«Иерархическая структура стромального микроокружения кроветворной ткани в норме и при заболеваниях системы крови» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, доктор наук Шипунова Ирина Николаевна

• Шипунова Ирина Николаевна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Шипунова Ирина Николаевна

Оглавление

Глава 1. Введение

1.1 Актуальность темы исследования

1.2 Степень разработанности темы исследования

1.3 Цели и задачи исследования

1.4 Научная новизна исследования

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Методология и методы исследования

1.7 Положения, выносимые на защиту

1.8 Степень достоверности и апробация результатов

1.9 Структура диссертации

Глава 2. Обзор литературы

2.1 Кроветворное стромальное микроокружение в костном мозге мыши и человека

2.2 Системная регуляция стромальных предшественников

2.3 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения

Глава 3. Материалы и методы

3.1 Источники стромальных клеток костного мозга

3.2. Методы выделения стромальных клеток костного мозга

3.3 Методы исследования стромальных клеток костного мозга

3.4 Статистическая обработка данных

Глава 4. Результаты

4.1 Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге мыши

4.2 Системная регуляция стромальных предшественников: роль паратиреоидного гормона

4.3 Стромальные предшественники кроветворного микроокружения в костном мозге человека: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки и колониеобразующие единицы фибробластов

4.4 Системная регуляция стромальных предшественников: влияние гидрокортизона на мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

4.5 Системная регуляция стромальных предшественников: отличия стромальных предшественников из костного мозга людей разных возрастных групп

4.6 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения

Глава 5. Обсуждение полученных результатов

5.1 Иерархия стромальных предшественников

5.2 Системная регуляция стромальных предшественников: роль паратиреоидного гормона

176

5.3 Системная регуляция стромальных клеток: роль гидрокортизона

5.4 Системная регуляция стромальных клеток: отличия стромальных предшественников из костного мозга людей разных возрастных групп

5.5 Влияние патологического кроветворения на свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения

Заключение

Выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Глава 1. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Иерархическая структура стромального микроокружения кроветворной ткани в норме и при заболеваниях системы крови»»

1.1 Актуальность темы исследования

Во взрослом костном мозге (КМ) кроветворение поддерживается и регулируется стромальным микроокружением. Известно, что кроветворная система имеет четкую иерархическую структуру: в основе находятся стволовые кроветворные клетки (СКК), способные к самоподдержанию и продуцирующие потомков, дающих начало всем линиям кроветворных дифференцировок. Между тем отдел стромальных предшественников охарактеризован недостаточно. Стромальное микроокружение обладает низкой интенсивностью самообновления, что приводит к трудностям в исследовании его иерархической структуры. Более того, для стромальных предшественников до сих пор не выявлены уникальные иммунофенотипические маркеры, необходимые и достаточные для выделения чистой популяции каждого из известных типов предшественников. Поэтому большинство исследований в настоящее время выполнены с применением функциональных тестов.

В КМ стромальные клетки формируют кроветворную нишу. Это специализированное стромальное микроокружение, поддерживающее функционирование СКК. В настоящее время описано, как минимум, два типа ниш - эндостальная и периваскулярная. Считается, что разные типы ниш регулируют функции разных типов кроветворных предшественников. Таким образом, качество кроветворения напрямую зависит от состояния стромальных клеток КМ. Исследование иерархической структуры стромальных клеток, механизмов взаимодействия и путей регуляции кроветворных и стромальных клеток необходимо для полного представления о функционировании кроветворной системы и разработки путей коррекции или компенсации изменений, происходящих в ней с возрастом, под действием внешних воздействий или же в процессе развития патологических состояний.

Костномозговая строма регулирует кроветворение (и локально, в кроветворных нишах, и дистантно, продуцируя цитокины и ростовые факторы) как в норме, так и при различных заболеваниях системы кроветворения. Известно, что у больных с гематологическими заболеваниями повреждается стромальное микроокружение. При этом, по-видимому, задействованы разные механизмы. Изменения в стромальном микроокружении также могут быть одной из причин неполноценного кроветворения у больных после трансплантации аллогенного костного мозга (алло-ТКМ). Исследование изменений, происходящих с клетками стромы у больных, поможет более полно охарактеризовать патогенез заболеваний системы

крови и оценить характер изменений, происходящих в строме КМ, как в процессе развития болезни, так и в ходе ее лечения.

Итак, исследование основных характеристик клеток-предшественниц стромального микроокружения, поддерживающего кроветворение, позволит установить иерархическую структуру отдела, выявить нарушения, возникающие с возрастом и в процессе развития патологических процессов.

1.2 Степень разработанности темы исследования

Впервые существование клоногенных стромальных клеток-предшественниц -колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф) - было описано и экспериментально подтверждено советским ученым А.Я. Фриденштейном с соавторами около 50 лет назад. Огромный вклад в развитие представлений о способности к самоподдержанию, радиорезистентности и мультипотентном дифференцировочном потенциале мезенхимных стволовых клеток (МСК) внесли исследования И.Л. Черткова с соавторами. Источники, механизмы и пути дифференцировки тканеспецифических (кроветворных и мезенхимных) и эмбриональных стволовых клеток в пре- и постнатальном онтогенезе в течение многих лет исследовались учеными под руководством Н.Г. Хрущова.

