Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.04, кандидат биологических наук Дубровский, Ярослав Александрович

• Дубровский, Ярослав Александрович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дубровский, Ярослав Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фосфорорганические соединения

1.2. Сернистый иприт

1.3. Ацетилсалициловая кислота

1.4. Металл-аффинная хроматография

1.5. М А Л ДИ масс-спектрометрия

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Выявление и идентификация фосфонилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы

3.2. Выявление и идентификация алкилированных аддуктов белков крови

3.3. Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобина человека и крысы

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Выявление и идентификация фосфорилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы

5.2. Выявление и идентификация алкилированных аддуктов сывороточного альбумина человека и крысы

5.3. Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобина человека и крысы

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе»

ВВЕДЕНИЕ

Белки и секретируемые пептиды могут приобретать различные посттрансляционные модификации аминокислот в полипептидной цепи. В настоящее время описано большое количество посттрансляциионных модификаций белков и пептидов. Такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, как правило, имеют важное функциональное значение и влияют на биологические функции белков; ряд других модификаций не имеют функционального значения. Кроме того, возможны посттрансляционные модификации секреторных белков в результате взаимодействия с чужеродными соединениями - ксенобиотиками. К которым относятся токсичные агенты и лекарственные средства.

Электро- и нуклеофильные химические соединения способны формировать ковалентные связи с белками, образуя аддукты (модификации, не имеющие общепринятого названия). В последнее время раздел биоорганической химии, который изучает такие модификации белков, получил собственное название -«аддуктомика». Большая часть опубликованных работ в этой области посвящена проблематике уничтожения химического оружия. В то же время, показана способность и ряда других ксенобиотиков формировать аддукты с белками.

Анализ биомедицинских проб позволяет по наличию определенных метаболитов токсичных агентов в организме человека или животного судить о факте отравления. Мощный инструментарий современной аналитической химии, как правило, направлен на идентификацию самого ксенобиотика или его метаболитов, которые в течение нескольких дней выводятся из организма. Аддукты токсиканта с белками могут сохраняться на протяжении всего времени жизни белка в организме и их можно рассматривать как долгоживущие биомаркеры экспозиции.

Для практических целей представляется целесообразным рассмотрение процедуры анализа посттрансляционных модификаций основных белков крови -сывороточного альбумина и гемоглобина, и сравнение с библиотекой

модификаций белков высокоопасными соединениями и/или лекарственными средствами. Выявление участка белка и идентификация аминокислотного остатка, участвующего в образовании аддукта, являются стабильным показателем, зависящим от третичной и четвертичной структуры белка, позволяющим установить факт воздействия. Разработанная процедура анализа белков крови для обнаружения аддуктов позволит значительно расширить спектр определяемых соединений и увеличить срок выявления факта экспозиции в токсикологическом анализе.

На сегодняшний день наиболее удобными для решения подобных задач являются иммунохимические и масс-спектрометрические методы анализа. Иммунохимические методы требуют наличия специфичных антител, которые не всегда возможно получить и охарактеризовать. Масс-спектрометрия с мягкими-методами ионизации является более универсальным методом биоорганического анализа. Следует отметить, что в последние годы большинство работ по исследованию аддуктов ксенобиотиков с белками выполнены с помощью приборов, имеющих в качестве источников ионов «электроспрей». Данный класс приборов отличается высокими требованиями к анализируемым образцам. До сих пор в очень немногих исследованиях в области анализа аддуктов используется метод матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), хотя этот метод менее чувствителен к присутствию солей и других загрязняющих компонентов. МАЛДИ масс-спектрометрия является универсальным методом анализа белковых гидролизатов и выявления посттрансляционных модификаций, обеспечивающим быстрое получение обширных данных о составе образца.

Таким образом, разработка нового подхода, совмещающего в себе преимущества биоорганического, химико-токсикологического и масс-спектрометрического анализа аддуктов ксенобиотиков с белками представляется актуальной.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования:

Разработка нового методического подхода для определения и идентификации ковалентных посттрансляционных модификаций белков крови алкилирующими (сернистый иприт), ацетилирующими (ацетилсалициловая кислота) и фосфонилирующими (производные метилфосфоновой кислоты -зарин, зоман и вещество типа Vx (RVX, VR) ксенобиотиками методами хроматографии и МАЛДИ масс-спектрометрии.

Задачи исследования:

- определить и идентифицировать сайты связывания ксенобиотиков с белками крови (гемоглобин и/или сывороточный альбумин) человека и крысы;

- продемонстрировать возможность выделения модифицированных пептидов из гидролизата белка методами хроматографии (обращенно-фазовая, металл-аффинная);

- разработать методики выделения модифицированных пептидов из гидролизатов белков методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих металлы Ti (IV), Fe (III), Си (II), in vitro;

- показать эффективность разработанного подхода на образцах крови, полученных в ходе токсикологического эксперимента.

Научная новизна

Выявлены и идентифицированы сайты связывания фосфорорганических отравляющих веществ (ФОБ) с сывороточным альбумином крысы (Y-411). Экспериментально показана возможность выделения модифицированных ФОБ пептидов из гидролизата сывороточного альбумина человека и крысы с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих оксид титана (IV) и хелатированные ионы железа (III).

