Сравнительное изучение длительности противооспенного иммунитета у кур, вакцинированных аэрозольно

2. Изучение динамики формирования и длительности иммунитета у цыплят, вакцинированных внутрикожно

3. Изучение эффективности иммунизации против оспы цыплят раннего возраста

3.1. Результаты внутрикожной вакцинации цыплят раннего возраста

3.2. Результаты интраназальной вакцинации цыплят культураль-

ным вирусом оспы кур ,

3.3. Результаты оральной иммунизации цыплят суточного возраста

4. Молекулярно-биологические исследования вакцинного штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток

4.1. Изучение полипептидного состава вакцинного штамма вируса оспы кур

4.2. Рестрикционный анализ ДНК вируса оспы кур шт.ВГНКИ-3 и построение физических карт генома

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ '

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуногенные свойства и структура генома вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Оспа птиц известна более двухсот лет. Однако острота проблемы специфической профилактики этой болезни у домашних птиц сохраняется до настоящего времени. Это связано в основном с тем, что условия современного промышленного птицеводства, характерной чертой которого является концентрация птиц на малых площадях, предрасполагают к появлению и быстрому распространению в хозяйствах оспенной болезни, а ветеринарная наука, призванная совершенствовать средства и методы вакцинопрофилактики, отстала в решении этой задачи. Так, до 1990

I

года биологическая промышленность страны выпускала для профилактики птичьей оспы две эмбриональные вакцины из вирусов оспы голубя (шт.Нью-Джерси) и оспы фазана (шт.27-АШ), которые по причине низкой иммуногенности создавали у цыплят иммунитет, длящийся не более 3-4 месяцев. Поэтому их должны были применять не менее 3-5 раз, да еще весьма трудоемким способом: втиранием цыплятам с помощью щеточки в фолликулы ощипанной голени. Для выполнения этой работы не хватало ветеринарного и вспомогательного персонала. Это способствовало поддержанию стойкого

I

неблагополучия по этой болезни в птицеводческих хозяйствах и целых регионах.

Существенные перемены в области специфической профилактики оспы у птиц в нашей стране произошли после внедрения в 1989 году сухой культуральной вакцины из вируса оспы кур и вскоре, в 1993 году, жидкой культуральной вакцины из голубиного вируса оспы, разработанных в ВГНКИ В.В.Гуненковым, З.Я.Чистовой, Г.Д.Кузнецовой и др. (1990, 1992, 1993).

Первая вакцина вводится птицам уколом в перепонку крыла однократно и обеспечивает создание иммунитета на срок не менее 12 месяцев. Вторая применяется аэрозольно и стимулирует образование иммунитета на срок до 7 месяцев.

Недостатком первой вакцины является небольшой запас инфекционной активности, чтобы быть примененной аэррзольно. А у второй недостаточная иммуногенность, поэтому она требует двукратного применения.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящих исследований явилось изучение иммуногенных свойств и структуры генома вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток, с перспективой создания более иммуногенной культуральной вакцины, пригодной для нескольких способов применения.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния дозы вакцинного вируса оспы кур шт.ВГНКИ-3, репродуцированного в культуре клеток, на формирование и длительность противооспенного иммунитета у цыплят, привитых аэрозольно.

2. Изучение динамики формирования и длительности иммунитета против оспы у цыплят, привитых культуральным вирусом оспы внутрикожно.

3. Изучение эффективности иммунизации против оспы цыплят раннего возраста.

4. Изучение структуры генома вируса оспы кур, шт.ВГНКИ-3, репродуцированного в культуре клеток, методом рестрикционного анализа.

Научная новизна работы.

Показана высокая иммунизирующая активность культурального вируса оспы кур при аэрозольном и внутрикожном применении цыплятам в возрасте 60, 106 и 136 дней. Иммунитет формируется в течение 5-7 дней на срок не менее 12-14 месяцев. Установлена зависимость динамики образования и длительности противооспенного иммунитета главным образом от дозы вакцинного вируса при иммунизации цыплят в возрасте 60 дней и старше. Экспериментально показано, что длительность противооспенного иммунитета у цыплят, привитых внутрикожно в возрасте 1-18 дней, ограничивается сроком, не превышающим 3-4 месяцев.

Методом рестрикционного анализа установлена структура генома вакцинного штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, а также признаки сходства и отличия его от других штаммов вируса этого вида. Разработаны физические карты генома вируса.

Практическая значимость работы заключается в том, что обоснована целесообразность применения штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток, для иммунизации цыплят и кур против оспы с использованием нескольких способов иммунизации. Профили рестрикции и размеры PST 1, Sal Gl, Hind Ш и Bam HI фрагментов ДНК штамма ВГНКИ-3 могут служить его генетическими маркерами.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на: • 13 Международном симпозиуме Всемирной ассоциации ветеринарных микробиологов, иммунологов и специалистов по инфекционным болезням, 1994 (Перуджа - Мантова, Италия).

• Второй Международной научно-практической конференции

I

«Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции», 1997 (Москва).

• Конференции ВНИИВВиМ, посвященной 40-летию института, 1998 (г.Покров).

Диссертационная работа апробирована на межлабораторном совещании ВГНКИ (протокол N 4 от 29.03.99 г).

Публикации. По материалам исследований опубликованы 4 печатные работы (Россия, Италия).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Штамм ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированный в культуре клеток куриного эмбриона, обладает высокими иммунизирующими свойствами при аэрозольном, внутрикожном и интраназальном применении цыплятам разного возраста.

2. Сроки формирования противооспенного иммунитета не зависят существенно от возраста прививаемых цыплят, дозы и пути введения вакцинного вируса.

3. Доза вакцинного вируса оказывает существенное влияние на длительность противооспенного иммунитета у цыплят.

4. Цыплята, привитые внутрикожно в возрасте 1-18 дней, приобретают иммунитет на срок, не превышающий 3-4 месяцев.

5. Структура генома вакцинного культурального вируса по результатам рестрикционного анализа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСПА ПТИЦ

I

1. Общие сведения об оспе птиц.

Оспа птиц - медленно протекающая болезнь, характеризующаяся развитием пролиферативных поражений на неоперенных частях тела птиц, а также на слизистых оболочках пищеварительного респираторного тракта, рта и пищевода (Tripathy 1984, 1989,1991, Olufemi, 1996, Boyle D.B.,1997, Ostrowski, 1996). Болезнь поражает цыплят, индеек, голубей, фламинго, перепелов, фазанов, канареек, страусов (Tripathy, 1991,A1-Ani, 1986, Arai S.,

1991, Olufemi, 1992, Perelman, 1988). Существуют две классические

»

формы клинического проявления болезни: кожная,

характеризующаяся появлением пролиферативных поражений на

неоперенных участках кожи, и дифтеритическая, при которой

поражаются слизистые оболочки ротовой и носовой полостей, а

также подглазничной ямки (Сюрин В.Н., 1998). При кожной форме

оспы обычно обнаруживают бородавчатые образования, покрытые

бурым кровянистым струпом, чаще на гребне, бородках, сережках, у

основания клюва, на щеках. Течение болезни преимущественно

хроническое. Оспа, протекающая без осложнений, заканчивается в

!

течение 5-6 недель. Кожная форма чаще протекает доброкачественно. Переболевшие куры становятся истощенными, многие слепнут на один или оба глаза. Летальность среди взрослых кур достигает 10-20%, среди молодняка, особенно в холодное время года - 50-70% (Сюрин В.Н. и др.,1998). Описана также атипичная форма оспы у бройлеров, при которой оспины появлялись только на оперенных участках кожи (Fallavena L.C et al, 1993). У индеек также описана венерическая форма оспы (Metz et al, 1985). Методом

борьбы с оспой является иммунопрофилактика. Важную роль в профилактике играет защита от насекомых для предотвращения механического переноса возбудителя москитами (Boyle D.B. et al.,1997).

2. Характеристика возбудителя.

t

Вирус оспы кур является типичным представителем рода вирусов оспы птиц (Avipoxvirus) подсемейства вирусов позвоночных (Chordopoxvirinae) семейства оспенных вирусов Poxviridae (Fenner F. et al., 1979, Tripathy et al., 1991).

2.1. Строение вириона.

Вирион вируса оспы кур кирпичевидной формы, средние размеры которого 258x354 nm (Randall С.С., Gafford, 1964 ), длина 3220 + 902 А, ширина 2640 ± 793 А и осевое соотношение 1,22 (Ф.Феннер, Б.Мак-Ослен и др., 1977). Типичный вирус оспы состоит из наружной трехслойной мембраны, которая заключает в себе двояковогнутую сердцевину, напоминающую форму гантели, и две овальные структуры - латеральные тела, функции которых не ясны (Панчева С., 1982). Вирусы оспы птиц имеют такую же структуру (Arhelger R., Randall С.С, 1964, Cheville N.F. et al., 1966 , Tajima M., Ushijima J., 1966). Наружный и внутренний слои оболочки

осмиофильны, средний - осмиофобный. На поверхности мембраны

i

имеются наружные шипики, размер которых варьирует от 300 А до 400 А. Обработка вируса оспы кур трипсином приводит к разрушению вирусной мембраны и высвобождению переплетенных канатоподобных структур, а также к потере шиловидных отростков. Внутренний слой мембраны, состоящий из субъединиц размером 40

А, имеет толщину 200-300 A (Hyde J.M., Gafford L.G. et al., 1965 ). Внеклеточные вирионы вируса оспы птиц покрыты дополнительной наружной оболочкой, отсутствующей у внутриклеточных вирионов. Она играет важную роль в индукции вируснейтрализующих антител (Сюрин В.Н.и др., 1998).

2.2. Физико-химические свойства вируса.

Вирусы оспы обладают различной устойчивостью к воздействию температуры. Наибольшую устойчивость имеют штаммы, распространенные в странах с тропическим климатом (Маренникова С.С., Мальцева Н.И., 1964). Это свойство характерно для отдельных штаммов и потому может варьировать у одного и того же вируса (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966). По данным (Щеглова И.В., 1971) отдельные клоны вируса оспы птиц теряли инфекционные свойства через 40 минут прогревания при 56° С, тогда как исходный штамм инактивировался через 20 минут. При нагревании до 50° С вирус теряет инфекционную активность в течение 30 минут, до 60° С - в течение 8 минут (Andrews С, Pereira H.G., 1978).

Большей термостабильностью обладают лиофилизированные вирусы оспы кур и голубей. При 100° С они сохраняют инфекционный титр в течение 10 минут, далее он снижается и через 120 минут наступает их полная инактивация. При температуре минус 4° С лиофилизированные вирусы сохраняются в течение 170 дней (Alboiu М., Bern S. et al, 1967).

Вирус оспы птиц чувствителен к этиловому спирту, быстро

погибает в гниющем субстрате. В оспенных корочках при

j

температуре минус 15 градусов вирус выживает до 2 лет и более. Вирус оспы кур инактивируется 1% раствором каустической соды и

фенола. Формалин в разведении 1:1 ООО инактивирует его в течение 9 дней. Хлороформ-бутанол разрушает вирус, но не действует на

ДНК, трипсин не оказывает действия ни на ДНК, ни на вирус в

j

целом (Randall et al,1966 ). Устойчивость к обработке эфиром является общим признаком для этой группы возбудителей (Mattews R.E.F. et al., 1982 ).

