Идентификация потенциальных клеточных субстратов для различных изоформ онкогена V-src тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Родина, Анна Анатольевна

• Родина, Анна Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Родина, Анна Анатольевна

1. Введение.

2. Обзор литературы. 14 Методы идентификации белок-белковых взаимодействий. Система двойных гибридов.

2.1. Введение.

2.2. Система двойных гибридов, разработанная Fields и Song.

2.3. Развитие системы двойных гибридов.

2.3.1. Транскрипционные факторы.

2.3.2. Векторы.

2.3.3. Репортерные штаммы дрожжей. . ••.

2.3.4. Трансформация дрожжей. .

2.3.5. Конъюгация дрожжей.

2.4. Скрининг библиотек.

2.5. Элиминация ложноположительных результатов.

2.6. Проблемы, возникающие при использовании системы двойных гибридов.

2.7. Преимущества системы двойных гибридов.

2.8. Возможности использования системы двойных гибридов.

2.9. Изучение ДНК-белковых взаимодействий.

2.9.1. Обнаружение активирующих последовательностей ДНК.

2.9.2. Идентификация ДНК-связывающих белков.

2.9.3. Метод обнаружения ДНК-связывающих доменов.

2.10. Обратная система двойных гибридов, определяющая диссоциацию белок-белковых взаимодействий.

2.11. Система трех гибридов. 48 2.11.1. Обнаружение РНК-белковых взаимодействий при помощи системы трех гибридов.

2.12. Обнаружение белок-белковых взаимодействий в клетках животных. 51 2.12.1. Метод количественной репликации.

2.12.2. Стратегия отбора взаимодействующих белков в ядре.

2.13. Бактериальная система двойных гибридов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация потенциальных клеточных субстратов для различных изоформ онкогена V-src»

Вирус саркомы Рауса (RSV) способен трансформировать клетки некоторых позвоночных in vitro и вызывать опухоли у некоторых видов лабораторных животных. Трансформирующая активность RSV связана с наличием в его геноме онкогена v-src, кодирующего тирозин-зависимую протеинкиназу (R. Jove and Н. Hanafusa, 1987). В геноме нормальных ^трансформированных клеток находится протоонкоген c-src, гомологичный гену v-src, но не обладающий трансформирующей активностью (D.Stehelin et al., 1976).

Продукт гена src принимает участие в передаче различного рода сигналов в клетке, взаимодействуя при этом с другими клеточными белками. Поиск субстратов src необходим для идентификации путей передачи сигналов, а также для понимания механизма трансформации, осуществляемой продуктом гена v-src.

Непермиссивные клетки, трансформированные RSV, являются хорошей моделью для исследования процесса опухолевой трансформации, а также такой важной стадии прогрессии опухоли как метастазирование.

Ранее в НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН была создана экспериментальная модельная система для изучения метастатического эффекта вируса саркомы Рауса (Deichman et al., 1989). Было получено несколько линий фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro штаммом Шмидт-Руппин D вируса саркомы Рауса. Все линии хотя и обладали типичным трансформированным фенотипом и были высокотуморогенны для сингенных животных, различались по способности к спонтанному метастазированию (Deichman et al., 1989).

Различия в метастатической активности этих линий коррелируют с определенными структурными изменениями в гене v-src из высоко и низкометастазирующих клеток. Путем молекулярного клонирования были получены новые изоформы онкогена v-src из данных линий: v-src-HM из высокометастазирующей линии и v-src-LM из низкометастазирующей линии (A.Tatosyan et al., 1996).

Ранее методом двойных гибридов был осуществлен скрининг библиотеки к-ДНК, полученной из низкометастазирующей линии RSV-трансформированных фибробластов хомяков НЕТ-БЯ, для обнаружения потенциальных партнеров онкогена у-эгс. В результате бьшо получено несколько клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с фрагментом белка у-вгс в системе двойных гибридов (М1гешпа & а!., 1998). К ним относятся белок узеар1 (белок, ассоциированный с концевым фрагментом белка у-вгс) и РЬА2Ьза1 (ген, кодирующий фосфолипазу А2 клеток хомяка, ассоциированную с белком бгс). УБеар1 и РЬА2Ьза1 являются новыми генами. Эти последовательности не были известны ранее.