В настоящее время российские ученые активно исследуют свойства и пути возможного применения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). Активно разрабатываются и применяются на практике методы и подходы получения ММСК из различных типов тканей человека. Так, свойства ММСК, полученных из жировой ткани людей (контрольной группы и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и сахарным диабетом 2 типа) изучают в группе под руководством В.А. Ткачука, а регуляцию способности этих клеток к хоумингу исследует Е.В. Парфенова с коллегами. Изменение пролиферативных и дифференцировочных свойств ММСК, а также регенеративного потенциала при ожирении и сахарном диабете изучают Р.И. Дмитриева с коллегами. Методы выделения, иммунологические и функциональные характеристики ММСК из пупочной вены разрабатывает коллектив под руководством Ю.А. Романова. Свойства ММСК из эндометрия исследует группа под руководством Н.Н. Никольского.

Свойства ММСК из жировой ткани в условиях гипоксии, аноксии и пониженной гравитации изучают Л.Б. Буравкова с коллегами, а свойства ММСК из пуповинной крови в тех же условиях - группа ученых под руководством Е.Р. Андреевой.

Также активно ведутся работы по разработке протоколов получения ММСК из тканей различных биологических видов с последующим изучением свойств выделенных клеток.

Свойства ММСК приматов изучают В.З. Агрба с коллегами, а ММСК собак - группа М.В. Киселевского. Группа под руководством Р.К. Чайлахяна занимается сравнением регенеративных свойств ММСК крысы, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии. Количество и состояние стромальных предшественников из КМ и селезенки мыши после иммунизации ее различными антигенами, а также после инъекций различных иммуномодулирующих препаратов изучают В.Г. Нестеренко с коллегами. Свойства различных субпопуляций ММСК из КМ и эмбриональной печени крыс исследует группа ученых под руководством Е.И. Домарацкой.

Также в нашей стране проходят исследования фундаментальных свойств ММСК. Так, Б.В. Попов с соавторами занимаются изучением молекулярных и клеточных механизмов дифференцировки ММСК в зрелые клетки различной тканевой специфичности. Возрастные изменения стромальных предшественников из КМ мыши исследуют В.Г. Нестеренко с соавторами, а возможные пути стимуляции пролиферации нормальных и стареющих ММСК из КМ мыши изучает А.В. Белявский с коллегами.

Продолжая работы Н.Г. Хрущова и В.И. Старостина, исследования фенотипических особенностей и потенций к дифференцировке пре- и постнатальных генераций ММСК, их роль в миогенезе, возможности прикладного применения ММСК для регенерации повреждений мышечной ткани проводятся под руководством Е.И. Домарацкой.

Отдельным направлением исследований, посвященных ММСК, является применение ММСК для лечения костных дефектов и биосовместимых трансплантатов. Разработка биосовместимых материалов для использования их при кокультивировании с ММСК ведется, например, в группах под руководством В.С. Комлева, В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова, также поиск подходящих материалов и условий культивирования ММСК проводит группа Н.С. Сергеевой. М.В. Киселевский с коллегами используют ММСК собаки для разработки моделей биосовместимых трансплантатов трахеи. ММСК кролика для разработки моделей биосовместимых резорбируемых аутотрансплантатов используют несколько групп исследователей: для регенерации повреждений связок эти клетки применяет Р.К. Чайлахян с соавторами, для регенерации крупных костных дефектов - В.Е. Мамонов и Н.И. Дризе. Также в качестве модели в группе под руководством И.В. Майбородина используют ММСК крыс -исследуют эффект их введения на скорость регенерации повреждения костной и хрящевой ткани.

В связи с тем, что ММСК обладают не только регенеративными свойствами, но и участвуют в иммунологических реакциях в организме, область их возможного применения в клинической практике не ограничивается только лишь восстановлением соединительной ткани. А.А. Темнов с соавторами используют ММСК для создания новых методов диагностики и

лечения, а также исследуют физиологические изменения данных клеток в условиях острой травмы. Продолжая дело В.Н. Ярыгина, внедрением ММСК в клиническую практику занимается Н.В. Ярыгин. Иммуномодулирующие свойства ММСК из КМ, жировой ткани и пупочной вены изучает группа под руководством В.Б. Климовича. Исследователи под руководством Я.Ш. Шварца разрабатывают способы модификации ММСК с целью регуляции их про- и противовоспалительную активности. Влияние ММСК, введенных в момент алло-ТКМ, на восстановление иммунитета пациентов изучает Е.Р. Черных с коллегами. Роль ММСК в иммунитете также исследуют на животных моделях. Так, количество и состояние стромальных предшественников из КМ и селезенки мыши после иммунизации ее различными антигенами, а также после инъекций различных иммуномодулирующих препаратов изучает В.Г. Нестеренко. О.В. Лебединская с соавторами исследуют морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и пути дифференцировки ex vivo стволовых стромальных клеток и их взаимодействие с эффекторными иммунными клетками.

А.Г. Коноплянников с соавторами исследует возможности применения ММСК для диагностики и лечения повреждений органов и тканей (при травмах, вызванных облучением, инфаркте миокарда, инсульте, диабете обоих типов, а также при ряде других заболеваний), а также изучает возможности использования ММСК в регенеративной медицине и при лечении онкологических больных. Данные исследования включают работы по использованию наночастиц в диагностике и лечении, а также применение ММСК в терапии некоторых заболеваний легких, таких как фиброз легочной ткани и туберкулез.