2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты. У представителей рода Avipoxvirus присутствуют все признаки, общие для семейства Poxviridae, включая форму вириона, локализацию репликации в цитоплазме и большой геном,

I

представленный двухцепочечной ДНК (R.Drillien, D.Spehner et al 1987). Негенетическая реактивация наблюдается между вирусами не только одного рода, но и между представителями различных родов вирусов оспы позвоночных. Это показывет, что у всех представителей оспенных вирусов общие механизмы репликации. (Hanafusa 1959; Гуненков В.В.,1966; Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966).

Геном вирусов оспы представлен двухспиральной линейной молекулой ДНК, состоящей из 130-375 тысяч пар нуклеотидов.

I

Концы ДНК ковалентно связаны и содержат инвертированные повторы различной длины. Доля Г-Ц пар в нуклеотидном составе поксвирусов позвоночных составляет 35-64%. С нуклеоидом вириона ассоциировано 15 ферментов, некоторые из них участвуют в транскрипции ДНК и модификации информационных РНК:аденировании, кэпировании и метилировании (Сюрин В.Н.и др., 1998). Терминальные регионы 30-35 kb генома вируса оспы кур содержат гены, определяющие важнейшие вирусные

характеристики, такие как спектр хозяев, вирулентность, тропизм и поведение в культуре клеток. Физическое расположение этих генов варьирует и степень консервативности среди них значительно ниже, чем у генов из центрального региона генома (Mockett, Archard, 1979).

ДНК вируса оспы кур неинфекционна. Вирусы оспы

I

размножаются в цитоплазме клетки. Процессы, связанные с их репродукцией, исследованы главным образом на различных вариантах вируса осповакцины и типичны для всех представителей семейства. Репликативный цикл делится на следующие стадии: адсорбция, проникновение в клетку, раздевание, ранняя транскрипция, репликация ДНК, поздняя транскрипция, сборка вируса, созревание и выход из клетки (Б.Филдс, Д.Найп и др., 1989). Внешняя мембрана вируса сливается с клеточной плазматической мембраной или с мембраной вакуоли, образованной путем

I

инвагинации, что приводит к проникновению вирусного нуклеоида в цитоплазму виропексисом (Dales S., Kajioka R., 1964, Chang A., Metz D.N., 1976, Панчева С., 1982 ). Стадия раздевания протекает в две фазы. Вначале под влиянием протеолитических ферментов разрушается большая часть белка и фосфолипидов оболочки вируса и высвобождается нуклеоид. Этот процесс продолжается около 20 минут. Далее с ДНК нуклеоида осуществляется транскрипция, а рибосомами клетки обеспечивается синтез ранних вирусных

протеинов и вирусспецифического раздевающего в том числе. Под

i

воздействием последнего происходит депротеинизация ДНК до формы, чувствительной к ДНК-азе (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966, Ф.Феннер, Б.Мак-Ослен и др., 1977, Панчева С., 1982).

На стадии ранней транскрипции, протекающей до репликации вирусной ДНК, транскрибируется около половины вирусного генома. Происходит синтез ряда ранних белков и ферментов на клеточных рибосомах (Esteban M., Metz D.N., 1973, Williamson J.D., Cooke В.S., 1973, Brakel S, Kates J., 1974, Pennington T.N., 1974, Boone R.F. Eusinger M.J. et al, 1977, Boone R.F, Moss В., 1978, Paoletti E, Grady L.J., 1977).

Специфическим признаком вирусов оспы является цитоплазматическая локализация ^ репликации ДНК, хотя новосинтезированная вирусная ДНК иногда попадает в ядро ( Pennington T.N, 1974, Gafford L.G, Randall C.C, 1976). Ее синтез укладывается во времени с 1,5 ч до 6 часов после заражения (Joklik W.K, Becker J, 1964). На поздних стадиях транскрибируется почти весь геном и синтезируются ранние и поздние структурные белки и ферменты ( Paoletti Е,Соорег N. et al, 1974, Paoletti Е, Grady L.J, 1977, Boone R.F, Moss В, 1978).

Начальные стадии образования вириона происходят в ограниченных гранулярных областях цитоплазмы, расположенных в стороне от клеточных мембран. Происходит накопление вирусных оболочек в этих местах. Далее незрелые вирусные мембраны принимают сферическую форму благодаря проникновению внутрь гранулярного матрикса плотной массы нуклеопротеина непосредственно перед их полным закрыванием (Dales S, Pogo B.G.T, 1981). Не выяснено, как происходит дальнейшее формирование вирусных частиц, в ходе которого возникает сложная организация наружных и внутренних компонентов. Очевидно оно должно сопровождаться непрерывно идущим синтезом белков (Б.Филдс, Д.Найп и др., 1989). Зрелые

вирусные частицы покидают область сборки и перемещаются к периферии клетки. Они отделяются от микроволокон, являющихся частью клеточного скелета, и приобретают двуслойную мембрану, формирующуюся из материала аппарата Гольджи. Далее наблюдается слияние зрелых вирионов с цитоплазматической мембраной, в результате чего происходит экстернализация последних (Ichihashi G., Matsumoto S. et al., 1971, Hiller G., Juhgwirth

C. et al, 1982 ).

Таким образом, после заражения клеток в них существенно увеличивается ДНК-полимеразная активность. Синтез ДНК-полимеразы идет с 1-1,5 ч до 4 ч, и она является вирус-специфической. Репродукция вируса осповакцины в клеточных системах также начинается через 1-1,5 ч, достигает пика через 2,5-3 ч и заканчивается на 90% и более через 4-5 ч. В это время в клетке еще содержится много свободных молекул ДНК, способных служить матрицами для дальнейшей репликации (Гендон Ю.З., 1975).

2.4. Характеристика полипептидного состава вируса оспы кур.

Геном вируса оспы кур на 100 kb больше, чем геномы оспы млекопитающих, что дает возможность кодировать широкий спектр специфических и неспецифических белковых продуктов, функцией которых является изменение клеток хозяина и блокирование антивирусных защитных механизмов. При сравнительном изучении полипептидного состава вирусов оспы кур и осповакцины было установлено наличие значительного количества белков со сходной электрофоретической подвижностью. Было выявлено 28 вирионных полипептидов у вируса оспы кур и 31 у вируса осповакцины, это наибольшее количество протеинов, известное среди вирусов (Boyle

D.B., 1997, Banks Т.А., Rouse В.Т., 1991, Gooding L.R., 1992, Smith

G.L., 1993, Spriggs M.K., 1996). Holowczak и Joklik (1967) обнаружили 17 протеинов у вируса осповакцины . У вирусов оспы кур и осповакцины не выявили высокомолекулярный белок массой 150000 Да, хотя у других крупных ДНК-вирусов, таких как вирус простого герпеса, отмечали наличие 5 высокомолекулярных протеинов (Spear P.G., Roisman B.J., 1972). Общая молекулярная масса белков вируса оспы кур 1 626 ООО Да или 16 ООО аминокислотных остатков. По данным (Hyde J.M., Gafford L.G. et al, 1967, Gafford L.G., Randall С.С., 1967) размер генома вируса оспы

кур составляет 200x10^ Да и 16% генома кодируют структурные

вирионные белки. ДНК вируса осповакцины имеет размер 180x10^ Да (Sarov I., Becker Y., 1967) и структурные протеины кодируют 19% генома. Большинство белков обоих вирусов имели одинаковую электрофоретическую подвижность, особенно в области разделения высокомолекулярных фрагментов. Поскольку все оспенные вирусы содержат общий нуклеопротеиновый антиген , возможно, что некоторые из белков вирусов оспы птиц и осповакцины со сходной подвижностью в геле агарозы могут быть связаны с их антигенной активностью (Boyle D.B., 1997, Banks Т.А., Rouse В.Т., 1991, Gooding L.R., 1992, Smith G.L., 1993, Spriggs M.K., 1996).

По данным M.Arita, I.Tagaya (1979) у вируса оспы кур и вируса осповакцины обнаруживали белки с молекулярной массой около 60000 Да, которые различались в нижнем регионе молекулярных масс. У обоих вирусов присутствовали полипептиды 25000 Да. Obieski J.F., Palmer et al (1973) отмечали, что структурные белки вируса оспы кур различались с таковыми у вируса осповакцины .

По данным Obijeski et al (1973) вирус оспы кур содержит 28 структурных полипептидов. Молекулярная масса наибольшего

белка была 70 кДа. А.Р.А.Москей, БЛ^оиЛее й а1 (1987) выявили 30 вирусных полипептидов в препарате очищенного вируса оспы кур, спектр масс которых колебался от 138 кДа до 14 кДа. В профилях расщепления полипептидов присутствовали 3 мажорные полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 91,64 и 58 кДа. Однако, по данным М.АгНа и I.Tagaya (1979) вирион оспы кур содержит мажорные белки массой 97 и 58 кДа.

А.Р.А.Москей, БЛ-БоиШее еЬ а1 (1987) показали, что большинство вирусных белков вируса оспы кур являются иммуногенными. Антисыворотка вступала в реакцию с белками массой 35 и 37 к Да. Три мажорных вирусных белка не являются основными иммуногенными полипептидами и, вероятно, относятся к сердцевинным белкам .

\У.М.8с1тк21ет, N. СЫ1сНа1, Б.КТпра&у (1988) изучили полипептидный состав 4 полевых и 2 вакцинных штаммов вируса оспы кур. Антигены с молекулярной массой 107, 63, 60, 47, 36, 32, 26 и 17 кДа были общими для всех изученных штаммов. Тем не менее, были обнаружены и различия^ в антигенном составе. Так, у штамма Уте1апс1 присутствовали уникальные белки 18 и 38 кДа, а протеин массой 37 кДа был представлен только у штамма к^егуе!. Штамм Яапс1а11-2 выделялся наличием 30 кДа антигена. Полипептид с молекулярной массой 34 кДа был общим для штаммов Мегуе! и ЗраГаэ. Присутствие сходных антигенов у различных штаммов вирусов оспы кур явилось закономерным, поскольку классификация Ау1роху1гш в основном базируется на иммунологических методах (МаНе-^УБ ШЕЛ7.,1982).

Высокая степень антигенной и геномной консервативности среди вирусов оспы птиц может быть использована в классификации других изолятов из рода Ау1рохущд8. В этой связи следует заметить,

что генетически сходные вирусы Junco и оспы голубей содержат антигены, обнаруженные у вирусов оспы кур. Антигенное родство оспы кур и голубей было выявлено благодаря возможности перекрестной иммунизации цыплят (Winterfield R.W. et al, 1965). Однако этот феномен не наблюдается среди остальных вирусов оспы птиц, таких как оспа перепелов и индеек (Winterfield R.W., Reed W.,1985).

Антигенные различия между вирусами оспы кур, голубей, перепелов и канареек изучали N.Ghildyal, W.M.Schnitzlein et al, 1989; W.M.Schnitzlein, N.Ghildyal, D.N.Tripathy( 1988). Они показали, что антигены с молекулярной массой 36, 35,5 и 26 кДа присутствовали у всех испытанных вирусов, кроме 2 штаммов вируса оспы перепелов.

