Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Мертц, Марианна Владимировна

• Мертц, Марианна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 1996

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мертц, Марианна Владимировна

Введение.

Глава1. Литературный обзор.

1.1. Строение и функции щитовидной железы.

1.2. Заболевания щитовидной железы, их диагностика и лечение. И

1.3. Иммуноанализ тироксина.

1.3.1. Особенности получения антител к тироксину.

1.3.2. Получение моноклональных антител к тироксину.

1.3.3. Методы иммуноанализа тироксина.

1.3.3.1. Радиоиммуноанализ.

1.3.3.2. Иммуноферментный анализ.

1.3.3.3. Использование гетерологичных конъюгатов гаптенов в иммуноферментном анализе.

1.3.3.4. Флуоресцентный и хемилюминисцентный иммуноанализ.

1.3.3.5. Метод с применением липосом.

1.3.3.6. Нефелометрический и турбодиметрический анализ.

1.3.4. Способы получения стандартных растворов тироксина.

1.4. Тенденции развития иммуноаналитических методов в медицинской диагностике.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Получение конъюгированных антигенов.

2.2.1. Получение конъюгата тироксин-БСА с использованием карбодиимида в качестве сшивающего агента.

2.2.2. Получение конъюгата трийодтиронин-БСА.

2.3. Антитела.

2.3.1. Определение титра антител в твердофазном ИФА.

2.3.2. Выделение моноклональных антител ионообменной хроматографией.

2.3.3. Характеристика антител.

2.3.3.1. Определение константы связывания антител методом твердофазного ИФА.

2.3.3.2. Определение подкласса антител.

2.3.3.3. Определение специфичности антител методом твердофазного ИФА.

2.3.3.4. Электрофорез.

2.3.5. Приготовление сефарозы с иммобилизованными антитироксиновыми антителами.

2.4. Реагенты для иммуноанализа.

2.4.1. Стандартные растворы тироксина в сыворотке.

2.4.2. Конъюгирование антител с ферментом.

2.4.3. Конъюгирование тироксина с пероксидазой из хрена.

2.4.4. Иммобилизация реагентов на твердофазные носители.

2.5. Методы иммуноанализа общего тироксина.

2.5.1. Твердофазный иммунометрический анализ тироксина.

2.5.2. Прямой твердофазный иммуноферментный анализ тироксина.

2.6. Определение оптимального времени анализа.

2.7. Определение рабочей концентрации АН С.

2.7.1. Зависимость связывания антител к тироксину от концентрации АН С.

2.7.2. Зависимость ингибирования от концентрации АН С.

2.8. Определение характеристик методов.

2.8.1. Определение параметров калибровочной кривой.

2.8.2. Линейность разведения пробы.

2.8.3. Вариабельность.

2.8.4. Чувствительность.

2.8.5. Тест на открытие.

Глава 3. Результаты и обсуждение.;.

3.1. Характеристика антител.

3.2. Определение концентрации общего тироксина методом прямой ELISA.

3.3. Методы измерения тироксина, основанные на непрямой ELISA.

3.4. Оптимизация параметров иммунометрического анализа общего тироксина.

3.4.1. Сорбция конъюгатов гормон-белок на пластик.

3.4.2. Влияние АНС на результаты анализа.

3.4.3. Очистка сыворотки.

3.4.4. Характеристики анализа общего тироксина.

3.4.5. Условия хранения реагентов.

Выводы.

Список сокращений, использованных в работе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител»

Достижения биотехнологии позволили современной медицине существенно расширить диагностические возможности. Наибольшее распространение получили иммуноаналитические методы. Гибридомная технология получения антител привела к возможности создания множества диагностических тест-систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Разработка количественных лабораторных методов, экспресс-анализов с использованием моноклональных антител для медицинской диагностики является важной задачей современной биотехнологии.