Ведутся активные исследования роли ММСК в канцерогенезе. А.В. Белявский с коллегами изучает влияние ММСК на опухолевые клетки при кокультивировании, пути возможной модификации ММСК с целью достичь противоопухолевого эффекта. Ингибирующий эффект ММСК из КМ на формирование метастазов исследует группа Е.В. Загайновой. В.Б. Климович с коллегами изучает свойства ММСК из жировой ткани больных раком молочной железы. Также количество и свойства стромальных предшественников из опухолей человека под влиянием различных полипептидов, а также при различных физических воздействиях исследуют под руководством Р.К. Чайлахяна.

Попыток установить иерархию в отделе стромальных предшественников не проводилось со времен работ А.Я Фриденштейна и И.Л. Черткова, однако в то время выделение ММСК еще не было поставлено на рутинную основу, и иерархическая позиция этих клеток не была описана. В настоящее время исследований свойств истинных стволовых мезенхимных клеток практически не проводится. Системные регуляторы стромальных предшественников разной степени дифференцированности практически не изучены. Недостаточно данных, касающихся ММСК, выделенных из костного мозга как здоровых доноров, так и пациентов с

гематологическими заболеваниями, хотя известно, что между данными клетками, полученными из разных тканей человека, выявляются достоверные различия. В связи с этим, хотя в целом исследования в данной области активно ведутся в Российской Федерации, тема представленной работы изучена недостаточно и ее дальнейшая разработка представляется актуальной.

В других странах исследования ММСК и других стромальных предшественников также имеют многолетнюю историю, и в настоящее время эта область научных исследований развивается очень активно. Еще 40 лет назад Р. Скофилд предложил понятие ниши для кроветворных клеток, сформированной клетками стромы. Большой вклад в изучение состава стромальных клеток, формирующих ниши в костном мозге, внесли Д. Скадден, Ш. Моррисон, М. Оуэн, П. Бианко, М. Питтенжер и другие. Роль остеобластов в нише для кроветворных клеток исследовали группы под руководством Л. Калви и Дж. Жанга. Принципиальную роль эндотелиальных клеток в составе кроветворных ниш описали М. Киль с соавторами, также над этой темой активно работают группы Б. Сачетти и С. Мендез-Феррера. В живом организме мыши локализацию стволовых кроветворных клеток в эндотелиальных нишах показали группы Д. Сипкинс и К. Ло Челсо.

Термин мезенхимная стволовая клетка (МСК) впервые предложил А. Каплан, имея ввиду культивируемые полипотентные стромальные предшественники. Впоследствии руководители нескольких ведущих лабораторий, занимающихся исследованиями данных клеток (Э. Хорвитс, К. Ле Блан, М. Доминичи и другие), предложили более корректное название для данного типа культивируемых клеток - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), а термин МСК было решено оставить для истинных стволовых мезенхимных клеток-предшественниц. Исследование изменений ММСК с возрастом проводятся под руководством А. Штольцинг, а корреляции с возрастом частоты КОЕф были показаны М. Галотто. Изменения, происходящие в стромальных клетках больных лейкозами, описывали Дж. Хирата, Н. Новитский, Л. Ватен, А. Банфи, Дж. Лью и другие исследователи. Т. Хотта, Дж. Марш, А. Басигалупо и другие ученые изучают изменения стромального микроокружения у больных апластической анемией. Строма при острых лейкозах изучена хуже. Механизмы взаимодействия лейкозных клеток со стромой больных исследуют в группах Ж. Вея, Г. Досен-Даля, М. Андрееффа, Л. Кальви и других. Колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф) в костном мозге больных острыми лейкозами изучали К. Карло-Стелла, Г. Майани, Дж. Као, А. Свирновски, А. Банфи, Л. Фуллиард и другие. В целом же, данные многих зарубежных исследований зачастую противоречивы и получены на небольшом числе пациентов или здоровых доноров. Результаты настоящей диссертационной работы внесут вклад в расширение знаний о функционировании стромальных предшественников в норме и при различных заболеваниях и могут представлять интерес для международного научного сообщества.

1.3 Цели и задачи исследования

Цель: охарактеризовать основные характеристики клеток-предшественниц поддерживающего кроветворение стромального микроокружения мыши и человека в норме и при заболеваниях системы крови.

Задачи:

1. изучить пути системной регуляции отдела стромальных предшественников кроветворного микроокружения;

2. выявить изменения, возникающие в данном отделе с возрастом;

3. установить изменения, появляющиеся в отделе стромальных предшественников при возникновении и развитии патологического кроветворения;

4. определить степень воздействия цитостатических препаратов на стромальные клетки-предшественницы;

5. функционально охарактеризовать иерархическую структуру отдела стромальных предшественников кроветворного микроокружения.