Таким образом, для вирусов оспы птиц характерна высокая степень консервативности в строении генома и антигеном составе (M.Arita и I.Tagaya ,1979). В этой связи следует заметить, что вирусы оспы кур и голубей содержат общие антигены детерминанты. Антигенное родство вирусов оспы кур и голубей было выявлено благодаря возможности перекрестной иммунизации птиц (Winterfield R.W., 1965). Однако этот феномен не наблюдается у других вирусов оспы птиц, таких как оспы перепелов и индеек (Winterfield R.W., 1985). Однако, по, данным Сюрина В.Н. (1998) между вирусами оспы кур, голубей и индеек имеется родство. Вирус оспы канареек в иммунологическом отношении отличается от возбудителей оспы кур и голубей. Антигенная вариабельность у вируса оспы кур не установлена.

3. Молекулярно-биологические методы изучения структуры генома.

Представители семейства Рохутёае - самые крупные из известных вирусов-разделены на 6 родов, включающих около 40 видов, представители которых имеют широкий круг восприимчивых организмов - млекопитающие, птицы и насекомые (Н.К.МиПег, Б1.\¥1иек ег а1, 1977, Р.Беппег, 1976). Классификация в основном основывается на фенотипических критериях, таких как морфология, антигенные свойства, спектр хозяев и поведение в культуре клеток (А.Мауг, Н.Ма1те1 а1, 1972). Новый изолят может быть отнесен к одному из родов путем установления близкого серологического родства среди его представителей. Однако, идентификация вирусов оспы внутри рода более сложна и традиционных методов для этого недостаточно (Н.К.МиПег, Я^йек ег а1, 1977, Н.Ма1те1 е1 а1, 1974, Б.ВахЬу, 1975). В настоящее время получили развитие новые методы идентификации и дифференциации вирусов, основанные на исследовании их нуклеиновой кислоты - рестрикционный анализ, различные виды гибридизации, полимеразная цепная реакция, секвенирование и др. Большинство из этих методов (гибридизация, ПЦР, секвенирование) предназначено для исследования отдельных участков генома, и только рестрикционный анализ позволяет сравнивать полные геномы больших вирусов. По данным (Н.К.МиПег, Я^Шек е1 а1, 1977) рестрикционный анализ является наиболее чувствительным методом сравнения близкородственных геномов, так как определенные изменения в последовательности оснований, которые невозможно, обнаружить электронной микроскопией или гибридизацией, приводят к изменению профилей рестрикции. Поэтому использование рестрикционного анализа и физического картирования открывает новые возможности для характеристики вирусных изолятов и определения их эволюционной

близости. Шансы обнаружить различия в последовательности ДНК увеличиваются с использованием нескольких рестриктаз.

Таким образом метод рестрикционного анализа позволяет выявить мутантные варианты в популяции, проводить контроль за генетической стабильностью популяции при пассировании вируса in vivo и in vitro, составлять генетические паспорта вакцинных, производственных и референс штаммов.

3.1. Физическое картирование геномов.

Физическое картирование является необходимым этапом изучения функциональной организации генома. Под физической картой генома понимается известная последовательность любых маркеров, то есть любых наследуемых и тестируемых свойств на молекуле ДНК. Практически в качестве молекулярно-генетических маркеров используют участки молекулы ДНК, узнаваемые рестриктазами, так как положение этих участков достаточно постоянно и при расщеплении молекулы на отдельные фрагменты, каждый из них сохраняет внутри себя маркеры в той же последовательности, что и в исходной молекуле (Янковский Н.К, 1989). Определение мест расположения сайтов рестрикции удобно и потому, что позволяет в дальнейшем работать лишь с небольшими, наиболее интересующими участками больших геномов, которые можно "вырезать" соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Построение физических карт обычно предшествует проведению работ по картированию белок-кодирующих областей и секвенированию. Физические карты активно применяются и для выявления эволюционной близости геномов. (Templeton A.R, 1983; Helm-Bychowsky K.M., Wilson A.S, 1986).

Первым этапом построения физической карты генома вирусов является рестрикционный анализ исследуемой ДНК, включающий в себя выбор наиболее удобных для картирования рестриктаз, расщепляющих исследуемую молекулу ДНК на минимальное количество фрагментов. Так как эндонуклеазы рестрикции имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК, а, следовательно, к получению смесей продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться (Сулимова Г.Е., 1993).

Для построения физических карт геномов вирусов исследуют молекулы ДНК, выделенные из препаратов высоко очищенных вирусов, что предотвращает получение ложных результатов, источником которых может служить примесь клеточных ДНК. В основе физического картирования лежит анализ профилей миграции фрагментов, полученных в результате рестрикции ДНК отдельно двумя различными ферментами и ее одновременного расщепления этими же ферментами, позволяющий установить относительное взаиморасположение фрагментов по двум рестриктазам. Однако, при изучении молекул ДНК, имеющих более 10 сайтов рестрикции по каждой эндонуклеазе, для однозначного восстановления физической карты таких данных недостаточно (Певзнер П.А., Миронов A.A., 1987). Это связано с серьезными вычислительными сложностями. В этих случаях для уточнения информации о расположении фрагментов дополнительно применяют один или несколько из перечисленных ниже способов анализа, набор и

последовательность выполнения которых подбирается для каждого конкретного исследования.

- Расщепление отдельных фрагментов рестрикции второй рестриктазой и последующее электрофоретическое разделение вновь образованных фрагментов в гелях агарозы.

- Частичное расщепление ДНК (недорестрикция), которое дает возможность получить информацию о смежных фрагментах на молекуле ДНК, что сокращает число допустимых парных карт.

Использование концевых меток позволяет определить расстояния от сайтов рестрикции до помеченного конца молекулы и значительно облегчает определение положения нескольких сайтов рестрикции, близких к помеченному концу.

- Гибридизацией по Саузерну можно установить участки ДНК с гомологичной последовательностью нуклеотидов, то есть идентифицировать перекрывающиеся фрагменты разных рестрикций.

Очевидно, что построение физических карт геномов даже с 10-20 сайтами по каждой рестриктазе является сложной и трудоемкой процедурой, связанной с огромным количеством гипотез о порядке расположения рестрикционных фрагментов. В связи с постоянным расширением работ по физическому картированию больших геномов, а также с целью повышения эффективности проведения генно-инженерных разработок путем анализа карт рестрикции ДНК были созданы специальные компьютерные программы (Александров A.A., 1990). Развитые программы физического картирования имеются в пакетах программ DNASIS и DNASTAR (Hoyle Р., 1987). Они позволяют вводить и редактировать данные о длине пробега рестрикционных фрагментов в гелях, рассчитывая затем их размеры в парах оснований относительно миграций фрагментов ДНК

маркера. На основании результатов одиночной и совместной рестрикции строятся три возможных варианта физической карты линейной или циркулярной формы с указанием процента соответствия. Рассчитанные варианты карт выводятся на дисплей или распечатываются на принтере.

Физическое картирование может быть значительно облегчено в случаях наличия данных о физических картах геномов вирусов, относящихся к тому же семейству, роду или группе. Это связано с тем, что комиграция расщепленных 'фрагментов в геле хотя и не означает их идентичности, но в случае близкого родства ДНК исследуемых изолятов свидетельствует о том, что они представляют аналогичные отделы геномов. Таким образом, сходство или расхождение профилей миграции различных ДНК отражает степень их генетического родства (H.K.Muller, R.Wittek et al, 1977) и может служить основой для построения сравнительных физических карт.

3.2. Молекулярно-биологическая характеристика ДНК различных представителей семейства Poxviridae.

H.K.Muller, R.Wittek et al, 1977 сравнили геномы 4 представителей рода Orthopoxvirus с разной степенью биологического родства (вирус оспы кроликов, КРС, вирусы осповакцины и эктромелии) и рода Avipoxvirus (оспа кур). Было показано, что геномы вирусов оспы кроликов и осповакцины близкородственны, поскольку отмечали значительное сходство биологических свойств. Обработка ДНК вирусов оспы кроликов и осповакцины эндонуклеазой Hind III приводила к расщеплению молекул на 15 и 17 фрагментов соответственно, и на картине рестрикции отмечалось сходство 1 значительной части числа фрагментов (до 80%). Однако, не представлялось возможным доказать, принадлежат ли вирусы оспы кроликов и осповакцины к

одной разновидности или просто являются разными вирусами в пределах одного рода. В профилях разделения ДНК представителей рода Orthopoxvirus вирусов оспы КРС и эктромелии присутствовало соответственно 18 и 22 Hind III фрагмента, из которых только 6 имели сходную электрофоретическую подвижность, что указывало на отсутствие генетического родства между ними. Так же не было выявлено сходства их геномов с ДНК других представителей этого v рода, таких как вирусы оспы кроликов и осповакцины. Полученные данные подтверждают результаты гибридизации A.J.D.Bellet, F.Fenner (1968), но не согласуются с результатами H.Mahnel (1974) по исследованию фенотипа этих возбудителей. Сравнение профилей миграции фрагментов ДНК вируса бспы кур с рестрикционными картами ДНК перечисленных представителей рода Orthopoxvirus выявило минимальное сходство геномов представителей двух родов семейства Poxviridae.

Молекулярные массы ДНК всех испытанных вирусов находились в пределах 116,9-127,5 кДа, за исключением генома вируса оспы

/г

кур, молекулярная масса которого составила 160x10 Да. Полученные данные оказались ниже, чем сообщали L.G.Gafford, C.C.Randall (1967). Coupar В., Тео Т, Boyle D.B.(1990) показали, что

I

общий размер геномов штаммов FPV-M и FPV-M3 вируса оспы кур

составил 308,6 и 298,6 kb (203.3x106 и 196.7x106 Да) , что согласуется с данными L.G.Gafford и C.C.Randall (1967) для полевого штамма ВОК. По данным (H.K.Muller, R.Wittek et al, 1977) молекулярная масса генома вируса осповакцины составила

125.3x1Да. Эти результаты подтверждают данные P.Geshelin, K.I. Berns (1974). Самая маленькая ДНК среди перечисленных возбудителей, размер которой был на 6 млн. Да меньше, чем у

вируса осповакцины, была у вируса оспы кроликов . Таким образом было показано, что геном вируса оспы кур отличался от геномов представителей рода Orthopoxvirus. У представителей этого рода отмечали отсутствие генетического родства. Однако,R.Wittek et al (1977) сообщали о высокой степени консервативности геномов ортопоксвирусов. Все основные различия ДНК в пределах этого рода были расположены в терминальных регионах геномов, фрагменты которых обладали у различных изолятов разной электрофоретической подвижностью (J.R.Lake, P.D.Cooper, 1980). По аналогии, некоторые из уникальных фрагментов ДНК геномов вирусов оспы птиц могут относиться к вариабельным терминальным областям (W.M.Schnitzlein, N.Ghildyal, D.N.Tripathy(1988).

