Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Бабурина, Юлия Леонидовна

• Бабурина, Юлия Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бабурина, Юлия Леонидовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза.

1.1.1. Молекулярная структура и физико-химические свойства СИР.

1.1.2. Субстраты и факторы, влияющие на ферментативную активность СЫР.

1.1.3. Взаимодействие с белками и нуклеиновыми кислотами.

1.1.4. Пост-трансляционная модификация СИР.

1.1.5. Локализация С№ в олигодендроцитах.

1.1.6. Роль СЫР в патогенезе заболеваний нервной системы.

1.1.7. Локализация С№ вне нервной системы.

1.2. Структура и функции митохондрий.

1.3. Неспецифическая кальций-индуцируемая, циклоспорин А-чувствительная пора внутренней мембраны Мх (РТР).

1.4. Регуляция митохондриальных функций.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Химические препараты и биологические объекты, использовавшиеся в экспериментах.

2.2. Выделение митохондрий из мозга крыс.

2.3. Выделение митохондрий из клеток, а также печени и сердца крыс.

2.4. Выделение Мх из олигодендроцитов, а также культур клеток глиомы С6.

2.5. Определение белка по Лоури.

2.6. Фосфорилирование митохондриальных белков.

2.7. Измерение величины трансмембранного потенциала и транспорта Са" в митохондриях.

2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.9. Метод очистки 46 кДа фосфобелка.

2Л L Метод Blue Native электрофореза в нативных условиях.

2.12. Определение набухания митохондрий мозга.

2.13. Определение выхода цитохрома с и CNP.

2.14. Определение активности CNP.

2.15. Электронная микроскопия изолированных митохондрий.

2.16. Трансфекция олигодендроцитов.

2.17. Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Выделение, очистка и идентификация 46 кДа фосфобелка в митохондриях.

3.2. Влияние субстратов CNP на функционирование Са -индуцируемой и CsA-чувствительной поры.

3.3. Определение активности CNP.

3.4. Исследование влияния снижения экспрессии CNP в клетках олигодендроцитов на активностьи и пороговую концентрацию Са2+.

3.5. Ассоциация CNP с Функциональными Комплексами митохондрий (IV).

3.6. Выход CNP из митохондрий.

3.7. Роль CNP в митохондриях при старении.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс»

Актуальность проблемы.

В настоящее время установлено, что митохондрии участвуют в клеточной гибели и играют ключевую роль в выживаемости клеток мозга. Обнаружено, что программируемая гибель нейронов и других клеток мозга происходит как при остром (ишемия, травма, инфекции ЦНС) ,так и при хроническом (Болезнь Альцгеймера, Паркинсона, старение) повреждении мозга. Последние сведения о молекулярных механизмах, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний, указывают на непосредственное вовлечение в эти процессы митохондриальных путей апоптоза.

Так как формирование неселективной поры в результате увеличения проницаемости внутренней мембраны (Permeability Transition Pore — РТР), считается начальной стадией апоптоза, то полагают, что функционирование неселективной поры может инициировать гибель нейрональных клеток. Структурное формирование митохондриальной поры индуцируется ионами кальция и происходит после накопления в матриксе митохондрий пороговых концентраций кальция, инициирующих падение мембранного потенциала, набухание митохондрий и выход про-апоптических белков. В результате этих событий запускается целый каскад реакций, вызывающих апоптоз. Аналогичные процессы могут происходить в митохондриях и в ответ на окислительный стресс. Поэтому инициация функционирования поры считается одной из ключевых стадий развития программируемой гибели клеток. Несмотря на многолетние исследования, к настоящему моменту не установлены ни точный состав поры, ни механизм регуляции ее функционирования.

До недавнего времени считалось, что пора формируется из потенциал-зависимого анионного канала (VDAC) и 18 кДа белка (белок-транслокатор, TSPO) внешней мембраны, транслоказы адениновых нуклеотидов (ANT) внутренней мембраны и циклофилина D матрикса. А регуляция осуществляется гексокиназой, креатинкиназой и белками семейства Вс12. Однако эксперименты, выполненные на мышах с выключенными генами VDAC и ANT, показали, что эти два белка не входят в структуру поры, но до сих пор считаются основными его модуляторами (Kokoszka, 2004, Baines, 2007). Поскольку точный состав поры не установлен до настоящего времени, представляется актуальным не только исследование структуры РТР, но и механизма ее регуляции.