1.4 Научная новизна исследования

Научная новизна диссертационного исследования заключается в следующем:

• впервые охарактеризовано действие системных регуляторов (паратиреоидный гормон и гидрокортизон) на известные в настоящее время типы стромальных предшественников в КМ;

• изменения, происходящие с возрастом со стромальными предшественниками из КМ человека, описаны на большой выборке здоровых доноров, и потому обладают высокой статистической достоверностью;

• впервые было исследовано воздействие нескольких цитостатических препаратов одновременно на два типа стромальных клеток-предшественниц, включая самые ранние;

• впервые на довольно большой выборке пациентов с апластической анемией комплексно проанализированы изменения, происходящие со стромальными клетками-предшественницами разного уровня дифференцированности у больных на разных стадиях лечения с учетом степени тяжести заболевания;

• впервые на довольно большой выборке пациентов с острыми лейкозами комплексно проанализированы изменения, происходящие со стромальными клетками-предшественницами разного уровня дифференцированности до и

после проведения алло-ТКМ, причем, в отличие от других исследований, состояние стромальных предшественников оценивали в течение 1 года после выполнения алло-ТКМ; • впервые описаны функциональные характеристики, достоверно подтверждающие иерархическую структуру отдела стромальных предшественников в КМ мыши и человека.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что результаты, полученные автором в ходе исследований, расширяют имеющиеся представления об устройстве и регуляции отдела стромальных предшественников в КМ мыши и человека. Практическая значимость исследования состоит в использовании полученных результатов при планировании экспериментов и клинических исследований, в которых применяют стромальные клетки человека. Выявленные возрастные изменения стромальных предшественников необходимо учитывать при проведении экспериментов и особенно клинических исследований. Выявленные эффекты паратиреоидного гормона, гидрокортизона, цитостатических препаратов, а также протоколов, сопровождающих алло-ТКМ, на стромальные предшественники разной степени зрелости необходимо учитывать в лечении пациентов, так как такие эффекты могут быть причиной осложнений. Так как стромальная ткань обновляется медленно, побочные эффекты могут проявляться через длительное время или в стрессовой ситуации.

1.6 Методология и методы исследования

Методологию данного исследования выстраивали в соответствии с поставленными задачами. Для исследований стромальных клеток-предшественниц непосредственно в живом организме (in vivo) использовали мышиные модели. Стромальные предшественники в КМ мыши исследовали как методами in vivo, так и in vitro. Применяли следующие экспериментальные методы: формирование очага эктопического кроветворения под капсулой почки сингенного реципиента, получение и культивирование длительных культур КМ мыши (ДККМ) по методу Декстера, анализ концентрации колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф), а также кроветворных предшественников различной степени зрелости (как косвенный показатель состояния кроветворного микроокружения). Для исследований стромальных клеток-предшественниц в КМ человека в норме и при развитии заболеваний системы крови исследовали образцы КМ здоровых доноров и больных. Применяли следующие

экспериментальные и описательные методы: получение и культивирование ММСК, анализ ММСК (фенотипирование поверхностных маркеров, способность к дифференцировке, показатели культивирования, способность к клонированию), анализ концентрации КОЕф. Во многих экспериментах, как на мышиных моделях, так и на человеческом КМ, также оценивали изменение относительного уровня экспрессии интересующих генов методами полимеразной цепной реакции в различных модификациях. Статистические отличия в зависимых группах оценивали при помощи парного ^критерия Стъюдента, в независимых - при помощи ^ критерия Стъюдента для независимых выборок. Количество клоногенных предшественников определяли методом Пуассона. Корреляции между показателями оценивали с помощью непараметрического коэффициента Спирмана.

1.7 Положения, выносимые на защиту

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Отдел мезенхимных клеток устроен следующим образом: во главе расположены МСК, далее следуют ММСК, затем КОЕф, из которых дифференцируются индуцибельные клетки-предшественницы, в свою очередь формирующие зрелые клетки стромы костного мозга.

2. Паратиреоидный гормон, являясь системным регулятором кальциевого метаболизма, регулирует количество ниш для стволовых кроветворных клеток в костном мозге.

3. С увеличением возраста донора костного мозга изменяются свойства стромальных клеток-предшественниц: снижается концентрация КОЕф и пролиферативная способность ММСК.

4. МСК, в отличие от КОЕф, не чувствительны к воздействию цитостатических препаратов.

5. Угнетение кроветворения при апластической анемии сопровождается функциональной активацией стромального микроокружения.

6. Лечение, проводимое при острых лейкозах, оказывает различающееся влияние на разные типы стромальных клеток-предшественниц.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных выводов обеспечена тщательной проработкой литературных данных по теме диссертации, детальной разработкой экспериментов, наличием в

анализируемых группах большого количества образцов, достаточного для достоверного использования выбранных методов статистического анализа. В работе подробно освещен каждый этап исследования. Все данные, использованные для анализа, приведены в приложении. Все это делает работу воспроизводимой и проверяемой.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на 26 международных научных конференциях, из которых 7 проходили в Российской Федерации и 19 - за рубежом. Всего по теме диссертации опубликовано 20 научных статей (17 статей в печатных периодических изданиях, общим объемом 100 печатных страниц; 3 статьи - в электронных периодических изданиях, общим объемом - 113992 знака (97322 знака без пробелов)), 1 глава в книге объемом 32 печатных страницы и 38 тезисов в материалах научных конференций общим объемом 42 печатных страницы.

1.9 Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, списка сокращений и условных обозначений и приложений А,Б и В; содержит 274 страницы текста, 27 таблиц и 49 рисунков.