W.M. Schnitzlein, N.Ghildyal, D.N.Tripathy(1988) сравнивали полевые и вакцинные штаммы вирусов оспы кур и голубей с целью определения консервативных областей их геномов. Профили ДНК, расщепленных Hind III,различались фрагментом величиной 9,7 kb, который был представлен у вакцинных штаммов Salsbury и Sterwin, полевого штамма U-1, и отсутствовал у вакцинных шт.СЕУА и Vineland. Аналогичные данные были получены в результате рестрикции ДНК вирусов оспы птиц эндонуклеазой Bam Н I. Отличия профилей расщепления исследуемых штаммов состояли в отсутствии или наличии фрагментов 9.4 и 8.5 kb. В геноме вакцинного вируса оспы голубей присутствовал фрагмент размером 2,9 kb, а фрагмент 5,3 kb был представлен у полевых штаммов FPC и Randall-2 ВОК. На картине распределения рестрикционных отрезков полевого шт. Junco и вакцинного вируса оспы голубей отсутствовали фрагменты 12,2, 6,2, 2,6 kb, представленные у других изолятов.

ДНК полевых шт. Junco и Randall-1 вируса оспы кур, расщепленные Bam Н I, имели идентичные фрагменты 8,1 и 3,9 kb. Полевые штаммы Randall-2 и FPC имели уникальный фрагмент 5,1 kb, в то время как в геноме полевого nrr.Spafas присутствовал фрагмент 9,0 kb.

Таким образом, сравнение электрофореграмм геномов вирусов оспы кур после обработки Bam Н I и Hind III выявило большое количество комигрирующих фрагментов. Большинство изолятов различалось наличием или отсутствием 1 или 2 фрагментов ДНК. Более того, профили ДНК полевых шт. Junco и Randall-1 вируса оспы кур или полевого штамма U-1 и вакцинного штамма Sterwin практически не различались. Большое количество комигрирующих фрагментов в профилях расщепления ДНК, составляющих основную массу генома, подразумевает более, чем 80% гомологию между изолятами (D.Schumperl, R.Lagades et al, 1978), хотя подтверждение этого заключения требует проведения молекулярной гибридизации. Сравнив электрофореграммы вакцинных и вирулентных штаммов вируса оспы кур, W.M.Schnitzlein, N.tíhildyal, D.N.Tripathy (1988) не удалось обнаружить связь вирулентности с полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов ДНК.

N.Ghildyal, W.M.Schnitzlein, ,D.N.Tripathy (1989) был проведен рестрикционный анализ геномов вирусов оспы кур и перепелов. Электрофорез продуктов расщепления ДНК вирусов оспы кур и перепелов по BamHI, EcoRl и Hind III показал, что в их профилях рестрикции отсутствовали комигрирующие фрагменты, а сравнение геномов трех штаммов вируса оспы перепелов выявило высокую степень их гомологии. Профили рестрикции последних различались по электрофоретической подвижности 2-3 фрагментов.

Приведенные данные соответствуют классификации вирусов оспы кур и перепелов, относящей их к разным видам из рода Avipoxvirus.

Coupar В., Тео Т, Boyle D.B.(1990) провели исследования генома вакцинного штаммма FPV-WEB вируса оспы кур и показали, что эндонуклеаза PST 1 расщепляет исследуемую ДНК на 17 фрагментов размером от 1,3 до 63 kb, а эндонуклеаза BamHI - на более, чем 30 фрагментов, массы которых находились в пределах от 2,1 до 39 kb. Размер терминальных BamHI фрагментов ДНК этих штаммов составлял 8,2 kb и был на 2 kb больше, чем сообщали J.I.A.Campbell et al (1989) для других штаммов вируса оспы кур. Различия концевых последовательностей геномов были характерны для представителей родов Orthopoxvirus (H.K.Muller et al, 1977) и Parapoxvirus (U.Gassman, R.Wyler et al, 1985). Профили рестрикционных фрагментов разных вирусов оспы птиц по мнению W.N.Schitzlein et al (1988) существенно различались. Однако^ими не было показано, относятся ли эти различия к терминальным областям генома.

Coupar В., Тео Т, Boyle D.B.(1990) показали, что размер генома вируса оспы кур является самым большим по сравнению с геномами других вирусов оспы и составляет приблизительно 300 kb или 200-

240x10^ Да (для сравнения - у вируса осповакцины - 185 kb) (L.G.Gafford, C.C.Randall, 1967). "Добавочные" 100 kb, могут кодировать от 50 до 100 белков. Гомология между вирусами оспы кур и осповакцины и возможность каждого распознавать промоторы сиквенса другого (D.B.Boyle et al, 1986) может означать использование сходных механизмов репликации и транскрипции для феномена негенетической реактивации внутри семейства Poxviridae

(H.Hanafusa, T.Hanafusa et al, 1959; Гуненков B.B., Сюрин B.H., 1966).

D.B.Boyle, A.D.Pye, B.E.H Coupar (1997) сравнивали вакцинные и полевые штаммы ВОК для определения корреляции структуры генома с вирулентностью и патогенностью генотипов, выявленных расщеплением ДНК рестриктазой PST 1. Сравнение более вирулентного вакцинного штамма FPV S с "мягким" штаммом FPV-М показало наличие различий в строении концевых фрагментов ДРЕК, которые были очевидны после обработки PST 1 и SalG 1. В картине распределения шт. FPV S присутствовал уникальный фрагмент PST 1 размером 9,8 kb и терминальные фрагменты генома шт. FPV S были меньше, чем у шт. FPV-M. Профили ДНК полевых изолятов вируса оспы кур были сходны с FPV S по всем испытанным рестриктазам - PST 1, SalG 1, BamHI, EcoRIh Hind III с небольшими вариациями в размерах фрагментов.

Фрагмент размером 10 kb был в переварах PST 1 ДНК всех полевых изолятов и uit.FPV S, но отсутствовал у iht.FPV М. Присутствие Not 1 сайтов рестрикции только в околоконцевых регионах вирусного генома (B.E.H.Coupar, Т.Тео et al, 1990) было использовано для подтверждения вариабельности в терминальных фрагментах различных изолятов. Рестрикционный анализ не выявил прямой корреляции между вирулентностью и структурой ДНК (B.E.H.Coupar, Т.Тео et al, 1990, L.G.Gafford, C.C.Randall, 1967), что соответствует данным W.M.Schnitzlein, N.Ghildial et al (1988).

Таким образом, для вирусов оспы кур характерна высокая степень консервативности геномов (W.M.Schnitzlein, N.Ghildial et al, 1988)^и основные различия в строении геномов вирусов оспы птиц лежат в терминальных околоконцевых регионах. Геномы вирусов оспы кур и голубей близкородственны.

4. Некоторые аспекты формирования иммунитета при оспе птиц.

Активный приобретенный иммунитет против оспы птиц является результатом выздоровления после перенесенной инфекции или вакцинации. Продолжительность и напряженность иммунитета у цыплят после иммунизации зависит 6т состава вакцины, метода ее введения, возраста и восприимчивости птицы. Он формируется за счет гуморальных и клеточных факторов. Персистенция вирусов оспы и латентная инфекция могут также стимулировать образование иммунитета на достаточно продолжительный период.

Гуморальный иммунитет проявляется образованием вируснейтрализующих, гемагглютинирующих, преципитирующих и комплемент-фиксирующих антител. По данным (Tsubahara Н., Sazava Н. et al, 1956; Wittmann G., 1958, Tsubahara H., Kataoka T. Et al, 1960, Jordan F.T.W., Chabb R.C.,1962, Pilchard E.I., Hanson L.R. et al, 1962, Dorn P., Kronthaler O., 1965, Tripathy D.N. Hanson L.E. et al, 1970); они вырабатываются начиная с 11-14 дня после вакцинации. Вируснейтрализующие антитела сохраняются дольше, чем комплементсвязывающие (Tsubahara Н., Kataoka Т. Et al, 1960). Преципитирующие антитела присутствуют в крови цыплят с момента появления в течение 2-5 недель (Tripathy D.N. Hanson L.E. et al, 1970.).

После иммунизации цыплят у них появляются сначала Ig М , обнаруживаемые в реакции агглютин'ации или в реакции пассивной гемагглютинации. Затем выявляются Ig G - основной класс иммуноглобулинов в сыворотке цыпленка (C.Vencatasubba Rao, M.S. Jayaraman et al, 1978).

C.Morita et al (1973), P.N.Pathak et al. (1974), R.Dharsana et al (1985) исследовали влияние клеточного иммунитета на формирование невосприимчивости в вирусу оспы птиц у цыплят. В

t

монослое макрофагов, полученных от иммунных к оспе кур, вирус оспы птиц накапливался в титре 1,0 lg, тогда как культура клеток нормальных макрофогов давала накопление до 2,0 lg и более. Резистентность клеток к оспе кур считается по природе неспецифичной, поскольку задерживает размножение не только гомологичных вирусов, но и других вирусных и бактериальных антигенов. Количество интерферона продуцировалось больше в случае использования иммунных к' оспе макрофагов, чем при исследовании нормальных макрофагов (Pathak P.N., Rama Rao G.V.S.V. et al, 1974).

R.Dharsana et al (1985) исследовали клеточный иммунитет к вирусу оспы у цыплят в агарозном микрокапельном тесте ингибиции миграции лейкоцитов, сравнив его с тестом задержки реакции на сережке in vivo. Оба теста становятся положительными в пределах 5 дней после вакцинации. Это коррелирует с ранним развитием иммунитета после вакцинации вирусом оспы птиц и способностью переноса защиты с клеток селезенки в течение 8 дней после вакцинации, тогда как гуморальный иммунитет включается в работу позднее. Наиболее выраженная ингибиция на 26 и 33 сутки.

Предполагается передача антител от вакцинированных кур к потомству через желток (Tripathy D.N., Hanson L.E. et al, 1974 ).

Значение активации комплемента как раннего неспецифического механизма защиты против вирусной инфекции описывалось многими авторами (Hirsh R.L., 1981, Okada Н., Okada N. Et al, 1984, Okada H., Tanaka Н., 1985, Sissons J.G.R., Oldstone M.B.A. et al, 1980, Okada H, 1986). Клетки куриного эмбриона, зараженные in vitro аттенуированным вирусом оспы кур, вырабатывали комплемент, что приводило к задержке размножения вируса без участия продукции специфических антител (Ohta Н., Yoshikava Y. et al, 1983).

Вакцинный штамм ВОК, в отличие от полевого, вызывал антитело-

{<? I

независимую активация, комплемента у инфицированных цыплят, куриных эмбрионов и в зараженной культуре клеток куриного эмбриона. Гистологически вакцинный штамм вызывал более острое воспаление. По данным Ohta Н., Yoshikava Y. et al, (1988);супрессия комплемента у зараженных цыплят отягчала течение болезни, смягчая воспаление. Таким образом, острое воспаление, индуцированное активацией комплемента, являлось ранним защитным механизмом при заражении вакцинным штаммом.

5. Профилактика оспы кур.

Основным средством профилактики оспы птиц является иммунизация восприимчивого поголовья и,в связи с этим; основной задачей исследователей является разработка эффективных живых вирус-вакцин как из гомологичных, так и из гетерологичных штаммов вирусов оспы птиц (Корсунский О.М., 1932; Садовский Т.Я. и др., 1932; Б.М.Гуревич, И.А.Дукалов и др., 1934; Петровская Е.А., 1937; Лихачев Н.В., Ушаков A.A. и др., 1947; Сюрин В.Н., 1949; Дорошко И.Н., 1952; Ширинов Ф.Б., Фарзалиев И.А. и др., 1977).

