Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Вьючнова, Надежда Васильевна

• Вьючнова, Надежда Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вьючнова, Надежда Васильевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Таксономическое положение и характеристика основных 14 биологических свойств Histoplasma capsulatum

1.2. Эпидемиология возбудителя гистоплазмоза

1.3.Методы лабораторной диагностики гистоплазмоза

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов

2.3. Обеззараживание материала, содержащего патогенные 45 микромицеты

2.4. Подготовка проб для постановки реакции амплификации

2.5. Методы выделения ДНК

2.6. Выбор и синтез олигонуклеотидных праймеров

2.7. Постановка полимеразной цепной реакции

2.8. Секвенирование продуктов амплификации

2.9. Проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации

2.10. Заражение лабораторных животных 51 2.11 .Статистическая обработка данных 52 ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА

3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и конструирование 53 группоспецифических праймеров

3.2. Подбор оптимальных условий для постановки полимеразной 56 цепной реакции

ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА

4.1. Подготовка проб и выделение ДНК из чистых культур возбудителя 64 гистоплазмоза для проведения ПЦР

4.2. Выделение ДНК возбудителя гистоплазмоза из искусственно 69 контаминированных проб

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫБРАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ, А ТАКЖЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИСТОПЛАЗМОЗЕ

5.1. Определение аналитической чувствительности и специфичности 74 выбранных олигонуклеотидных затравок при исследовании чистых культур различных штаммов Н. capsulatum и гетерологичных микроорганизмов

5.2. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения 82 возбудителя гистоплазмоза при экспериментальной инфекции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

86 90

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг - антиген Ат - антитело

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

кДа - килодальтон

п.н. - пары нуклеотидов

м.п.н. - миллион пар нуклеотидов

ИФА - иммуноферментный анализ

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис - трис (гидрооксиметил) аминометан

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции»

ВВЕДЕНИЕ

Histoplasma capsulatum — диморфный микромицет, возбудитель тяжелого инфекционного заболевания - гистоплазмоза. В настоящее время выделяют: H.capsulatum var. capsulatum - возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, высокоэндемичные очаги которого расположены вдоль реки Миссисипи (США) и H.capsulatum var. duboisii - возбудитель африканского гистоплазмоза, распространенного в странах Центральной и Западной Африки [72, 73]. В последнее время гистоплазмоз зарегистрирован в ряде штатов США, странах Латинской Америки [69, 91, 93, 106, 131], а также многих азиатских странах, таких как Индонезия, Тайланд, Индия [68, 104].

Еще один вариант Н. capsulatum var. farciminosum - возбудитель эпизоотического лимфангоита у лошадей, ослов, мулов. Возбудитель широко распространен в Европе, Северной Африке, Индии и Южной Азии. В патологии людей какого-либо существенного значения не имеет [28, 92]. Более того, первоначально данный вариант Н. capsulatum, рассматривался как отдельный вид Н. farciminosum [3].

В настоящее время случаи заболевания гистоплазмозом зарегистрированы более чем в 60 странах мира [39, 65, 72, 73, 91, 93]. В России до сих пор не было достоверно подтверждено ни одного случая заболевания гистоплазмозом. Можно предположить, что причина заключается в малой осведомленности работников здравоохранения в отношении этого микоза и отсутствие коммерческих препаратов для диагностики. В то же время имеется вероятность выявления данных возбудителей у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных стран, а также в продуктах растениеводства, импортируемых из этих регионов [104].

Ввиду существования угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате террористических актов, интерес к возбудителю гистоплазмоза проявляется и как к потенциальному агенту биотерроризма. Высокая степень угрозы обусловлена легкостью создания

микроспорового аэрозоля, неэффективностью вакцин, сложностью диагностики и терапии, а также отсутствием иммунной прослойки и потому практически полной незащищенностью населения от этого патогена [17, 23].

Разнообразие клинических проявлений наряду с отсутствием патогномоничных симптомов являются причинами трудностей диагностики гистоплазмоза [74, 90]. Для подтверждения диагноза необходима изоляция Н.capsulatum на питательной среде. Достоверность культурального метода должна быть подтверждена получением конверсии одной фазы гриба в другую. Как правило, эти процедуры занимают минимум 3-4 недели. К биологическому методу лабораторной диагностики гистоплазмоза прибегают для идентификации культуры гриба при исследовании патологического материала, контаминированного посторонней биотой. При этом время, необходимое для верификации диагноза, увеличивается до 8 недель. Постановка иммунологических реакций занимает значительно меньшее время, но они недостаточно специфичны из-за возможных перекрестных реакций с гетерологичными видами микромицетов [74, 92]. Как следует из этих литературных данных, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет преодолеть эти трудности и выявлять данный патоген независимо от этапа культивирования гриба.

В большинстве зарубежных публикаций посвященных разработке генетических методов идентификации Н.capsulatum в качестве ДНК-мишеней используют последовательности генов 18S рРНК, 100 кДа белка, гена Н-антигенаи гена М-антигена [44, 52, 62, 106, 107, 112, 116, 151].

R. Bialek с соавторами [52] разработали «гнездную»-ПЦР с использованием праймеров на основе гена 18S рРНК. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов грибов, в этой работе рекомендовано дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов. Важно отметить, что метод секвенирования для идентификации продуктов ПЦР при

анализе клинических проб и проб из объектов внешней среды может быть использован лишь после секвенирования и внесения в GenBank генов 18S рРНК всех грибов. В противном случае возможно получение ложноположительных результатов.

В дальнейших работах авторами разработана «гнездная»-ПЦР, где в качестве мишени для праймеров выбран участок гена, кодирующего уникальный 100 кДа белок H.capsulatum. При секвенировании продуктов реакции все последовательности были гомологичными последовательности гена, кодирующего 100 кДа белок H.capsulatum [44, 62]. Однако 30% положительных при микроскопии клинических образцов от больных гистоплазмозом не детектировались в реакции амплификации с данными праймерами.

A. Bracca et. al. [107] разработали «полу-гнездную» ПЦР с олигонуклеотидными затравками, фланкирующими фрагменты гена Н-антигена возбудителя гистоплазмоза. Заявляемая авторами чувствительность составила порядка 10 геномных копий. В то же время, по словам самих авторов, количество проанализированных образцов недостаточно для оценки возможности применения данного теста в диагностических целях.

Более перспективной оказалась работа H. L. de Matos Guedes et. al. [116], которые подобрали праймеры на основе нуклеотидных последовательностей гена М-антигена. Авторами были исследованы чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы. Праймеры детектировали как H.capsulatum var. capsulatum, так и H.capsulatum var. duboisii, в то время как пробы, содержащие Н. capsulatum var. farciminosum, были отрицательными.

По химическому строению клеточная стенка H.capsulatum существенно отличается от клеточной стенки бактерий и содержит глюканы, хитин, небольшое количество белка и липидов. Разрушить оболочку клетки гриба -сложную и прочную структуру, в формировании которой принимают участие различные типы связей, достаточно сложно. Ввиду особенностей строения

клеточной стенки грибов для оптимизации метода выделения ДНК необходимо использование дополнительных приемов, которые обеспечивают эффективный лизис клеток возбудителя гистоплазмоза [5, 7, 54, 43, 137].

Анализ литературных данных не позволяет сделать заключение о преимуществах тех или иных праймеров для идентификации возбудителей гистоплазмоза. До сих пор нет общепринятых ДНК-мишеней, на основе которых конструировали бы амплификационные тест-системы. На сегодняшний день в России не разработаны тест-системы для обнаружения Н. capsulatum методом ПЦР.

На основании вышеизложенного очевидна актуальность исследований, направленных на совершенствование схем лабораторной диагностики гистоплазмоза и создание амплификационной тест-системы для идентификации H.capsulatum методом ПЦР.

Цель работы заключалась в конструировании амплификационной тест-системы для выявления ДНК H.capsulatum методом полимеразной цепной реакции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации H.capsulatum методом ПЦР.

2. Оптимизировать условия проведения ПЦР, оценить специфичность и чувствительность выбранных олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, НсСВР ls-HcCBP2as на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов и разработать амплификационную тест-систему для идентификации H.capsulatum.

3. Определить оптимальные методы выделения и очистки ДНК возбудителя гистоплазмоза при анализе чистых культур микромицетов, объектов

внешней среды и биологического материала, контаминированных клетками Н.capsulatum.

4. Оценить эффективность сконструированной амплификационой тест-системы для диагностики экспериментального гистоплазмоза.

Научная новизна:

Впервые для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза в качестве ДНК мишеней для посадки праймеров использовали ген, кодирующий белок мицелиальной фазы MS8 и ген, опосредующий синтез кальций-связывающего белка СВР в дрожжевой фазе.

На основании полученных результатов получено положительное решение о выдаче патента на изобретение №2011127594/10(040875) «Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum» (от 04.06.2012 г., приоритет от 05.07.2012 г.).

На основе гена ms8 впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистоплазмоза на основе ПЦР и показана ее эффективность при обнаружении ДНК гриба в объектах внешней среды, контаминированных клетками Н.capsulatum и биологическом материале, полученном от экспериментально зараженных животных.

В результате исследований предложен метод выделения ДНК возбудителя гистоплазмоза, позволяющий проводить эффективный лизис клеток и очистку ДНК патогенных грибов, обеспечивающий высокую чувствительность и специфичность реакции амплификации.

Впервые схема лабораторной диагностики гистоплазмоза дополнена этапами ПЦР с использованием разработанной тест-системы при идентификации чистых культур Н. capsulatum, а также обнаружении возбудителя в клиническом материале и пробах из объектов внешней среды.

Практическая ценность:

Материалы научных исследований использованы при разработке МУ 3.4.3008-12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней» (утверждены Главным , государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.03.2012 г.), проекта Методических рекомендаций «Идентификация возбудителей особо опасных микозов по таксономическим признакам и эпидемиологической значимости» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).

По результатам диссертационной работы составлены Методические указания «Лабораторная диагностика особо опасных микозов» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 3.04.2012 г.), методические рекомендации «Использование олигонуклеотидных праймеров для выявления возбудителей гистоплазмоза с помощью полимеразной цепной реакции» (утверждены директором института 30.06.2009 г.) и методические рекомендации «Подготовка проб контаминированных возбудителями гистоплазмоза для исследования методом ПЦР» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).

Для государственной регистрации проведены внутриинститутские комиссионные испытания параметров качества сконструированной амплификационой тест-системы (чувствительность, специфичность) (акт испытаний от 30.06.2010 г.), разработана и утверждена нормативная документация, в том числе Пусковой регламент, Технические условия и Инструкция по применению к «Набору реагентов для выявления ДНК

ДНК Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции (утверждены директором института 10.10.2011 г.).

Сконструированную амплификационную тест-систему и предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа генетических особенностей музейных штаммов Н.capsulatum и испытательно-лабораторном центре при исследовании поступающих проб на наличие возбудителей микромицетов II группы патогенности.

Материалы включены в лекционный материал программы повышения квалификации врачей по специальности «Лабораторная микология» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 21.04.2005 г.; курсов повышения квалификации врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.09.2007 г.; программы профессиональной переподготовки по специальности «Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II группы» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27.08.2010 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Группоспецифические праймеры HcMs8s-Ms8as3 подобранные, на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBPls-HcCBP2as сконструированные на основе гена кальций-связывающего белка СВР, обеспечивают амплификацию ДНК Н. capsulatum var. capsulatum, Н. capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.

2. Амплификационная тест-система, сконструированная на основе праймеров HcMs8s-Ms8as3, обладает аналитической чувствительностью 1x104 кл/мл при анализе чистых культур и объектов внешней среды

(почвы, воды), контаминированных клетками Н. capsulatum, и позволяет обнаруживать возбудитель в клиническом материале.

3. Праймеры HcMs8s2-Ms8as, обеспечивающие чувствительность ПЦР 1x10 - 1x10° кл/мл, позволяют выявлять ДНК Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. farciminosum и не определяют Н. capsulatum var. duboisii.