В последнее время особую актуальность приобретает проблема диагностики и лечения эндокринных заболеваний, в частности заболеваний щитовидной железы. Очевидно, что рост этих заболеваний не в последнюю очередь связан с ухудшением экологических условий. Для полной оценки тироидного статуса необходимо учесть концентрацию всех гормонов, связывающих белков, аутоантител и других факторов, участвующих в регуляции работы щитовидной железы [11, 27, 28, 81]. Для первичной оценки достаточно знать концентрации в крови тироксина и тиротропина [14, 30, 46].

В настоящее время для измерения концентрации тироксина применяют в основном иммуноаналитические методы. Огромное значение для успешного применения этих методов имеет качество используемых антител.

Антитела должны обладать высокой специфичностью и аффинностью к тироксину, поэтому использование моноклональных антител намного предпочтительней, чем использование поликлональных [54, 65]. Кроме того, явные преимущества имеют методы, применимые для проведения массовых анализов в клинике: они не должны быть длительными, трудоемкими, напротив, должны быть просты в исполнении, использовать малый объем крови, не требовать предварительной обработки пробы.

Целью данной работы является создание количественных иммуноферментных методов определения тироксина с использованием моноклональных антител.

Моноклональные антитела к тироксину были получены ранее в лаборатории молекулярной биотехнологии АО "Биотехнология".

При выполнении работы были поставлены следующие задачи, выбор оптимальной стратегии анализа; изучение влияния гаптенной гетерологии на характеристики иммунометрического анализа; изучение условий, обеспечивающих разрушение комплексов тироксина со связывающими белками; очистка донорской сыворотки от тироидных гормонов для дальнейшего получения стандартных разведений тироксина.

Научная новизна.

Изучены возможности использования моноклональных антител к тироксину 1В7 в твердофазных методах определения тироксина, основанных на принципе прямой и непрямой ELISA.

Разработан иммунометрический метод определения общего тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител.

Изучено влияние гетерологии на чувствительность и специфичность иммунометрического метода.

Практическая значимость работы.

Тема диссертационной работы является темой, утвержденной и финансировавшейся Министерством Здравоохранения и Министерством по Чрезвычайным Ситуациям "Т4-ТЕСТ". В данной работе создана тест-система для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител, которая позволяет провести анализ за 30 минут, использовать малый объем крови (достаточно брать кровь у больных из пальца), проста в исполнении. Разработанный метод по своим характеристикам не уступает лучшим зарубежным аналогам, являясь при этом более экономически выгодным. Метод опробован на банке сывороток (80 штук), любезно предоставленном Институтом Экспериментальной Эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН. В настоящий момент разработаны и утверждены медико-технические требования, технические условия и регламент для производства опытной партии тест-систем с целью их дальнейшего промышленного производства.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Мертц, Марианна Владимировна

выводы.

1. Разработан одностадийный метод измерения концентрации общего тироксина, основанный на принципе прямой ELISA, с использованием моноклональных антител, подобраны оптимальные условия получения конъюгата тироксина с пероксидазой.

2. Изучено влияние гаптенной гетерологии на чувствительность и специфичность иммунометрического анализа тироксина для данных моноклональных антител.

3. Подобраны условия приготовления стандартных растворов тироксина на донорской сыворотке.

4. Разработан чувствительный и удобный иммунометрический метод анализа общего тироксина в сыворотке крови человека на планшетах, для которого необходимо всего лишь 10 мкл пробы, время анализа 20 мин. Для метода характерна высокая специфичность, низкая вариабельность результатов и хорошая корреляция с другими методами.

В настоящее время разработаны и утверждены медико-технические требования, лабораторно-промышленный регламент и технические условия набора реагентов для анализа общего тироксина "Т4-тест", в основу которого положен этот метод, идет подготовка к производству на АОЗТ "Диаплюс".

Список сокращений, использованных в работе.