С точки зрения механизма регуляции поры наиболее важным представляется возможное вовлечение в этот процесс реакции фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков, поскольку этот вид посттрансляционной модификации является самым мощным механизмом регуляции многих функций в клетке.

Предыдущие исследования, проводимые в нашей лаборатории, выявили спектр митохондриальных фосфобелков с молекулярной массой в 65-67 кДа, 43-46 кДа и 3.5 кДа, изменение статуса фосфорилирования которых коррелировало с индукцией открытия РТР в митохондриях (Azarashvili, 1999, 2002, 2003). На основании этих результатов было сделано предположение, что механизм фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков является одним из возможных путей регуляции функционирования поры. Данное предположение подтверждается тем фактом, что VDAC, TSPO и ANT фосфорилируются протеинкиназой /V и тирозиновой протеинкиназой, обнаружены также фосфорилированные формы регуляторных белков РТР таких, как Bcl-2, Bid, Bad, Вах семейства и каспаз, участвующие в апоптозе. Однако, ранее из спектра обнаруженных фосфобелков была идентифицирована только субъединица с F0F|-ATPa3bi, уровень фосфорилирования которой снижался в присутствии пороговых концентраций Ca2* (Азарашвили, 2002). Наибольший интерес представляло обнаруженное увеличение включения меченного фосфата в белки с молекулярной массой 46 кДа. Фосфорилирование этого белка зависело от кальция и изменялось в присутствия циклоспорина А, поэтому он рассматривался нами как пороспецифичный. В связи с этим, следует упомянуть работы С. Папа и др. (Papa, 2000), которые показали, что 43 кДа фосфобелок, обнаруженный в митохондриях сердца, изменяет уровень фосфорилирования в присутствии сАМР, а также взаимодействует с Функциональными Комплексами митохондрий. Кроме того, методом конфокальной микроскопии в клетках олигодендроцитов и других глиальных клетках была обнаружена ассоциация 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP) с митохондриями. Было установлено, что CNP обладает аминокислотной последовательностью, направляющей ее к митохондриям для ассоциации с ними (Lee, 2002).

В связи с этим, идентификация 46 кДа белка в митохондриях, как нового компонента/регулятора РТР представлялась важной и актуальной.

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным была сформулирована цель настоящей работы - идентификация 46 кДа фосфобелка как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP), его локализация и функции в митохондриях крыс.

Согласно поставленной цели, были сформулированы задачи исследования:

1. Идентифицировать фосфобелок 46 кДа в митохондриях мозга методом двумерного электрофореза с последующим проведением масс-спектрометрии и western blot анализа (иммуноблот) с использованием специфических антител, выработанных к CNP.

2. Выяснить присутствие CNP в митохондриях, изолированных из разных тканей и клеток и выявить локализацию CNP внутри митохондрий.

3. Исследовать влияние субстратов CNP (2',3,-сАМР и 2',3'

О-*. cNADP) на параметры открытия РТР (Са~ -индуцированный выход Са~ , изменение мембранного потенциала и набухание) и установить корреляцию активности фосфодиэстеразы с функционированием РТР.

4. Исследовать влияние пониженной экспрессии СЫР на активность фосфодиэстеразы и параметры открытия РТР в митохондриях, изолированных из трансфецированных и нетрансфецированных клеток олигодендроцитов.

5. Изучить способность СЫР к ассоциации с Функциональными Комплексами (1-У) в митохондриях и выяснить влияние 2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАБР на ассоциацию С1ЧР с Комплексами в контрольных условиях и в присутствии пороговых концентраций Са2+, инициирующих открытие РТР.

6. Выявить возможный выход СЫР из митохондрий мозга в присутствии пороговых концентраций кальция и в присутствии субстратов СЫР.

Научная новизна.