4. Ферменты «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» или «Chitinase from Trichoderma viride», добавленные в образец на стадии пробоподготовки, позволяют улучшить лизис клеток, увеличить концентрацию, чистоту выделяемой ДНК микромицетов и, соответственно, повысить чувствительность реакции амплификации.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, Национальная Академия Микологии 2007 г.; на III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции Москва, 2008 г.; научно-практической конференции по медицинской микологии «XI Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2008 г.; на Междисциплинарном микологическом форуме, Москва Национальная Академия Микологии 2009 г.; на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» Оболенск, 2009 г.; на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, Россия, 2009 г.; научно-практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2009 г.; на V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2010 г.; на Междисциплинарном

микологическом форуме, Москва, Национальная Академия Микологии 2010 г.; на научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2010 г.; на научно-практической конференции по медицинской микологии «XIII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2010 г.; на VII Всероссийской научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» Москва, 2010 г.; на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2011 г.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 158 источников, в том числе 26 отечественных и 132 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Таксономическое положение и характеристика основных биологических свойств H.capsulatum

Систематическое положение возбудителя гистоплазмоза

Гнстоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к виду Н. capsulatum. Естественной средой обитания возбудителя гистоплазмоза является почва различных климатических зон. Н. capsulatum var. capsulatum - возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, выделяют преимущественно вдоль реки Миссисипи (США); Н. capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки. Н. capsulatum var. farciminosum не является патогенным для человека, ареал его распространения включает Европу, Северную Африку, Индию и Южную Азию [27, 28, 72, 91, 93].

Возбудитель гистоплазмоза, помимо анаморфы - Н. capsulatum, имеет половую стадию развития — телеоморфу — Ajellomyces capsulatum [20].

Гистоплазмоз был впервые описан в 1906 году американским врачом Darling S.T. в зоне Панамского канала. При микроскопическом исследовании патологического материала он обратил внимание на включения в гистиоцитах и сделал предположение об открытии нового вида простейших - Histoplasma capsulatum [46]. В 1908 Darling S.T. описал еще 3 случая гистоплазмоза, окончившихся летально [47].

Природа возбудителя гистоплазмоза подвергалась сомнению еще в 1912 году, когда da Rocha-Lima установил, что «сравнение микроорганизма Дарлинга с лейшманиями и дрожжами выявило гораздо большее сходство его свойств с дрожжами, чем с простейшими» [3]. Истинная природа возбудителя была выяснена только в 1934 году в результате наблюдения за ребенком, страдавшим тяжелой анемией неизвестной этиологии. После смерти ребенка Monbreun W. выделил чистую культуру микромицета на разных питательных средах, тем самым установив диморфную природу гриба, описал

культуральные свойства и морфологические признаки возбудителя, он же впервые успешно заразил экспериментальных животных [109, 138].

В 1949 году Emmons С. W. впервые выделил чистую культуру Н. capsulatum из почвы и микроскопически обнаружил в почве бугорчатые споры этого гриба. В 1954 году сотрудники американского центра по изучению гистоплазмоза нашли Н. capsulatum в пробах воздуха [60].

Dubois А. и Vanbreuseghem R. у больных в Конго описали африканский тип гриба, который отличается от американского более крупными размерами (10-13мкм) тканевых форм [56, 152].

Изначально Н.capsulatum var. duboisii был определен как самостоятельный вид, однако в дальнейшем оказалось, что морфологические и иммунологические различия между Н.capsulatum и Н.duboisii несущественны, а половая стадия обоих видов грибов идентична. Более того, успешно осуществлялось скрещивание между этими вариантами, хотя не исключено, что речь идет о получении межвидовых гибридов [88].

Различия трех вариантов Н. capsulatum - capsulatum, duboisii и farciminosum были выявлены при секвенировании их спейсерных областей (ITS1-5.8S rDNA - ITS2) [89, 118, 119, 143, 150].

В настоящее время систематическое положение возбудителей гистоплазмоза представлено таким образом [144]: Надцарство: Eukaryota; Царство: Fungi; Отдел: Ascomycota; Подотдел: Pezizomycotina\ Класс: Euascomycetes; Порядок: Onygenales; Семейство: Onygenaceae; Род: Ajellomyces {Histoplasma)\ Вид: А. capsulatus (Н. capsulatum) - Н. capsulatum var. capsulatum, Н. capsulatum var. duboisii, H. capsulatum var. farciminosum.

Много исследований было направлено на попытки сгруппировать штаммы Н. capsulatum на основе генетического сходства методом ПДРФ, с использованием праймеров на основе митохондриальной, рибосомальной ДНК и последовательности гена yps, что позволяет разделить штаммы Н.capsulatum на различные группы и классы в зависимости от географического

распространения и степени вирулентности [64].

Vincent R. et. al. в качестве матрицы использовали митохондриальную ДНК. При изучении 23 штаммов Н.capsulatum удалось распределить их по 3-м классам, в 1-й из которых вошел только штамм Downs, во второй - 16 штаммов (штаммы Н. capsulatum var. capsulatum, выделенные в Северной Америке и Н.capsulatum var. duboisii, изолированные на Африканском континенте) и в 3-й - оставшиеся 6 штаммов с ареалом, ограниченным Центральной и Южной Америкой [38].

Впоследствии, с помощью ПДРФ-анализа, на основе исследований митохондриальной ДНК и гена yps3 было проанализировано 76 штаммов Н.capsulatum, выделенных из почвы или образцов биоматериала. После анализа различий профиля используемых в работе штаммов, большинство были отнесены ко 2-му классу, и только 4 температурочувствительных штамма (обладающих низкой вирулентностью), взятых у больных, инфицированных ВИЧ, попали в 1-ю группу со штаммом Downs. При исследовании изолятов, выделенных из почвы штата Флорида, были выявлены различия в митохондриальной ДНК и гене yps3, позволяющие выделить данные штаммы в 4-й класс. На основе полиморфизма гена yps3, выявленных в штаммах, выделенных от больных СПИДом в штате Нью-Йорк, авторы отнесли эти штаммы в 5-й класс [130].

Другими авторами, полиморфизм ДНК, детектируемый с помощью ПДРФ-метода с использованием митохондриальной, рибосомальной ДНК или гена yps-З, позволил классифицировать различные изоляты также в зависимости от их географического распространения. В данном исследовании степень гомологии между различными изолятами варьировала от 75 до 99%, что позволило выделить две группы штаммов (А и Б). К группе А отнесены 8 изолятов с 75%-й гомологичностью между собой. Группа А была разделена на 2 подгруппы: А] содержала мексиканские изоляты, выделенные от ВИЧ-инфицированных больных (ЕН-316-319, ЕН-323 и ЕН-325), гомологичные друг

другу на 86% и подгруппа А2 содержала 2 мексиканских изолята (ЕН-46 и ЕН-53), гомологичных на 87%. Группа Б включала 6 изолятов с гомологичностью 80% и разделялась на три подгруппы: Б1 (ЕН-313 и ЕН-315, 89% гомологии), Б2 (G-186B и H.1.02.W, 87% гомологии), и БЗ (Колумбийский штамм, 82% гомологии) [130].

Еще один метод типирования Н.capsulatum основан на анализе таких последовательностей как ITS1, расположенной между генами, кодирующими 5,8S рРНК и 18S рРНК, а также ITS2, расположенной между генами 5,8S рРНК и 26S рРНК. Штаммы Н. capsulatum разделены на 8 географических кладов -Азиатский тип (I), Южно-Американские типы А (II) и В (III), ЮжноАмериканские типы 1 (IV) и 2 (V), Н. duboisii типы А (VI) и В (VII), а также Восточно-Азиатский тип (VIII) [42, 70, 89, 118, 119].

ITS регионы, расположенные между генами 16S рРНК и 23 S рРНК у бактерий, уже использовались ранее для типирования таких микроорганизмов как Neisseria meningitides [29], Burkholderia cepacia [35, 97] и Leptosphaeria maculans [155].

Характеристика генома H.capsulatum

Использование методов реассоциации ДНК, а также электрофореза с инверсией поля и пульс-электрофореза в гомогенном электрическом поле показало, что различные штаммы H.capsulatum имеют разное число хромосом. Штамм H.capsulatum Gl86В содержит 4 хромосомы, штамм H.capsulatum G217B - 3 хромосомы, а штамм H.capsulatum Downs - 7 [139]. Также разнятся данные об общей величине генома//, capsulatum - от 23 м.п.н. (штамм G186A-S) до 32 м.п.н. (штамм Downs). Есть сообщение о размере генома возбудителя гистоплазмоза в 33 м.п.н. (штамм Н. capsulatum NAml) [41]. В зависимости от величины генома число различных повторов ДНК колеблется в интервале от 0,5 до 8,0 % [66].

Например, в геноме штамма Н. capsulatum G186AS размером 23 м.п.н. примерно 0,5% от общей величины приходится на повторяющиеся

последовательности. А большая часть этих повторов, в свою очередь, приходится на рибосомальную ДНК. Геном этого штамма имеет сходство с геномом филогенетически близкого вида Aspergillus nidulans, имеющего величину 26 м.п.н., 2% из которых также приходится на повторы [148]. У штамма Н. capsulatum Downs гаплоидный геном размером 35 м.п.н. и 8,3% из них - это повторяющиеся последовательности. Такие различия в размерах могут объясняться утратой ДНК одним штаммом или дупликациями в геноме другого штамма. В пользу гипотезы о дупликации говорит факт содержания в геноме Н. capsulatum Downs штамма нескольких копий генов а- и ß-тубулина в разных хромосомах, в то время как у штамма Н. capsulatum Gl 86AS эти гены представлены единичными копиями [37].

Отличия в величине геномов характерны не только для Н.capsulatum, но и для других микромицетов, например грибов рода Fusarium, чьи величины геномов варьируют от 41 до 51 м.п.н., а количество хромосом от 11 до 14 соответственно. В целом же размеры геномов штаммов Н.capsulatum по размерам отличаются от дрожжевого аскомицета Saccharomyces cerevisiae (13 м.н.п.), но схожи с филаментными аскомицетами, такими как А. nidulans (26 м.п.н.), Pénicillium paxilli (23 м.п.н.) [86], Podospora anserina (34 м.п.н.) [87] и Neurospora crassa (44 м.п.н.) [122], что говорит об их филогенетическом сходстве. Содержание пар гуанин+цитозин в геноме Н. capsulatum составляет 45,4 - 49,8 % [37].

В 2004 году были опубликованы данные по физическому картированию генома Н. capsulatum G217B с использованием фазмид. Клоны были получены с помощью трех эндонуклеаз: BamHI, HindIII и Pstl. Средний размер фрагмента составил 35.5 м.п.н. (±4.3 м.п.н.) и колебался в пределах 22.0 - 49.9 м.п.н. Для составления физической карты в общей сложности было проанализировано 9951 фазмидных клонов, которые впоследствии объединили в 84 кластера. Процесс закрепления и ориентирования кластеров физической карты к полученному собранию контигов проводили с использованием концевого

сиквенса фазмид. На основе полученных результатов детализировали карту генома Н. capsulatum G217B. Тем не менее, физическая карта возбудителя гистоплазмоза все еще содержит большие пробелы и не дает полной и точной информации [66, "Histoplasma capsulatum Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT (http/www, broadinstitute. org/)"].

H.capsulatum - это диморфный микромицет, соответственно в его дрожжевой и мицелиальной фазах экспрессируются разные гены, что отражает различия в условиях существования (мицелиальная фаза - почва, дрожжевая фаза - организм человека или животного) [111]. Геномы H.capsulatum в этих фазах были изучены методом шотган-секвенирования [85]. Поскольку на момент проведения исследования геном H.capsulatum был секвенирован не полностью, в данном исследовании была задействована выборка из 10000 элементов, содержащих произвольные участки генома (в сумме около 1/3 общего размера генома), с последующей амплификацией клонов из этой выборки. В результате идентифицировано около 500 генов, экспрессия которых была различной в разные фазы жизненного цикла. Приблизительно 30 генов H.capsulatum с уже известными последовательностями содержат небольшие (порядка 100 п.н.) интроны, в количестве до 6 на один ген.

Идентифицированные гены мицелиальной фазы отвечают за образование конидий, полярность клеток, продукцию меланина и т.п. Один из них, fluí, гомологичен гену flug у A. nidulans, отвечающему за дифференцировку конидий и продукцию вторичных метаболитов [100]. Fbcl и wetl кодируют транскрипционные факторы. Ген tyrl регулирует образование меланина в мицелиальной фазе. Кроме того, в мицелиальной фазе обнаружены гены, экспрессия которых влияет на другие регуляторные факторы, например фактор сплайсинга PRP8 [140] или фактор сайленсинга HST4. Гены dppl и oxol кодируют цинк-зависимый диациглицеропирофосфат и 3-оксиацилредуктазу соответственно. Экспрессия генов ms96 и тубулина в мицелиальной фазе впятеро выше, чем в дрожжевой. Наконец были выявлены гены, «включение»

которых способствует формированию мицелиальной фазы. Один из них, nirl, кодирующий нитритредуктазу, имеет сходство с геном aniA у Neisseria gonorrhoeae, отвечающим за рост в условиях недостатка кислорода [79]. У Н. capsulatum он отвечает за нитрификацию почвы, что необходимо для нормального существования мицелиальной фазы.