Целью данной работы является исследование потенциальных клеточных субстратов продукта онкогена у-йгс и сравнительный анализ взаимодействия одного из обнаруженных белков с различными изоформами у-бгс. Исследования велись по двум направлениям:

1) Анализ потенциальных партнеров онкогена у-бгс.

2) Изучение определенных биохимических характеристик некоторых белков фокальной адгезии, известных в качестве партнеров белка вгс.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать взаимодействие продукта гена РЬА2Ьза1, обнаруженного в результате скрининга библиотеки к-ДНК,

- с С-концевым фрагментом белка у-эгс-НМ и С-концевым фрагментом белка у-вгс-ЬМ в системе двойных гибридов.

- с полноразмерными белками у-вгс-НМ, у-эгс-ЬМ, а также с с-эгс белком при помощи системы гибридных белков глутатион-Б-трансферазы.

2. Анализ обнаруженного взаимодействия путем прямой ко-иммунопреципитации продукта РЬА2118а1 с белком у-бгс из белкового лизата клеток линии ЯБУ-трансформированных фибробластов хомяков.

3. Изучение локализации и возможности фосфорилирования белка РЬА2Ьза1 в клетках трансформированных линий фибробластов хомяков.

4. Анализ уровня синтеза и степени фосфорилирования следующих белков: киназы фокальной адгезии (рр125гдк) и адапторного белка паксилина в трансформированных линиях фибробластов хомяков, обладающих различной метастатической активностью и уровнем продукции онкобелка v-src.

Работа имеет теоретическое значение для понимания деталей трансформирующего механизма продукта v-src, в частности ассоциации онкобелка src с различными белками, вовлеченными в процесс передачи сигнала в опухолевых клетках.

В результате проведенных исследований было показано, что продукт гена vseapl специфично взаимодействует с С-концевым фрагментом белка v-src-HM в системе двойных гибридов. Было также убедительно доказано взаимодействие белков PLA2hsal и v-src при помощи ряда методов in vivo и in vitro. Методами двойных гибридов и гибридных белков, содержащих глитатион-Б-трансферазу (GST), было впервые обнаружено различное сродство белка PLA2hsal к изоформам белка v-src, полученным из линий с различной метастатической активностью. Методом GST-гибридных белков была показана возможность взаимодействия белков PLA2hsal и с-src. Как уже говорилось, белок src является одним из основных белков системы передачи сигнала в клетке. Он входит в различные сигнальные пути. В следствие приведенных особенностей белка src, поиск его партнеров является очень актуальной проблемой на данный момент. В настоящее время выявлено около 50 белков, которые потенциально могут являться субстратами pp60src, т.е. белками, у которых изменяется уровень фосфорилирования по тирозину под действием pp60src ( G.Gillet et al., 1995 ). Оригинальность полученных в этой работе данных заключается в том, что исследуемые белки vseapl и PLA2hsal являются новыми, не известными ранее партнерами белка src. Результаты по сродству белка PLA2hsal к разновидностям белка v-src из клеточных линий с различной метастатической активностью дают возможность делать предположения о роли этого взаимодействия в процессах src-ассоциированного метастазирования.

Была исследована степень продукции белка PLA2hsal в линиях трансформированных фибробластов хомяка, отличающихся по ряду параметров, обнаружены определенные корреляции. Исследована локализация и возможность фосфорилирования белка PLA2hsal в трансформированных клетках хомяка.

Одним из путей передачи сигнала, в котором принимает участие белок src, является сигнальный путь через интегрины. Он активируется при взаимодействии белков экстраклеточноо матрикса со своими трансмембранными клеточными рецепторами - интегринами. Это взаимодействие приводит к аутофосфорилированию подмембранной киназы фокальной адгезии (FAK). Затем FAK взаимодействует с белком Src. Последствием этого взаимодействия является фосфорилирование FAK по ряду тирозиновых остатков. FAK и Src взаимодействуют с адапторным белком паксилином, локализованным в области фокальных контактов, и какая-то из этих тирозин-киназ фосфорилирует паксилин. Затем белки FAK и паксилин через промежуточные адапторные белки (GRB2 и Crk) взаимодействуют с белками, регулирующими активностью белка ras (такими как Sos) и далее этот сигнальный путь идет через МАР-киназы в ядро клетки (М. Schaller and Т. Parsons, 1995; E.Clark and J.Brugge, 1995)(см. схему).