В рамках выполнения диссертации впервые был идентифицирован фосфобелок с молекулярной массой 46 кДа как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (СЫР, ЕС 3.1.4.37). Обнаружено, что СЫР присутствует в митохондриях, изолированных из мозга, печени, сердца крыс, а также клеток олигодендроцитов и глиомы Сб. В митохондриях она локализуется в мембранных фракциях. Впервые получены данные, показывающие, что субстраты СЫР (2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАОР) в низких микромолярных концентрациях являются индукторами открытия РТР. Ферментативная активность СЫР в митохондриях мозга, нагруженных кальцием, уменьшается. Снижение экспрессии СИР в культуре клеток олигодендроцитов приводит к уменьшению активности фосфодиэстеазы в митохондриях, изолированных из трансфецированных клеток и снижению пороговых концентраций кальция в них. Установлено, что во внутренней мембране митохондрий СЫР может ассоциироваться с функциональными Комплексами митохондрий (1-У), и это взаимодействие регулируется 2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАОР. Впервые проведено сравнительное исследование содержания и активности СЫР в митохондриях, изолированных из животных разного возраста.

Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков митохондрий мозга и корреляции между уровнем их фосфорилирования и индукцией • неселективной митохондриальной поры указывает на существование нового механизма регуляции РТР. Обнаруженная стимуляция открытия РТР циклонуклеотидами - субстратами СИР дает возможность рассматривать белок как возможный регулятор поры. Так как функционирование РТР рассматривают как начальную стадию, инициирующую апоптоз, полученные данные позволяют выявить новые возможные механизмы регуляции клеточной гибели, вовлечение СЫР в процессы нейропротекции и противоопухолевые механизмы.

Связь СКР с Комплексами внутренней митохондриальной мембраны позволяет предположить ее участие в функционировании митохондриальной дыхательной цепи, а также в деградации РНК и биосинтезе белка в митохондриях и связанных с ними митохондриальных болезнях.

Обнаруженные изменения уровня и активности фермента в митохондриях при старении, указывает на его роль в возраст-зависимых процессах, что, возможно, будет способствовать пониманию механизма старения.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Бабурина, Юлия Леонидовна

выводы

1. Фосфобелок 46 кДа в митохондриях мозга был идентифицирован как 2',3'-циклонуклеотид фосфодиэстераза.

2. Установлено, что CNP присутствует не только в мх мозга, но и в митохондриях, изолированных из сердца, печени, поджелудочной железы крыс, а также клеток линии глиома С6 и< локализована в мембранных фракциях митохондрий.

3. Обнаружено, что циклические нуклеотиды (2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP), являющиеся субстратами CNP, ускоряют открытие РТР, снижая пороговую концентрацию кальция, увеличивая скорость выхода Са2+ из митохондрий, а также стимулируя набухание. Выявлено, что фосфодиэстеразная активность CNP в митохондриях мозга крыс снижается в присутствии пороговых концентраций кальция, т.е. в условиях открытой поры.

4. Показано, что снижение экспрессии CNP в культуре олигодендроцитов приводит к уменьшению уровня CNP в митохондриях, изолированных из трансфецированных клеток, снижению фосфодиэстеразной активности в этих митохондриях, уменьшению пороговой концентрации кальция и ускорению открытия поры

5. Показано, что CNP может быть ассоциирована с Функциональными Комплексами митохондрий. Ассоциация/диссоциация CNP с Комплексами I, III и V может быть механизмом регуляции функций митохондрий и зависит от пороговой концентрации кальция, циклических нуклеотидов и CsA.

6. Показано, что выход CNP увеличивается при открытии РТР, а также в присутствии ее субстратов.

7. Исходя из полученных результатов, предложена схема участия CNP в функционировании митохондриальной неспецифической поры.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бабурина, Юлия Леонидовна, 2011 год

1. Adams,C.W., Davison A.N., Gregson N.A., 1963. Enzyme inactivity of myelin: histochemical and biochemical evidence. J. Neurochem. 10, 383395.

2. Agrawal,H.C., Sprinkle,T.J., Agrawal,D., 1990. 2',3'cyclic nucleotide-3'-phosphodiesterase in peripheral nerve myelin is phosphorylated by a phorbol ester-sensitive protein kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 817-823.

3. Anderson,B.M., Kahn,D.W., Anderson,C.D., 1985. Studies of the 2':3'-cyclic nucleotide phosphodiesterase of Haemophilus influenzae. J. Gen. Microbiol. 131,2041-2045.