Гены дрожжевой фазы отвечают в основном за метаболизм сульфатных соединений, влияющих на морфологию H.capsulatum, а также захват питательных веществ и регуляцию клеточного цикла. Экспрессия гена, кодирующего цистеиндиоксигеназу, является специфичной для этой фазы. Были выявлены гены, с последовательностями, имеющими сходство с последовательностями генов, регулирующих метаболизм сульфатов в других организмах: холинсульфатазу, АТФ сульфорилазу (первый фермент в цепочке синтеза метоинина/цистеина), глутамат-цистеинлигазу и метионинпермеазу.

Многим штаммам H.capsulatum необходимо наличие цистина или цистеина в питательной среде для нормального развития дрожжевой фазы [133, 136]. Ген ЪиЫ влияет на клеточный цикл, кодируя сборку циклин-зависимых киназ, а ген smcl регулирует процесс сцепления сестринских хроматид [142].

Кластерный анализ генома Н. capsulatum выявил следующие группы генов со схожей экспрессией [85]: первый кластер содержит мультикопийные гены, экспрессирующиеся только в мицелиальной фазе и кодирующие белки fbcl, nirl, и tyrl, а также транспортный белок MSF4. Во втором кластере находятся гены sdhl и abc4, несущие информацию о структуре сорбитол-дегидрогеназы и АТФ-связывающем белке-транспортере. В третий кластер входят гены chol, lypl, tiß, trill, sipl, и abc3, демонстрирующие очень высокий уровень экспрессии в стационарном периоде дрожжевой фазы. Гены четвертого кластера экспрессируются преимущественно в дрожжевой фазе и являются генами рибосомальной ДНК. Пятый кластер, кроме генов, содержит участки, гомологичные ретротранспозонам, часто встречающиеся в геноме H.capsulatum. Хотя гены последнего кластера и экспрессируются преимущественно в

дрожжевой фазе, неизвестно, коррелирует ли их транскрипция с частотой транспозиции.

Большинство вышеописанных генов относятся к группе генов «домашнего хозяйства» и имеются у других микромицетов. Для диагностики важны только те гены, которые специфичны для Н.capsulatum и играют определенную роль в его вирулентности.

Способность Н.capsulatum изменять морфологию под воздействием быстрых температурных сдвигов позволяет идентифицировать гены, ответственные за эти изменения, по их экспрессии [105].

Переход из одной фазы в другую требует активации и экспрессии определенных генов. Ген, кодирующий последовательность кальций-связывающего белка (СВР1), является подходящим кандидатом на роль фазоспецифичного гена, поскольку кодирует продукт, повышенное содержание которого наблюдается в дрожжевой фазе и который играет важную роль в патогенезе гистоплазмоза [49, 126].

Дрожжевые клетки Н.capsulatum способны к существованию внутри макрофагальных фаголизосом, в среде, являющейся непригодной для обитания большинства известных патогенных микроорганизмов. В связи с этим возбудитель гистоплазмоза приобрел специальные приспособительные механизмы, позволяющие выжить в данной экологической нише при определенных условиях и являющиеся специфичными только для дрожжевой фазы [125]. Предположительно одну из ключевых ролей в этом играет кальций-связывающий белок, присутствующий лишь в дрожжевой фазе. В опытах in vitro он связывает хлористый кальций и участвует в захвате Ca внутри фаголизосом. Результаты экспериментов показывают, что клетки дрожжевой фазы лучше, чем клетки мицелиальной фазы растут при низких уровнях кальция в среде, так как кальций-связывающий белок облегчает захват СаС12 дрожжевыми клетками [31, 32]. Секреция его варьирует в зависимости не только от фазы, но и от содержания кальция в среде [117].

Ген cbpl регулируется на уровне транскрипции. Проводили опыты по идентификации нетранслируемого региона (UTR), играющего роль промотора в гене кальций-связывающего белка. Челночный вектор, включающий ген lacZ без промоторной последовательности, вводили в клетки Н.capsulatum путем электропорации, затем встраивали в ген ига5, в результате чего происходила продукция ß-галактозидазы. В ходе изучения полученных белков было выяснено, что промоторную активность в гене cbpl проявляет участок длиной 102 п.н., а использование метода замены оснований выявило наиболее важные для активации участки между 839 и 877 п.н. этого гена [31, 32].

Исследования штаммов с «выключенным» геном cbpl показали, что при инкубации их с макрофагоподобными клетками (линия P388D1), происходил захват дрожжевых клеток клетками-фагоцитами. При «включении» этого гена макрофагоподобные клетки разрушались дрожжевыми, что свидетельствует в пользу участия cbpl в вирулентности Н.capsulatum. Предполагаемая основная роль белка СВР1 заключается в железосвязывающей и кальцийсвязывающей функции. Кроме того, белок СВР1 способен изменять фаголизосомальное содержимое, делая возможным внутриклеточное выживание дрожжевой фазы Н. capsulatum [117, 141].

Еще одним специфичным для Н. capsulatum геном является ген ms8. При исследовании методом Нозерн-блот анализа экспрессия данного гена отмечена в мицелиальной фазе и не обнаруживается в дрожжевой фазе. Ген ms8 кодирует белок, богатый аминокислотами глицином (22%) и глутамином (19%), длиной приблизительно 203 аминокислоты и молекулярной массой 21,332 Да и предположительной изоэлектрической точкой в районе 6,76 и прерывается интроном длиной 95 п.н. Усиленная экспрессия гена ms8 начинается с активации промотора TEF1. В дрожжевой фазе вследствие искусственного усиления экспрессии происходит образование сгустков клеток в жидкой среде и формирование клейких и вязких колоний на твердых питательных средах, что не свойственно морфологии Н. capsulatum. Мутантные по ms8 гену штаммы,

получившиеся в результате «выключения» экспрессии гена, формируют нормальные дрожжевые колонии, но нетипичные мицелиальные, более мелкого размера, чем в норме, с зернистой поверхностью, продуцирующие темно-красный пигмент и имеющие гифы на 40% толще обычных, более короткие ответвления и более зигзагообразную форму [154].

Ген ms8 не играет ключевой роли в формировании мицелиальной структуры. Даже с «выключенным» геном клетки все-таки формируют мицелиальные колонии, хоть и отличающиеся от типичных. Высокий уровень экспрессии ms8 в дрожжевых клетках, как и «молчание» этого гена мало влияют на нормальное функционирование дрожжевой фазы. Вполне вероятно, что MS8 протеин участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость. Это подтверждает наличие повышенной вязкости и тягучести у колоний дрожжевых клеток с искусственно созданным высоким уровнем экспрессии ms8, что предполагает наличие MS8 протеина в клеточной стенке или на ней [147].

Гликопротеин М является иммунодоминантным антигеном, ответственным за развитие острой фазы инфекции, и его присутствие можно обнаружить во всех стадиях заболевания. Результаты иммунофлуоресценции показывают, что М антиген располагается почти на всей площади клеточной стенки и взаимодействует с иммунокомпетентными клетками организма и его антителами [81]. При секвенировании гена, кодирующего М антиген, установлено, что он содержит как участки с высокой гомологией к участкам генов, ответственных за каталазы других возбудителей микозов, так и участки абсолютно не гомологичные им. Наличие этих специфических участков и обеспечивает возможность подбора к ним праймеров [33, 116].

Вирулентные штаммы H.capsulatum содержат а-(1,3)-глюкан в клеточной стенке дрожжевой фазы, хотя в мицелиальной фазе он отсутствует. Этот полисахарид также обнаруживается в некоторых других патогенных грибах, таких как Paracoccidiodes brasiliensis и Blastomyces dermatitidis. Потеря его

активности ведет за собой снижение вирулентности. Штаммы Н.capsulatum способны к активной регуляции продукции а-(1,3)-глюкана и он постоянно секретируется, когда клетки пролиферируют внутри макрофагов. Результаты исследований говорят о том, что клетки Н.capsulatum высвобождают фактор, который (если он в достаточной концентрации) обеспечивает встраивание а-(1,3)-глюкана в клеточную стенку. Такая модуляция продукции а-(1,3)-глюкана является проявлением феномена межклеточных взаимодействий. Суть его состоит в высвобождении клеткой своеобразного автоиндуктора в постоянном диапазоне концентраций во внешнюю среду, пропорционально плотности расположения клеток в среде. В соответствии с этим сенсорная молекула распознает критические концентрации автоиндуктора и сигнализирует транскрипционным факторам, регулирующим фенотипические изменения. У бактерий автоиндуктор, как правило, ацил-гомосериновый лактон или пептид с молекулярной массой, позволяющей диффундировать через мембрану. В случае с Н.capsulatum автоиндуктором выступает крупная молекула с массой порядка 6 кДа, не способная к трансмембранной диффузии. Высокая интрафагосомальная концентрация автоиндуктора запускает сигнал синтеза а-(1,3)-глюкана, необходимого фактора защиты клеток от фагосомального содержимого [80, 110, 117].

Несмотря на большое количество молекулярно-генетических исследований, посвященных Н. capsulatum, многие вопросы до конца не выяснены. Геном возбудителя гистоплазмоза полностью не секвенирован и не аннотирован.

Морфология

Возбудители гистоплазмоза существуют во внешней среде в виде мицелиальной (сапробной) формы, а в организме человека и животных преобразуются в дрожжеподобную форму [99, 102].

Мицелиальная фаза Н. capsulatum представлена колониями от белого до светло-коричневого цвета. Мицелий септированный, многоклеточный,

диаметром 1-5 мкм. Через 5-10 дней после посева, в зависимости от штамма, состава питательной среды и условий культивирования начинается споруляция. Конидиеносцы короткие, на всем протяжении одинаковой ширины, отходящие от гиф под прямым углом. Н. capsulatum образует конидии двух типов, встречающихся в разных количественных соотношениях: сферические, толстостенные макроконидии (8-12 мкм) с пальцевидными выростами («бугорчатые») или без них и микроконидии (2-4 мкм) с гладкими или шероховатыми стенками [10, 13, 20, 24, 102].

Дрожжеподобная фаза представлена тонкостенными овальными клетками (2 х 3-4 мкм). Деление клеток происходит почкованием с образованием перемычки между клетками. В патологическом материале обособленные клетки, обычно округлой, реже грушевидной формы, размером 2-4 мкм и даже меньше. Характерным для тканевых форм является внутриклеточное расположение в макрофагах, в ретикуло-эндотелиальной системе: селезенке, печени, лимфатических узлах. На плотных питательных средах при 37 °С дрожжевая форма растет в виде мелких блестяще-сальных, гладких колоний от кремового до серого цвета [10, 13, 20, 24].

Н. capsulatum, особенно мицелиальная ее форма, - аэроб; дрожжеподобная фаза может развиваться и при ограниченном притоке кислорода. Микромицет хорошо растет на простых питательных средах (агар Сабуро, сусло-агар, мясо-пептонный агар и др.) в широком диапазоне температур (от 20 до 37 °С). После нанесения мицелиальных элементов на обогащенные питательные среды и культивировании при 37 °С происходит конверсия в дрожжевую (или паразитическую) фазу [1, 12, 13, 21, 24].

Грибы, в том числе и Н. capsulatum, имеют ядро и все свойственные эукариотам органоиды. Клетки Н. capsulatum обладают прочной клеточной стенкой, состоящей из нескольких слоев. Общая масса клеточной стенки может достигать 30% от массы всей клетки. Стенка клетки состоит на 40% из маннопротеинов и до 40% — из хитина; остальное приходится на полимер

глюкозы - глюкан. Глюкан является важным структурным компонентом клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности, состоящим из нескольких типов молекул, образованных, в основном, ß-1,3 и ß-1,6-связанными остатками глюкозы. Хитин - чрезвычайно важный компонент клеточной стенки — представляет собой полимер с Р-1,4-связанными остатками N-ацетилглюкозамина [5, 7, 54, 105, 145].

1.2 Эпидемиология возбудителя гистоплазмоза

В настоящее время случаи заболевания гистоплазмозом зарегистрированы в 60 странах мира, однако лишь в 17 из них доказано сапрофитическое существование гриба в почве [72, 104].

Гистоплазмоз эндемичен для целого ряда штатов США (Индиана, Миссури, Огайо, Теннеси, Кентукки, Миссисипи, Арканзас, Алабама, Луизиана, Айова) [69]. В Латинской Америке высокоэндемичные области находятся в Венесуэле, Эквадоре, Парагвае, Уругвае и Аргентине. Условия окружающей среды в областях высокой эндемичности представлены умеренным климатом с постоянной влажностью [106, 131].