Схема пути передачи сигнала через интегрины. Белки экстраклеточного матрикса (фибронектин) е грины щшсилин экспрессия генов

В работе бьша использована модель, полученная и охарактеризованная ранее в НИИ Канцерогенеза и состоящая из набора трансформированных линий фибробластов сирийского хомяка, отличающихся по ряду биологических свойств, таких как метастатическая активность in vivo, уровень продукции онкобелка v-src, секреция простагландинов (G. Deichman et al., 1989; G. Deichman et al., 1992; G. Deichman et al., 1996). Линии клеток отличались также по структуре сети фибронектина - основного компонента внеклеточного матрикса у данных клеток (А. Tatosyan et al., 1996). В связи с этим, вторым направлением работы было изучение уровня синтеза и степени фосфорилирования по тирозину двух белков фокальных контактов: киназы фокальной адгезии (FAK) и адапторного белка паксилина. Эти белки являются ключевыми компонентами цепи передачи сигнала от интегринов (см. схему) и известны в качестве партнеров белка src. Была обнаружена прямая корреляция между метастатической активностью исследованных клеточных линий и уровнем фосфорилирования по тирозину белков FAK и паксилина.

2. Обзор литературы.

Методы идентификации белок-белковых взаимодействий.

Система двойных гибридов.

2.1. Введение.

Специфические взаимодействия между белками формируют основу многих важнейших биологических процессов. Например, биологические "машины", такие как рибосомы, сплайсосомы или полимеразы содержат много различных белков и играют фундаментальную роль в синтезе макромолекул. Сети взаимодействующих факторов передачи сигналов регулируют экспрессию генов, контролирующих клеточный рост и дифференцировку (L. Guarente, 1993).

Взаимодействия между белками в основном изучаются с использованием биохимических методов: таких как кроссшивка белков, ко-иммунопреципитация и хроматографическое кофракционирование.

При проведении экспериментов по ко-иммунопреципитации, в продуцируемые клеткой белки вводят радиоактивную метку. Затем при помощи антител к известному белку путем преципитации получают иммунокомплексы, содержащие белки, ассоциированные с данным известным белком. Полученные иммунокомплексы разделяют в полиакриламидном геле и по наличию радиоактивной метки выявляют белки, ассоциированные с данным белком. Таким методом, однако, можно определить только примерную молекулярную массу ассоциированных белков. Получение клонированных генов, кодирующих эти белки, часто затруднено (С. Chien et al., 1991). Эту проблему можно обойти, используя очищенные белки в качестве проб при скрининге экспрессирующих библиотек бактерий. При таком подходе, при выявлении взаимодействующего белка, доступен и кодирующий его ген (P. Nelbock et al., 1990).

Недавно был описан еще один подход к обнаружению взаимодействующих белков. Метод основан на фиксации синтезированного белка на твердой подложке и на детекции белков-мишеней, кодируемых библиотекой к-ДНК, взаимодействующих с этим белком. Белок, используемый в качестве "наживки" для обнаружения взаимодействующих с ним белков, получают в Е. coli в виде гибридного белка с белком-носителем биотин карбоксилазы (ВССР) (S. Li and J. Cronan, 1992). Фрагмент BCCP подвергается биотинилированию в клетках Е. coli (J. Cronan, 1990). За счет этого, гибридный белок может быть фиксирован на носителе, содержащем авидин или стрептавидин. Клетки, продуцирующие этот гибридный белок, инфицируют рекомбинантным фагом 1, кодирующим химерную конструкцию гена Ь-галактозидазы с последовательностью из библиотеки к-ДНК на С-конце. Образованный с химерной конструкции гибридный белок сохраняет свою Ь-галактозидазную активность. При переносе фаговых бляшек на фильтры, покрытые авидином, происходит фиксация ВССР-гибридных белков. В случае, если белок-"наживка" и белок, кодируемый фрагментом к-ДНК, взаимодействуют, гибрид Ь-галактозидазы также сохраняется на фильтре. Окраска хромогенным субстратом b-галактозидазы выявляет позитивные бляшки (F. Germino et al., 1993).

Представленные выше подходы к обнаружению взаимодействующих белков являются системами in vitro. Использование методов in vivo более предпочтительно, поскольку данные условия проведения опытов считаются приближенными к естественным.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Родина, Анна Анатольевна

6. Выводы.