Впервые определены сайты связывания сернистого иприта с глобином крысы и человека (С-93, С-126 в бета-субъединице глобина крысы и Е-27 в альфа-субъединице глобина крысы, и С-93 в бета-субъединице глобина человека). Инструментально выявлены модифицированные триптические пептиды глобина и сывороточного альбумина крысы, содержащие С-93 и С-34 соответственно, в эксперименте in vivo. Впервые показана возможность выделения модифицированных сернистым ипритом пептидов из гидролизата глобина с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем ионы меди (И).

Определены сайты связывания ацетилсалициловой кислоты (АСК) с глобином человека и крысы (К-17, К -41, К-57, К-91 в альфа-субъединице глобина человека и К-18, К-96, К-133 в бета-субъединице глобина человека; К-17, К-57, К-91, К-140 в альфа-субъединице глобина крысы и К-17, К-77 в бета-субъединице глобина крысы). Методом МАЛДИ масс-спектрометрии впервые идентифицированы ацетилированные К-17 и К-57 в бета-цепи глобина, выделенного из крови человека в модельном эксперименте после инкубации с АСК в концентрации 100 мкг/мл.

Реализация работы

Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в научно-исследовательской работе отдела токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России. Результаты работы реализованы в методических рекомендациях «Методы определения алкилированных аддуктов сернистого иприта с белками крови» № 41-11 от 26.10.2011.

Практическая значимость

Предложенный способ пробоподготовки с использованием металл-аффинной хроматографии для выделения модифицированных пептидов из гидролизата белков крови (сывороточный альбумин и гемоглобин) с последующим масс-спектрометрическим анализом может быть использован для

разработки методов диагностики интоксикации ксенобиотиками алкилирующего, ацетилирующего и фосфонилирующего действий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Твердофазная экстракция и металл-аффинная хроматография являются перспективными методами, для выделения модифицированных пептидов, позволяющими увеличить чувствительность и надежность токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт алкилирует сывороточный альбумин и гемоглобин человека и крысы in vitro и in vivo предпочтительно по свободным тиоловым группам остатков цистеинов. Алкилированные сернистым ипритом аддукты сывороточного альбумина и гемоглобина являются долгоживущими биомаркерами интоксикации.

3. Фосфорорганические отравляющие вещества способны образовывать ковалентные аддукты с остатками тирозина сывороточного альбумина. Основным сайтом связывания для ОВ G-типа является Y-411, в то время как для ОВ V-типа более реакционноспособным является Y-150. Фосфонилированный сывороточный альбумин - перспективный долгоживущий биомаркер экспозиции.

4. Модификацию белков крови лекарственными средствами (на примере ацетилсалициловой кислоты) можно идентифицировать с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии.

Апробация работы

Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, нашли отражение в докладах на: IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 27-28 мая 2010); 10th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 8-11 июля 2010);

Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010); V российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011); II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 14-17 ноября 2011); Семинаре «Успехи современной масс-спектрометрии» (Санкт-Петербург, 12 мая 2011); 11th International Meeting on Cholinesterases (Казань, 4—9 июня 2012); Всероссийском симпозиуме «Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 17 февраля 2012); 11th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 3-5 июня 2013); 38th Federation of European Biochemical Societies Congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013).

Личное участие автора

Автор принимал участие в планировании, и выполнении исследований, проводил регистрацию масс-спектров и принимал участие в анализе, обобщении и оформлении полученных данных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в научных рецензируемых журналах и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы. Она изложена на 121 страницах и включает 47 рисунка, 9 таблиц и 113 наименование списка используемой литературы.

Заключение диссертации по теме «Токсикология», Дубровский, Ярослав Александрович

7. ВЫВОДЫ

1. Масс-спектрометрический анализ модификаций сывороточного альбумина и гемоглобина, как основных белков крови, является перспективным подходом для ретроспективного токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт модифицирует сывороточный альбумин человека и крысы по С-34. Глобин крысы алкилируется по Е-27 в альфа-субъединице и С-93, С-126 в бета-субъединице, и глобин человека по С-93 в бета-субъединице. Аддукты сернистого иприта с сывороточным альбумином и гемоглобином были выявлены до 7 суток после интоксикации. Метод металл-аффинной хроматографии на ионах Cu(II) позволяет концентрировать алкилированные пептиды глобина крысы.

3. Фосфорорганические вещества фосфонилируют сывороточный альбумин человека и крысы по Y-411 для зомана и зарина, и Y-150 для вещества типа Vx (RVX, VR). Аддукт сывороточного альбумина крысы с зоманом выявляли в плазме крови экспонированных дозой 2X0,4 ЛД50 животных до 14 суток после интоксикации, используя комбинацию методов твердофазной экстракции, металл-аффинной хроматографии на сорбентах содержащих Ti(IV) и МАЛДИ масс-спектрометрии.

4. Ацетилсалициловая кислота приводит к ацетилированию остатков лизина сывороточного альбумина и гемоглобина человека и крысы. При инкубации цельной крови человека с ацетилсалициловой кислотой в концентрации 100 мкг/мл определяются ацетилированные лизины: К-17 и К-57 в бета-субъединице глобина человека.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные подходы позволят значительно усилить доказательную базу и надежность ретроспективного токсикологического анализа при отравлении различными ксенобиотиками.