Гистоплазмоз является одним из наиболее распространенных системных микозов в Бразилии. В последние годы в различных регионах Бразилии было отмечено свыше 160 случаев заболевания гистоплазмозом населения. Существуют мнения, что области распространения возбудителя гистоплазмоза значительно шире, чем предполагалось ранее [42, 156].

Ареалами распространения Н.capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Тайланд, Индия. Увеличение количества ВИЧ-инфицированных людей в данных регионах повлекло за собой и увеличение численности заболеваний системными микозами. С 1993 по 1997 в Таиланде были выделены 13 штаммов Н.capsulatum [68, 104].

H. capsulatum var. duboisii - этиологический агент африканского гистоплазмоза - широко распространен в странах Центральной и Западной Африки (Нигерия, Конго, Синегал) и о.Мадагаскар [72, 103].

Достоверных сведений о существовании гистоплазмоза в России и странах СНГ до настоящего времени нет.

В эндемичных регионах Н. capsulatum развивается во влажной почве (pH 5,0-10,0) за счет перегноя растительных или животных материалов, экскрементов птиц, летучих мышей и др. В почве гриб находят на разной глубине, обычно на уровне 5-15 см; в более глубоких слоях он встречается реже. Высвобождение множества конидий гриба в воздух происходит при образовании аэрозоля во время разрушения мест обитания птиц и летучих мышей, особенно при проведении строительных и ремонтных работ, исследовании пещер, разбивки летних лагерей. Возможно распространение инфекционных частиц на большие расстояния с воздушными потоками [57, 65]. Основной инфицирующий элемент — конидии и мелкие фрагменты мицелия -при вдыхании попадают в дистальные отделы легких, где через 2-7 дней происходит их конверсия в дрожжевые клетки тканевой формы. Считается, что микроконидии как инфекционные частицы более вирулентные за счет сравнительно малых, по сравнению с макроконидиями, размеров [92].

От человека к человеку заболевание не передается, хотя и относится к особо опасным инфекциям [11, 98]. Изоляции заболевших не требуется. Описаны единичные случаи заражения при пересадке органов от инфицированных доноров [61, 76].

В эндемичных районах ежегодно регистрируют около 500 000 случаев заболевания гистоплазмозом [82, 113].

Организм человека не обладает естественным иммунитетом к грибам, поэтому восприимчивость человека к ним считается всеобщей [8, 9]. Клинические проявления гистоплазмоза варьируют от бессимптомной до диссеминированной инфекции [57]. Эти проявления зависят, главным образом,

от инфицирующей дозы (то есть от числа вдыхаемых частиц гриба), вирулентности инфицирующего штамма и иммунного статуса человека. У иммунокомпрометированных пациентов штаммы Н. capsulatum, которые ранее не рассматривались как вирулентные, способны вызвать болезнь с летальным исходом [67].

Для Н. capsulatum var. duboisii характерно более частое внедрение возбудителя через поврежденную кожу и слизистые оболочки, а поэтому среди различных клинических форм преобладают заболевания с поражением кожи и костей [72].

Частым результатом заражения микромицетом является бессимптомное развитие первичного очага в легких с вовлечением лимфатических путей и регионарных лимфатических узлов. Вместе с формированием первичного комплекса может происходить диссеминация гриба в различные органы и ткани [92]. Описаны случаи гистоплазмоза кожи, костей, органов брюшной полости, нервной, эндокринной, половой систем, желудочно-кишечного тракта и другой локализации, при которых поражений в легких выявить не удалось [90, 91, 92].

Продолжительность болезни широко варьирует: от 3-х недель до 8 месяцев. Описаны формы продолжительностью 4-8 и даже 16 лет [39].

1.3 Методы лабораторной диагностики гистоплазмоза

Разнообразие клинических проявлений наряду с отсутствием характерных черт являются причинами трудностей диагностики гистоплазмоза. Например, острый легочный гистоплазмоз подобен разнообразным вирусным инфекциям дыхательных путей. Проявления болезни с легочными инфильтратами и увеличением лимфатических узлов сходны с инфекциями, вызываемыми другими диморфными грибами или Mycobacterium tuberculosis [92, 153].

Возможно развитие хронического гистоплазмоза на фоне легочной патологии. Микромицет способен вызывать диссеминированные заболевания,

преимущественно у лиц с ослабленной иммунной системой, а также в престарелом возрасте.

Для диагностики гистоплазмоза используют микологический, иммунологический, молекулярно-генетический и биологический методы исследования [92].

Исследуемым материалом могут быть гной, мокрота, соскобы с язвенных поражений на коже и слизистой оболочке, цереброспинальная жидкость, кровь, биоптаты из очагов поражения [1, 22].

Микроскопический метод

Патологический материал исследуют в капле 10 %-ного раствора КОН, в смеси спирта с глицерином. Но ввиду малых размеров микромицетов, обычно расположенных внутри фагоцитов, микроскопическое исследование препаратов, как правило, малоинформативное. Нередко клетки Н. capsulatum в патологическом материале и биоптатах путают с другими возбудителями глубоких микозов — Blastomyces dermatitidis, Pénicillium marneffei, Cryptococcus neoformans [67]. Расположенные внутри клеток макроорганизма Н. capsulatum визуально напоминают таких возбудителей, как трипаносомы или лейшмании. Именно поэтому рекомендуется использование специальных методов окраски. При обработке PAS-методом клетки Н. capsulatum окрашиваются в лилово-красный цвет. При окраске гематоксилином и эозином определяются в виде базофильного ядра, окруженного светлым ободком «капсулы». При импрегнации по Гомори-Грокотт на фоне светлого ободка четко выявляются стенки гриба. По Д. Бауэру, клетки гриба окрашиваются в пурпурно-красный цвет на желтом фоне ткани [134].

При исследовании препаратов, окрашенных вышеперечисленными способами, необходимо присматриваться к фагоцитирующим клеткам внутри которых микромицет представлен в виде мелких грушевидных образований 1 -3 мкм в диаметре.

Микологический метод

Культуральное исследование имеет значительные преимущества перед микроскопическим. Для подтверждения диагноза «гистоплазмоз» необходимым условием является выделение чистой культуры Н. capsulatum на питательных средах. Основным критерием идентификации гриба является доказательство его двуфазности [13, 24, 92].

В соответствии с действующими санитарно - эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. duboisii относят ко второй группе патогенности. Дополнительные требования при работе с этими возбудителями сводятся, прежде всего, к тому, что во избежание заражения персонала лабораторий аэрогенным путем, все манипуляции с культурами особо опасных микромицетов проводят в боксах биологической безопасности Ш-го класса. Работу с дрожжевыми фазами грибов и Н. capsulatum var. farciminosum проводят в боксовой комнате в костюме III типа с маской [16, 19].

Успех культурального исследования определяется степенью микробного загрязнения исследуемого материала, качеством питательных сред и наличием жизнеспособных элементов гриба в патологическом материале [13, 24].

Для первичного выделения мицелиальной фазы обычно применяют агар Сабуро с 1,5-3 % дрожжевого экстракта и 4 % глюкозы. В среды необходимо добавлять антибиотики. Хорошие результаты дает добавление левомицетина 0,05 мг на 1 мл среды. Посевы выдерживают при температуре 25-30 °С в течение не менее 30 суток. На жидких средах рост возбудителей гистоплазмоза происходит несколько быстрее. При пересевах на жидкие питательные среды удается подростить культуру, что облегчает развитие грибов на плотных средах. Для выделения дрожжевой фазы используют агар Френсиса с добавлением 8 % цельной крови, 1 % глюкозы и 0,1 % L-цистеина с дальнейшей инкубацией при 37 °С от 6 до 14 суток в зависимости от штамма.

Идентификация выросшей культуры основывается на изучении морфологии гриба и получении феномена конверсии одной фазы в другую in vivo и in vitro.

После выявления на средах зрелой грибницы культуру обеззараживают 40 % формалином, через 1 час из нее готовят мазок, окрашивают и микроскопируют.

Диаметр мицелия от 1 до 5 мкм, он септированный, многоклеточный. Макроконидии обычно крупные (до 25 мкм) шиповатые или бугристые, сферические или грушевидные. Они преобладают в воздушной части мицелия, в субстратной преобладают макроконидии, не имеющие бугристости. Шиповатые макроконидии служат дифференциальным признаком этого гриба. Микроконидии обычно гладкостенные, сферической, грушевидной или даже сигарообразной формы 2-6 мкм в диаметре [20, 115].

Большинство штаммов гриба при первичном выделении из клинического материала образуют бугристые макроконидии, что очень важно с диагностической точки зрения. Однако иногда споры такого типа могут быть малочисленными или отсутствовать совсем, что резко затрудняет идентификацию.

Дрожжеподобная форма на плотных питательных средах растет в виде мелких круглых блестяще-сальных колоний, могут быть складчатые или бугристые. С течением времени колонии. Под микроскопом в таких колониях преобладают почкующиеся дрожжеподобные клетки, расположенные цепочками (псевдомицелий). Дрожжеподобная форма, отчасти, напоминает собою тканевую паразитическую форму гриба [10, 13, 20].

Методов биохимической идентификации грибов Н. capsulatum в настоящее время практически не существует. Резюмируя данный раздел, следует отметить, что культуральный метод является трудоёмким, требует соблюдения повышенных требований биологической безопасности и, как правило, занимает минимум 15 дней.

Имуносерологические методы

Временные затраты уменьшают серологические методы диагностики. Обнаружение антител и определение их титров предоставляет информацию, которая помогает определить характер заболевания и динамику инфекционного процесса [13].

Эффективность гуморального ответа определяется природой антигенных субстанций гриба. В ответ на заражение грибом в процессе болезни появляются агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела, развиваются аллергические реакции и активируются фагоцитарные процессы [24].

Основными диагностически важными антигенами, к которым образуются антитела, являются С, М, и Н антигены. Антиген С - карбогидрат (галактоманнан) является в значительной степени ответственным за перекрестные реакции, наблюдаемые с другими видами грибов [78]. М антиген является каталазой и антиген Н - ß-глюкозидазой. Из-за их более высокой специфичности, антитела против М и Н антигенов Н. capsulatum нашли широкое применение в диагностике гистоплазмоза [112].

Стандартными методами иммунодиагностики гистоплазмоза являются реакция связывания комплемента (РСК) и реакция иммунодиффузии (РИД).

РИД основана на выявлении М и И - линий преципитации. Линия М образуется при острой инфекции, часто видна при хронических формах гистоплазмоза и присутствует в течение многих месяцев и даже лет после выздоровления. Линия Н - значительно менее распространена и редко обнаруживается без линии М, она указывает на хроническую или тяжелую форму гистоплазмоза. Преципитины появляются в начале болезни, на 2-3 неделе, сохраняются 4-6 недель. В качестве антигена в реакции преципитации обычно применяют гистоплазмин (культуральный фильтрат мицелиальной фазы) или его фракции. В положительных случаях появляются от 1-2 до 6 и более линий преципитации. Обнаружение в РИД зон преципитации к Н и М антигенам Н. capsulatum - один из наиболее широко доступных методов

JJ

диагностики. Чувствительность метода составляет приблизительно 80%, а специфичность этого теста 70 % [53, 71, 77, 96, 99, 129, 146].

Реакция связывания комплемента (РСК) является более чувствительной, чем реакция преципитации (90 %), но менее специфичной, чем РИД. Следует отметить, что возможны перекрестные реакции с сыворотками от больных другими микозами (бластомикоз, кандидоз, кокцидиоидомикоз, паракокцидиоидомикоз). У 95 % больных гистоплазмозом образование Ат, обнаруживаемых в РСК, начинается на 3-6 неделе после инфицирования Н. capsulatum. Титры между 1:8 и 1:16 считаются слабоположительными и определяются в 25 % случаев. Однако эти титры Ат могут свидетельствовать о прошедшей инфекции и могут обнаруживаться в сыворотках здоровых людей проживающих в областях эндемичных для гистоплазмоза. Высокие титры (1:32 и больше) или четырехкратное увеличение титра с течением времени -показатель острого гистоплазмоза [53]. В качестве Аг используют цельные клетки дрожжевой фазы [36] или гистоплазмин [120].