1. Методом двойных гибридов показано специфичное взаимодействие продукта неизвестного ранее гена УБеар 1 (белок, ассоциированный с концевой последовательностью белка у-вгс) клеток хомяков с С-концом НМ-варианта онкобелка у-вгс.

2. Методами 1) двойных гибридов, 2) преципитации ОБТ-гибридных белков и 3) ко-иммунопреципитации, обнаружено специфичное взаимодействие неизвестного ранее белка РЬА2Ьза1 (фосфолипаза А2 хомяков, ассоциированная с белком вгс) с продуктом онкогена у-бгс.

3. Методом преципитации ОБТ-гибридных белков установлено, что сродство белка РЬА2Ьва1 к белку у-вгс-НМ вьппе, чем к у-вгс-ЬМ. Выявлена также потенциальная способность белка РЬА21т1 взаимодействовать с белком с-вгс, происходящим из клеток кур и хомяков .

4. Исследована локализация Р1А2118а1 в трансформированных клетках хомяков. Полученные данные позволяют предположить ассоциацию белка РЬА2Ьва1 с компонентами эндоплазматической сети и присутствие некоторого количества этого белка в цитоплазме клеток.

5. Выявлено повышенное количество фосфотирозина в ключевых белках, участвующих в процессе передачи сигнала от интегринов - киназе фокальной адгезии (БАК) и адапторном белке паксилине в высокометастазирующих линиях трансформированных фибробластов хомяка по сравнению с содержанием фосфотирозина в данных белках в низкометастазирующих линиях.

6. Обнаружена корреляция между степенью фосфорилирования паксилина по тирозину и уровнем продукции белка у-бгс в трансформированных линиях фибробластов хомяков. Подобная корреляция не выявлена при исследовании фосфорилирования по тирозину белка БАК.

7. Установлено, что белок РАК не способен фосфорилировать паксилин по тирозину в линиях клеток ЭТНЕ и НЕТ-8Я-28С-Ы-газ 34 кл.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Родина, Анна Анатольевна, 1999 год

1. Aarsman, A., de Jong, J., Arnoldussen, E., Neys, F., van Wassenaar, P. and Van den Bosch, H. (1989). Immunoaffinity purification, partial sequence, and subcellular localization of rat liver phospholipase A2. J. Biol. Chem. 264(17), 10008-10014.

2. Acheson, N. (1980). DNA Tumor Viruses, ed. Tooze. J. (Cold Spring Harbor Lab., NY), 151-160.

3. Van Aelst L., Barr M., Marcus S., Polverino A., Wigler M. (1993). Complex formation between RAS and RAF and other protein kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 62136217.

4. Axelrod, J., Burch, R. and Jelsema, C. (1988). Receptor-mediated activation of phospholipase A2 via GTP-binding proteins: arachidonic acid and its metabolites as second messengers Trends Neurosci 11, 117-123.

5. Barbour, S. and Dennis E. (1993). Antisense inhibition of group II phospholipase A2 expression blocks the production of prostaglandin E2 by P388D1 cells. J. Biol. Chem. 268(29), 21875-21882.

6. Bartel, P., Chien, C., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993). Elimination of false positives that arise in using the two-hybrid system. BioTechniques 14, 920-924.

7. Bartel, P., Chien, C., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993a) in "Cellular interactions in development: a practical approach" (D.A. Hartley, ed.) Oxford University Press, Oxford, 153-179.

8. Bartel P. and Fields S. (1995). Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 254, 241-263.

9. Bendixen, S. Gangloff and R. Rothstein (1994). A yeast mating-selection scheme for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research 22(9), 1778-1779.

10. Boeke, J., LaCroute, F. and Fink, G. (1984). A positive selection for mutants lacking orotidine-5-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.

11. Bogerd, H., Fridell, R„ Blair, W., Cullen B. (1993). Genetic evidence that the Tat proteins of human immunodeficiency virus types 1 and 2 can multimerize in the eukaryotic cell nucleus. J. Virol 67,5030-5034.

12. Brent, R. and Ptashne, M. (1985). A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43, 729-736.

13. Brown, N., Costanzo, M. and Fox, T. (1994). Interaction among three proteins that specifically activate translation of the mitochondrial COX3 mRNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 14, 1045-1053.