1. Т4 - тироксин

2. ТЗ - трииодтиронин

3. ГГ4 - свободный тироксин

4. ГГЗ - свободный трииодтиронин

5. ГГ41 - свободный тироксин индекс

6. ТВГ или Т11Н - тиреотропин высвобождающий гормон

7. ТТГ или ТБН - тиреотропин

8. ТВ в - тироксин связывающий глобулин или тиропексин

9. ТВРА - тироксин связывающий преальбумин или транстиретин

10. БСА - бычий сывороточнай альбумин

11. БОН - семейная дисальбуминческая гипертироксимия

12. РИА - радиоиммуноанализ

13. ИФА - иммуноферментный анализ

14. ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор

15. КЬН - гемоцианин моллюска фисуреллы

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мертц, Марианна Владимировна, 1996 год

1. Балаболкин М.И.// Эндокринология. Москва, Медицина, 1989.

2. Свиридов О.В.// Структурные и функциональные аспекты мультикомпонентной системы белков, связывающих тироксин. Биохимия, 1993, N 6, с.57-62.

3. Старкова Н.Т. //Фармакотерапия в эндокринологии. Москва, Медицина, 1989.

4. Туракулов Я.Х. //Пути биосинтеза и механизм действия гормоновщитовидной железы в норме и патологии. Вестник АМН СССР, 1988. N7, с.54-61.

5. Abuid J„ A.H.Klein, Т.Р. Foley, P.R.Larsen. // Total and freetriiodothyronine and thyroxine in early infancy. J. Clin. End. Metab. 1974. V.39. P.263-268.

6. Anderson V.L. // Thyroid hormons alters the DNA binding properties ofchicken thyroid hormone receptors and Nucleik Acids Res. 1992. V.20. N.18. P.4803-4810.

7. Aracava, Maeda, Tsuji, Ishii. //Fluorophotometric enzyme immunoassay of

8. T4 in dried blood samples on filter paper. Bunseki Kagaki 1982, V.31, p.55-61.

9. Beaman J.,Woodhead J.S.,Liewendahl K., MahonenH. // The evaluationof a chemiluminescent assay for free thyroxine by comparison with equilibrium dialysis in clinical samples. Clin.Chem. Acta. 1989., V.189., P.83-90.

10. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. // Measurement of monoclonalantibody by non-competitive enzyme immunoassay. J.Immunol.Meth., 1987, V.100, P.173-179.

11. Belgorodsky. //Evaluation of serum total T4. J. Endocrin. Invest. 1993, V.7, p. 499-503.

12. Bhagat C., Garcia-Webb P., Watson F.,Beilby J. // Interference of radioimmunoassay of total serum thyroxine and free thyroxine due to thyroxine binding autoantibodies. Clin. Chem. 1983., V.29., P. 1324-1325.

13. Bhayana V.,Y.A.Tan, A.Papanastasiou-Diamandi, M.J.Khosravi // A one-step immunoassay free-T4 by time-resolved immunofluorometry. 1990., V.36. N.6., P.1077.

14. Bianca C.,D. Hwang, B. Meriadec, M. Strasswimmer, C.Woo.//An improved, second generation method for T4 on the Technicon RA System. 1990., Clin. Chem. V.36., N.6., P. 1082.

15. Blick K.E., Michael Smith, Gillum R.L. // Apparent Lack of Concordance between Free T4 and TSH Determinations. Clin. Chem. 1991, V.37, N.6, P.943.

16. Braverman L.E.,Vagenakis A.G., Foster A.E., Ingbar S.H.// Evaluation of a simplified technique for the specific measurement of serum thyroxin concentration. J.Clin.Endoc. 1971, V.32, P.497-502.

17. Buchman D., Miller D., Koch G.// Monoclonal antibodies to digoxin, comparison of an vitro and in vivo immunization Hybridoma 1985 V.4. P.173-177.

18. Canova-Davis E., Redemann C.T., Volmer Y.P., Kung V.T.//Use of a reversed-phase evaporation vesicle formulation for a homogeneous liposome immunoassay Clin.Chem. 1986 V.32, P.1687-1691.