Антитела к Н. capsulatum можно также обнаружить с помощью иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуноблоттинг успешно используют для диагностики гистоплазмоза и оценки эпидемиологического распространения заболевания. Используя иммуноблоттинг, были идентифицированы четыре Ar Histoplasma: 91, 83, 70 и 38 кДа, которые реагируют с гистоплазмозными сыворотками. Чувствительность колеблется в интервале от 45 % до 100 % в зависимости от длительности заболевания. При постановке ИФА используют различные антигенные препараты (фильтрат мицелиальной фазы гриба, экстракт дрожжевых клеток). Непрямой иммуноферментный метод применяют для обнаружения Ат против гистоплазмина, при этом чувствительность метода составляет 92 %, специфичность 96 %. Этот метод используют при иммунологическом исследовании сывороток пациентов с разными клиническими проявлениями гистоплазмоза [59, 149].

Методы, основанные на обнаружении Аг, в ряде случаев могут быть более информативными, чем на обнаружении Ат (при диагностировании гистоплазмоза в острой фазе, при диссеминированной форме гистоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией). Аг можно обнаружить при исследовании крови, плевральной, бронхоальвеолярной и цереброспинальной жидкостей, в моче.

Для обнаружения 70 кДа белка используют ИФА с применением видоспецифических мышиных моноклональных Ат. В целом, этот тест обнаруживает Аг в 71,4 % образцов сывороток. Чувствительность различна - от 57,1 до 88,9 % в зависимости от клинической формы гистоплазмоза, специфичность составляет 85,4 % [51].

Кожная проба с гистоплазмином не используется в диагностических целях, поскольку положительный результат может свидетельствовать не о текущей, а о перенесенной инфекции, а отрицательный результат не исключает диагноза гистоплазмоза. Ложноотрицательные результаты отмечаются при диссеминированном гистоплазмозе, а ложноположительные — при других эндемических микозах. Кроме того, образование Ат при проведении пробы с гистоплазмином затрудняет последующую серологическую диагностику. Кожная проба в прошлом использовалась, в основном, в эпидемиологических целях, для выявления инфицированных лиц. Ответ на кожную пробу развивается через 2 недели после инфицирования [98].

Молекулярно-генетические методы

В последние годы для индикации и идентификации возбудителей гистоплазмоза стали использовать молекулярно-биологические подходы, основанные на анализе генома, являющегося стабильной характеристикой микроорганизма.

На первом этапе ДНК-диагностики Н. capsulatum использовали метод ДНК-зондов, основанный на взаимодействии меченной люминесцентным агентом искусственно синтезированной специфичной нуклеотидной последовательности с ДНК возбудителя [83, 101, 124].

В опытах с Н. capsulatum применяли коммерческий препарат Gen-Probe AccuProbe (Gen-Probe Corp., San Diego., Calif.) - чувствительность метода варьировала от 87,8 до 95% в первичном тестировании и повышалась до 97,3 при повторном анализе ложноотрицательных результатов. Пошаговое выполнение всех процедур анализа с использованием ДНК-зонда занимает приблизительно 45-50 минут вне зависимости от исследуемого образца, поэтому он является рутинным экспресс-тестом для выявления Н. capsulatum во многих лабораториях [40]. Недостатком метода является наличие ложноположительных результатов при использовании коммерческих наборов для идентификации Н. capsulatum, например, с В. dermatitidis, Emmonsia parva, Chrysosporium spp., Candida albicans [63, 83, 101] или термолабильного штамма Gymnascella hyalinospora, вызывающего пневмонию. Кроме того, в случае использования крови как материала для выделения ДНК, необходимо учитывать, что за счет собственной хемилюминесценции эритроцитов, недостаточная очистка ДНК может также привести к ложноположительным результатам [114].

Метод Rep-ПЦР был использован в экспериментах по идентификации таких микромицетов как Н. capsulatum, В. dermatitidis и Coccidioides spp. Первоначально в методе Rep-ПЦР использовались праймеры к некодирующим, многократно повторяющимся участкам (от 50 до 300 п.н.), распределенным по всему геному Н.capsulatum. Внешние праймеры обычно комплементарны участкам между повторами, в то время как внутренние комплементарны самим повторам (как в методе анализа VNTR-повторов) [121].

Широкое развитие и применение в диагностике патогенных микромицетов получил метод ПЦР.

В большинстве публикаций по разработке ПЦР-систем для идентификации возбудителей микозов поиск праймеров основан на данных секвенирования гена 18S рРНК, широко представленных в различных

генетических базах данных. Преимуществом данной ДНК-мишени для ПНР является консервативность и мультикопийность этого гена [52, 75].

Однако имеются данные о возможности получения ложноположительных результатов в реакции амплификации при использовании праймеров, сконструированных на основе рибосомальных генов. Так, при исследовании 29 микроскопически подтвержденных положительных на гистоплазмоз биопсийных образцов с праймерами, фланкирующими участок гена 18S рРНК, специфические фрагменты амплификации наблюдались в 26 случаях. Из них 6 ампликонов при последующем секвенировании на 95-99 % были гомологичны последовательностям ДНК нескольких грибов, принадлежавших к классу Euascomycetes. При исследовании 50 биопсийных образцов, не содержащих возбудитель гистоплазмоза, положительными оказались 18 проб. При последующем секвенировании ни одна из них не была идентична последовательности гена 18S рРНК Н. capsulatum. Также отмечены ложноположительные результаты реакций с этими праймерами с другими диморфными грибами Blastomyces dermatitidis и Paracoccidioides brasiliensis [44, 52].

Следует помнить, что генетические базы данных, касающиеся гена 18S рРНК, не полны ни для сапрофитических грибов, ни для грибов, имеющих медицинское значение, поэтому при идентификации возбудителей особо опасных микозов, основанной на детекции последовательностей рибосомальных генов, вероятно получение ложноположительных результатов, обусловленных наличием гомологичных фрагментов ДНК микромицетов [45, 112].

Таким образом, для доказательства специфичности ПЦР необходимо секвенирование всех продуктов амплификации, если в тест-системе используют праймеры, разработанные на основе фрагментов рибосомальных генов микромицетов. В противном случае можно столкнуться с

ложноположительными результатами, в частности, при исследовании объектов внешней среды.

Для индикации H.capsulatum в образцах почвы описана гнездная ПЦР с праймерами на ITS регионы. Чувствительность реакции амплификации с предложенными олигонуклеотидными затравками составляла 10 клеток в образце [128]. Эту же область использовали для конструирования праймеров, которыми в дальнейшем выявляли ДНК H.capsulatum в пробах, полученных от больных с диагнозом гистоплазмоз [30, 50].

В качестве ДНК - мишеней для конструирования диагностических праймеров могут быть использованы участки геномов микроорганизмов, кодирующих синтез различных факторов патогенности или различные специфичные антигены [4, 34, 117, 141].

R. Bialek et. al. разработал гнездную ПЦР с использованием праймеров на ген, кодирующий уникальный 100 кДа белок H.capsulatum. Предел чувствительности реакции составил 1-5 клеток в образце. Было проведено сравнение результатов ПЦР с праймерами Не 100 PCR и ранее предложенными олигонуклеотидными затравками на ген 18S рРНК. Показатели чувствительности реакции амплификации обеих пар праймеров совпадали, при этом праймеры Не 100 PCR не детектировали ДНК других микромицетов. При последующем секвенировании всех проб доказанаЮО % специфичность этих праймеров [44, 62].

A. Bracca et al. разработали полугнездную ПЦР с олигонуклеотидными затравками, фланкирующими фрагменты гена Н-антигена, способную детектировать геномный материал, соответствующий 10 клеткам. Исследования проводили с пробами крови, биоптатами внутренних органов и соскобами с кожных покровов, взятыми у пациентов с подтвержденным диагнозом гистоплазмоза. Все пробы исследовали микроскопией, культуральным методом и ПЦР. Всего в работе проведен анализ 30 проб (24 образца крови, 4 пробы, содержащие соскобы с кожи и 2 биопсии). При исследовании материала

биопсии и кожи результаты всех трех методов совпадали. 4 образца крови были положительны в ПЦР, хотя в двух из них Н. capsulatum не выявлена другими, используемыми в работе методами [107].

Необходимо отметить, что, не смотря на заявляемую авторами высокую чувствительность ПЦР, применение ее гнездной и полугнездой вариантов постановки имеет определённый недостаток - высокий риск контаминации проб на втором этапе постановки реакции. На ряду с этим увеличиваются временные затраты на постановку реакций и возрастает стоимость проведения исследования. Более перспективным, на наш взгляд, является разработка и применение «классической» ПЦР проводимой в одну стадию.

Имеются сообщения о разработке праймеров для «одностадийной» ПЦР на основе нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего продукцию М-антигена. Исследовали чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы. Праймеры детектировали Н.capsulatum var. capsulatum и Н.capsulatum var. duboisii, в то время как пробы, содержащие Н. capsulatum var. farciminosum, были отрицательными [106, 112].

J. Martagon-Villamil et al. сообщили о разработках ПЦР в режиме реального времени с ДНК-зондами на основе нуклеотидных последовательностей спейсерной области рРНК. В качестве метки для зонда использовали Red 640. В работе использовали 107 образцов, содержащих чистые культуры, и клинический материал, полученный от трех больных с подтвержденным диагнозом гистоплазмоза. Диагностическая чувствительность ПЦР, как и специфичность, составила 100 % [84, 127].

Наряду с проблемой выбора ДНК-мишеней для диагностики гистоплазмоза методом ПЦР важен выбор метода выделения ДНК из клеток микромицета.

Клеточная стенка гриба по своему составу существенно отличается от бактериальной оболочки [48, 55]. При экстракции ДНК из клетки бактерии полного лизиса можно достичь простым кипячением, в то время как клеточная

стенка микромицетов, как правило, при этом не разрушается. Основная проблема при выделении ДНК из грибного материала - как наиболее эффективно разрушить их клеточные стенки для того, чтобы с максимальным выходом экстрагировать ДНК.

Известны следующие традиционные методы разрушения дрожжевых клеток и грибного мицелия при выделении ДНК: интенсивное встряхивание со стеклянными шариками; разрушение с помощью ступки и пестика; механическая гомогенизация; ультразвуковая обработка; воздействие различными химическими веществами; обработка литическими ферментами.

Метод встряхивания со стеклянными шариками - один из наиболее часто используемых. Впервые он разработан применительно к дрожжам, однако оказался эффективным и для мицелиальных грибов с умеренно прочной клеточной стенкой [5, 7]. Поскольку манипуляции проводят в одноразовых центрифужных пробирках, одновременно удается обрабатывать много образцов.

С помощью ступки и пестика можно выделить ДНК практически из любых грибных объектов, однако методика не подходит для одновременной работы с несколькими образцами из-за повышения степени риска контаминации проб. Ограничивающим моментом этого способа является необходимость тщательного мытья инструментов после каждого нового объекта с целью полного разрушения геномной ДНК.

Универсален метод разрушения дрожжевых клеток и грибного мицелия, замороженных в жидком азоте, с помощью высокоскоростных механических гомогенизаторов. Недостаток этого способа - сильная фрагментация ДНК. Мицелиальные грибы с умеренно прочными клеточными стенками могут быть разрушены также и при комнатной температуре посредством высокоскоростной гомогенизации в присутствии солей-хаотропов. Ограничивающим фактором здесь также является необходимость стерилизации повторно используемого

оборудования с целью предотвращения контаминации образцов чужеродной ДНК.

Дрожжевые и мицелиальные грибы обладают клеточной стенкой, которая устойчива к действию большинства литических агентов [5]. Разрушить оболочку клетки гриба, в формировании которой принимают участие различные типы связей, как ковалентные, так и нековалентные, достаточно сложно. В настоящее время, для получения протопластата у микромицетов используют различные ферменты: (3 (1—3) и Р (1—6) глюканазу (коммерческое название литиказа или зимолаза), протеазу, маннаназу, хитиназу и желудочный сок виноградной улитки [129] которые действуют разрушающе на различные межмолекулярные связи.

В доступной литературе встречается ограниченное количество публикаций, посвященных использованию лизирующих ферментов для экстракции ДНК возбудителей гистоплазмоза [58, 108].

Таким образом, анализ литературных данных позволяет сделать заключение о необходимости продолжения исследований, направленных на анализ геномов и поиск оптимальной маркерной последовательности для возбудителей гистоплазмоза, в частности, с целью конструирования амплификационных тест-систем, обеспечивающих высокий уровень специфичности и чувствительности.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Вьючнова, Надежда Васильевна

ВЫВОДЫ:

1. Выявлено, что группоспецнфические праймеры HcMs8s-Ms8as3, комплементарные фрагменту гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBPls-HcCBP2as - на основе гена кальций-связывающего белка СВР, позволяют детектировать Н. capsulatum var. capsulatum, Н. capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.