14. Brunton, V., Ozanne, B., Paraskeva, G. and Frame, M. (1997). A role for epidermal growth factor receptor, c-src and focal adhesion kinase in an in vitro model for the progression of colon cancer. Oncogene 14, 283-293.

15. Burridge, K., Turner, C. and Romer, L. (1992). Tyrosine phosphorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly. J. Cell Biol. 119(4), 893-903.

16. Calalb, M.B., Polte, T.R. and Hanks, S.K. (1995). Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase at sites in the catalytic domain regulates kinase activity: a role for src family kinases. Mol and Cell Biol 15(2), 954-963.

17. Cary, L.A., Chang, J.F. and Guan, J. (1996). Stimulation of cell migration by overexpression of focal adhesion kinase and its association with Src and Fyn. J. Cell Sci. 109, 1787-1794.

18. Chan, P., Kanner, S., Whitney, G. and Aruffo, A. (1994). A transmembrane-anchored chimeric focal adhesion kinase is constitutively activated and phosphorylated at tyrosine residues identical to ppl25FAK J. Biol. Chem. 269, 20567-20574.

19. Chardin, P., Camonis, J., Gale, N., van Aelst, L., Schlessinger, J., Wigler, M. and Bar-Sagi, D. (1993). Human Sosl: a guanine nucleotide exchange factor for Ras that binds to GRB2. Science 260, 1338-1343.

20. Chevray, E. and Nathans, D. (1992). Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jim. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793.

21. Chien, C-T., Bartel, P., Sternglanz, R., Fields, S. (1991). The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582.

22. Clark, E. and Brugge, J. (1995). Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science 268, 233-239.

23. Cobb, B.S., Schaller, M.D., Leu, T. and Parsons, J.T. (1994). Stable association of pp60src and pp59fyn with the focal adhesion-associated protein tyrosine kinase, ppl25FAK. Mol. Cell. Biol. 14(1), 147-155.

24. Crawford D., Shools, G., Salmon, S. and Davies, K. (1996). adapt33, a novel oxidant-inducible RNA from hamster HA-1 cells. Arch. Biochem. Biophys. 332(2), 255-260.

25. Cronan, J. (1990). Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to label, purify, and study proteins. J. Biol. Chem. 265, 10327-10333.

26. David-Pfeuty, T. and Nouvian-Dooghe, Y. (1990). Immunolocalization of the cellular src protein in interphase and mitotic NIH c-src overexpresser cells. J. Cell Biol. Ill, 30973116.

27. Deichman, G.I., Kashkina, L.M., Mizenina, O.A., Gorojanskaya, E.G., Nikiforov, M.A., Gudkov, A.V., Dyakova, N.A., Komelkov, A.V., Prilutskaya, M.O., Kushlinsky, N.E. and Tatosyan, A.G. (1996). Mechanisms of unusually high antioxidant activity of RSV

28. SR-transformed cells and of its suppression by activated p21ras. Int. J. Cancer 66, 747752.

29. Dennis, E. (1983) in The Enzymes (Boyer, P., ed). Academic Press, NY 16, 307-353.

30. Dennis, E. (1994). Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2. J. Biol. Chem. 269(18), 13057-13060.

31. Douglas, H. and Hawthorne, D. (1966). Regulation of genes controlling synthesis of the galactose pathway enzymes in yeast. Genetics 54(3), 911-916.

32. Durfee, T., Becherer, K., Chen, P-L., Yeh, S-H., Yang, Y., Kilburn, A., Lee, W-H., Elledge, S. (1993). The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes Dev. 7, 555-569.

33. Dutta, A., Wang, L., Hanafusa, T. and Hanafusa, H. (1985). Partial nucleotide sequence of Rous sarcoma virus-29 provides evidence that the original Rous sarcoma virus was replication-defective. J. Virol. 55, 728-735.

34. Eide, B., Turck, C. and Escobedo, J. (1995). Identification of Tyr-397 as the primary site of tyrosine phosphorylation and pp60src association in the focal adhesion kinase, ppl25FAK. Mol. Celt. Biol. 15(5), 2819-2827.

35. Feilotter, H., Hannon, G., Ruddel, C., Beach, D. (1994). Construction of an improved yeast strain for two hybrid screening. Nucleic Acids Res. 22, 1502-1503.