В отношении идентификации ФОВ Организация по запрещению химического оружия (ОЗХО) рекомендует определение в биопробах как их свободных метаболитов, так и аддуктов с белками. Ковалентные аддукты белков крови с другими опасными химикатами, например цианидами [113], являются долгоживущими и надежными биомаркерами интоксикации, а разработка методов идентификации нестандартных посттрансляционных модификаций белков крови является актуальным направлением в ретроспективном анализе факта интоксикации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дубровский, Ярослав Александрович, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Франке 3. Химия отравляющих веществ / 3. Франке. - Т.1: Пер. с нем. - М.: Химия, 1973.-440 с.

2. Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита / С.А. Куценко. - СПб: Издательство ФОЛИАНТ, 2004. - 526 с.

3. Suzuki. Drugs and Poisons in Humans. A Handbook of Practical Analysis / O. Suzuki, K. Watanabe. - Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2005. - 672 p.

4. Ellman, G. L. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Jr Andres, and R. M. Feather-Stone // J. Biochemical Pharmacology. - 1961. - V.7. - P. 88-95.

5. Подольская Е.П., Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе / Е.П. Подольская, В.Н. Бабаков // Научное приборостроение. - 2008. - т. 4. - №18. С. 5-12.

6. Carol-Visser, J. Development of an automated on-line pepsin digestion-LC- tandem MS configuration for the rapid analysis of protein adducts of chemical warfare agent / J. Carol-Visser, M. van der Schans, A. Fibber, A.G. Hulst // J. of chromatography B. -2008.-V.870.-P. 91-97.

7. Marsillach, J. Biomarkers of organophosphorus (OP) exposures in humans / J. Marsillach, R. J. Richter, J. H. Kim, R.C. Stevens, M. J. MacCoss, D. Tomazela, M. Suzuki, L. M. Schopfer, O. Lockridge, С. E. Furlong // J. Neurotoxicology. - 2011 -V. 32.-P. 656-660.

8. Li, H. Aging pathways for organophosphate-inhibited human butyrylcholinesterase, including novel pathways for isomalathion, resolved by mass spectrometry / H. Li, L.M. Schopfer, F. Nachon, M.T. Froment, P. Masson, O. Lockridge // J. Toxicological Sciences. - 2007. - V. 100. - P. 136-145.

9. Worek, F. Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes / F. Worek, H. Thiermann, L. Szinicz, P. Eyer // J. Biochemical Pharmacology. - 2004 - V. 68. - P. 2237-2248.

10. Aurbek, N. Analysis of inhibition, reactivation and aging kinetics of highly toxic organophosphorus compounds with human and pig acetylcholinesterase / N. Aurbek, H. Thiermann, L. Szinicz, P. Eyer, F. Worek // J. Toxicology. - 2006. - V. 224. - P. 91-99.

11. Read, R.W.Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinesterase and phosphylated albumin after oxime therapy / R.W. Read, J.R. Riches, J.A. Stevens, S.J. Stubbs, R.M. Black // J. Archives of Toxicology. - 2010. - V.84. - P. 25-36.

12. Casida, J.E. Serine hydrolase targets of organophosphorus toxicants / J.E. Casida, G.B. Quistad // J. Chemico-Biological Interactions. - 2005. -V. 157-158. - P. 277-283.

13. Bakry, N.M. Direct actions of organophosphate anticholinesterases on nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors / N.M. Bakry, A.H. El-Rashidy, A.T. Eldefrawi, M.E. Eldefrawi // J. Biochemical Toxicology. - 1988. - V. 3. - P. 235-259.

14. Costa, L.G. Current issues in organophosphate toxicology / L.G. Costa// Clinica Chimica Acta. - 2006. - V. 366. - P. 1-13.

15. Grigoryan, H. Covalent binding of the organophosphorus agent FP-biotin to tyrosine in eight proteins that have no active site serine / H. Grigoryan, B. Li, E.K. Anderson, W. Xue, F. Nachon, O. Lockridge, L.M. Schopfer // J. Chemico-Biological Interactions. - 2009. - V. 180. - P. 492^198.

16. Gupta, R. Handbook of toxicology of chemical warfare agents / R.Gupta. Academic, Amsterdam, 2009. - 1168 p.

17. Li, B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry assay for organophosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr411 / B. Li, L.M. Schopfer, S.H. Hinrichs, P. Masson, O. Lockridge // J. Analytical Biochemistry. -2007.-V. 36.-P. 263-272.

18. Ding, S.J. Five tyrosines and two serines in human albumin are labeled by the organophosphorus agent FP-biotin / S.J. Ding, J. Carr, J.E. Carlson, L. Tong, W. Xue, Y. Li, L.M. Schopfer, B. Li, F. Nachon, O. Asojo, C.M. Thompson, S.H. Hinrichs, P.

Masson, O. Lockridge // J. Chemical Research in Toxicology. - 2008. - V. 21. - P. 1787-1794.