4. Azarashvili,T., Krestinina,0., Odinokova,!., Evtodienko,Y., Reiser,G., 2003. Physiological Ca2+ level and Ca2+-induced Permeability Transition Pore control protein phosphorylation in rat brain mitochondria. Cell Calcium 34, 253-259.

5. Baines,C.P., Kaiser,R.A., Sheiko,T., Craigen,W.J., Molkentin,J.D., 2007. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat. Cell Biol. 9, 550-555.

6. Basso,E., Petronilli,V., Forte,M.A., Bernardi,P., 2008. Phosphate is essential for inhibition of the mitochondrial permeability transition pore by cyclosporin A and by cyclophilin D ablation. J. Biol. Chem. 283, 2630726311.

7. Beatrice,M.C., Palmer,J.W., Pfeiffer,D.R., 1980. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria. J. Biol. Chem. 255, 8663-8671.

8. Bera,A.K., Ghosh,S., Das,S., 1995. Mitochondrial VDAC can be phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 213-217.

9. Bera.A.K., Ghosh,S., 2001. Dual mode of gating of voltage-dependent anion channel as revealed by phosphorylation. J. Struct. Biol. 135, 67-72.

10. Beutner,G., Ruck,A., Riede,B., Welte,W., Brdiczka,D., 1996. Complexes between kinases, mitochondrial porin and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability transition pore. FEBS Lett. 396 , 189-195.

11. Bifulco,M., Laezza,C., Stingo,S., Wolff,J., 2002. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: a membrane-bound, microtubule-associated protein and membrane anchor for tubulin. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 99, 18071812.

12. Bostwick,D.G., 1992. Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN): current concepts. J. Cell Biochem. Suppl 16H, 10-19.

13. Braun,P.E., De,A.D., Shtybel,W.W., Bernier,L., 1991. Isoprenoid modification permits 2',3-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase to bind to membranes. J. Neurosci. Res. 30, 540-544.

14. Brdiczka,D., Beutner,G., Ruck,A., Dolder,M., Wallimann,T., 1998. The molecular structure of mitochondrial contact sites. Their role in regulation of energy metabolism and permeability transition. Biofactors 8, 235-242.

15. Broekemeier,K.M., Dempsey,M.E., Pfeiffer,D.R., 1989. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. J. Biol. Chem. 264, 7826-7830.

16. Chalmers,S., Nicholls,D.G., 2003. The relationship between free and total calcium concentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J. Biol. Chem. 278, 19062-19070.

17. Cho,S.J., Jung,J.S., Shin,S.C., Jin,I., Ko,B.H., Kim,K.Y., Suh-Kim,H., Moon,I.S., 2003. Nonspecific association of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase with the rat forebrain postsynaptic density fraction. Exp. Mol. Med. 35,486-493.

18. Crompton,M., Ellinger,H., Costi,A., 1988. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem. J. 255, 357-360.

19. Domanska-Janik,K., Bourre,J.M., 1987. Effect of mercury on rabbit myelin CNP-ase in vitro. Neurotoxicology 8, 23-32.

20. Douglas,A.J., Thompson,R.J., 1993. Structure of the myelin membrane enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: evidence for two human mRNAs. Biochem. Soc. Trans. 21, 295-297.

21. Dreiling,C.E., Schilling,R.J., Reitz,R.C., 1981. 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase in rat liver mitochondrial membranes. Biochim. Biophys. Acta 640, 114-120.

22. Gillespie,C.S., Bernier,L., Brophy,P.J., Colman,D.R., 1990. Biosynthesis of the myelin 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterases. J. Neurochem. 54, 656-661.

23. Giulian,D., Iwanij,V., Dean,G., Drummond,R.J., 1983. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase within the vertebrate retina. Brain Res. 265,217-225.

24. Gravel,M., DeAngelis,D., Braun,P.E., 1994. Molecular cloning and characterization of rat brain 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase isoform 2. J. Neurosci. Res. 38, 243-247.

25. Gravel,M., Robert,F., Kottis,V., GallouziJ.E., PeIletier,J., Braun,P.E., 2009. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: a novel RN4-binding protein that inhibits protein synthesis. J. Neurosci. Res. 87, 1069-1079.