36. Fields,S. and Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246.

37. Fields, S. (1993). The two-hybrid system to detect protein-protein interactions. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 5, 116-124.

38. Fields, S. and Sternglanz, R. (1994). The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. Trends in Genetics 10(8), 286-292.

39. Fincham, V.J., Wyke, J.A. and Frame, M.C. (1995). v-src induced degradation of focal adhesion kinase during morphological transformation of chicken embryo fibroblasts. Oncogene 10, 2247-2252.

40. Flick J. and M. Johnston (1990). Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 10(9), 4757-4769.

41. Germino, F., Wang, Z. and Weissman, S. (1993). Screening for in vivo protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad Sei. USA 90, 933-937.

42. Gillet, G., Guerin, M., Trembleau, A. and Brun, G. (1995). A £c/-2-related gene is activated in avian cells transformed by the Rous sarcoma virus. The EMBO Journal 14(7), 1372-1381.

43. Glaser, K. (1995). Regulation of phospholipase A2 enzymes: selective inhibitors and their pharmacological potential. Adv. Pharmacol. 32, 31-66.

44. Glenney, J.R. and Zokas, L. (1989). Novel tyrosine kinase substrates from Rous sarcoma virus-transformed cells are present in the membrane skeleton. J. Cell Biol. 108, 24012408.

45. Guarente, L. (1993). Strategies for the identification of interacting proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 1639-1641.

46. Hanks, S.K., Calalb, M.B., Harper, M.C. and Patel, S.K. (1992). Focal adhesion protein-tyrosine kinase phosphorylated in response to cell attachment to fibronectin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8487-8491.

47. Hannon, G., Demetrick, D. and Beach, D. (1993). Isolation of the Rb-related pl30 through its interaction with CDK2 and cyclins. Genes Dev. 7, 2378-2391.

48. Hardy, C., Sussel, L., Shore, D. (1992). A RAP-1-interacting protein involved in transcriptional silencing and telomere length regulation. Genes Dev. 6, 801-814.

49. Harper, J., Adami, G., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. (1993). The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of Gl cyclin-dependent kinases. Cell 75, 805-816.

50. Hieter, P., Mann, C., Snyder, M. and Davis, R. (1985). Mitotic stability of yeast chromosomes: a colony color assay that measures nondisjunction and chromosome loss. Cell 40, 381-392.

51. Hofer, F., Fields, S., Schneider, C. and Martin, S. (1994). Activated Ras interacts with the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1108911093.

52. Hollander, M., Alamo, I. and Fornace, J. (1996). A novel DNA damage-inducible transcript, gadd7, inhibits cell growth, but lacks a protein product. Nucleic Acids Res. 24, 1589-1593.

53. Hollenberg, S., Sternglanz, R., Cheng, P. and Weintraub, H. (1995). Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15(7), 3813-3822.

54. Holt, K., Olson, A., Moye-Rowley, W. andPessin, J. (1994). Phosphatylinositol 3-kinase activation is mediated by high-affinity interactions between distinct domains within the pi 10 and p85 subunits. Mol. Cell. Biol. 14, 42-49.

55. Johnston, M. (1987). A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiaq. Microbiol. Rev. 51, 458-476.

56. Johnston, M. and Davis, R. (1984). Sequences that regulate the divergent GAL1-GAL10 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 4, 1440-1448.

57. Jove, R. and Hanafusa, H. (1987). Cell transformation by the viral Src oncogene. Annu. Rev. Cell Biol. 3,31-56.

58. Kanner, S.B., Reynolds, A.B., Vines, R.R. and Parsons, J.T. (1990). Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosine-kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3328-3332.

59. Karimova, G., Pidoux, J., Ullmann, A. and Ladant, D. (1998). A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,5752-5756.

60. Keegan, L., Gill, G. and Ptashne, M. (1986). Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein. Science 231, 699-704.

61. Kikuchi, A., Demo, S., Ye, Z., Chen, Y. and Williams, L. (1994). ral GDH family members interact with the effector loop of ras p21. Molecular and cellular biology 14, 7483-7491.

62. Krueger, J., Wang, E., Garber, E. and Goldberg, A. (1980). Difference in intracellular location of pp60src in rat and chicken, cells transformed by Rous sarcoma virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4142-4146.