19. Li, B. Binding and hydrolysis of soman by human serum albumin / B. Li, F. Nachon, M.T. Froment, L. Verdier, J.C. Debouzy, B. Brasme, E. Gillon, L.M. Schopfer, O. Lockridge, P. Masson // J. Chemical Research in Toxicology. - 2008. -V. 21. - P. 421—431.

20. Manoharan, I. Diisopropylfluorophosphate-sensitive aryl acylamidase activity of fatty acid free human serum albumin / I. Manoharan, R. Boopathy // J. Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2006. - V. 452. - P. 186-188.

21. Sanger, F. Amino-acid sequences in the active centres of certain enzymes / Sanger, F // J. Proceedings of the Chemical Society. - 1963. - V. 5. - P. 76-83.

22. John, H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for detection and identification of albumin phosphylation by organophosphorus pesticides and G- and V-type nerve agents / H. John, F. Breyer, J.O. Thumfart, H. Hochstetter, H. Thiermann // J. Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - V. 398. - P.2677-2691.

23. Gerhard, R. Thiol-modifying phenylarsine oxide inhibits guanine nucleotide binding of Rho but not of Rac GTPases / Gerhard R., John H., Aktories K., Just I. // J. Molecular Pharmacology. - 2003. - V. 63. - P. 1349-1355.

24. John, H. Identification and characterization of novel endogenous proteolytic forms of the human angiogenesis inhibitors restin and endostatin / H. John, K. Radtke, L. Standker, W.G. Forssmann // J. Biochimica et Biophysica Acta. - 2005. - V. 1747. -P. 161-170.

25. John, H. Comparative in vitro degradation of the human hemorphin LW-H7 in mammalian plasma analysed by capillary zone electrophoresis and mass spectrometry / H. John, S. Schulz, W.G. Forssmann // Biopharmaceutics & Drug Disposition. - 2007. -V. 28.-P. 73-85.

26. Elhanany, E. Resolving pathways of interaction of covalent inhibitors with the active site of acetylcholinesterases: MALDI-TOF/MS analysis of various nerve agent

phosphyl adducts / E. Elhanany, A. Ordentlich, O. Dgany, D. Kaplan, Y. Segall, R. Barak, B. Velan, A. Shafferman // J. Chemical Research In Toxicology. - 2001. - V. 14.-P. 912-918.

27. Black, R.M. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site / R.M. Black, J.M. Harrison, R.W. Read // J. Archives of Toxicology. - 1999. - V. 73. - P .123-126.

28. Williams, N.H. Phosphylated tyrosine in albumin as a biomarker of exposure to organophosphorus nerve agents / N.H. Williams, J.M. Harrison, R.W. Read, R.M. Black // J. Archives of Toxicology. - 2007. - V. 81. - P. 627-639.

29. Noort, D.Covalent binding of organophosphorothioates to albumin: a new perspective for OP-pesticide biomonitoring? / D. Noort, A.G. Hulst, A. van Zuylen, E. van Rijssel, M.J. van der Schans // J. Archives of Toxicology. - 2009. - V. 83. - P. 1031-1036.

30. Li, B. Detection of adduct on tyrosine 411 of albumin in humans poisoned by dichlorvos / B. Li, I. Ricordel, L.M. Schopfer, F. Baud, B. Megarbane, F. Nachon, P. Masson, O. Lockridge // J. Toxicological Sciences. - 2010. - V. 116. - P. 23-31.

31. Peeples, ES. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry / ES. Peeples, LM. Schopfer, EG Duysen, R. Spaulding, T. Voelker, CM. Thompson, O. Lockridge // J. Toxicological Sciences. -2005.-V. 83.-P. 303-312.

32. Lockridge, O. Review of tyrosine and lysine as new motifs for organophosphate binding to proteins that have no active site serine / O. Lockridge, L.M. Schopfer // J. Chemico-Biological Interactions. - 2010. - V. 187. - P. 344-348.

33. Schopfer, L.M. Characteristic mass spectral fragments of the organophosphorus agent FP-biotin and FP-biotinylated peptides from trypsin and bovine albumin (Tyr410) / L.M. Schopfer, M.M. Champion, N. Tamblyn, C.M. Thompson, O. Lockridge // J. Analytical Biochemistry. - 2005. - V. 345. - P. 122-132.

34. Wils, E.R.J. Analysis of Thiodiglycol in Urine of Victims of an Alleged Attack with Mustard Gas / E.R.J. Wils, A.G. Hulst, A.L. de Jong, A. Verweij, H.L. Boter // J. Analytical Toxicology. - 1985. - V.9 - P. 254-257.

35. Wils, E.R.J. Analysis of thiodiglycol in urine of victims of an alleged attack with mustard gas, Part II / E.R.J. Wils, A.G. Hulst, J. Van Laar // J. Analytical Toxicology. - 1988.-V. 12.-P. 15-19.

36. Black, R.M. Improved methodology for the detection and quantitation of urinary metabolites of sulphur mustard using gas chromatography-tandem mass spectrometry / R.M. Black, R.W. Read // J. Chromatogr. B. - 1995. - V. 665. - P. 97-105.