19. Cernosek R.M., M. Klute, M. Norden, D. Ashby, and W.Knight / / An automated solid-phase enzyme immunoassay for measurement of T-Uptake. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P.1079.

20. Chang E.L., Waite B.A.// Analysis of vesicle immunolysis assays: the direct binding model J.Immun.Methods 1987 V.102, P.33-43.

21. Chen I.W., Sohnlein B., Heminger L., Sperling M. // Evaluation of a fully automated immunoassay system for thyroid function testing. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1080.

22. Chilcoat K.A., O Kell R., Shea R.A. // Evaluation of the SYVA EMIT thyroxine assay applied on the COBAS BIO. Clin.Chem.1990, V.36, N.6, P.1079.

23. Chooi M.K., Coates J.E.// Effect of use of a specific monoclonal antibody on radioimmunoassay results for serum cyclosporine. Clin.Chem. 1988. V.34. P.2556.

24. Churchill W.H., Tapley D.F. //Antibodies specific for thyroxine and its analogues. Nature 1964, N.202, P. 29-31.

25. Cole R. and Trundle D.S.//Evaluation of SYVA ECP thyroxine and T-Uptake reagent on the COBAS FARA 11. Clin.Chem.1991,V. 37, N.6, P. 938.

26. Collinsworth W.L. // Multicenter evaluation of CEDIA T4 and T-Uptake assays on Boehringer Mannheim/Hitachi Analyzers. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1078.

27. Cristofides, Nicos, Sheehan. //Multicenter evaluation of enhanced chemiluminescence labeled-antibody immunoassay (Amerlite) for T4. Clin. Chem.1995, V.l, p. 24-31.

28. De-Groot L.J. // Mechanism of thyroid hormone action. Adv. Exp.Med.Biol. 1991, V.299, P.l.

29. Delange.// Neonatal hypothyroidism. Clin. Endocrin. 1988, V.2, p. 637-652.

30. Desai R.K., Deppe W.M., Norman R.J. // The simple TRAC FT4 / TSH assay evaluated as first-line thyroid function test. Clin.Chem. 1988, V.34, P. 1488-1491.

31. Diran, Riodan, Silbert. //Effect of hapten heterology on thyroid hormone immunoassays. JIM 1990, N 2, p. 207-214.

32. Duffy P., Marshall C.M. // Performance of EMIT T4 and T-Uptake assays on the Technicon CHEM 1 ANALYSER. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1083.

33. Engvall E., Perlmann P.// Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry 1971, V.8, P.871-874.

34. Farid N.R., Kennedy C. // Assessment of a method of measuring serum thyroxine by radioimmunoassay, with use of polyethylene glycol precipitation. Clin.Chem. 1977, V.23, N.7, P. 1333-1335.

35. Ferrua, Genetet, Savaron, Moulin, Salard, Massaeff./ / Immunoassay of total T4 using immobilizate antibody. JIM 1986, V.87, p. 137-143.

36. Freytag J.W., Dickinson J.C., Tseng S.Y.// A highly sensitive * affinity-column-mediated immunometric assay, as exeplified bydigoxin. Clin.Chem. 1984 V.30, P.417-420.

37. Gil, Tang, Halsall, Heineman, Misiego. //Competitive heterogeneous enzyme immunoassay for theophylline. Clin. Chem. 1990, V.36, p.662-665.

38. Gonzales R. //An enzyme immunoassay for determination TT4 in human serum using an ultramicroanalitical system. Clin. Chem. Acta 1991, V.3, p. 159-170.

39. Green G., Inbar S., Meneghini F.A., Long E.W., Yamartino E.J.,, Bo wen M.S., Blackwood J.J., Padila A.J., Maretsky D., Staedter //Multilayer fluorescent immunoassay technique. Clin.Chem.(1989) 35, 1865-1868.

40. Greene H., Hwang D., Hutchins J., Johnson A. // Technicon thyroxine and thyroid binding globulin: two fully automated immunoassays for the serum. Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1082.