Глава 2. Обзор литературы

2.1 Кроветворное стромальное микроокружение в костном

мозге мыши и человека

Структура костного мозга

Постнатальный КМ состоит из кроветворной ткани и ассоциированной с ней стромы. Глубокий фенотипический и функциональный анализ клеточного состава КМ выявил наличие двух независимых стволовых клеток. КМ, по-видимому, является единственным органом, в котором два типа отличных друг от друга стволовых клеток и производимых ими клеточных типов не только сосуществуют, но и функционально взаимодействуют [57]. Известно, что поддержание нормального кроветворения осуществляется в тесной взаимосвязи со стромальным микроокружением КМ [27]. Клетки стромы КМ представлены потомками МСК: фибробластами, адипоцитами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками, а также остеобластами-остеоцитами, хондроцитами и теноцитами [77; 219; 294]. КМ окружен костной тканью, пронизанной нервными волокнами и кровеносными сосудами с прилегающими к ним периваскулярными ретикулярными клетками [116]. Тонкие выросты костной ткани наполняют метафизы костей, поэтому клетки, которые там находятся, в большинстве своем располагаются близко к поверхности кости. Место контакта кости и КМ называется эндост, он покрыт формирующими кость остеобластами и резорбирующими ее остеокластами. Кислород, питательные вещества и ростовые факторы поступают в КМ через артерии и артериолы, которые затем формируют синусоиды, сливающиеся в центральный венозный синус. Синусоиды - это специализированные венулы, формирующие ретикулярную сеть фенестрированных сосудов, которые облегчают клеткам крови вхождение в кроветворное русло, а также выход из него. Особенно богат артериолами и синусоидами эндост [266].

Ниши для стволовых кроветворных клеток

Стромальные клетки КМ не просто являются механической подложкой, на которой происходит кроветворение. Еще в 1978 году была выдвинута гипотеза существования специализированных ниш для стволовых кроветворных клеток (СКК), основанная на изучении поведения СКК при трансплантации в облученный организм [341]. Современная формулировка понятия ниши более широка и включает в себя конкретную комбинацию клеток локального

микроокружения, напрямую регулирующую и поддерживающую конкретный тип стволовых клеток или клеток-предшественниц [267].

В настоящее время известно, что кроветворное микроокружение состоит из остеобластных и сосудистых ниш в КМ, включающих в себя МСК, другие стромальные предшественники и дифференцированные клетки стромы. Первые исследования, направленные на выявление клеточных компонентов ниш, показали, что при нормальном кроветворении гомеостаз ранних СКК поддерживают ниши, в состав которых входят остеобласты [73; 438]. В этих работах впервые было экспериментально подтверждено существование некроветворных клеток, регулирующих функции СКК, однако, было неочевидно, является ли это воздействие прямым или опосредованным. Тем не менее, было положено начало огромному количеству исследований, которые позволили описать сложную структуру кроветворного микроокружения в КМ. Данные, полученные в настоящее время, позволяют более точно определить компоненты, регулирующие СКК и, в некоторой степени, другие кроветворные клетки-предшественницы, в КМ. Система регуляторных воздействий в КМ сложно устроена и сбалансирована; воздействие на один клеточный тип оказывает влияние на другие клетки, и необязательно это непосредственные взаимодействия. Современные данные позволяют предположить, что ранние работы, в которых было показано изменение частоты встречаемости СКК в КМ после генетических манипуляций с остеобластами [73; 438], скорее описывали непрямой эффект на СКК, чем существование остеобластной ниши для этих клеток [266]. Повышенная экспрессия паратиреоидного гормона (ПТГ) оказывает воздействие не только на остеобласты, но и на другие типы клеток, в том числе на эндотелиальные, и даже на нервные клетки [404; 418].

Выявление необходимой и достаточной комбинации поверхностных маркеров наиболее ранних, покоящихся СКК (CD150CD48 CD41 /CD41low) [208] позволило локализовать эти клетки на гистологических срезах. Оказалось, большинство CD150CD48 CD41 Lin клеток расположено рядом с синусоидами, и практически все клетки с таким иммунофенотипом - в пределах 5 клеточных диаметров от синусоида [206; 208]. В то же время, большинство СКК расположены в трабекулярных областях КМ, и, таким образом, СКК и/или клетки поддерживающих их ниш находятся под прямым или опосредованным влиянием факторов, представленных на поверхности кости.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Шипунова Ирина Николаевна, 2019 год

использованных для ПЦР

Ген Праймер Последовательность нуклеотидов

ALPL Прямой CCAACGTGGCTAAGAATGTC

Обратный CATCTCGTTGTCTGAGTA

GAPDH Прямой ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG

Обратный GCCAGTGGACTCCACGACGT

PPARG Прямой CCACGAGATCATTTACACA

Обратный AGAATAGTGCAACTGGAAGA

PTHR1 Прямой GTGACACACGGCAGCAGTAC

Обратный ATGACTGTCTCCCACTCTTC

Таблица Б.2 - Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов, использованных для ПЦР в режиме реального