Вакцины готовят из слабовирулентных штаммов. В зависимости от вирулентности вакцины иммунизация проводится в суточном возрасте или в первые 4-5 недель жизни. Иммунизация кур вакциной из куриного или голубиного вирусов заметно снижает экономические потери от этого заболевания, заключающиеся в снижении яйценоскости и уменьшении веса бройлеров . Вместе с тем, имеются сообщения (Fatunmbi О.О., W.M.Reed, 1994,1996, Tripathy D.N., 1993) о возникновении вспышек оспы в стадах птиц, вакцинированных против этой болезни. Авторы связывают это с

появлением в стаде генетических рекомбинантов, иммунологически отличающихся от вируса, входящего в состав коммерческой вакцины. По другим данным (Fatunmbi О.О, W.M.Reed, 1993, 1994, 1996);от вакцинированных птиц выделяют вирусы чаще.идентичные вирусам, входящим в состав применяемых коммерческих вакцин.

Вакцины против оспы.как правило ,вводят уколом в перепонку крыла, хотя были предприняты попытки применять их другими методами (Cunningham C.N, 1978). Птицу вакцинируют в суточном возрасте и в дальнейшем ревакцинируют. Для крупных птицеводческих хозяйств более выгодно применение с питьевой водой или аэрозольным методом для снижения затрат труда (Boyle D.B, Heine H.G, 1994). Наиболее эффективным является метод введения вируса в кожу методом укола или скарификации (Boyle D.B, Heine H.G, 1994; Taylor J, Edbauer С et al, 1990; Letellier C, Burny A. et al, 1991; Webster R.G, Kawaoka Y, Taylor J, 1991; Beard C.W, Schnitzlein W.M, Tripathy D.N, 1992).

A.Peleg, I.Samina, J.Brenner (1993) внутрикожно иммунизировали цыплят живой вакциной против оспы птиц в двух формах: заключенной в масло и растворенной в дистиллированной воде. Было показано, что к 14 дню после иммунизации в обоих случаях у 100 % птиц формировалась устойчивость к оспе птиц. Однако наблюдали различия в динамике формирования иммунитета:

I

на 9 день после применения вакцины были иммунными 60% птиц, вакцинированных вакциной в масле и 90% цыплят, получивших вирус в дистиллированной воде.

Хорошие результаты также были получены при введении вакцины парентеральным методом, таким как внутримышечный или внутривенный, однако они непригодны для широкого применения (Chambers Р, Emmerson Р.Т, Binns М.М, 1990, Edbauer С,

Weinberg R., Taylor J., 1990, Nazerian K., Lee L.F. et al, 1992). Вакцинация против оспы интраокулярно, интраназально или с питьевой водой обеспечивали значительно меньший эффект (Beard C.W., Schnitzlein W.M., Tripathy D.N., 1992, Taylor J., Edbauer С., Rey-Senelonge, 1990, Letellier С., Burny A. Et al, 1991), а применение вакцины аэрозольно требует подбора штаммов с высокой вирулентностью (Boyle D.B., Heine H.G., 1994).

В отечественной и зарубежной литературе имеется ряд сообщений об эффективности аэрозольной вакцинации птиц против оспы с использованием вакцин из вирусов оспы кур и голубей (Михальский Г.А., 1977, Сикачина В.И., 1977 ), а также комплексная иммунизация против болезни Ньюкасла и оспы (Р.Г.Мавлинаев, В.В.Чернышев и др., 1978); против инфекционного ларинготрахеита, оспы и болезни Ньюкасла (Ерохина Л.М., Архипов Н.И. и др., 1977, Дутко Ю.С., 1977). Однократная вакцинация против ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита и оспы приводит к формированию иммунитета у 100%, 93,7% и 92,85% соответственно.

Beaudette F.R.,1949, Graham R., Brandly C.A.(1940) сообщают, что развитие первичной вакцинальной реакции в месте внутрикожного введения вируса свидетельствует о возникновении противооспенного иммунитета, однако по данным Winterfield R.W., Hitchner S.B.(1965) отсутствие оспин в месте укола не является критерием оценки устойчивости птиц и необходимо проводить контрольное заражение. Учет контрольного заражения проводят на 6-8 дни после заражения, когда оспины достигают своего

I

максимального развития. Как правило, они локализуются в месте укола, без образования вторичных поражений и исчезают в течение 20 дней (Boyle D.B., Pye A.D. et al, 1997, Boyle D.B, Heine H. D.,

1994). Для контрольного заражения обычно используют вирулентные штаммы вируса оспы кур, что затрудняет применение данного метода контроля иммуногенных свойств противооспенных вакцин и оценку иммунного фона к оспе птиц в крупных птицеводческих хозяйствах. Т.В.Черкезовой и З.Я.Чистовой (1991) был предложен метод контроля иммуногенной активности вакцин против оспы птиц с использованием вакцинного штамма вируса оспы кур в дозах 100 и 1000 ИД50. Были получены равноценные результаты при использовании для контрольного заражения вакцинного штамма «К» в сравнении с вирулентным штаммом

I

«Кучинский» вируса оспы кур.

В нашей стране, начиная с шестидесятых годов, для профилактики оспы птиц применялась сухая эмбриональная вакцина из голубиного штамма вируса «Н-Д». (В.В.Бондарь, В.Н.Сюрин, 1968). Иммунитет после вакцинации этим штаммом наступал на 1520 сутки и сохранялся до трех месяцев у молодняка и до 5-6 месяцев у взрослой птицы. В неблагополучных по оспе хозяйствах цыплят вакцинировали в возрасте 25-30 дней, затем ревакцинировали в 5565-дневном возрасте и 145-155-дневном возрасте. В дальнейшем

I

взрослую птицу иммунизировали через каждые 5-6 месяцев (В.В.Бондарь, В.Н.Сюрин, 1968).

Ширинов Ф.Б. и др.( 1978, 1983) создали вакцину из штамма «27-АШ» вируса оспы фазанов. Штамм был выделен от больного фазана и аттенуирован последовательным пассированием его через организм голубя. Эта вакцина обеспечивала создание напряженного иммунитета на значительно большие сроки, чем предыдущая из штамма «Н-Д»: на 4 месяца у 30-дневных цыплят и на 9-10 месяцев у взрослых кур.

Помимо низкой иммуногенной активности и необходимости многократного применения, эмбриональные вакцины имели и другие существенные недостатки, связанные с контаминацией бактериальной микрофлорой, трудоемкостью способа их применения - втиранием кисточкой в фолликулы голени цыплят после удаления из них перьев. В связи с упомянутым, ветеринарная практика испытывала серьезные трудности в проведении мероприятий по защите птиц против оспы.

Ситуация по профилактике оспы у домашних птиц стала резко меняться в стране в конце 80-х годов в связи с разработкой в ВГНКИ культуральных противооспенных вакцин, отличающихся современной технологией, исключающей контаминацию препарата бактериальной микрофлорой, высокими иммунизирующими

I

свойствами, обеспечивающими 12-месячный иммунитет после однократного применения, и возможностью использования не только индивидуального (уколом в кожу), но и группового (аэрозольным) способов вакцинации птиц (Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., 1990).

Первой была создана и в 1989 году внедрена в производство и ветеринарную практику сухая культуральная вакцина ВГНКИ против оспы птиц из куриного вируса с разбавителем (Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., 1990). Вакцину применяют с 2-х

I

месячного возраста однократно уколом в перепонку крыла с помощью двухигольного инъектора. Иммунитет появляется на 7 день и длится до 12 месяцев. Вслед за этим препаратом была разработана жидкая культуральная вакцина ВГНКИ из голубиного вируса оспы, которая отличалась от первой возможностью применения не только уколом в кожу, но и аэрозольно (Гуненков

В.В.1991;ГуненковВ.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., 1990). В 1991 году вакцина была внедрена в ветеринарную практику.

Таким образом, к началу 90-х годов в стране стали применять культуральные вакцины для профилактики оспы у домашних птиц. Они полностью вытеснили из производства и применения эмбриональные вакцины. За многие годы применения культуральных вакцин в ВГНКИ не поступило ни одной рекламации

I

на эти препараты. В птицеводческих хозяйствах страны значительно улучшилась эпизоотическая ситуация по оспе.

Тем не менее, описанные выше культуральные вакцины имели отдельные недостатки. В частности, сухая вакцина имела недостаточный запас инфекционной активности, который необходим для применения ее не только внутрикожно уколом, но и аэрозольно.

Жидкая культуральная вакцина из голубиного вируса обладала

достаточной иммуногенной активностью и создавала напряженный

1

противооспенный иммунитета на срок до 7 месяцев и только после двукратного применения.

В связи с изложенным, целью настоящей работы было изучение иммунобиологических свойств культурального штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур с перспективой создания из него новой эффективной вакцины, предназначенной как для аэрозольного, так и внутрикожного однократного применения.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы вирусов. В работе использовали 2 штамма вируса оспы птиц.

1. Штамм ВГНКИ-3 вируса оспы кур. Взят из коллекции штаммов вирусов лаборатории. Адаптирован к культуре клеток кожи куриного эмбриона. Титр вируса 7,0 ^ ТЦД50/мл при титровании в культуре клеток или 4,0 ^ ИД50/0,015 мл при титровании на цыплятах.

2. Штамм «Кучинский» вируса оспы кур. Взят из коллекции штаммов лаборатории. Штамм поддерживается пассированием на куриных эмбрионах при заражении на ХАО. Титр вируса 5,5 ^ ЭИД 50/0,2 мл

Питательные среды, сыворотки.

1. 0,5% раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса (ГЛАХ).

2. Среда 199.

3. Сыворотка крови крупного рогатбго скота.

Антибиотики.

1. Пенициллин 100 ед/мл

2. Стрептомицин 100 мкг/мл

3. Гентамицин 5-10 мкг/мл

Растворы.

1. Раствор Хенкса (рН 7,2-7,4)

2. Раствор Эрла (рН 7,2-7,4)

3. Раствор бикарбоната натрия

-37-Животные.

1. Куриные эмбрионы 9-12-дневного срока инкубации.

2. Цыплята суточного, 18-, 60-, 106- и 136-дневного возраста.

Ферменты

1 .Раствор трипсина 0,2-0,25% (рН 7,2-7,4)

2. Эндонуклеазы рестрикции Sal GI, PstI, Bam HI, HindIII, ("Fermentas", г,Вильнюс)

3. ПротеиназаК (" Serva" ,ФРГ)

4. ДНК-аза 1, РНК-аза ("Pharmacia", Швеция).

Реактивы

В работе использовали следующие реактивы : борная кислота, уксусная кислота, соляная кислота, фенол, натрий едкий, спирт этиловый, спирт метиловый, трихлоруксусная кислота, хлороформ, натрий хлористый, натрий лимоннокислый (Россия), агароза, акриламид, бис-акриламид, ТЕМЕД, персульфат аммония, ксилен цианол, бромфеноловый синий, кумасси синий R-250, трис основной, ЭДТА-Ма2 соль, бромистый этидий, додецил сульфат натрия, саркозил натрия, бычий сывороточный альбумин, сахароза, ацетат натрия ("SERVA", ФРГ).