37. Boyer, A.E. Quantitation of the sulfur mustard metabolites l,l'-sulfonylbis[2-(methylthio)ethane] and thiodiglycol in urine using isotope-dilution Gas chromatography-tandem mass spectrometry / A.E. Boyer, D. Ash, D.B. Barr, C.L. Young, W.J. Driskell, R.D. Whitehead Jr., M. Ospina, K.E. Preston, A.R. Woolfitt, R.A. Martinez, L.A.P. Silks, J.R. Barr // J. Analytical Toxicology. - 2004. - V. 28. - P. 327-332.

38. Black, R.M. Biological fate of sulphur mustard, l,l'-thiobis(2-chloroethane): isolation and identification of urinary metabolites following intraperitoneal administration to rat / R.M. Black, K. Brewster, R.J. Clarke, J.L. Hambrook, J.M. Harrison, D.J. Howells // J. Xenobiotica. - 1992. - V. 22. - P. 405-418.

39. Roberts, J.J. Studies of the mode of action of alkylating agents-VI The metabolism of bis-2-chloroethylsulphide (mustard gas) and related compounds/ J.J. Roberts, G.P. Warwick // J. Biochemical Pharmacology. - 1963. - V. 12. - P. 1329-1334.

40. Davison, C. Metabolism of bis-beta-chloroethyl sulfide (sulfur mustard gas) / C. Davison, R.S. Rozman, P.K. Smith // Biochemical Pharmacology. - 1961. - V. 7. - P. 65-74.

41. Black, R.M. Biological fate of sulphur mustard, l,l'-thiobis(2-chloroethane): identification of beta-lyase metabolites and hydrolysis products in human urine / R.M. Black, R.W. Read // J. Xenobiotica. - 1995. - V. 25 - P. 167-173.

42. Noort, D. Biomonitoring of exposure to chemical warfare agents: a review / D. Noort, H.P. Benschop and R.M. Black // J. Toxicology and Applied Pharmacology. -2002.-V. 184.-P. 116-126.

43. Tornqvist, M. Protein adducts: quantitative and qualitative aspects of their formation, analysis and applications / M. Tornqvist, C. Fred, J. Haglund, H. Helleberg, B. Paulsson and P. Rydberg // J. Chromatography B. - 2002. - V. 778. - P. 279-308.

44. Boogaard, P.J. Use of haemoglobin adducts in exposure monitoring and risk assessment / P.J. Boogaard // J. Chromatography B. - 2002. - V. 778. - P. 309-322.

45. Brookes, P. The reaction of mustard gas with nucleic acids in vitro and in vivo / P. Brookes, P.D Lawley. // Biochemical J. - 1960. - V. 77. - P. 478-484.

46. Fidder, A. Synthesis, characterization and quantitation of the major adducts formed between sulfur mustard and DNA of calf thymus and human blood / A. Fidder, G.W.H. Moes, A.G. Scheffer, G.P. Van der Schans, R.A. Baan, L.P.A. De Jong and H.P. Benschop // J. Chemical Research in Toxicology. - 1994. - V. 7. - P. 199-204.

47. Fidder, A. N7-(2-Hydroxyethyl-thioethyl)-guanine: a novel urinary metabolite following exposure to sulfur mustard / A. Fidder, D. Noort, L.P.A. De Jong, H.P. Benschop and A.G. Hulst // J. Archives of Toxicology. - 1996. - V. 70. - P. 854-855.

48. Rao, M.K. A facile methodology for the synthesis and detection of N7-guanine adduct of sulfur mustard as a biomarker / M.K. Rao, P.S. Bhadbury, M. Sharma, R.S. Dangi, A.S.B. Bhaskar, S.K. Raza and O.K. Jaiswal // Canadian Journal of Chemistry. -2002. - V. 80.-P. 504-509.

49. Hambrook, J.L. Biological fate of sulfur mustard (l,l'-Thiobis(2-chloroethane)): uptake, distribution and retention of 35S in skin and in blood after cutaneous application of 35S-sulfur mustard in rat and comparison with human blood in vitro / J.L. Hambrook, D.J. Howells and C. Schock // J. Xenobiotica - 1993. - V. 23. - P. 537-561.

50. Wheeler, G.P. Studies related to the mechanisms of action of cytotoxic alkylating agent: a review / G.P. Wheeler // J. Cancer Research. - 1962. - V. 22. - P. 651-688.

51. Noort, D. Characterization of sulfur mustard induced structural modifications in human hemoglobin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry / D. Noort, E.R. Verheij, A.G. Hulst, L.P.A. De Jong and H.P. Benschop // J. Chemical Research in Toxicol. - 1996. - V. 9. - P. 781-787.

52. Black, R.M. Biological fate of sulphur mustard: in vitro alkylation of human haemoglobin by sulphur mustard / R.M. Black, J.M. Harrison and R.W. Read // J. Xenobiotica. - 1997. - V. 27. - P. 11-32.

53. Noort, D. Synthesis and mass spectrometric identification of the major amino acid adduct formed between sulfur mustard and hemoglobin in human blood / D. Noort, A.G. Hulst, H.C. Trap, L.P.A. De Jong and H.P. Benschop // Archives of Toxicology.

- 1997.-V. 71.-P. 171-178.