времени

Ген Праймер/Проба Последовательность нуклеотидов

ВАСТ Прямой CAACCGCGAGAAGATGACC

Обратный CAGAGGCGTACAGGGATAGC

Проба ROX-AGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACG-RTQ2

BGLAP Прямой GCAGCGAGGTAGTGAAGAG

Обратный GAAAGCCGATGTGGTCAG

Проба FAM-CTCCCAGCCATTGATACAGGTAGC-RTQ1

ВМР4 Прямой ACAGCACTGGTCTTGAGTATC

Обратный TGGGATGTTCTCCAGATGTTC

Проба FAM- AACACCGTGAGGAGCTTCCACCA -RTQ1

CFH Прямой TTACCCTTACAGGAGGAAATGT

Обратный GCTGTCACTGGTAAACACTTC

Проба FAM-CTTCACATATAGGAATATCATTGGTCCAT-RTQ1

CSF1 Прямой AGGAACTCTCTTTGAGGCTG

Обратный CATTCTTGACCTTCTCCAGCA

Проба FAM-CTTGTCATGCTCTTCATAATCCTTGG-RTQ1

FGF2 Прямой GAAGAGCGACCCTCACATCAAG

Обратный TCCGTAACACATTTAGAAGCCAGTA

Проба FAM-TCATAGCCAGGTAACGGTTAGCACACACTCCT-RTQ1

FGFR1 Прямой CAGAATTGGAGGCTACAAGG

Обратный TGATGCTGCCGTACTCATTC

Проба FAM- CATCATAATGGACTCTGTGGTGC-RTQ1

FGFR2 Прямой GCAGCGAGGTAGTGAAGAG

Обратный GAAAGCCGATGTGGTCAG

Проба FAM-CTCCCAGCCATTGATACAGGTAGC-RTQ1

GAPDH Прямой GGTGAAGGTCGGAGTCAACG

Обратный TGGGTGGAATCATATTGGAACA

Проба ROX-CTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCA-RTQ2

1САМ1 Прямой GCAATGTGCAAGAAGATAGC

Обратный CTCCACCTGGCAGCGTAG

Проба ROX-CACGGTGAGGAAGGTTTTAGCTGTT-RTQ2

Ю01 Прямой AGCGTCTTTCAGTGCTTTG

Обратный GGATTTGACTCTAATGAGCACA

Проба FAM-ACATGCTGCTCAGTTCCTCCAGG-RTQ1

IGF1 Прямой CTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGC

Обратный TTGCGTTCTTCAAATGTACTTCCT

Проба FAM-CCTGCCAAGTCAGCTCGCTCTGTC-RTQ1

ген праймер/проба последовательность нуклеотидов

111В Прямой ATTCTCTTCAGCCAATCTTCA

Обратный AAGGAGCACTTCATCTGTTTA

Проба FAM-AGAACAAGTCATCCTCATTGCCAC-RTQ1

И1Я1 Прямой CTAATGAGACAATGGAAGTAGAC

Обратный AGCACTGGGTCATCTTCATC

Проба FAM- CAGTTGAGTGACATTGCTTACTGGAA -RTQ1

1Ь6 Прямой ACCTGAACCTTCCAAAGATG

Обратный CTCCAAAAGACCAGTGATGA

Проба FAM-ATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTG-RTQ1

1Ь8 Прямой ACCATCTCACTGTGTGTAAAC

Обратный GTTTGGAGTATGTCTTTATGC

Проба FAM-CAGTTTTGCCAAGGAGTGCTAAAG-RTQ1

Мв1 Прямой ATAAAGTCCTTCCCGCTG

Обратный TTATCTTCTCCCATCATTAAG

Проба FAM-AGACAACAGACAAATCACCATTCGT-RTQ1

ЬОЛЬЗЬ Прямой CCAGCAACCTGAATCTCA

Обратный CGAAGCTCTTAGCGTCAG

Проба FAM-CACTCGAAGGCACTCTCCAGGT-RTQ1

Прямой AAGTGCAGCCCATAATGAAG

Обратный CATTGAGCTGTGCCAGTTG

Проба FAM-TTGTGCCCCTGCTGTTGGTTCT-RTQ1

PDGFRЛ Прямой TGGCTAAGAATCTCCTTGGA

Обратный ACCAGGACAATAAGTGAGATG

Проба FAM-CAATCACCAACAGCACCAGGACT-RTQ1

PDGFRB Прямой CTCCCTTATCATCCTCATCA

Обратный TCCACGTAGATGTACTCATG

Проба FAM-TCACAGACTCAATCACCTTCCATC-RTQ1

PPЛRG Прямой TACTGTCGGTTTCAGAAATGC

Обратный CAACAGCTTCTCCTTCTCG

Проба FAM-CCATCAGGTTTGGGCGGATGCC-RTQ1

PTGES Прямой CTGGTCATCAAGATGTACGTG

Обратный CTCCGTGTCTCAGGGCAT

Проба FAM- CTTCTTCCGCAGCCTCACTTGG-RTQ1

SDF Прямой CTACAGATGCCCATGCCGAT

Обратный TAGCTTCGGGTCAATGCACA

Проба FAM-CAGTTTGGAGTGTTGAGAATTTTGAG-RTQ1

SOX9 Прямой AGCAAGACGCTGGGCAAG

Обратный GTTCTTCACCGACTTCCTC

Проба FAM-CTGGAGACTTCTGAACGAGAGC-RTQ1

SPP1 Прямой ATAGTGTGGTTTATGGACTGAG

Обратный ATTCAACTCCTCGCTTTCC

Проба FAM-CCAGTACCCTGATGCTACAGACGAG-RTQ1

ген праймер/проба последовательность нуклеотидов

TGFB1 Прямой TGCGTCTGCTGAGGCTCAA

Обратный CGGTGACATCAAAAGATAACC

Проба FAM-AGGAATTGTTGCTGTATTTCTGGTAC-RTQ1

TGFB2 Прямой AGTGCCTGAACAACGGATTG

Обратный CACAACTTTGCTGTCGATGTA

Проба FAM-ATATCAGATTCTCAAGTCCAAAGATTT-RTQ1

VCAM1 Прямой CCGAAAGGCCCAGTTGAAG

Обратный CACGAGAAGCTCAGGAGAAA

Проба FAM-AACAAAGTTGGCTCACAATTAAGAAGTTT-RTQ1

VEGFA Прямой AGGCGAGGCAGCTTGAGTTA

Обратный ACCCTGAGGGAGGCTCCTT

Проба FAM-CCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGT-RTQ1

Приложение В

(обязательное)