Лабораторное оборудование

- Комплект оборудования для электрофоретического разделения ДНК фирмы "Pharmacia";

- комплект оборудования фирмы Эппендорф, состоящий из центрифуги,

термостата, миксера;

- низкотемпературные холодильники на -20° , -70° С;

холодильный шкаф модели Комбиколд на 4°С

i

- трансиллюминатор;

-38- комплект автоматических микропипеток (Джилсон) с объемами: 0-20 мкл, 0200 мкл, 0-1000 мкл ;

низкоскоростная центрифуга модели 16-В «Бекман»; • высокоскоростные центрифуги ] 21 "Дескшап", ОТО-65 "БогуаГ';

- шуттель-аппарат;

- комплект оборудования для очистки воды модели МШ-С> фирмы «Миллипор»;

Заражение куриных эмбрионов.

10-11-дневные куриные эмбрионы заражали на хорионаллантоисную оболочку. Под контролем овоскопа на боковой поверхности скорлупы яйца отмечали участок между кровеносными сосудами и границы воздушной полости. Затем в скорлупе прокалывали два отверстия: в центре воздушной полости и в месте метки на скорлупе. В образовавшуюся полость шприцем вводили вирус в объеме 0,2 мл и заклеивали отверстие лейкопластырем.

Получение культуры клеток кожи куриного эмбриона (КЭК).

Культуру клеток КЭК готовили по методике А.БШт й а1 (1982), модифицированной в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против оспенных и респираторных инфекций. Для работы использовали куриные эмбрионы 9-12- дневного возраста. Эмбрионы стерильно извлекали из яиц, трехкратно отмывали раствором Хенкса с антибиотиками и однократно -раствором трипсина, подогретым до 37° С. Затем эмбрионы заливали раствором трипсина и помещали на магнитную мешалку на 7-10 минут. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 минут, ресуспендировали в питательной среде и фильтровали через двухслойный марлевый фильтр.

Концентрацию клеток определяли в камере Горяева. Для этого образец концентрированной суспензии разводили раствором Хенкса 1:10, тщательно перемешивали и вносили в камеру Горяева. Трижды подсчитывали общее количество клеток в камере и определяли среднюю. Концентрацию клеток в суспензии находили по формуле:

Х = АхВ/0,9 х 1000, где

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Яременко, Лилиана Ивановна

выводы

1. Штамм ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированный в культуре клеток куриного эмбриона, обладает высокой иммуногенной активностью при различных способах иммунизации цыплят. 1

2. Формирование противооспенного иммунитета у 90-100% цыплят в возрасте от 1 до 136 дней, вакцинированных аэрозольно, внутрикожно и интраназально разными дозами культурального вакцинного вируса, завершается к 5-7 дню после прививки.

3. Динамика формирования противооспенного иммунитета у птиц в течение первых 4-6 дней после аэрозольной вакцинации существенно зависит от дозы примененного вируса. Это выражается в появлении большего числа иммунных цыплят по дням в указанный период в группе, получившей большую дозу.

4. Сроки сохранения противооспенного иммунитета зависят от возраста, в котором привиты цыплята, способа вакцинации и дозы применения вакцинного вируса.

5. Наиболее продолжительный иммунитет, равный 14 месяцам, формируется после аэрозольной вакцинации цыплят в возрасте 60 дней и старше. К указанному сроку иммунными остаются все птицы, получившие дозу 3000 ТДЦ50 и регистрируется несколько меньший процент иммунных, равный 88,2±4,5 и 72,9±6,4% у птиц, получивших дозы 2000 и 1000 ТЦД50 соответственно.

6. Внутрикожная вакцинация цыплят в возрасте 60 дней культуральным вирусом в дозе 1000 ИД50 приводит к образованию напряженного иммунитета на срок не менее 12 месяцев при незначительном снижении процента иммунных птиц в этот период от 100 до 83,3+10,8%.

-1071

7. Суточные и 18-дневные цыплята, привитые внутрикожно, приобретают сравнительно короткий иммунитет на срок, не превышающий 3 и 4 месяцев соответственно при получении ими вируса в дозе 600 ИД50, а при уменьшении дозы до 5 ИД50 иммунных к 3-месячному сроку остается не более 50%.

8. Нуклеиновая кислота культурального штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур отличается большим размером (370 кЬ) по сравнению с ДИК других штаммов того же вида вируса. Консервативная область генома сходна с таковой у других штаммов I вируса оспы кур. Уникальные последовательности нуклеотидов, характерные для штамма ВГНКИ-3, расположены в правой вариабельной области генома (0,7-0,95 единиц физической карты). I

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Яременко, Лилиана Ивановна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров A.A., Александров H.H. и др. Компьютерный анализ генетических текстов.-М.: Наука.- 1990.

2. Бондарь В.В., Сюрин В.Н. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов вируса оспы голубей// Ветеринария,- 1968.- С.31-34.

3. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и животных. -М.: Медицина.- 1975.- 302 с.

4. Гуненков В.В. Изучение наследственных признаков и генетической реактивации некоторых вирусов группы оспы. - Автореф.дисс. на соиск.уч.степени канд.биол.наук. - Москва.- ВНИИ вет.вирусологии и микробиологии.- 1966.- 15 с.

5. Гуненков В.В., Сюрин В.Н. Сравнительное изучение генетических признаков оспы животных. - Сообщение П. Спектр чувствительности, культур тканей и хорионаллантоиса куриных эмбрионов к различным вирусам оспы.//Вопросы вет.вирусологиии.- 1966.- Т.2.-С.380-392.

6. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д. Сухая культуральная вакцина против оспы птиц// И.Л. N 216-90.- Яросл. М/т центр.н.-т. информации и пропаганды.-1990. 1

7. Гуненков В.В. Опыт создания новых вакцин против вирусных, респираторных, кишечных и оспенных болезней животных // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции «Совершенствование методов госконтроля вет.препаратов».-М.-1991, С.10-12.

8. Гуненков В.В., Чистова З.Я. и др. Вакцина против оспы птиц. Патент № 1570068 с 22.01.92.

9. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Ходасевич Н.Ф. и др. вакцина пртив оспы птиц и способ ее изготовления. Патент № 1405148 с 12.05.93.

Ю.Гуненков В.В., Кузнецова Г.Д., Яременко Л.И. и др. вакцина для аэрозольной и внутрикожной вакцинации птиц против оспы// Материалы 13 Международного симпозиума Всемирной ассоциации вет.микробиологов.-1994.-Италия.- с.277.

П.Гуревич Б.М., И.А.Дукалов и др. Экспериментальное изучение методов специфической профилактики и борьбы с оспо-дифтеритом кур// Советская ветеринария.- 1934.- 2.- С.64.

12.Дорошко И.Н. Получение универсальной вирусвакцины против оспы кур, индеек и голубей // Труды XXXI пленума вет. секции академии,- М.- 1952.- С. 61-67.

13.Дутко Ю.С. Аэрозольная вакцинация птиц одновременно против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и оспы. -Автореф. дисс. на соиск. уч. степени канд.вет.наук.- Покров.- 1977.

М.Ерохина Л.М., Архипов Н.И., Чернышев В.В. и др. Изучение иммуногенеза при ассоциированной аэрозольной вакцинации цыплят против болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита и оспы// Материалы У1 Всес.конф. по патанатомии животных,-Тарту.- 1977.- Т.2.- С. 175-177.

15.Корсунский О.М. Развязання проблеми воспо-дифтериту у курей // Радянська ветеринария.- 1932.- N 3-4. - С. 17-27.

16.Кузнецова Г.Д., Тарасенко Е.В. и др. Адаптация вируса оспы кур к культуре клеток и его некоторые иммунобиологические свойства//Тез.докл.Всесоюзн.научн.конф.ВГНКИ.-1991.-с.64-66.

17.Лакин Г.Ф. Биометрия. М.:Высшая школа.-1990.-352 с.

18.Лихачев Н.В., Ушаков A.A., Барановский В.О. Испытание американской вакцины против оспы - дифтерита птиц// В кн.: Контр.инст.вет.преп.- М.- 1947. - С.20-29.

J

19.Мавлинаев Р.Г, Дутко Ю.С, В.В.Чернышев . Аэрозольная вакцинация цыплят против болезни Ньюкасла и оспы и влияние ее на течение хронической инфекции // В кн.: Вопросы вет. вирусол, микробиол. и эпизоотологии. Тез.докл.научн.конф. ВНИИ вет.вирусол. и микробиол.- Покров.- 1978. - С.67-69.

20.Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.- М.: Мир.- 1984, 480 с.

21 .Маренникова С. С, Мальцева Н.И. Сравнительное изучение некоторых штаммов вирусвакцины. Сообщение 1. Особенности поведения в куриных зародышах гемагглютинирующей активности и терморезистентности // Вопр. Вирусологии.- 1964.- 3. - С.280-286.

22.Михальский Г.А. Аэрозольная вакцинация птиц против оспы дифтерии // Тез.докл. 11 Всесоюзной конференции по применению аэрозолей в народном хозяйстве.- Одесса.- 1972.- С.67-68.

23 .Михальский Г.А. Аэрозольная вакцинация птиц против оспы -дифтерита с помощью турбулирующей аэрозольной насадки // Труды ВНИИВС.-1977.- т.58.- С.29-34.

24.Панчева С. Молекулна биология на шарковирусите // Ветеринарно Мед. Науки.- 1982,-Т. 19.-№ 10.-С. 107-113.

25.Певзнер П.А, Миронов A.A. Эффективный метод физического картирования // Молекулярная биология.- 1987.- т.21.-№ 3.-С.788-796.

26.Петровская Е.А. Об иммунитете у птиц, вакцинированных оспенным вирусом голубя // Труды ВНИИПП.- 1937.- №3.- СЛ.

27.Садовский Т.Я, Данилова Е.В. До бюлогии eipycy восподифтериту птицы // Радянська ветеринар1я.- 1932.- № 9.- С.12-14.

28.Сикачина В.И. Экспериментальное изучение аэрозольной вакцинопрофилактики оспы птиц // Тез. 3-й Всес.конференции по аэрозолям.- Ереван.- 1977.- Т.З.- С.94-96.

29.Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных животных: методы изучения и перспективы использования // Успехи современной генетики.-Вып. 18.-М.: Наука.-1993.- 232 с.

30.Сюрин В.Н. Иммунизация против оспы-дифтерита птиц // Ветеринария,- 1949.- №11.- С.35-39.

31.Сюрин В.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В.// Вирусные болезни животных .- М.: ВНИТИБП.- 1998.- 928 с.

32.Феннер Ф., Б.Мак-Ослен и др. Размножение ДНК-содержащих вирусов // В кн.: Биология вирусов животных. Перевод с английского В.И.Агола. -М.-1977.- Т.1.- С.274-289.

33.Филдс Б., Д.Найп и др. Репликация поксвирусов // В кн.: вирусология. Перевод с англ.А.В.Гудкова.- М.- 1989.- Т.З.- С.246-275.

34.Черкезова Т.В., Чистова З.Я. Усовершенствование метода контроля вакцин против оспы птиц на иммуногенность // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции «Совершенствование методов госконтроля вет.препаратов.- М.-1991,- С.63-64.

35.Ширинов Ф.Б., Фарзалиев И.А., Ибрагимова А.И. Специфическая профилактика оспы птиц.// Аз. НИИНТЛ. Тез.докл.научн.конф., поев. 75-летию со дня основания АзНИВИ.- Баку.- 1977.- С.26-27.