63. Ladant, D. (1988). Interaction of Bordetella pertussis adenylate cyclase with calmodulin. Identification of two separated calmodulin-binding domains. J. Biol. Chem. 263, 26122618.

64. Ladant, D., Michelson, S., Sarfati, R., Gilles, A., Predeleanu, R. and Barzu., O. (1989). Characterization of the calmodulin-binding and of the catalytic domains of Bordetella pertussis adenylate cyclase. J. Biol. Chem. 264,4015-4020.

65. Li, S. and Cronan, J. (1992). The gene encoding the biotin carboxylase subunit of Escherichia coli acetyl-CoA carboxylase. J. Biol. Chem. 267, 855-863.

66. Li, B. and Fields, S. (1993). Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two-hybrid system. FASEB J. 7, 957-963.

67. Li, J. and Herskowitz, I. (1993). Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science 262, 1870-1874.

68. Liu, F. and Green, M. (1990). A specific member of the ATF transcription factor family can mediate transcription activation by the adenovirus Ela protein. Cell 61, 1217-1224.

69. Liu, J., Wilson, T., Milbrandt, J. and Johnston, M. (1993). Identifying DNA-binding sites and analyzing DNA-binding domains using a yeast selection system. METHODS: A Companion to Methods inEnzymology 5, 125-137.

70. Luban, J., Bossolt, K., Franke, E., Kalpana, G. and Goff, S. (1993). Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A and B. Cell 73, 10671078.

71. J.Luban and S.Goff (1995). The yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions. Current opinion in biotechnology 6, 59-64.

72. Luo, Y., Yu, H., Peterlin, B. (1994). Cellular protein modulates effects of human immunodeficiency virus type 1 Rev. J. Virol. 68, 3850-3856.

73. Ma, J. and Ptashne, M. (1987). Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments. Cell 48, 847-853.

74. Mizenina, O., Yanushevich, Y., Musatkina, E., Rodina, A., Camonis, J., Tavitian, A. and Tatosyan, A. (1998). C-terminal end of v-src protein interacts with peptide coded by gadd7/adapt 15-like RNA in two-hybrid system. FEBS Letters 422, 79-84.

75. Nelbock, P., Dillon, P., Perkins, A. and Rosen, C. (1990). A cDNA for a protein that interacts with the human immunodeficiency vims Tat transactivator. Science 248, 16501653.

76. Nigg, E., Sefton, B., Hunter, T., Walter, G. and Singer, S. (1982). Immunofluorescence localization of the transforming protein of Rous sarcoma virus with antibodies against a synthetic src peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5322-5326.

77. Owens, L.V., Xu, L., Craven, R.J., Dent, G.A., Weiner, T.M., Kornberg, L., Liu, E.T. and Cance, W.G. (1995). Overexpression of the focal adhesion kinase(pl25(FAK)) in invasive human tumours. Cancer Res. 55, 2752-2755.

78. Peden, W, Pipas, J., Pearson-White, S. and Nathans. D. (1980). Isolation of mutants of an animal virus in bacteria. Science 209, 1392-1396.

79. Petermann, R., Mossier, B., Aryee, D. and Kovar, H. (1998). A recombination based method to rapidly assess specificity of two-hybrid clones in yeast. Nucleic Acids Research 26(9), 2252-2253.

80. Ptashne, M. and Gann, A. (1990). Activators and targets. Nature (London) 346, 329-331.

81. Rohrschneider, L. (1979). Immunofluorescence on avian sarcoma virus-transformed cells: localization of the src gene product. Cell 16, 11-24.

82. Rusconi, S., Severne, Y., Georgiev, O., Galli, I. and Wieland, S. (1990). A novel expression assay to study transcriptional activators. Gene 89, 211-221.

83. Sathe, G., O'Brian, S., McLaughlin, M., Watson, F. and Livi, G. (1991). Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells. Nucleic Acids Research 19, 4775.

84. Schaller, M.D., Borgman, C.A., Cobb, B.S., Vines, R.R., Reynolds, A.B. and Parsons, J.T. (1992). ppl25FAK, a structurally distinctive protein-tyrosine kinase associated with focal adhesions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5192-5196.