Характеристики стромальных предшественников, выделенных из костного мозга больных апластической анемией

Таблица В.1 - Характеристики ММСК трех больных АА до и после алло-ТКМ

Характеристика ММСК № больного ММСК пациентов ММСК доноров

Время после алло-ТКМ, дни М±SEM; 95%-й ДИ (от; до)

0 30 60 90 120 180 365

Суммарная продукция ММСК за 3 пассажа, млн 1 11,24 12,78 12,8 9,55 9,79 14,42 17,46 6,97±1,09; (4,83; 9,11)

2 0,27 12,6 0,79 11,8 2,43 12,98 0,65

3 - 14,53 5,75 10,17 9,22 15,75 12,75

Время до П0, дни 1 14 14 16 11 9 16 13 14,16±0,58; (13,03; 15,30)

2 14 11 10 10 11 12 9

3 - 14 14 12 13 9 13

Экспрессия гена BMP4 1 5,00 1,94 1,34 0,52 0,06 - 0,46 1,18±0,23; (0,72; 1,63)

2 0,66 0,12 0,03 0,00 1,04 0,22 2,01

3 0,07 0,18 0,41 1,55 0,46 0,89

Характеристика ММСК № больного ММСК пациентов ММСК доноров

Время после алло-ТКМ, дни M±SEM; 95%-й ДИ (от; до)

0 30 60 90 120 180 365

Экспрессия гена IL6 1 3,3 0,4 42,7 7,4 112,7 - 7,0 3,06±0,66; (1,77; 4,34)

2 4,0 1,0 4,3 13,5 4,1 4,3 7,1

3 - 43,6 8,2 41,8 8,3 66,0 26,3

Экспрессия гена CFH 1 0,79 0,00 0,13 0,10 0,16 - 1,19 0,83±0,25; (0,32; 1,33)

2 0,83 0,28 0,11 0,23 0,09 1,00 1,46

3 - 0,36 0,05 0,00 1,98 1,21 1,69

Экспрессия гена IDO 1 1 5,6 0,0 4,0 2,7 1,3 - 0,5 1,86±0,97; (0,0; 3,8)

2 0,4 0,0 2,7 0,0 2,9 0,7 0,3

3 - 0,0 0,0 3,5 0,0 0,5 0,1

Экспрессия гена PTGES 1 1,13 0,65 0,68 1,54 1,90 - 0,33 1,66±0,22; (1,24; 2,08)

2 2,07 3,89 0,71 0,63 2,40 1,59 0,88

3 - 0,69 1,42 0,84 0,46 0,83 1,58

Экспрессия гена CSF1 1 0,47 0,30 0,87 0,51 1,75 - - 0,71±0,13; (0,46; 0,96)

2 0,04 0,08 0,09 0,08 0,54 0,30 0,14

3 - 0,35 1,49 0,49 - - -

Экспрессия гена JAG1 1 1,72 0,27 0,64 0,32 2,46 - 3,30 1,72±0,28; (1,18; 2,27)

2 0,85 0,64 3,01 0,77 2,76 2,05 1,27

3 - 1,86 1,00 1,16 5,08 6,16 6,67

Экспрессия гена SDF1 1 0,76 0,62 0,41 0,82 1,25 - - 0,89±0,19; (0,50; 1,28)

2 4,66 1,96 0,58 2,70 2,92 1,50 1,54

3 - 0,49 0,37 1,13 - - -

Характеристика ММСК № больного ММСК пациентов ММСК доноров

Время после алло-ТКМ, дни М±SEM; 95%-й ДИ (от; до)

0 30 60 90 120 180 365

Экспрессия гена FGF2 1 1,33 2,44 2,51 1,32 6,98 - 9,53 4,64±1,04; (2,60; 6,69)

2 2,06 2,05 3,15 8,28 3,02 1,73 7,69

3 - 1,80 3,75 5,21 5,59 9,24 5,72

Экспрессия гена FGFR1 1 0,45 0,78 0,47 0,43 0,15 - 0,45 0,67±0,10; (0,48; 0,87)

2 1,19 1,20 0,46 0,69 0,28 0,19 0,27

3 - 0,56 0,25 0,25 0,42 0,36 0,40

Экспрессия гена FGFR2 1 1,47 2,48 1,22 0,98 2,06 - 2,05 3,86±0,92; (1,99; 5,74)

2 0,42 0,55 0,17 0,28 0,56 0,59 0,21

3 - 1,79 1,07 1,09 2,03 1,33 1,52

Экспрессия гена TGFЫ 1 0,43 0,34 0,56 0,70 0,50 2,02 1,18±0,17; (0,84; 1,52)

2 1,16 1,42 1,32 2,01 1,34 0,65 1,66

3 1,25 1,39 1,10 1,69 1,20 1,04

Экспрессия гена TGFЫ2 1 1,63 0,64 1,39 0,79 4,06 - 13,09 4,33±1,51; (1,26; 7,41)

2 0,08 0,55 1,49 1,04 0,36 0,50 3,23

3 - 2,05 1,15 1,65 6,03 6,12 5,22

Экспрессия гена PDGFRA 1 1,24 1,00 0,74 0,79 1,60 - 2,74 0,84±0,15; (0,55; 1,13)