54. Price, E.G. MALDI-TOF/MS as a diagnostic tool for the confirmation of sulfur mustard exposure / E.G. Price, J.R. Smith, C.R. Clark, J.J. Schlager and M.L. Shih // J. Applied Toxicology. - 2002. - V. 20. - P. 193-197.

55. Noort, D. Alkylation of human serum albumin by sulfur mustard in vitro and in vivo: mass spectrometric analysis of a cysteine adduct as a sensitive biomarker of exposure / D. Noort, A.G. Hulst, L.P.A. De Jong and H.P. Benschop // J. Chemical Research in Toxicology. - 1999. -V. 12. - P. 715-721.

56. Bechtold, W.E. Biological markers of exposure to benzene: S-phenylcysteine in albumin / W.E. Bechtold, J.K. Willis, J.D. Sun, W.C. Griffith and T.V Reddy // J. Carcinogenesis. - 1992. - V. 13. - P. 1217-1220.

57. Noort, D. Covalent binding of nitrogen mustards to the cysteine-34 residue in human serum albumin / D. Noort, A.G. Hulst and R. Jansen // Archives in Toxicology.

- 2002. - V. 76.-P. 83-88.

58. Korte, W.D.Monitoring sulfur mustard exposure by the GC-MS analysis of thiodiglycol cleaved from blood proteins' / W.D. Korte, J.R. Smith, B.R. Capacio, M. DeLion and D.R. Anderson // U.S. Army medical research and material command, Proceedings of the 2002 Bioscience Review, Hunt Valley, MD, 269.

59. Van der Schans, G.P. Immunochemical detection of sulfur mustard adducts with keratins in the stratum corneum of human skin / G.P. Van der Schans, D. Noort, R.H. Mars-Groenendijk, A. Fidder, L.F. Chau, L.P.A. De Jong and H.P. Benschop // Chemical Research in Toxicology. - 2003. -V. 15. - P. 21-25.

60. Shimokawa, T. Prostaglandin endoperoxide synthase. The aspirin acetylation region / T. Shimokawa, WL. Smith // J. Biological Chemistry. - 1992. - V. 267 - P. 12387-12392.

61. Dimitrios, G. Simultaneous Determination of Acetylsalicylic Acid and Its Major Metabolites in Human Serum by Second-derivative Synchronous Fluorescence Spectrometry / G. Dimitrios, D.G. Konstantianos, C. Pinelopi loannou. // J. Analyst. -1992.-V. 111.-P. 877-882.

62. Mullangi, R. Review of HPLC methods and HPLC methods with mass spectrometric detection for direct determination of aspirin with its metabolite(s) in various biological matrices / R. Mullangi , K. Sharma , NR. Srinivas // Biomedical Chromatography. - 2012. - V. 26. - P. 906-941.

63. Zaugg, S. Determination of salicylate, gentisic acid and salicyluric acid in human urine by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection / S. Zaugg, X. Zhang, J. Sweedler, W. Thormann // Journal of Chromatography B. - 2001. - V. 752.-P. 17-31.

64. Nieder, M. Determination of acetylsalicylic acid and salicylic acid in blood and plasma by HPLC / M. Nieder and H. Jaeger // Journal of High Resolution Chromatography. - 1983. - V. 6. - P. 655-660.

65. McMahon, G. Determination of aspirin and salicylic acid in human plasma by column-switching liquid chromatography using online solid-phase extraction / McMahon G. and Kelly MT. // J. Analytical Chemistry. - 1998. - V. 70. - P. 409-414.

66. Lacey, D. Aspirin revealed: A cationization strategy for detecting acetylsalicylic acid by MALDI mass spectrometry / D. Lacey, X.K. Hu, A.V. Loboda, N.J. Mosey, R.H. Lipson // International Journal of Mass Spectrometry. - 2007. - V. 261. - P. 192— 198.

67. Pasekova, H. Potentiometric determination of acetylsalicylic acid by sequential injection analysis (SIA) using a tubular salicylate-selective electrode / H. Pasekova, M.G. Sales, M.C. Montenegro, A.N. Araujo, M. Polasek // J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2001. -V. 24. - P. 1027-1036.

68 Goyal, R.N. Electrochemical sensor for the simultaneous determination of caffeine and aspirin in human urine samples / R.N. Goyal, S. Bishnoi, B. Agrawal // J. Electroanalytical Chemistry. - 2011. - V. 655. - P. 97-102

69. Junior, L.R. Determination of salicylate in blood serum using an amperometric biosensor based on salicylate hydroxylase immobilized in a polypyrrole-glutaraldehyde matrix / L.R. Junior, G. Neto, J.R. Fernandes, L.T. Kubota // J. Talanta. - 2000. - V. 51. - P. 547-557.

70. Konstantianos, D.G. Simultaneous determination of acetylsalicylic and salicylic acids in human serum and aspirin formulations by second-derivative synchronous fluorescence spectrometry / D.G. Konstantianos, P.C. Ioannou, C.E. Efstathiou // J. Analyst. - 1991,-V. 116.-P. 373-378.

71. Snezana, S. Quantitative Analysis of Acetylsalicylic Acid in Commercial Pharmaceutical Formulations and Human Control Serum Using Kinetic Spectrophotometry / S.M. Snezana, Z. M. Gordana, A.N. Pavlovic // Acta chim. Slov. -2008. - V. 55.-P. 508-515.