2. Показано, что с помощью праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcCBPls-HcCBP2as и HcMs8s2-Ms8as, возможна дифференциация клинически значимых вариантов возбудителя гистоплазмоза - Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. duboisii.

3. На основе нуклеотидной последовательности гена, детерминирующего белок мицелиальной фазы Ms8 определены олигонуклеотидные затравки, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструирована амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистооплазмоза, позволяющая выявлять//, capsulatum в концентрации 1x104 кл/мл.

4. Продемонстрирована возможность применения амплификационной тест-системы, разработанной на основе олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3 для специфической детекции Н.capsulatum при исследовании объектов внешней среды (почвы, воды), искусственно контаминированных возбудителем гистоплазмоза и моделировании инфекционного процесса.

5. Подобраны оптимальные способы экстракции и очистки ДНК возбудителя гистоплазмоза из контаминированных проб различных объектов внешней среды и биологического материала, позволяющие выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1x104 кл/мл.

6. Установлено, что использование литических ферментов «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» или «Chitinase from Trichoderma утс1е» на стадии пробоподготовки повышает концентрацию и чистоту препарата выделяемой ДНК, и, как следствие, чувствительность реакции амплификации на один-два порядка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гистоплазмоз - заболевание, относящееся к особо опасным микозам. Для гистоплазмоза характерен широкий спектр клинических проявлений от легких и латентных форм до прогрессирующих заболеваний, заканчивающихся смертью больного [22].

Гистоплазмоз эндемичен, прежде всего для стран Африки и Южной Америки, но встречается также в Европе и Азии. В природных условиях возбудитель гистоплазмоза обитает во влажной почве, богатой органическими веществами, в помете птиц и летучих мышей, а заражение человека или животных происходит воздушно-пылевым путем, при вдыхании спор [13, 24, 93, 113].

Трудности при диагностике микоза связаны с отсутствием патогномоничных симптомов заболевания и большим разнообразием клинических проявлений. Установление лабораторного диагноза гистоплазмоза по традиционной схеме связано с длительным процессом культивирования грибов и получением конверсии фаз. Существующие иммунологические методы позволяют получить результат за более короткий срок, однако из-за возможных перекрестных реакций с гетерологичными видами микромицетов возможно получение ложноположительных реакций [92, 95]. Существующие методы идентификации данных возбудителей оказываются недостаточно эффективными для их выявления и ускоренной диагностики микоза.

В решении задач по эффективному обнаружению ДНК возбудителя гистоплазмоза существенную роль играет полимеразная цепная реакция с применением видоспецифичных праймеров, как высокочувствительный, специфичный, но, в то же время, доступный и простой в исполнении метод. Анализ существующих литературных данных не позволяет сделать заключение о преимуществах тех или иных праймеров для идентификации возбудителя гистоплазмоза. На сегодняшний день отсутствуют коммерческие ПЦР тест-системы для идентификации Н.capsulatum.

На основе зарубежных литературных источников и компьютерной базы данных Gen Bank были подобраны праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза. Первоначально с этой целью были исследованы несколько пар олигонуклеотидных праймеров на основе генов факторов вирулентности и уникальных структурных компонентов H.capsulatum. В качестве мишеней для отжига праймеров мы использовали различные гены, специфичные для H.capsulatum. На основе гена ms8 (mold-specific MS8 protein) нами разработаны две пары праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as и одна пара праймеров HcCBPls- HcCBP2as на основе гена, кодирующего последовательность кальций-связывающего белка (СВР1).

В серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации.

При оценке чувствительности праймеров НсСВРls-HcCBP2as штаммы возбудителя гистоплазмоза {H.capsulatum var. capsulatum, H.capsulatum vor. duboisii и H.capsulatum var. farciminosum) в концентрации lxlО4 кл/мл детектировались в 80 % случаев.

На основе последовательностей гена ms8 разработаны две комбинации пар праймеров. С первой парой HcMs8s-Ms8as3 в реакции амплификации синтезировались специфические ампликоны ДНК H.capsulatum var. capsulatum, H.capsulatum var. duboisii и H.capsulatum var. farciminosum. В концентрациях lxlO4 кл/мл чувствительность ПЦР с данными праймерами составляла 100%.

С помощью праймеров HcMs8s2-Ms8as в ПЦР определялись H.capsulatum var. capsulatum и H.capsulatum var. farciminosum и не детектировались штаммы H.capsulatum var. duboisii. Чувствительность была ниже, чем у других взятых в работу праймеров - при концентрации lxlO4кл/мл детектировались 50 % проб.

Аналитическая специфичность праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, НсСВРls-HcCBP2as доказана при тестировании проб чистых культур у гетерологичных микроорганизмов в дозах 1x10 кл/мл. Неспецифических (ложноположительных) реакций не выявлено.

Для проверки специфичности продуктов ПЦР проведено их выборочное секвенирование. С помощью программы BLASTn выявлено, что секвенированные нуклеотидные последовательности ампликонов, синтезируемых с помощью праймеров, используемых в работе, были высокогомологичны соответствующим участкам генов.

В результате исследований проб чистых культур возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с различными олигонуклеотидными затравками установлено, что наибольшей чувствительностью обладали подобранные нами праймеры HcMs8s-Ms8as3. Чувствительность метода ПЦР составила 1x104 клеток/мл и специфичность 100%.

Одним из обязательных методов специфической индикации патогенных биологических агентов является ПЦР. В ходе работы нами отработаны условия проведения анализа объектов окружающей среды и показана принципиальная возможность применения использования ПЦР с праймерами HcMs8s-Ms8as3 для детекции Н.capsulatum. В результате реакции амплификации праймеры HcMs8s-Ms8as3 выявляли ДНК возбудителя гистоплазмоза в пробах воды и почвы в концентрациях 1х104кл/мл в 100% случаев.

С помощью разработанных нами праймеров HcMs8s-Ms8as3 были проанализирована кровь и биоптаты, полученные от лабораторных животных, зараженных возбудителем гистоплазмоза. Исследование проб проводили параллельно культуральным методом и ПЦР. В реакции амплификации ДНК возбудителя гистоплазмоза детектировали в суспензиях органов белых мышей во все сроки наблюдения.

Использование праймеров HcMs8s-Ms8as3 при анализе органов животных методом ПЦР позволило выявить исследуемые микроорганизмы в 19 (14,8%) из 128 проб. Применение культурального метода позволяло обнаружить возбудителя в 27 из 128 проб (21,1%). При сравнительной оценке эффективности микологического метода и ПЦР не установлено статистически достоверных различий в диагностической эффективности этих двух методов (р > 0,05).

При подготовке проб для ПЦР использовали несколько общепринятых методов выделения ДНК: высокотемпературный лизис, метод нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата и гуанидин-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. Оказалось, что в результате кипячения грибной взвеси не происходит экстракции необходимого для ПЦР количества ДНК, что приводит к ложноотрицательным результатам анализа. При исследовании проб чистых культур микромицетов и объектов окружающей среды оптимальным способом выделения ДНК являлся метод гуанидин-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом.

В случае выделения ДНК из биологического материала наиболее эффективным оказался метод нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата натрия. Кроме того повышению чувствительности реакции амплификации способствовало добавление буфера, лизирующего эритроциты при выделении ДНК из проб крови, а в случае секционного материала - предварительная обработка 50 мМ NaOH .

Во всех случаях была показана эффективность применения литических ферментов на стадии пробоподготовки [25].

Резюмируя все выше сказанное, можно сделать заключение, о том что праймеры HcMs8s-Ms8as3 могут быть использованы для разработки амплификационной тест-системы, которая удовлетворяет всем предъявляемым к современным диагностическим системам требованиям по чувствительности и специфичности, а следовательно, может эффективно применяться для идентификации ДНК Н.capsulatum.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вьючнова, Надежда Васильевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аравийский P.A., Климко H.H., Васильева Н.В. Диагностика микозов. - СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004. - 186 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Ленинград: Гос. изд-во мед. лит., 1962. -181 с.

3. Бочкарев М.В., Кашкин П.Н. Гистоплазмоз. - Кишинев.: Издательство «Штиинца», 1977.- 149 с.

4. Гришина М.А. Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза: Автореф. дис.канд. мед.наук. - Волгоград. - 2006. - 25 с.

5. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР // Биоорганическая химия.-2002.-Т.28, №2.-С.156-167.

6. Идентификация возбудителей кокцидиоидомикоза методом полимеразной цепной реакции / Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Антонов В.А., Савченко С.С. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-2007.-№4.- С. 25-31.

7. Кабелина Т.С., Кулаев И.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биологической химии.-2001 .-Т.41 .-С. 105-130.

8. Кашкин П.Н. Медицинская микология: Краткое руководство для врачей - Л.: Ленмедгис, 1962. - 344 с.

9. Кашкин П.Н., Лесовой B.C. Лабораторная диагностика гистоплазмоза и обнаружение его возбудителя на объектах внешней среды // Методическое пособие для врачей - курсантов.- Ленинград.: 1973.-С-17.

10. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. - Москва.: Издательство «Медицина», 1983.-192с.

11. Климко H.H. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008.-336 с.

12. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под. ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: Медицина, Шико, 2009. - 472 с.

13. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика глубоких микозов: Методические рекомендации / Лесовой B.C., Липницкий A.B., Тихонов Н.Г. с соавт. // Элиста, 1995. - 47 с.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир, 1984.- 479 с.

15. МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I -IV групп патогенности» / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2009. - 42-с.

16. Озерская С.М., Иванушкина Н.Е., Кочкина Г.А. Микроскопические грибы в связи с проблемами биологической безопасности // Проблемы медицинской микологии.-2011.-Т. 13., №3.-С. 103-112.

17. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я. и др. - В.: 2004.- 288 с.

18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. - М.: Медиа Сфера, 2003. - 305 с.

19. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности) // Бюллетень нормативных и методических документов. Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - С. 66 - 144.

20. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. -М.: Издательство «Мир», 2001.-467с.

21. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. - М.: Издательство Бином, 2003. - 439с.

22. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции: Руководство для врачей. - М.: Издательство Бином, 2008. - 480 с.

23. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под. ред. Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.

24. СПИД-ассоциированные микозы / Лесовой B.C., Липницкий А.В., Тихонов Н.Г., Яшкулов К.Б. - Элиста, 1995.- 173с.

25. Сравнительный анализ методов выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum Darling / Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В.// Проблемы медицинской микологии.-2009 г., T.-l 1, №3., с. 38-42.

26. Шелохович А.И., Черченко И.И., Бондарев И.Н., Евтодиенко В.Г., Сафронова О.И., Лащенов П.М. и др. Методические рекомендации по получению из виноградных улиток препарата, лизирующего клеточную стенку дрожжей и грибов.- Волгоград.: 1984

27. A Molecular epidemiology of canine histoplasmosis in Japan / Murata Y, Sano A, Ueda Y, Inomata T, Takayama et.al. // Med Mycol.-2007.- Vol.45, №3.-P.233-247.

28. A1 - Ani F.K. Epizootic lymphangitis in horses: a review of the literature // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.-1999.-Vol. 18, №3.-P.691-699.

29. Amplification of rDNA loci to detect and type Neisseria meningitidis and other eubacteria / McLaughlin G.L., Howe D.K., Biggs D.R., Smith A.R. et.al. // Mol Cell Probes.-1993.-Vol.7, №1.-P.7-17.

30. Assessment of a quantitative PCR method for clinical diagnosis of imported histoplasmosis / Buitrago M.J., Gomez-Lopez A., Monzon A., et al. // Enferm Infecc Microbiol Clin. - 2007. - Vol.25, №1. -P.16-22.

31. Batanghari J.W, Deepe G.S., Di Cera E. Histoplasma acquisition of calcium and expression of CBP1 during intracellular parasitism // Mol. Microbiol.-1998.-Vol.27.-P.531-540.

32. Batanghari J.W., Goldman W.E. Calcium dependence and binding in cultures of Histoplasma capsulatum II Infect. Immun.-1997.-Vol.65.-P.5257-5261.

33. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum / Guimaraes A.J., Andrew J.H., de M. Guedes H.L., Nosanchuk J.D. et.al. 11 PLoS ONE. 2008; 3(10): e3449 Published online 2008 October 17. doi: 10.1371/journal.pone.0003449

34. Bohse M.L., Woods J.P. Surface localization of the Yps3p protein of Histoplasma capsulatum II Eukaryot Cell.-2005.-Vol.4, №4.-P.685-693.