41. Guin, Witty. //Molecular film fluorescence technology applied to detection of T4. Clin. Chem. 1993, v.6, p. 1163.

42. Hammila I.// Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin.Chem. 1985, V.31, P.359-370.

43. Hammila I., Malminen O., Micola H., Lovgren T.// Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay of thyroxin in serum. Clin. Chem. 1988, V.34, p.2320-2322.

44. Helemus T., Liewendahl K. // Improved dialysis method for free " thyroxin in serum compared with five commercialradioimmunoassays in nonthyroidal illness and subjects with abnormal concentration of TBG. Clin. Chem. 1983, V.29, N.5, P. 816-822.

45. Helfand. //Screening for thyroid disfunction. JAMA 1993, V.270, p. 2297-2298.

46. Hoffman W. //Characterization of immune complex components by dot blot analysis. Anal. Biochem. 1992, V.l, p.44-50.

47. Hollander L., Worthy T.E. // Performance of the microgenics CEDIA T4 MAB and T-Uptake assays on the coulter electronics optichem. Clin.Chem. 1991, V.37.N. 6, P. 944.

48. Hunter M.M.,Margolies M.N.,Ju A.,Haber E. //High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glicozide digoxin. J.Immunol. 1982. V.129 P.1165-1172.

49. Jarvis S., Socqueline A. // Homology model of thyroxine binding globulin and elucidation of the thyroid hormone binding site. Protein Eng. 1992, V.5, N.l, P. 61-67.

50. Khosravi M.J. and A. Papanastasiou-Diamondi. // Hapten -heterologous conjugates evaluated for application to free thyroxine immunoassays. Clin.Chem. 1993,V.39, N.2.P.256-262.

51. Kohler G., Howe S.C., Milstein C. //Fusion between immunoglobulin secreting and non-secreting myeloma cell lines. Eur. J. Immunol., 1976, V.6, P.292.

52. Kruse V.// Production and evaluation of high-quality thyroxine antisera for use in radioimmunoassay. Scand.J. Clin. Lab. Invest. 1976, V36.P.95.

53. Kwiatkowski M., Long L., and Sickel M. // An automated chemiluminescence immunoassay test for free thyroxine (FT4) Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1078.

54. Lenz, Helmet, Bialk (Boeringer Mannheim). //Method and standart solution for determination of T3 or T4 in serum by immunoassay. Patent DE 4,226,949. 1994.

55. Leo-Mensah A., Piran Uri, Blick M., Edgeworth D., Hayes E., Simonaitis R., Hudson T. // An automated chemiluminescence immunoassay test for total thyroxine. Clin. Chem. 1991, V.3, p. 137-140.

56. LeVinson S.S., Burch P.A. // Microparticle enzyme immunoassay (MEDYA) and fluorescence polarization (FP) for thyroid evaluation. Clin.Chem. 1991, V.37, N.6, P. 943.

57. Litchfield W.J., Freytag J.W., Adamich M.// Highly sensitive immunoassays based on use of liposomes without complement Clin.Chem. 1984. V.30, P.1441-1445.

58. Luckenbach C. et al. // Isoelectric focussing of human thyroxine binding globulin (thyropexin) and human prealbumin (transthyretin). Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 1992, V.30, N.7, P. 387-390.

59. Maeda Masaco, Hiroshi Ohokuma, Hidetochi Arakawa, and Akio Tsuji. / / Enzyme-linked immunosorbent assay for free thyroxin using glucose oxidase as a label enzyme. Clin. Chem., 1990, V.36, N. 6, P. 1078.

60. Marsh J.A., Johnson B.E., Lillehoj H.S., Scanes C.G. // Effect of thyroxine and Chicken growth hormone on immune function in autoimmune-thyroiditis (Obese). Proc.of the society forexper.biol.and med., 1992, V.199, N.l, P. 114-122.