26. Guha,A., Moore,S., 1975. Solubilization of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase from bovine brain without detergents. Brain Res. 89, 279-286.

27. Halestrap,A.P., Brenner,C., 2003. The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore and key player in cell death. Curr. Med. Chem. 10, 1507-1525.

28. Hansford,R.G., 1994. Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport. J. Bioenerg. Biomembr. 26, 495-508.

29. Haworth,R.A., Hunter,D.R., 2000. Control of the mitochondrial permeability transition pore by high-affinity ADP binding at the ADP/ATP translocase in permeabilized mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 32, 9196.

30. Heaton,P.A., Eckstein,F., 1996. Diastereomeric specificity of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. Nucleic Acids Res. 24, 850-853.

31. Hofmann,A., Zdanov,A., Genschik,P., Ruvinov,S., Filipowicz,W., \Vlodavver,A., 2000. Structure and mechanism of activity of the cyclic phosphodiesterase of Appr>p, a product of the tRNA splicing reaction. EMBOJ. 19,6207-6217.

32. Jansen,R.P., 1999. RNA-cytoskeletal associations. FASEB J. 13,455-466.

33. Juhaszova,M., Wang,S., Zorov,D.B., Nuss,H.B., Gleichmann,M., Mattson,M.P., Sollott,S.J., 2008. The identity and regulation of the mitochondrial permeability transition pore: where the known meets the unknown. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1123, 197-212.

34. Kato,M., Shirouzu,M., Terada,T., Yamaguchi,H., Murayama,K., Sakai,H., FCuramitsu,S., Yokoyama,S., 2003. Crystal structure of the 2'-5' RNA ligase from Thermus thermophilus HB8. J. Mol. Biol. 329, 903-911.

35. Kier,L.D., Weppelman,R., Ames,B.N., 1977. Resolution and purification of three periplasmic phosphatases of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 130, 399-410.

36. Kim,S.U., McMorris,F.A., Sprinkle,T.J., 1984. Immunofluorescence demonstration of 2':3'-cyclic-nucleotide 3-phosphodiesterase in cultured oligodendrocytes of mouse, rat, calf and human. Brain Res. 300, 195-199.

37. Kim,T., Pfeiffer,S.E., 1999. Myelin glycosphingolipid/cholesterol-enriched microdomains selectively sequester the non-compact myelin proteins CNP and MOG. J. Neurocytol. 28, 281-293.

38. KokoszkaJ.E., Waymire,K.G., Levy,S.E., SlighJ.E., Cai,J., Jones,D.P., MacGregor,G.R., Wallace,D.C., 2004. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. Nature 427, 461-465.

39. Kozlov,G., Lee,J., Elias,D., Gravel,M., Gutierrez,P., Ekiel,I., Braun,P.E., Gehring,K., 2003. Structural evidence that brain cyclic nucleotide phosphodiesterase is a member of the 2H phosphodiesterase superfamily. J. Biol. Chem. 278, 46021-46028.

40. Kroemer,G., ReedJ.C., 2000. Mitochondrial control of cell death. Nat. Med. 6,513-519.

41. Kurihara,T., Nishizawa,Y., Takahashi,Y., 1977. The use of non-aqueous chloroform/methanol extraction for the delipidation of brain with minimal loss of enzyme activities. Biochem. J. 165, 135-140.

42. Kurihara,T„ Nishizawa,Y., Takahashi,Y., Odani,S„ 1981. Chemical, immunological and catalytic properties of 2':3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase purified from brain white matter. Biochem. J. 195, 153157.

43. Kushnareva,Y.E., Haley,L.M., Sokolove,P.M., 1999. The role of low (< or = I mM) phosphate concentrations in regulation of mitochondrial permeability: modulation of matrix free Ca2+ concentration. Arch. Biochem. Biophys. 363, 155-162.

44. Laemmli,U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

45. Laezza,C., Wolff,J., Bifiilco,M., 1997. Identification of a 48-kDa prenyiated protein that associates with microtubules as 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in FRTL-5 cells. FEBS Lett. 413, 260264.

46. Lappe-Siefke,C., Goebbels,S., Gravel,M., Nicksch,E., Lee,J., Braun,P.E., Griffiths,I.R., Nave,K. A., 2003. Disruption of Cnpl uncouples oligodendroglial functions in axonal support and myelination. Nat. Genet. 33,366-374.