35. Bouchet V., Huot H., Goldstein R. Molecular genetic basis of ribotyping // Clin. Microbiol. Rev.-2008.-Vol.21, №2.-P.262-273.

36. Campbell C.C. Use of yeast phase antigens in a complement fixation test for histoplasmosis. IV. Results with ground yeast phase antigens in serial specimens of serums from thirty-seven patients // Public Health Monogr.-1956.-Vol.70, №39.-P.140-143.

37. Carr J., Shearer G. Genome size, complexity, and ploidy of the pathogenic fungus Histoplasma capsulatum // Journal of bacteriology.-1998.-Vol.180, №24.-P.6697-6703.

38. Classification of Histoplasma capsulatum isolates by restriction fragment polymorphisms / Vincent R.D., Goewert R., Goldman W.E, Kobayashi G.S. et.al. //J. Bacteriol.-1986.-Vol.165, №3.-P.813-818.

39. Clinical and evolutionary characteristics of four patients with pulmonary histoplasmosis reported in the Paraiba Paulista Valley Region / da Costa Zollner M.S., e Carvalho Rezende K.M., Birman S., Elias C.P. et.al. // Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical.-2010.-Vol.43, №5.-P.599-601.

40. Comparative evaluation of a chemiluminescent DNA probe and an exoantigen test for rapid identification of Histoplasma capsulatum! Padhye A.A.,

Smith G., McLaughlin D. et al. // J.Clin.Microbiol.-1992.-Vol.30, №12.-P.3108-3111.

41. Comparative genomic analyses of the human fungal pathogens Coccidioides and their relatives / Sharpton T.J., Jason E. et al. // Genome Res.-2009.-Vol. 19.-P. 1722-1731.

42. Comparison of different DNA-based methods for molecular typing of Histoplasma capsulatum / Muniz M.M., Tavares P.M., Meyer W., Nosanchuk J.D. // Appl Environ Microbiol.- 2010.-Vol.76, №13.-P.4438-4447.

43. Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood / Loffler J., Hebart H., Schumacher U. et al. // J.Clin.Microbiol.-1997.-Vol.35, № 12.-P.3311-3312.

44. Comparison of staining methods and a nested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections / Bialek R., Ernst F., Dietz K. et al. // Microbiology and Infectious Disease.- 2002.-Vol.l 17.-P.597-603.

45. Contaminations occurring in fungal PCR assays / Loeffter J., Hebart H., Biallek R. et.al. // J.Clin.Microbiol.-1999.-Vol.37, №4.-P. 1200-1202.

46. Darling S.T. A Protozoon general infection producing pseudotubercles in the lungs and focal necroses in the liver, spleen and lymphnodes // J. Am. Med. Ass., (JAMA).-1906.-Vol.46.-P. 1283-1285.

47. Darling S.T. Histoplasmosis: A fatal infection disease resembling kala-azar found among natives of tropical America // Archiver of internal medicine.-1908.-P.107-123.

48. Davis T.E., Domer J.E., Li Y.T. The. Cell wall studies of Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis using autologous and heterologous enzymes // Infect Immunity.-1977.-Vol. 15, №3.-P.978-987.

49. Definition of the extracellular proteome of pathogenic-phase Histoplasma capsulatum / Holbrook E.D., Edwards J.A., Youseff B.H., Rappleye C.A. //J Proteome Res.-2011.-Vol. 10, №4.-P. 1929-1943.

50. Detection of Histoplasma capsulatum DNA in lesions of chronic ocular histoptasmosis syndrome / Spencer W.H., Chan C.-C., Shen D.F. et.al. // Arch Ophthalmol.-2003 .-Vol. 121 .-P. 1551 -155 5.

51. Development of a novel antigen detection test for histoplasmosis / Gomez B.L., Figueroa J.I., Hamilton A.J., Ortiz B.L. et.al. // J. Clin. Microbiol.-1997.-Vol.35, №10.-P.2618-2622.

52. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay / Bialek R., Fischer J.R., Feucht A. et al. // J.Clin.Microbiol.-2001.-Vol.39, №4.-P. 1506-1509.

53. Diagnosis of acute pulmonary histoplasmosis by antigen detection / Swartzentruber S., Rhodes L., Kurkjian K., et al. // Clin Infect Dis. - 2009. - Vol.49, №12. -P.1878-1882.

54. Domer J. Monosaccharide and chitin content of cell walls of Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis II J. Bacteriology.-1971.-Vol.107, №3.-P.870-877.

55. Domer J.E., Hamilton J.G., Harkin J.C. Comparative study of the cell walls of the yeastlike and mycelial phases of Histoplasma capsulatumII J. Bacteriology.-1967.-Vol.94, №2.-P. 466-474.

56. Dubois A., Vanbreuseghem R. Experimental study on a Belgian strain of Histoplasma capsulatum; comparison with other strains and with Histoplasma duboisii II Antonie Van Leeuwenhoek.-1956.-Vol.22, №1.-P. 103-112.

57. Eissenberg L.G., Goldman W.E. Histoplasma variation and adaptive strategies for parasitism: new perspectives on histoplasmosis // Clin Microbiol Rev.-1991.-Vol.4, №4.-P.411^121

58. Electrophoresis karyotype and chromosome-length polymorphism of Histoplasma capsulatum clinical isolates from Latin America / Canteros C.E., Zuiani M.F., Ritacco V., et al. // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2005. - Vol.45, № 3. -P.423-428.

59. ELISA for early diagnosis of histoplasmosis / Guimaräes A.J., Pizzini C.V., De Matos Guedes H.L., Albuquerque P.C. et.al. // J. Med. Microbiol.-2004.-Vol.53, №6.-P.509-514.

60. Emmons C.W. Isolation of Histoplasma capsulatum from soil in Washington, D.C // Public Health Rep.-1961.- Vol.76, N07.-P.591.595.

61. Epididymal and prostatic histoplasmosis in a renal transplant recipient from southern India / Baig W.W., Attur R.P., Chawla A., Reddy S. et.al. // Transpl Infect Dis.-2011 .-Vol. 13.- P.489-491.

62. Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue / Bialek R., Feucht A, Aepinus C. et al. // J.Clin.Microbiol.-2002.-Vol.40, №5.-P. 1644-1647.

63. False-positive Histoplasma capsulatum gen-probe chemiluminescent test result caused by a Chrysosporium species / Brandt M.E., Gaunt D., Iqbal N. et al. // J.Clin.Microbiol.-2005.-Vol.43, №3.-P. 1456-1458.

64. Fast DNA isolation from Histoplasma capsulatum: methodology for arbitrary primer polymerase chain reaction-based epidemiological and clinical studies / Woods J.P., Kersulyte D., Goldman W. et al. // J.Clin.Microbiol.-1993.-Vol.31, №2.-P.463-464.

65. Ferreira M.S., Borges A.S. Histoplasmosis // Rev Soc Bras Med Trop.-2009.-Vol. 42, №2.-P.192-198.

66. Fosmid-based physical mapping of the Histoplasma capsulatum genome / Magrini V., Wesley C. Warren, Wallis J. et.al. // Genome Research.-2004.-Vol. 14.-P.1603-1609.

67. Fungal infections: a growing threat / Dixon D.M., McNeil M.M., Cohen M.L., GellinB.G. et.al. //Public HealthRep.-1996.-Vol. Ill, №3.-P.226-235.

68. Genetic analysis of Histoplasma capsulatum strains isolated from clinical specimens in Thailand by a PCR-based random amplified polymorphic DNA method / Poonwan N., Imai T., Mekha N. et al. // J.Clin.Microbiol.-1998.-Vol.36, №10.-P.3073-3076.

69. Geographic distribution of endemic fungal infections among older persons, United States / Baddley J.W., Winthrop K.L., Patkar N.M. et al. // Emerg Infect Dis [serial on the Internet]. 2011 Sep [date cited]. http://dx.doi.org/10.3201/eidl709.101987.

70. Geographical distribution of genetic polymorphism of the pathogen Histoplasma capsulatum isolated from infected bats, captured in a central zone of Mexico / Taylor M.L., Chávez-Tapia C.B., Rojas-Martínez A., Reyes-Montes M.R. et.al. //Immun Med Microbiol.-2005.-Vol. 45, №3.-P.451-458.

71. Gerber J.D., Riley R.E., Jones R. Evaluation of a microtiter latex agglutination test for histoplasmosis // Appl. Microbiol.-1972.-Vol.24, №2.-P.191-197.

72. Gugnani H.C. Histoplasmosis in Africa: a review // Indian J Chest Dis Allied Sci.-2000.-Vol.42, №4.-P.271-277.

73. Gugnani H.C., Muotoe-Okafor F. African histoplasmosis: a review // Rev Iberoam Micol.-1997.-Vol.l4.-P.155-159.

74. Guimaráes A.J., Nosanchuk J.D., Zancopé-Oliveira R.M. Diagnosis of histoplasmosis // Brazilian Journal of Microbiology.-2006.-Vol.3 7.-P. 1-13.

75. Guttel R., Larsen N., Woese C. / Lessons from an evolving rRNA:16S and 23 S rRNA structures from a comparative perpective // Microbiological review.-1994.-Vol.8, №l.-P.10-24.

76. Hadley S, Karchmer A.W. Fungal infections in solid organ transplant recipients // Infect Dis Clin North Am.-1995.-Vol.9, №4.-P. 1045-1074.

77. Heiner D.C. Diagnosis of histoplasmosis using precipitin reactions in agar gel // Pediatrics.-1958.-Vol.22.-P.616-627.

78. Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the BioRad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay / Wheat L.J., Hackett E., Durkin M. et.al. // Clinical and Vaccine Immunology.-2007.-Vol. 14, №5.-P.638-640.

79. Hoehn T, Clark V.L. Isolation and nucleotide sequence of the gene (aniA) encoding the major anaerobically induced outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae II Infect Immun.- 1992.-Vol.60.-P.4695-4703.

80. Hogan L.H., Klein B.S., Levitz S.M. Virulence factors of medically important fiingi // Clinical Microbiology Reviews.-1996.-Vol.9, №4.-P.469-488.

81. Howard D. Studies on the catalase of Histoplasma capsulatum.il Infect Immun.-1983.-Vol.39, №3.-P. 1161-1166.

82. Howard D. The epidemiology and ecology of blastomycosis, coccidioidomycosis and histoplasmosis // Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A.-1984.-Vol.257, №2.-P.219-227.

83. Huffnagle K.E., Gander R.M. Evaluation of Gen-Probe's Histoplasma capsulatum and Cryptococcus neoformans AccuProbes // J Clin Microbiol.-1993.-Vol.31,№2.-P.419-421.

84. Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by RealTime PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, №3.-P. 1295-1298.

85. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray / Hwang L., Hocking-Murray D., Bahrami A.K. et al. // Molecular Biology of the Cell.-2003.-Vol.14.-P.2314-2326.

86. Itoh Y., Johnson R., Scott B. Integrative transformation of the mycotoxin-producing fungus Penicillium paxilli II Curr Genet.-1994.-Vol.25.-P. 508513.

87. Javerzat J.P., Jacquier C., Barreau C. Assignment of linkage groups to the electrophoretically-separated chromosomes of the fungus Podospora anserine 11 Curr. Genet.- 1993.-Vol.24.-P. 219-222.

88. Joseph H., Filler S.G., Mitchell A.P., Edwards J.E., Jr. Molecular principles of fungal pathogenesis. 1st ed. New York: ASM Press, 2006. (Heitman et al. 321-331).

89. Kasuga T, Taylor J.W, White T.J. Phylogenetic relationships of varieties and geographical groups of the human pathogenic fungus Histoplasma capsulatum Darling//J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.653-663.

90. Kauffman C. A. Pulmonary histoplasmosis // Curr. Infect. Dis. Rep. -2001. -Vol.3. -P.279-285

91. Kauffman C.A. Histoplasmosis // Clin Chest Med. - 2009. - Vol.30, №2. -P.217-25

92. Kauffman C.A. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update // Clinical Microbiology Reviews.-2007.-Vol.20, № 1.-P. 115-132.

93. Kauffman C.A. Endemic Mycoses: Blastomycosis, Histoplasmosis, and Sporotrichosis // Infect Dis Clin N Am.-2006.-Vol.20.-P.645-662.

94. Keath E.J., Kobayashi G.S., Medoff G. Typing of Histoplasma capsulatum by restriction fragment length polymorphisms in a nuclear gene // Journal Clinical Microbiology.-1992.-Vol. 30.-P.2104-2107.