61. Mitsuma T., Colcci J., Shenkman L., Hollander C.S. //Rapid simultaneous radioimmunoassay for triiodothyronine and thyroxine in unextracted serum. BBRC. 1972, V.46, N.6, P.2107- 2113.

62. Mpoko C.N., Cordon D.B., Laing I., Corbitt G., Storey C.C. //The production and characterisation of a monoclonal antibody to thyroxin. Clin.Chem.Acta, 1985, V.146, P. 215-222.

63. Murray R., Burkhardt M., Boches F. // Development of a monoclonal antibody based total T4 RIA. Clin.Chem., 1990, V.36, N.6, P. 1077.

64. Nakane P.K., Kawaoi A. // Peroxidase labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 1974, V.72, P. 108.

65. Nantov, Suonpaci, escola, Lovgren. //Direct solid-phase fluoroassay of TT4. J. Clin. Biochem. Science, 1985, V.4, p.52-56.

66. Nelson J.C., Tomei R.T. // Direct determination of free thyroxin in undiluted serum by equilibrium dialysis/radioimmunoassay. Clin.Chem., 1988, V.34, P. 1737-1744.

67. Neto E.G., J. Schulte, E.Kreisner and R. Giugliani. // Application of a comprehensive protocol for detection and diagnosis of congenital hypothyroidism in Brazil.Clin.Chem. 1991, V.37., N.6, P.935.

68. Nishokawa T., Kubo H., Saito M.// Competitive nephelometric immunoassay of theophylline in plasma. Clin. Chim.Acta 1979, V.91, P.59-65.

69. Olberding M.L., Haven M.C., Markin R.S. //Evaluation of the reformulated TDx thyroxine assay. Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1080.

70. Ozinscas et all. //Homogeneous model immunoassay of T4 by phase-modulation fluorescence spectroscopy. Anal. Biochem. 1993, V.2, p. 264-270.

71. Papanastasiou-Diamandi A., Bhayana V.,Diamandis E.P. //A time resolved fluoroimmunoassay of total thyroxine in serum. Ann.Clin.Biochem. 1989, V.26., P.238.

72. Plomp T.A.,Drost R.A., Thyssen J.H.N. // Evaluation of the manual enzyme immunoassay (EMIT) procedure for the determination of serum thyroxin. J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1979, V.17, P.315.

73. Pollack. //A fluorescence liposome immunoassay for TT4. Clin. Chem. 1993, V.6, p.1254.

74. Ratcliffe W.A., Challand G.S., Ratcliffe J.G.,// A critical evaluation of separation methods in radioimmunoassay for total triiodothyronine and thyroxine in unextracted human serum. Ann. Clin. Biochem. 1974, V.ll, P.224.

75. Ratcliffe W.A., Ratcliffe J.G., McBridge A.D.// The radioimmunoassay of thyroxine in unextracted serum. Clin. Endocrinol. 1974. V.3.,P.481.

76. Ritter D., Stott R., Grant N., Moon H. Nahm // Endogenous antibodies that interfere with thyroxine fluorescence polarization assay but not with radioimmunoassay or EMIT. Clin. Chem. 1993, V. 39, N.3, P.508-511.

77. Robins B., Soltys R., Dowben R., Alford M., Shriver B. // Development of a fluorescence polarization immunoassay for total T4. Clin.Chem.1993. V.39/6.P.1169.

78. Sapin R. // In vitro and in vivo effects of increased »concentrations of free fatty acids on free thyroxinmeasurements as determined by five assays. Clin.Chem. 1990, V.36, N.4, P.611-613.

79. Sapin, Remy, Gasser, Francoise. //Spuriously high concentration of serum FT4 due to anti-T3 antibody. Clin. Chem. 1995, V.l, p. 117-118.

80. Schmitt Cheril A. and A. A. McDonough. / / Thyroid hormone regulates and isoforms of Na,K - ATPase during development in neonatal rat brain. J.Biol.Chem. 1988, V.263, N.33, P. 176-178.