47. Lee,J., Gravel,M., Zhang,R., Thibault,P., Braun,P.E., 2005. Process outgrowth in oligodendrocytes is mediated by CNP, a novel microtubule assembly myelin protein. J. Cell Biol. 170, 661-673.

48. Lees,M.B., Samiullah,M., Laursen,R.A., 1984. Structural analogies between myelin basic protein and proteolipid. Prog. Clin. Biol. Res. 146, 257-264.

49. Leung,A.W., Varanyuwatana,P., Halestrap,A.P., 2008. The mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition. J. Biol. Chem. 283, 263 12-26323.

50. Liu,J., Li,H., Papadopoulos,V„ 2003. PAP7, a PBR/PKA-RIalpha-associated protein: a new element in the relay of the hormonal induction of steroidogenesis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 85, 275-283.

51. Lowry O.H., Rosebrough N.L., Farr A.L., Randall R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

52. Mazumder,R., Iyer,L.M., Vasudevan,S., Aravind,L., 2002. Detection of novel members, structure-function analysis and evolutionary classification of the 2H phosphoesterase superfamily. Nucleic Acids Res. 30 , 52295243.

53. McFerran,B., Burgoyne,R., 1997. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase is associated with mitochondria in diverse adrenal cell types. J. Cell Sei. 110 ( Pt 23), 2979-2985.

54. MuIler,H.W., CIapshaw,P.A., Seifert,W., 1981. Two molecular forms of the isolated brain enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. FEBS Lett. 131,37-40.

55. Muller,H.W., 1982. Dissociation of CNPase dimer into catalytically active monomers by 1,4-dithiothreitol and urea. Protein-promoted reassembly. FEBS Lett. 144, 77-80.

56. Nichols,B.J., Denton,R.M., 1995. Towards the molecular basis for the regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Mol. Cell Biochem. 149-150,203-212.

57. Nishizawa,Y., Kurihara,T., Masuda,T., Takahashi,Y., 1985. Immunohistochemical localization of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in adult bovine cerebrum and cerebellum. Neurochem. Res. 10, 1107-1118.

58. Persson,H., Corneliuson,0., 1990. Separation and identification of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase on isoelectric focusing gels. Anal. Biochem. 186,90-94.

59. Peters,A., Rosene,D.L., Moss,M.B., Kemper,T.L., Abraham,C.R., Tigges,J., Albert,M.S., 1996. Neurobiological bases of age-related cognitive decline in the rhesus monkey. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55, 861-874.

60. Rais,I., Karas,M., Schagger,H., 2004. Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification. Proteomics. 4, 2567-2571.

61. Rasband,M.N., Tayler,J., Kaga,Y., Yang,Y., Lappe-Siefke,C., Nave,K.A., Bansal,R., 2005. CNP is required for maintenance of axon-glia interactions at nodes of Ranvier in the CNS. Glia 50, 86-90.

62. Rice JE,L.J., 1997. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach.

63. Sardanelli,A.M., Technikova-Dobrova,Z., Scacco,S.C., Speranza,F., Papa,S., 1995. Characterization of proteins phosphorylated by the cAMP-dependent protein kinase of bovine heart mitochondria. FEBS Lett. 377, 470-474.

64. Schagger,H., von,J.G., 1991. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anai. Biochem. 199, 223-231.

65. Schlaepfer,W.W., 1977. Structural alterations of peripheral nerve induced by the calcium ionophore A23187. Brain Res. 136, 1-9.

66. Shapira,R., Mobley,W.C., Thiele,S.B., Wilhelmi,M.R., Wallace,A., Kibler,R.F„ 1978. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase of rabbit brain by sedimentation in a continuous sucrose gradient. J. Neurochem. 30, 735-744.

67. Shoshan-Barmatz,V., Gincel,D., 2003. The voltage-dependent anion channel: characterization, modulation, and role in mitochondrial function in cell life and death. Cell Biochem. Biophys. 39, 279-292.