95. Khansari N., Segre D., Segre M. Diagnosis of histoplasmosis and blastomycosis by an antiglobulin hemagglutination test // Am. J. Vet. Res.-1982.-Vol.43, №12.-P. 2279-2283.

96. Kleger B., Kaufman L. Detection and identification of diagnostic Histoplasma capsulatum precipitates by counterelectrophoresis // Appl Microbiol.-1973.-Vol.26, №3.-P.231-238.

97. Kostman J.R, Edlind T.D, LiPuma J.J., Stull T.L. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polymerase chain reaction ribotyping // J. Clin. Microbiol.-1992.-Vol. 30, №8.-P.2084-2087.

98. Kurowski R., Ostapchuk M. Overview of Histoplasmosis // Kentucky Am Fam Physician.-2002.-Vol.66, №12.-P.2247-2253.

99. Laniado-Laborin R. Coccidioidomycosis and other endemic mycoses in Mexico // Rev.Iberoam.Micol.-2007.-Vol. 24.-P.249-258.

100. Lee B.N., Adams T.H. The Aspergillus nidulans fluG gene is required for production of an extracellular developmental signal and is related to prokaryotic glutamine synthetase //1. Genes Dev.-1994.-Vol.8.-P.641-651.

101. Lindsley M.D., Hurst S.F., Iqbal N.J., Morrison C.J. Rapid identification of dimorphic and yeast-like fungal pathogens using specific DNA probes // J Clin Microbiol.-2001 .-Vol.39, №10.-P.3505-3511.

102. López C.E. Dimorphism and pathogenesis of Histoplasma capsulatum II Rev Argent Microbiol.-2006.-Vol.38, №4.-P.235-242.

103. Loulergue P. Literature review and case histories of Histoplasma capsulatum var. duboisii infections in HIV-infected patients // Emerg Infect Dis. -2007. - Vol.13, №11. - P.1647-1652.

104. Manfredi R, Mazzoni A, Nanetti A, Chiodo F. Histoplasmosis capsulati and duboisii in Europe: the impact of the HIV pandemic, travel and immigration // Eur J Epidemiol.-1994,-Vol. 10, №6.-P.675-681.

105. Maresca B., Kobayashi G.S. Dimorphism in Histoplasma capsulatum: a model for the study of cell differentiation in pathogenic fungi // Microbiological Reviews.- 1989.-Vol.53, №2.-P. 186-206.

106. Molecular characterization of Histoplasma capsulatum isolated from an outbreak in treasure hunters Histoplasma capsulatum in treasure hunters / Muñoz B., Martínez M.A., Palma G., et al. // Infect Dis. - 2010. - Vol. 8, №10. 264.

107. Molecular detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples / Bracea A., Tosello M.E., Girardini J.E. et al. II J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, №4.-P. 1753-1755.

108. Molecular diagnosis of human histoplasmosis in whole blood samples / Toranzo A.I., Tiraboschi I.N., Fernández N. et al. // Rev Argent Microbiol. - 2009. -Vol.41, №l.-P.20-26.

109. Monbreun W. The cultivation and cultural characteristics of Darling's Histoplasma capsulatum II Am. Jour. Trop. Med.-1934. .-Vol.l4.-P.93-125.

110. Nemecek J.C., Wuthrich M., Klein B.S. Global control of dimorphism and virulence in fungi // Science.-2006.-Vol.312, №28.-P.583-588.

111. Nguyen V.Q., Sil A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Rypl, a conserved transcriptional regulator // The National Academy of Sciences of the USA.-2008.

112. Non-culture based diagnostic tests for mycotic infections / Reiss E., Obayashi T., Orle K., Yoshida M. et.al. // Med Mycol.-2000.-Vol.38, №1.-P. 147-159.

113. Nosanchuk J.D., Gacser A. Histoplasma capsulatum at the host-pathogen interface 11 Microbes and Infection.-2008.-Vol. 10, №9.-P.973-977.

114. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens / Burik J-A.V., Myerson D., Schreckhise R.W. et.al. // J.Clin.Microbiol.-1998.-Vol.36,№5.-P.l 169-1175.

115. Pathogenic fungi in humans and animals / Howard D.H. - New York. -2002.- 790 p.

116. PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen / de Matos Guedes H. L., Guimaraes A.J., Peralta J.M. et al. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, №2.-P.535-539.

117. Phenotypic variation and intracellular parasitism by Histoplasma capsulatum /Kugler S., Sebghati T.S., Eissenberg L.G. et.al. // PNAS.-2000.- Vol.97, №16.-P.8794-8798.

118. Phylogenetic characterization of Histoplasma capsulatum strains based on ITS region sequences, including two new strains from Thai and Chinese patients in Japan / Tamura M, Kasuga T, Watanabe K, Katsu M. et.al. // Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi.-2002.-Vol.43, №1.-P.-11-19.

119. Phylography of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum / Kasuga T., White T.J, Koening G., Mcewen J. et.al. // Mol Ecol.-2003.-Vol.-12.-P.3383-3401.

120. Pine L., Malcolm G.B., Gross H., Gray S.B. Evaluation of purified H and M antigens of histoplasmin as reagents in the complement fixation test // Sabouraudia.-1978.-Vol. 16, №4.-P.257-269.

121. Pounder J.I., Hansen D., Woods G.L. Identification of Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, and Coccidioides species by repetitive-sequence-based PCR// J Clin Microbiol.-2006.-Vol.44, №8.-P.2977-2982.

122. Radford A., Parish J.H. The genome and genes of Neurospora crassa // Fungal Genet Biol.-1997.-Vol.21, №3.-P.258-66.

123. Rapid and simple method purification of nucleic acids / Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. // J.Clin.Microbiol.-1990.-Vol.28, №3.-P.495-503.

124. Rapid diagnosis of Histoplasma capsulatum endocarditis using the AccuProbe on an excised valve / Roy F.C., Tomford J.W., Hall G.S. et al. // J.Clin.Microbiol.-2001.-Vol.39, №7.-P.2640-2641.

125. Rappleye C.A., Goldman W.E. Defining virulence genes in the dimorphic fungi // Annu Rev Microbiol.-2006.-Vol.60.-P.281-303.

126. Ratel J.B., Batanghari J.W., Goldman W.E. Probing the yeast phase-specific expression of the CBP1 gene in Histoplasma capsulatum II Journal of Bacteriology.-1998.-Vol. 180, №7.-P. 1786-1792.

127. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing / Espy M.J., Uhl J.R., Sloan L.M. et.al. // Clinical Microbiology Reviews.-2006.-Vol. 19, № 1 .-P. 165-256.

128. Reid T.M., Schafer M.P. Direct detection of Histoplasma capsulatum in soil suspensions by two-stage PCR // Mol Cell Probes.-1999.-Vol. 13, №4.-P.269-273.

129. Reiss E., Miller S.E., Kaplan W., Kaufman L. Antigenic, chemical, and structural properties of cell walls of Histoplasma capsulatum yeast-form chemotypes 1 and 2 after serial enzymatic hydrolysis // Infect Immun.-1977.-Vol. 16, №2.-P.690-700.

130. Relatedness analyses of Histoplasma capsulatum isolates from Mexican patients with AIDS-associated histoplasmosis by using histoplasmin electrophoretic profiles and randomly amplified polymorphic DNA patterns / Reyes-Montes M.R., Bobadilla-Del Valle M., Martinez-rivera M.A. et al. // J.Clin.Microbiol.-1999.-Vol.37, №5.-P. 1404-1408.

131. Rios-Fabra A., Moreno A.R, Isturiz R.E. Fungal infection in Latin American countries // Infect Dis Clin North Am.-1994.-Vol.8, №1.-P.129-154.

132. Salazar O., Juan )K., Asenjo A. Enzymatic lysis of microbial cells // Biotechnol Lett.-2007.-Vol.29.-P.985-994.

133. Salvin S.B. Cysteine and related compounds in the growth of the yeastlike phase of H. capsulatum II J. Infect. Dis.- 1989.-Vol.84.-P. 275-283.

134. Samaila M.O., Abdullahi K. Cutaneous manifestations of deep mycosis: an experience in a tropical pathology laboratory Indian // J Dermatol.-2011.-Vol.56, №3.-P.282-286.

135. Sandhu G.S., Bruce C.K., Stockman L. Molecular probes for diagnosis of fungal infections // J.Clin.Microbiol.-1995.-Vol.41, №4.-P.2913-2919.

136. Scherr G.H. The roles of -SH group and incubation temperature // Exp. Cell Res.-1957.-Vol.l2.P.92-102.

137. Scott J.H., Schekman R. Lyticase: endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis // Journal of Bacteriology.-1980.-Vol. 142, №2.-P.414—423.

138. Sen P.K., Ghosh M.B. A study on histoplasmosis // Indian Journal of Tuberculosis.-1956.-Vol.3, №3.-P. 78-85.

139. Steele P.E, Carle G.F, Kobayashi G.S., Medoff G / Electrophoretic analysis of Histoplasma capsulatum chromosomal DNA // Mol. Cell. Biol.-1989.-Vol.9, №3.-P.-983-987.

140. Strauss E.J., Guthrie C. A cold-sensitive mRNA splicing mutant is a member of the RNA helicase gene family // Genes Dev.-1991.-Vol 5.-P.629-641.

141. Structural features responsible for the biological stability of Histoplasma's virulence factor CBP / Beck M.R., DeKoster G.T., Hambly D.M., Gross M.L. et.al. // Biochemistry.-2008.-Vol.47, №15.-P.4427^1438.

142. Strunnikov A.V., Larionov V.L, Koshland D. SMC1: an essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous protein family // J. Cell Biol.-1993.-Vol. 123.-P. 1635-1648.

143. Taylor J.W., Geiser D.M., Burt A., Koufopanou V. The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing / Clin Microbiol Rev.-1999.-Vol. 12, №1 .-P. 126-146.

144. The Ajellomycetaceae, a new family of vertebrate-associated Onygenales / Untereiner W.A., Scott J.A., Naveau F.A., Sigler L. et.al. // Mycologia.-2004.-Vol.96, №4.-P.812-821.

145. The interaction between Histoplasma capsulatum cell wall carbohydrates and host components: relevance in the immunomodulatory role of histoplasmosis / Gorocica P., Taylor M.L., Alvarado-Vásquez N., Pérez-Torres A. et.al. // Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.-2009.-Vol. 104, №3.-P.492-496.

146. The protein "mycoarray": a novel serological assay for the laboratory diagnosis of primitive endemic mycoses /Ardizzoni A., Baschieri M.C, Manca L, Orsi C.F. et.al.//New Microbiol.-201 l.-Vol.34, №3.-P.307-316.

147. Tian X., Shearer G. Cloning and analysis of mold-specific genes in the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum II Gene.-2001.-Vol.275.-P. 107-114.

148. Timberlake W.E. Low repetitive DNA content in Aspergillus nidulans. II Science 1978.-Vol. 202.-P.973-975.

149. Torres M., Diaz H., Herrera T., Sada E. Evaluation of enzyme linked immunosorbent-assay and western blot for diagnosis of histoplasmosis // Rev. Invest. Clin.-l993.-Vol.45, №2.-P. 155-160.

150. Typing of Histoplasma capsulatum strains by fatty acid profile analysis / Zarnowski R., Miyazaki M., Dobrzy A. et.al. // J Med Microbiol.-2007.-Vol.56.-P.788-797.

151. Validation and clinical application of a molecular method for identification of Histoplasma capsulatum in human specimens in Colombia, South America / Muñoz C, Gómez B.L., Tobón K.A. et.al. // Clin Vaccine Immunol.-2010.-Vol.17, №l.-P.62-67.

152. Vanbreuseghem R. African histoplasmosis or histoplasmosis caused by Histoplasma duboisii // Bull Acad R Med Belg.-1964.-Vol.4.-P.543-585.

153. Woods J.P. Histoplasma capsulatum molecular genetics, pathogenesis, and responsiveness to its environment // Fungal Genet Biol.-2002.-Vol.35, №2.-P.81-97.

154. Xianbin T., Glenmore S. The mold-specific ms8 gene is required for normal hypha formation in the dimorphic pathogenic fungus Histoplasma capsulatum II Eukaryotic cell.-2002.-Vol.l, №2.- P.249-256.

155. Xue B., Goodwin P.H., Annis S.L. Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonucleotide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences // Physiolog Mol Plant Pathol.-1992.-Vol.1, №3.-P.179-188.

156. Zancoper-Oliveira R.M., Tavares P.M., de Medeiros Muniz M. Genetic diversity of Histoplasma capsulatum strains in Brazil // Immunology and Medical Microbiology.-2005. -Vol.45 .-P.443-449.