72. Polagani, S.R. High performance liquid chromatography mass spectrometric method for the simultaneous quantification of pravastatin and aspirin in human plasma: Pharmacokinetic application / S.R. Polagani, N.R. Pilli, V. Gandu // J. Pharmaceutical Analysis. - 2012. - V. 2. - P. 206-213.

73. Hawkins, D. Acetylation of human serum albumin by acetylsalicylic acid / D. Hawkins, R.N. Pinckard, R.S. Farr // J. Science. - 1968. - V. 160. - P. 780-781.

74. Hawkins, D. Structural changes in human serum albumin induced by ingestion of acetylsalicylic acid / D. Hawkins, R.N. Pinckard, I.P. Crawford, R.S. Farr // J. Clinical Investigation. - 1969. - V. 48. - P. 536-542.

75. Walker, J.E. Lysine residue 199 of human serum albumin is modified by acetylsalicyclic acid / J.E. Walker // FEBS Lett. - 1976. - V. 66. - P. 173-175.

76. Liyasova, M.S. Reaction of human albumin with aspirin in vitro: Mass spectrometric identification of acetylated lysines 199, 402, 519, and 545 / M.S. Liyasova , L.M. Schopfer , O. Lockridge // J. Biochemical Pharmacology. - 2010. - V. 79.-P. 784-791.

77. Yamamoto, E. Sensitive determination of aspirin and its metabolites in plasma by LC-UV using on-line solid-phase extraction with methycellulose-immobilized anionexchange restricted access media / E. Yamamoto, S. Takakuwa, T. Kato and N. Asakawa // J. Chromatography B. - 2007. - V. 846. - P. 132-138.

78. Abu-Qare, A. A validated HPLC method for the determination of pyridostigmine bromide, acetaminophen, acetyl salicylic acid and caffeine in rat plasma and urine / A. Abu-Qare and M.B. Abou-Donia // J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2001.-V. 26.-P. 939-947.

79. Pirola, R. Determination of acetylsalicylic acid and salicylic acid in skin and plasma by high-performance liquid chromatography / R. Pirola, S.R. Bareggi and G. De Benedittis // J. Chromatography B. - 1998. - V. 705. - P. 309-315.

80. Kees, F. Simultaneous determination of acetyl salicylic acid and salicylic acid in human plasma by highperformance liquid chromatography / F. Kees, D. Jehnich and H. Grobecker // J. Chromatography B. - 1996. - V. 677. - P. 172-177.

81. Krivosikova, Z A highly sensitive HPLC method for the simultaneous determination of acetylsalicylic, salicylic and salicyluric acids in biologic fluids: pharmacokinetic, metabolic and monitoring implications / Z. Krivosikova, V. Spustova and R. Dzurik // J. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. - 1996.-V. 18.-P. 527-532.

82. Klimes, J. Simultaneous highperformance liquid chromatographic determination of salicylates in whole blood, plasma and isolated erythrocytes / J. Klimes, J. Sochor, M. Zahradnicek and J. Sedlacek // J. Chromatography. - 1992. - V. 584. - P. 221-228.

83. Shen, J. A sensitive assay for aspirin and its metabolites using reversed-phase ion-pair highperformance liquid chromatography / J. Shen, S. Wanwimolruk, C.R. Clark and M.S. Roberts // J. Liquid Chromatography. - 1990. - V. 13. - P. 751-761.

84. Gaspari, F. Determination of aspirin and salicylic acid in uremic patient's plasma using reversed-phase high-performance liquid chromatography / F. Gaspari and M. Locatelli // J. Therapeutic Drug Monitoring. - 1987. - V. 9. - P. 243-247.

85. Bridges, K.R. The acetylation of hemoglobin by aspirin In vitro and in vivo / K.R. Bridges, G.J. Schmidt, M. Jensen, A. Cerami, H.F. Bunn // J. Clinical Investigation. -1975.-V. 56.-P. 201-207.

86. Xu, A.S. Aspirin acetylation of beta Lys-82 of human hemoglobin. NMR study of acetylated hemoglobin / A.S. Xu, Y. Ohba, L. Vida, R.J. Labotka, R.E. London, J. Tsurumai. // J. Biochemical Pharmacology. - 2000. - V. 60. - P. 917-922.

87. Porath, J. Metalchelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage // J. Nature. - 1975. - V. 258.-P. 598-599.

88. Кельциева, O.A. Металл-аффинная хроматография. Основы и применение / O.A. Кельциева, В.Д. Гладилович, Е.П. Подольская // Научное приборостроения. -2013.-Т. 23.-№ 1.-С. 74-85

89. Каныиин, Е.Д. Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков / Е.Д. Каныпин, И.Э. Нифантьев, A.B. Пшеженцкий // Масс-спектрометрия. -2009. - Т. 6. - № 2. - С. 103-120.

90. Leitner, A. Phosphopeptide enrichment using metal oxide affinity chromatography / A. Leitner // J. Trends in Analytical Chemistry. - 2010. - V. 29. - P. 177-185.