81. Schroeder H.R., Yeager F.M., Boguslaski R.C., Vogelhut P.O. // Immunoassay for serum thyroxin monitored by chemiluminescence. J.Immunol. Methods, 1979, V.25, P.275-282.

82. Sestoft L. //Metabolic aspects of the calorigenic effect of thyroid hormone in mammals. Clin.Endocrin.,1980,V.13,P.489

83. Shall, Fraser, Hansen. //A sensitive manual enzyme immunoassays for T4. Clin. Chem. 1990, V.2, p. 933-938.

84. Siebert G.R., Raleigh N.C., Armstrong J. // Monoclonal antibodies recognizing L-thyroxine. United States Patent 1989, N. 4,888,296.

85. Sqoutas D., Annie Love, Fredricks M. // Comparison of the TOSOH AIA 1200, ABBOT TDx and Pharmacia DELFIA methods for the determination of serum thyroxine. Clin.Chem. 1991,V.37, N.6, P.942.

86. Sturgess M.L., Ian Weeks, C.N. Mpoko. // Chemiluminescent labeled-antibody assay for thyroxin in serum, with magnetic separation of the solid phase. Clin.Chem., 1986, V.32, N.3, P.532-535.

87. Surks M.I., Hupart K.H., Pan C. // Normal free thyroxine in critical nonthyroidal illnesses measured by ultrafiltration of undiluted serum and equilibrium dialysis. J.Clin.Endocrinol.Metab. 1988, V.67, P.1031-1039.

88. Taimela, Aalto, Mijia.// Clinical laboratory studies of fluorescence immunoanalisis of TT4. Clin. Chem. 1993, V.4, p.679-682.

89. Thede-Reynolds K.R., Johnson G.F. // Antibody suitability for two stage free thyroxin assay. Clin.Chem. 199,1 ,V.37, N.6, P. 1044.

90. Tillotson, Lartic. //Plasma total Thyroxine. J. Clin. Pathology, 1992, V.9, p. 818-820.

91. Tuuminen T., Kaepyaho K. // Determination of thyrotropin, thyroxine and free thyroxine in dried blood samples by enzyme FIA. Eur.Pat.App.EP 1991, N.460,650.

92. Velasques, uphan, Philipp, Altaffer.// ELISA T4 assay compared to fluorescence polarisayion. Clin. Chem. 1993, V.39, p. 1209.

93. Wallase, Aitken, Duffy, Fraser.// Measurement FT4 by using Magnetic Ab-containing Microcapsules. Clin.Chem. 1990, V74, p. 614-619.

94. Wang L., Hexter C.S., Inbar M. // Monoclonal antibodies to thyroid hormones anti-thyroxine and anti-triiodothyronine in

95. Monoclonal antibodies and T cell Hybridomas. Eds: Hammerling G.I., Hammerling G.H.,Kearney J.F. Elsevier, Amsterdam, 1982. P.357.

96. Weerasecera, Kim, Barnard.// Measurement of T4 by solid phase chemiluminescence. Clin. Biochem. 1993, V.l, p. 100-104.

97. Welby M. //Clinical chemistry of thuroid function testing. Adv. Clin. Chem. 1990, V.28, p. 81-92.

98. Wilson M., Hitchcock K.R., De-Lellis R.A. // Immunohistochemical localization of thyroid hormone in rat thyroid gland. J. Histochem.Cytochem. 1978, V.26. P.1121.

99. Yaoita Y., Brown D.D. // Xenopus laevis and thyroid hormone receptors. PNAS, 1990, V.87, P. 7090-7094.

100. Yatscoff R.W., Hayter J.// Competitive nephelometric inhibition immunoassay of theophylline with use of monoclonal reagents: comparison with EMIT procedures -Clin.Chem. 1983. V.29, P. 1857-1858.

101. Zuk, Rowky.// Flurescence protection: a new homogeneous assay technique. Clin. Chem. 1989, V.5, p. 1554-1560.