36.Ширинов Ф.Б. Оспа птиц и меры борьбы с ней. - Автореф.дисс. на соискание уч.степени докт.вет.наук.-М.- ВИЭВ.- 1978.- 36 с.

37.Ширинов Ф.Б., Ибрагимова А.И., Керимова С.Н. Влияние иммунного фона на выработку иммунитета против оспы после ревакцинации кур вакциной из штамма 27-АШ // Сб.научн.трудов Азерб.н.-и. вет.ин-та.-1983.- Т.29.- С.48-52.

38.Щеглова И.В. Выделение и изучение клонов вакцинных штаммов вируса оспы птиц. - Автореф.дисс.на соиск.уч.степени

канд.биол.наук. - Тарту.- Эстонский НИИ животноводства и ветеринарии.- 1971. - 19 с.

39.Янковский Н.К. Конструирование и анализ клонотек геномов. // Биотехнология. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР.-М,-1989.- Т.16.- С.252.

40.A1-Ani Muntasir О.А. An outbreak pf pox among pheasants in Iraq // Avian Patol. - 1986.- 15.-N 4.-P.795-796.

41.Alboiu M., Bern S. et al. Influenta unor factory de mediu asupa vaccinurilor antivariolice aviare liofilizate // I.Sava Luorari (Inst.de cecretari veterinare si biopreparate «Pasteur».- 1967.- V 4.- N 3-4.- P. 111-121.

42.Andrews C., Pereira H.G., Wildy P. Viruses of vertebrates, 4 th ed.-

1978.- Bailiere, London.

43.Arai S., Arai C., Fujimaki M. Cutaneous tumor-like lesions due to poxvirus infection in Chilean flamingQS // J.Comp.Pathol.- 104.- P.439 -441.

44.Arhelger R., Randall C.C. Electron microscopic observation on the developnent of fowlpox virus in CAM // Virology.- 1964.- N 22.- P.59-66.

45.Arita M., I.Tagaya. Virion polypeptides of poxviruses// Arch.of Virol.-

1979.-N 63.-P.209-225.

46.Banks T.A., Rouse B.T. Herpesviruses - immune escape artists?// Clin.Infect.Dis.- 1991.-14,- P.933-941.

47.Baxendale W. Studies of 3 Avianpox .viruses and the development of an impruved fowlpox vaccine // Vet.Rec.-1971.- p.5-10.

48.Baxby D. Identification and interrelationship of the variola/vaccinia subgroup of poxviruses // In: Progress in med.virol.- 1975.- V.19.-P.215-246.

49.Beard C.W., Schnitzlein W.M., Tripathy D.N. Effect of route of administration of the efficacy of a recombinant fowlpox virus against H5 N2 avian influenza//Av.Dis.- 1992.-36.- P. 1052-1055.

50.Beaudette F.R. Twenty years of progress in immunization against virus diseases of birds.//J.Am. Vet.Med. Assoc. -1949.- V.155.- P.232-244.

51.Bellet A.J.D., F.Fenner. Studies of base-sequence homology among some cytoplasmic deoxyriboviruses of vertebrate and invertebrate animals // J. Of Virol.-1968 .-V.2.-P. 13 74-13 80.

52.Boone R.F., Eusinger M.J. et al. Synthesis of mRNA guanyltransferase and mRNA methyltransferases in cells infected with vaccinia virus // J.Virol.- 1977,- N 21.- P.475-483.

53.Boone R.F., Moss B. Sequence complexity and relative abundance of vaccinia virus mRNAs synthesized in vivo and in vitro // J.Virol.- 1978.-N 26.- P.554-569.

54.Boyle D.B., Heine H.G. Influence of dose and route of inoculation on responses of chickens to recombinant fowlpox virus vaccines // Vet.microbiol.- 1994.-V. 41.-P. 173-181.

55.Boyle D.B., A.D.Pye, B.E.H Coupar.1 Comparison of field and vaccine strains of Australian fowlpox viruses.// Arch.Virol.- 1997.- V.142. P.737-748.

56.Boyle D.B., Coupar B.H. Identification and cloning of the fowlpox virus TK gene using vaccinia virus // J.Gen.Virology.- 1986.- V.68.-P.1591-1600.

57.Brakel S., Kates J. Poly (A) polymerase from vaccinia virusinfected cells. Partial purification and characterization // J.Virol.- 1974.-N 14.-P.715-723.

58. Campbell J.I.A., Binns M.M et al. Tandem repeated sequences within the terminal region of the fowlpox virus genome // J.Gen.Virol.-1989.-V.70, P.145-154.

59.Chambers P., Emmerson P.T., Binns M.M. Insertion of the fusion gene from Newcastle disease virus into a npn-essential region in the terminal repeats of fowlpox virus and demonstration of protective immunity induced by the recombinant // J.Gen.Virol.- 1990.- V.71.-P. 621-628.

60.Chang A., Metz D.N. Further investigation on the mode of entry of vaccinia virus into cells // J.Gen.Virol..- 1976,- N 32,- P.275-282.

öl.Cheville N.F. Cellular fatty acids during fowlpox virus infection of three different host systems // Am.J.Pathol.- 1966,- N 49.- P.723-737.

62.Coupar B.E.H., T.Teo et al. Restriction endonuclease mapping of the fowlpox virus genome//Virology.- 1990.-V.179.-P. 159-167.

63.Cunningham C.N. Avian pox // In.: diseases of Poultry.- 1978.-7th ed., Ir., ed. Iowa State Univ. Press, Ames. IA.

64.Dales S., Kajioka R. The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earles strain L cells. I.Uptake and penetration // Virology.- 1964.- N 24.-P.278-294.

65.Dales S., Pogo B.G.T. Biology of Poxviruses //Virology Monographs.-1981.- V. 18 ed.by D.W.Kingsbury and H.Zur Hausen, Springer-Verlag, New York.

66.Dharsana R., Spradbrow P.B. The demonstration of cellmedialed immunity in chickens vaccinated with,fowlpox virus // 3 bl. Veter.-Med. Reiche B.-1985.- V. 32.- N 8.- P.628-632.

67.Dorn P., Kronthaler O. Experimentelle Untersuchungen über präzipitierende anticorper bei geflugelpocken // Dtsch.Tieraerztl Mochenschr.- 1965,- V. 72.- P. 169-172.

68.Drillien R., D.Spehner et al. Similar genetic organization between a region of fowlpox virus DNA and the vaccinia virus Hind 111 J fragment despite divergent location of the TK gene // Virol.-1987.-V.160.-P.203-209.

69.Edbauer C., Weinberg R., Taylor J. Protection of chickens with a

i

recombinant fowlpox virus expressing the Newcastle disease virus haemagglutinin-neuraminidase gene 11 Virol. -1990.- V.179.-P.901-904.

70.Esteban M., Metz D.N. Early virus protein synthesis in vaccinia virus-infected cells // J.Gen.Virol.- 1973,- N 19,- P.201-216.

71.Fallavena L.C,Rodrigues N.C., Scheutler W. Atipical fowlpox in broiler chickens in southern Brasil // Vet.Rec.- 1993.- V. 132.-P.635.

72.Fatunmbi O.O., W.M.Reed. Evaluation of a commercial modified live virus fowl pox vaccine for the control of variant fowl pox virus infections // Avian Dis.-1996.

73.Fatunmbi O.O., W.M.Reed. The control of variant fowl pox virus infection using a commercial modified live virus fowl pox vaccine // Proc. 45th North Central Avian Disease Conferens, Iowa.- 1994.- P. 83.

74.Fatunmbi O.O., W.M.Reed. Use of a bivalent vaccine in the control of

* th

avian pox in chickens// In: Proceeding of the 45 North Central Avian Dis.Conference.-1993.- P.94-95.

75.Fenner F. The classification and nomenclature of viruses. Summary of results of meeting of the International Commitee on taxonomy of viruses in Madrid//J. ofGen.Vir.- 1976.-V.31.-P.463-470.

76.Fenner F. Portraits of viruses: the poxvirus // Intervirology.-1979.-V.ll.- P.137-157.

77.Gafford L.G., Randall C.C. The high molecular weight of the fowlpox genome //J.Mol.Biol. -1967.-V.26.- P.303-310.

78.Gafford L.G., Randall C.C. Virus-cpesific DNA and DNA in nuclei of cells infected with fowlpox virus // Vrology.-1976.- N 69.-P. 1-14.

79.Gassman U., R.Wyler et al. Analysis of parapoxvirus genomes// Arch.Virol.- 1985.-V. 83,- P. 17-31.

80.Gelenczei E.F., Lasher H.N. Comparative studies of cell-culture propagated avian pox viruses in chickens and turkeis // Av.Dis.- 1968.-V.12.-P.142-150.

81.Geshelin P., Berns K.I. Characterization and localization the naturally

r

occuring cross-links in vaccinia virus DNA // J. Mol.Biol.-1974.-V.88.-P.785-796.

82.Ghildyal N, W.M.Schnitzlein et al. Genetic and antigenic differenses between fowlpox and quailpox viruses // Arch.Vir.- 1989.-V.106.-P.85-92.

83.Gooding L.R. Virus proteins that counteract host immune defences // Cell.- 1992.-V.71.-P. 5-7.

84.Graham R., Barger E.N. Fowlpox // Univ. 111.Coll.Agr.Ext.Serv.Agr.Home Econ.Circular.-1935.- N 430.- p.1-15.

85.Graham R., Brandly C.A. Immunisation against pox in domestic fowl // Univ.Illinois Agr.Exp.Stat.Bull. -1940,- V. 470.- P. 1-76.

86.Hanafusa H., T.Hanafusa et al. Transformation phenomena in the pox group virus //Bikens J.-1959.-V.2.- P.85-91.

87. Helm-Bychowsky K.M., Wilson A.S. Rates of nuclear DNA evolution in phesant-like birds: evidens from restriction maps // Proc.Nat.l Acad.Sci.USA.- 1986.-Vol.83.- N 3.- p.688-692.

88.Hiller G., Juhgwirth C. et al. Fluorescence microscopical analysis of the life cycle of vaccinia virus in chick embryo fibroblasts // Exp.Cell Res.-1982.-N 132.-P. 81-87.

89.Hirsh R.L. The complement system: its importance in host response to viral infection // Microbiol.Rev.- 1981.- V. 46.- P.71-85.

90.Holowczak J.A., Joklik W.K.// Virol.- 1967.-33.-P.717-725.

91.Hoyle P. Use of commercial software on IBM personal computers// IRN Press.- 1987.-p.417.

92.Hyde J.M, Gafford L.G. et al. Fine structure of the coat and nucleoid material of fowlpox virus // J.Bacteriol.-1965.-V.89.- N 6,- P.1557-1569.

93.Hyde J.M, Gafford L.G. et al//Virology.- 1967,- N 33,- P. 112-120.

94.1chihashi G, Matsumoto S. et al. Biogenesis of poxviruses // Virology.-

1971.-N 46.-P.507-532.

95.Joklik W.K, Becker J. The replication and coating of vaccinia DNA // J.Mol.Biol.-1964.- N 10.- P.452-474.