2 0,72 0,48 0,08 0,67 0,24 0,27 0,55

3 - 0,28 0,39 0,87 2,58 2,85 2,17

Экспрессия гена PDGFRЫ 1 1,20 1,34 0,47 0,96 1,45 - - 1,02±0,16; (0,70; 1,33)

2 - - - - - - -

3 - 1,13 0,40 0,54 - - -

Характеристика ММСК № больного ММСК пациентов ММСК доноров

Время после алло-ТКМ, дни М±SEM; 95%-й ДИ (от; до)

0 30 60 90 120 180 365

Экспрессия гена SPP1 1 0,05 0,01 0,06 0,08 2,48 - 0,74 0,49±0,33; (0,00; 1,16)

2 1,10 0,01 0,79 0,00 0,03 0,00 1,46

3 - 0,08 1,76 0,02 0,46 0,17 12,18

Экспрессия гена PPARG 1 0,49 0,09 0,13 0,20 0,32 - 0,06 0,27±0,04; (0,19; 0,36)

2 12,03 0,50 1,08 0,37 2,15 0,91 0,24

3 - 0,05 0,18 0,28 0,22 1,20 1,88

Экспрессия гена SOX9 1 1,69 0,97 2,04 3,25 7,91 - - 1,71±0,25; (1,21; 2,20)

2 0,47 0,27 0,33 0,66 0,20 0,48 1,40

3 - 3,48 3,75 1,96 - - -

Экспрессия гена Ш 1 7,17 0,23 16,04 0,91 18,55 - 2,15 4,04±2,63; (0,0; 9,5)

2 0,14 0,04 1,42 0,17 1,02 0,04 0,09

3 - 2,34 1,04 11,79 0,36 38,71 13,41

Экспрессия гена Ш1В 1 0,03 0,03 1,46 0,01 2,20 - - 0,32±0,12; (0,11; 0,53)

2 0,00 0,01 1,13 0,14 0,78 0,07 0,06

3 - 1,52 0,17 0,19 - - -

Экспрессия гена КШ 1 1,22 0,87 1,60 11,49 5,00 - - 1,35±0,19; (0,99; 1,72)

2 0,85 0,51 0,21 0,73 0,51 0,19 0,33

3 - 0,88 0,50 2,32 - - -

Экспрессия гена VEGF 1 2,38 2,74 10,39 6,86 13,40 - - 3,39±0,58; (2,27; 4,52)

2 0,63 0,38 0,89 0,23 0,55 0,25 0,57

3 - 8,99 7,26 3,49 - - -

Экспрессия гена IGF1 1 1,11 0,07 0,11 0,31 0,61 - 1,09 0,49±0,22; (0,05; 0,93)

2 3,54 0,66 0,13 1,07 0,27 0,48 0,56

3 - 0,18 0,15 0,14 3,26 2,14 1,70

Таблица В.2 - Характеристики КОЕф трех больных АА до и после алло-ТКМ

Характеристика ММСК № больного ММСК пациентов ММСК доноров

Время после алло-ТКМ, дни М±SEM; 95%-й ДИ (от; до)

0 30 60 90 120 180 365

концентрация КОЕф в КМ, на млн клеток 1 58,3 64,3 2,67 24,3 67 0 12 20,68±3,77; (13,29; 28,07)

2 38 185 28 38,5 - 34 0,5

3 0 1,3 13 0 6 184 20

Экспрессия гена FGF2 1 0,57 3,94 0,71 5,19 0,29 - 3,97 4,40±1,64; (0,00; 4,16)

2 - 0,60 - 0,06 5,06 3,48 0,00

3 - 0,12 4,84 - 1,79 0,43 0,73

Экспрессия гена FGFR1 1 1,68 0,46 0,63 0,92 0,65 - 0,78 0,86±0,10; (0,66; 1,04)

2 - 0,80 - 0,35 0,46 0,54 0,43

3 - 0,13 0,52 - 0,38 1,19 1,75

Экспрессия гена FGFR2 1 0,63 0,08 0,03 0,30 0,11 - 0,16 0,52±0,18; (0,00; 0,52)

2 - 0,09 - 0,00 0,05 0,32 0,00

3 - 0,00 0,01 - 0,07 1,64 1,18

Экспрессия гена SPP1 1 0,14 0,59 15,47 0,52 0,02 - 15,35 4,89±1,65; (0,00; 4,87)

2 - 0,04 - 37,29 2,48 0,10 9,63

3 - 3,41 5,99 - 2,62 0,32 0,64

Экспрессия гена PPARG 1 0,97 0,35 3,51 0,68 0,22 - 2,58 1,41±0,36; (0,00; 1,21)

2 - 0,29 - 7,83 1,50 0,44 7,54

3 - 3,87 2,99 - 2,26 0,62 2,64

Экспрессия гена ЫMP4 1 3,94 0,12 0,33 0,59 0,53 - 0,69 0,31±0,09; (0,00; 0,26)

2 - 0,48 - 0,11 1,13 0,76 0,34

3 - 0,00 0,21 - 0,37 0,37 3,35

Примечание к таблицам В.1 и В.2:

алло-ТКМ - трансплантация аллогенного костного мозга; ММСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки; КОЕф - колониеобразующие единицы фибробластов;

M±SEM - mean ± standard error of mean, среднее ± стандартная ошибка среднего; 95%-й ДИ - 95%-й доверительный интервал.