91. Block, H. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review / H. Block, B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J. Labahn, F. Schäfer // J. Methods in Enzymology. - 2009. - V. 463. - P. 439-473.

92. Kweon, H.K. Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis / H.K. Kweon, K. Hakansson // J. Analytical. Chemistry. - 2006. - V. 78. - P. 1743-1749.

93. Li, Y. Highly selective and rapid enrichment of phosphorylated peptides using gallium oxide-coated magnetic microspheres for MALDI-TOF-MS and nano-LC-ESI-MS/MS/MS analysis / Y. Li, H. Lin, C. Deng, P. Yang, X. Zhang // J. Proteomics. -2008.-V. 8.-P. 238-249.

94. Lee, A. Enrichment of phosphopeptides using bare magnetic particles / A. Lee, H.-J. Yang, E.-S. Lim, J. Kim, Y. Kim // Rapid Communications in Mass Spectrometry. -2008.-V. 22.-P. 2561-2564.

95. Qi, D. Development of core-shell structure Fe304@Ta205 microspheres for selective enrichment of phosphopeptides for mass spectrometry analysis / D. Qi, J. Lu, C. Deng, X. Zhang // J. Chromatography A. - 2009. - V. 1216. - P. 5533-5539.

96. Jensen, S.S. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques S.S. Jensen, M.R. Larsen // J. Rapid Communications in Mass Spectrometry. - 2007. - V. 21. - P. 3635-3645.

97. Гладилович, В.Д. Идентификация пептидов сывороточного альбумина, модифицированных фосфорорганическими соединениями, с применением методов хроматографии и масс-спектрометрии / В.Д. Гладилович, И.А. Краснов, Е.П. Подольская, Я.А. Дубровский, Н.Г. Войтенко, С.В. Фиронов, В.Н. Бабаков, Н.В. Гончаров, Н.В. Краснов // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20. - № 4. - С. 84-92.

98. Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biopolymers / F. Hillenkamp, M. Karas // J. Analytical Chemistry. - 1991. - V. 63. -P. 1193A-1202A.

99. Karas, M. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors / M. Karas, M. Gltickmann and J. Schefer // J. Mass Spectrometry. - 2000. -V. 35.-P.1-12.

100. Knochenmuss, R. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization / R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker and R. Zenobi // J. Mass Spectrometry. - 2000. - V. 35. - P. 1237-1245.

101. Zenobi, R. Ion formation in MALDI mass spectrometry. R. Zenobi and R. Knochenmuss // Mass Spectrometry Reviews. -1998.-V. 17.-P. 337-366.

102. Лебедев, A.T. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. Москва, Бином, 2003. - 496 с.

103. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // J. Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

104. Klose, J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals / J. Klose // J. Humangenetik. - 1975. - V. 26. - P. 231-243.

105. O'Farrell, PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins / P.H. O'Farrell // J. Biological Chemistry. - 1975. - V. 250. - P. 4007-4021.

106. Shevchenko, A. Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels / A. Shevchenko, ON. Jensen, AV. Podtelejnikov, F. Sagliocco, M. Wilm, O. Vorm, P. Mortensen, A. Shevchenko, H. Boucherie, M. Mann // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - V. 93. - P. 14440-14445.

107. Краснов, И. А. Разработка методик и систем ввода наноколичеств образцов в масс-спектрометр для решения задач поиска и идентификации адцуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином: дис. ... канд. тех. наук: 01.04.01, 02.00.02 / Краснов Илья Александрович. - СПб., 2010.- 120 с.

108. Noort, D. Alkylation of human serum albumin by sulfur mustard in vitro and in vivo: mass spectrometric analysis of a cystein adduct as a sensitive biomarker of exposure / D. Noort, A.G. Hulst, L.P.A. De Jong, H.P. Benschtop // Chemical Research in Toxicology. - 1999. - V. 12. - P. 715-721.

109. Noort, D. Covalent binding of nitrogen mustards to the cysteine-34 residue in human serum albumin / D. Noort, A.G. Hulst, R. Jansen // Archives of Toxicology. -2002.-V. 76.-P. 83-88.

110. Price, E.O. MALDI-ToF/MS as a diagnostic tool for the confirmation of sulfur mustard exposure / E.O. Price, J.R. Smith, C.R. Clark , J.J. Schlager, M.L. Shih // J. Applied Toxicology. - 2000. -V. 20. - Suppl. 1. - P. 193-197.

111. Benschtop, H.P. Diagnosis and dosimetry of exposure to sulfur mustard: development of standard operating procedures; further exploratory research of protein adducts / H.P. Benschtop, D. Noort, G.P. Van der Schans, L.P.A. De Jong // Final report cooperative agreement DAMD 17-97-2-7002. NTIS number: ADA381035/XAB (2000).

112. Baselt, R. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man / R. Baselt - 8th edition. Biomedical Publications. Foster City. CA, 2008. - 1720 p.

113. Fasco, M.J. Cyanide adducts with human plasma proteins: albumin as a potential exposure surrogate / M.J. Fasco, C.R. Iii, Stack RF, C. O'hehir, J.R. Barr, G.A. Eadon // J. Chemical Research in Toxicology. - 2007. - V. 20. - P. 677-684.