85. Schaller, M.D., Hildebrand, J.D., Shannon, J.D., Fox, J.W., Vines, R.R. and Parsons, J.T. (1994). Autophosphorylation of the focal adhesion kinase, ppl25FAK, directs SH2-dependent binding of pp60src. Mol. and Cell. Biol. 14(3), 1680-1688.

86. SenGupta, D., Zhang, B., Kraemer, B., Pochart, P., Fields, S. and Wickens, M. (1996). A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8496-8501.

87. Shalloway, D., P.M. Coussens and P. Yaciuk (1984). Overexpression of the c-src protein does not induce transformation of NIH 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7071-7075.

88. Shrivastava, A., Saleque, S., Kalpana, G., Artandi, S., Goff, S. and Calame, K. (1993). Inhibition of transcriptional regulator Yin-Yang-1 by association with c-Myc. Science 262, 1889-1892.

89. Staudinger, J., Perry, M., Elledge, S. and Olson, E. (1993). Interactions among vertebtate helix-loop-helix proteins in yeast using the two-hybrid system. J. Biol. Chem. 268,4608-4611.

90. Stehelin,D., Varmus, H., Bishop, J. and Vogt, P. (1976). DNA related to the transforming gene(s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA. Nature 260, 170-173.

91. Turner, C. and Miller, J. (1994). Primary sequence of paxillin contains putative SH2 and SH3 domain binding motifs and multiple LIM domains: identification of a vinculin and pp 125FAK-binding region. J. Cell Sci. 107, 1583-1591.

92. Uhlenbeck, O., Carey, J., Romaniuk, P., Lowary, P. and Beckett, D. (1983). Interaction of R17 coat protein with its RNA binding site for translational repression. J. Biomol. Struct. Dyn. 1, 539-552.

93. Ullmann, A. and Danchin, A. (1983) in Advances in Cyclic Nucleotide Research (Raven, NY) 15, 1-53.

94. Van den Bosch, H. (1980). Intracellular phospholipases A Biochim. Biophys. Acta 604, 191-246.

95. Vasavada, H., Ganguly, S., Settleman, J., DiMaio, D. and Weissman, S. (1988). A model system for the rescue of cDNA encoding transacting transcription activator by contingent replication assay. Indian J. Boichem. Biophys. 25, 488-494.

96. Vasavada, H., Ganguly, S., Germino, F., Wang, Z. and Weissman, S. (1991). A contingent replication assay for the detection of protein-protein interactions in animal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10686-10690.

97. Verheij, H., Slotboom, A. and de Haas, G. (1981). Structure and function of phospholipase A2. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 91, 91-203.

98. Vidal, M., Brachmann, R., Fattaey, A., Harlow, E. and Boeke, J. (1996). Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10315-10320.

99. Vojtek, A., Hollenberg, S. and Cooper, J. (1993). Mammalian ras interacts directly with the serine/threonine kinase raf. Cell, 74, 205-214.

100. Waite, M. (1987). in Phospholipases (Hanahan, D., ed) Plenum Publishing Corp., NY.

101. Wang, M. and Reed, R. (1993), Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature 364, 121-126.

102. Weng, Z., Taylor, J., Turner, C., Brugge, J. and Seidel-Dugan, C. (1993). Detection of Src homology 3-binding proteins, including paxillin, in normal and v-src-transformed Balb/c 3T3 cells. J. Biol. Chem. 268(20), 14956-14963.

103. Wilson, T., Fahrner, T., Johnston, M. and Milbrandt, J. (1991). Identification of the DNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. Science 252, 1296-1300.

104. Wolfiier, M., Yep, D., Messenguy, F. and Fink, G. (1975). Integration of amino acid biosynthesis into the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 96, 273-290.

105. Wood, C., Turner, C., Jackson, P. and Critchley, D. (1994). Characterization of the paxillin-binding site and the C-terminal focal adhesion targeting sequence in vinculin. J. Cell Sci. 107,709-717.

106. Xing, Z., Chen, H., Nowlen, J., Taylor, S., Shalloway, D. and Guan, J. (1994). Direct interaction of v-src with the focal adhesion kinase mediated by the Src SH2 domain. Mol. Biol, of the Cell 5, 413-421.

107. Zhang, J. and Lautar, S. (1996). A yeast three-hybrid method to clone ternary protein complex components. Anal. Biochemistry 242, 68-72.