68. Sims,N.R., 1990. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55, 698-707.

69. Sinensky,M., 2000. Recent advances in the study of prenylated proteins. Biochim. Biophys. Acta 1484, 93-106.

70. Sloane,J.A., Hinman,J.D., Lubonia,M, Hollander,W., Abraham,C.R., 2003. Age-dependent myelin degeneration and proteolysis of oligodendrocyte proteins is associated with the activation of calpain-1 in the rhesus monkey. J. Neurochem. 84, 157-168.

71. Sogin.D.C., 1976. 2',3'-Cyclic NADP as a substrate for 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase. J. Neurochem. 27, 1333-1337.

72. Sprinkle,T.J., Grimes,M.J., Eller,A.G., 1980. Isolation of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase from human brain. J. Neurochem. 34, 880887.

73. Sprinkle,T.J., Knerr,J.R., 1981. Inhibition of 2',3'-cycIic nucleotide 3'-phosphodiesterase activity from bovine, human and guinea pig brain. Brain Res. 214,455-459.

74. Sprinkle,T J., 1989. 2',3-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase, an oligodendrocyte-Schwann cell and myelin-associated enzyme of the nervous system. Crit Rev. Neurobiol. 4, 235-301.

75. Steenaart,N.A., Shore,G.C., 1997. Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit IV is phosphorylated by an endogenous kinase. FEBS Lett. 415, 294-298.

76. Struglics,A., Fredlund,K.M., Moller,I.M., Allen,J.F., 1998. Two subunits of the F0F1-ATPase are phosphorylated in the inner mitochondrial membrane. Biochcm. Biophys. Res. Commun. 243, 664-668.

77. Struglics,A., Fredlund,K.M., Konstantinov,Y.M., Allen,J.F., MLller,I.M., 2000. Protein phosphorylation/dephosphorylation in the inner membrane of potato tuber mitochondria. FEBS Lett. 475, 213-217.

78. Technikova-Dobrova,Z., Sardanelli,A.M., Papa,S., 1993. Phosphorylation of mitochondrial proteins in bovine heart. Characterization of kinases and substrates. FEBS Lett. 322, 51-55.

79. Technikova-Dobrova,Z., Sardanelli,A.M., Stanca,M.R., Papa,S., 1994. cAMP-dependent protein phosphorylation in mitochondria of bovine heart. FEBS Lett. 350, 187-191.

80. Tyc,K., Kellenberger,C., Filipowicz,W., 1987. Purification and characterization of wheat germ 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 262, 12994-13000.

81. Vogel,U.S., Thompson,R.J., 1988. Molecular structure, localization, and possible functions of the myelin-associated enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. J. Neurochem. 50, 1667-1677.

82. Whitefeld,P.R., Heppel L.A., Markham R., 1955. The enzymic hydrolysis ofribonucleoside-2':3' phosphates. Biochem. J. 60, 15-19.

83. Yin,X., Peterson,J., Gravel,M., Braun,P.E., Trapp,B.D., 1997. CNP overexpression induces aberrant oligodendrocyte membranes and inhibits MBP accumulation and myelin compaction. J. Neurosci. Res. 50, 238-247.

84. Yoshino,J.E., Dinneen,M.P., Sprinkle,T.J., Devries,G.H., 1985. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase on cultured Schwann cells. Brain Res. 325, 199-203.

85. Yu,H., Lee,I., Salomon,A.R., Yu,IC., Huttemann,M., 2008. Mammalian liver cytochrome c is tyrosine-48 phosphorylated in vivo, inhibiting mitochondrial respiration. Biochim. Biophys. Acta 1777, 1066-1071.

86. Yu,W.P., Collarini,E.J., Pringle,N.P., Richardson,W.D., 1994. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron 12, 13531362.

87. Zaid,H., bu-Hamad,S., Israelson,A., Nathan,I., Shoshan-Barmatz,V., 2005. The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death. Cell Death. Differ. 12, 751-760.

88. Zoratti,M., Szabo,I., 1995. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta 1241, 139-176.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

89. С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителю моей работы Азарашвили Тамаре Сергеевне за чуткое отношение, руководство и помощь в работе.

90. Я благодарна моим рецензентам и оппонентам доктору наук Опанасенко Вере Константиновне и профессору, доктору наук Акатову Владимиру Семеновичу за время, уделенное моей работе, и за полезные замечания.