96.Johnson W.T. Fowl pox prevention by immunisation // JAVMA.-1927.-V.71.-P. 750-763.

97.Johnson W.T. The effect of fowl and pigeon pox virus vaccination of egg production // JAVMA.-1931.- V.78.-P.98-101.

98.Jordan F.T.W, Chabb R.C. The agar gel diffusion technique in the diagnosis of infectious laryngotracheitis and its differentiation from fowlpox // Res.Vet.Sci.-1962.- V. 3.- P.245-255.

99.Lake J.R, P.D.Cooper. Deletion of the terminal sequences in the genomes of the white pock and host-restricted mutants of rabbitpox virus//J.Gen. Virol.- 1980.-V.48.-P. 135-137.

100.Letellier C, Burny A. et al. Construction of a pigeonpox virus recombinant expression of the Newcastle disease virus fusion glycoprotein and protection of chickens against NDV challenge // Arch.Virol.- 199,- V.l 18,-P.43-56.

101.Mackett M,Archard L.S. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure // J.Gen.Virol.-1979.-45.-p.683-701.

102.Mahnel H. Labordifferenzierung der Orthopockenviren // Zentralblatt fur Vet, Reine B.-1974.- N 21.- p.242-258.

103.Mattews R.E.F. Classification ahd nomenclature of viruses // Intervirology.- 1982.- 17.-p.42-46.

104.Mayr A, H.Mahnel et al. Systematisierung und Differenzierung der Pockenviren// Zentralblatt fur Vet, Reine B.-1972.- N 19.- p.69-88.

105.Metz A.L. et al Venerial pox in breeder turkeys in Minnesota //Av.Dis.- 1985,- 29(3).-p.850-853. ,

106.Mockett A.P.A., Southee et al. Fowlpox virus: its structural proteins //Av.Pathol.- 1987,- 16.-p.493-504.

107.Morita C. Studies on fowlpox virus. 11 Plaque neutralization test // Avian Dis.-1973.- V.17.- P.93-98.

108.Muller H.K., R.Wittek et al. Genetic relationship between two poxviruses determined by restriction analysis of their DNAs//Experienta.- 1977.-N 33.-p.133.

109.Nagy E. et al. Vaccination of 1-day old chicks with Fowlpox virus by the aerosol, drinking water or cutaneous routes // Av.Dis.-1990.-34.-p.677-682.

110.Nazerian K., Lee L.F. et al. Protection against Mareks disease by a fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein B of Mareks disease virus // J.Virol.- 1992.- V.66.-P.1409-1413.

lll.Obieski J.F., Palmer et al. Polyacrilamide gel electrophoresis of fowlpox and vaccinia proteins// Virol.-1973.-N 51.- p.512-516.

112.0hta H., Yoshikava Y. et al. Activation of chicken alternative complement by fowlpox virus-infected cells // Infect.Immun.- 1983.-V.42.-P. 721-727.

113.0hta H., Yoshikava Y. et al. Role of Complement in the patogenesity of fowlpox virus infection in chickens and chicken embrios // Jpn.J.Vet.Sci.- 1988.- V.50(l). P. 145-152.

114.01ufemi O.F., W.M.Reed. Characterization of avian pox viruses restriction endonucleases analisis // Proc.43rd North Central Avian Disease Conference, University of Minnesota, St.Paul,Minn.- 1992.-P.105-106.

115.01ufemi O., Fatunmbi S., Reed M. Evaluation of a Commercial Quail pox Vaccine for the control of «Variant» fowl poxvirus infection // Av.Dis.- 1996.- V. 40.- P. 582-587.

116.0strowski S., Dorrestein G., Burger L. et al. Cross-protection test of an avian poxvirus isolated from Houbara Bustards // Avian Dis.- 1996.-V.40.- P.762-769.

117.0kada H., Okada N. et al. Supression of tumor growth in guinea pigs by simultaneous inoculation by tumor cells treated with UV-irradiated Sendai virus at a different site//Med.Bull.Fukuoka Univ.- 1984.-N 11.-p.15-17.

118.Okada H., Tanaka H et al. Increased immunogenisity of tumor cells by indication of complement activation capasity of cell membrane// Basic Mecanisms and Clinical Treatment of Tumor Metastasis Academic Press.- 1985.- p.255-270.

119.Okada H. Effect of complement depletion by cobra venom factor on fowlpox virus infection in chickens and chicken embryos // J.Virol.-1986.-V.57.-P. 670-673.

120.Paoletti E., Grady L.J. Transcriptional complexity of vaccinia virus in vivo and in vitro// J.Virol.-1977.-N 23.- P.603-615.

121.Paoletti E.,Cooper N.,Moss B. Regulation of syntesis of two immunologically distinct nuclei acid-dependent nucleoside triophosphate phosphohydrolases in vaccinia virus-infected Hela cells // J.Virol.- 197.- N 14.- P.578-586.

122.Pathak P.N., Rama Rao G.V.S.V. et al. In vitro cellular immunity to unrebated pathogens in chicens infected with fowpox virus // Infect.Immun.-1974.- V.10.- P. 34-41.

123.Peleg A., I.Samina, J.Brenner . Vaccination of chickens with live fowl pox vaccine in oil// J.Vet.Med.-1993.- B.40.-p. 522-524.

124.Pennington T.N. Vaccinia virus polypeptide syntesis sequential appearens and stability of pre-and postreplicative polypeptides // J.Gen.Virol.- 1974.- N 25.- P.433-444.

125.Perelman B.A.et al. Pox in ostriches // Av.Pathol.- 1988.- V.17.-P.735-739.

126.Pilchard E.I., Hanson L.R. et al. Fowl-pox neutralization antibody and viraemia in turkeys// Av.Dis.- 1962.- N 6.- p. 396-402.

127.Randall C.C., Gafford L.G. et al. Molecular weight determination

i

fowlpox virus DNA by electron microscopy // J.Bacteriol.- 1964.- V. 87,- P.939-944.

128.Randall C.C., Gafford L.L. et al. Electron microscopy study of fowlpox virus. // J.Bacteriol.-1966.- V. 91.- P. 95-100.

129.Reed W.M., Fatunmby O.O. Characterisation and immunogenisity of variant strains of avian poxviruses // Proc. 131 th AVMA Annual meeting, San Francisco.- 1994.-P.83.

130.Sarma D.K., Sharma S.N. Immune responce of chicks vaccinated with

fowl pox virus vaccines by the feather follicle method //

i

Trop.Anim.Prod.- 1989.- V.21.- P. 107-108. 131.Sarov I., Becker Y. Studies of vaccinia virus DNA// Virol.- 1967.- N 35, P.369-375.

132.Schnitzlein W.M, N.Ghildyal, D.N.Tripathy Genomic and antigenic

characterization of avipox viruses // Vir.Res.-1988.- N 10.- P.65-76. 133.Schumperli D., R.Lagades et al. DNA sequence gomology estimation by combinatorial analysis of endonuclease restriction data // J. Gen. Virol.- 1978.- N 38.- P.161-166. 134.Silim A.et al. A simple technique for preparation of chicken-embryo-skin cell cultures//Av.Dis.-1982.-26.-N l.-p.l82-185.

135.Sissons J.G.R., Oldstone M.B.A. et al. Antibody-independent activation of the alternative complement pathway by measles virus-infected cells // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.- 1980.- N77.- P.559-562.

136.Smith G.L. Vaccinia virus glicoproteins and immune evasion // J.Gen.Virol.- 1993.-N47,-P. 1725-1740.

137.Spear P.G, Roisman B.J.// J.Virol.- 1972.- N,9.-P.143-159.

138.Spriggs M.K. One step ahead of the game: viral immunomodulatory molecules // Annu.Rev.Immunol.- 1996.- N 14,- P. 101-130.

139.Tajima M. Ushijima J. Electron microscopy of avian pox viruses with

spesial reference to the significance of inclusion bodies in viral

replication//Jpn.J.Vet.Sci.- 1966,-N28.- P.102-118.

i

140.Taylor J., Edbauer C., Rey-Senelonge. Newcastle disease virus fusion protein expressed in a fowlpox virus recombinant confers protection in chickens // J.Virol.- 1990.- N 64.- P. 1441-1450.

141.Templeton A.R. Phylogenetic inference from restriction endonuclease cleavage site maps with particular reference to the evolution of humans and the aper//Evolut.- 1983.-Vol.37.-p.221-244.

142.Tripathy D.N. Hanson L.E. et al. Detection of fowl pox virus antigen in tissue culture by fluorescent antibody technique // Avian Dis.- 1970.-N 14.- P.810-812.

t

143.Tripathy D.N, Hanson L.E. Immunity to fowlpox // Am.J.Vet.Res.-1975.-N36,- P.541-554.

144.Tripathy D.N.,Cunningham C.N. Avian pox // In: Diseases of poutry. Iowa State University Press. Amer. Iowa.- 1984.- P. 524-534.

145.Tripathy D.N.// A laboratory manual for the isolation and identification of avian patogens.- 1989.- P. 103.

146.Tripathy D.N. Pox // Diseases of poultry, 9 th ed. B.W.Calnek, H.J.Barnes. Iowa State University Press.- 1991.- P.583-596.

147.Tripathy D.N, Hanson L.E. et al. Atipical fowlpox in a poultry farm in Illinois // AvianDis.- 1974.- N18.- P.84-90.

148.Tripathy D.N. Outbreaks of fowl pox in vaccinated flocks // In: Proceeding of the 44th North Central Avian Disease Conf. -1993,- P. 93.

149.Tsubahara H, Sazava H. et al. Complement fixation inhibition with fowl serum // Bull.Hatl Inst.Anim.Health.- 1956.- N 31.- P. 59-70.

150.Tsubahara H, Kataoka T. et al. Complement fixation in fowlpox. // Bull.Natl.Inst.Anim.Health.- I960.- N 41.- P.6-10.

151.Vencatasubba Rao C, M.S. Jayaraman et al. Laboratory and field trials with cell culture fowl pox vaccine // Indian Vet.J.- 1978.- V.55- N 2.- P.133-136.

152.Webster R.G, Kawaoka Y, Taylor J. Efficasy of nucleoprotein and haemagglutinin antigens expressed in fowlpox virus as vaccine for influenza in chickens // Vaccine.- 1991.- N 9.- P. 303-308.

153.Williamson J.D, Cooke B.S. Argindsuccihate synthe taselyase activity in vaccinia virus-infected Hela and mouse cells // J.Gen.Virol.- 1973.- N 21.- P.349-357.

154.Winterfield R.W, Hitchner S.B. The response of chickens to vaccination with different concentration of pigeon pox and fowl pox viruses // Av.Dis.- 1965.- N9.- P.237-241.

155.Winterfield R.W, Reed W. Avian pox: infection and immunity with quail, Psittacine, Fowl and pigeon pox viruses.// Poultry Sci.- 1985.- N 64.- P. 65-70.

156.Wittek R, Menna A. et al. Hind'111 and PST 1 restriction sites mapped on rabbit poxvirus and vaccinia virus DNA // J.Virol.-1977.-N 23.- P.669-678.

157.Wittmann G. Der nachweis pratipitierender anticorper ber der hunerpokeninfection mit hilfe des agar-diffusionverffhrens // Zentralbl Veterinaermed B.- 1958.-N 5.- S.769-775.