Идентификация и изучение функциональных особенностей новой теломеразы дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Смекалова, Елена Михайловна

• Смекалова, Елена Михайловна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Смекалова, Елена Михайловна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы.

Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез

1.1. Реакционный цикл теломеразы

1.2. Структура теломеразной РНК

1.2.1. Псевдоузел

1.2.2. STE элемент

1.2.3. Н/АСА scaRNA домен

1.3. Биогенез теломеразной РНК

1.3.1. Транскрипция и процессинг

1.3.1.1. в дрожжах

1.3.1.2. в реснитчатых простейших

1.3.1.3. в позвоночных (human)

1.3.2. Локализация и траспорт теломеразной РНК

1.3.2.1. в дрожжах

1.3.2.2. в позвоночных

1.4. Взаимодействие теломеразной РНК с дополнительными белками

1.4.1. в дрожжах

1.4.2. в позвоночных

1.5. Регуляция экспрессии теломеразной РНК человека

1.5.1. Амплификация гена

1.5.2. Регуляция транскрипции

1.5.3. Регуляция с помощью сигнальных путей

1.5.4. Регуляция с помощью механизмов эпигенетики

1.6. Неканонические функции теломеразной РНК

1.7. Заключение

2. Результаты и обсуждение.

49

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и изучение функциональных особенностей новой теломеразы дрожжей»

Введение 49

2.1. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha 51

2.1.1. Идентификация каталитической субъединицы

теломеразы Н. polymorpha (hpTERT) 51

2.1.2. Разработка метода выделения белка hpTERT,

пригодного для структурных и функциональных исследований 51

2.1.3. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha, экспрессированная в Е. coli, обладает ограниченной обратно-транскриптазной активностью в отсутствии теломеразной РНК 55

2.1.4. Димеризация N-концевого домена hpTERT и белка Est3

дрожжей S. cerevisiae 57

2.2. Теломераза Н. polymorpha 61

2.2.1. Детекция теломеразной активности в клетках Н polymorpha 61

2.2.2. Характеристики теломеразы Н. polymorpha 64

2.2.2.1. Способность использовать олигонуклеотиды разной длины 64

2.2.2.2. Процессивность 64

2.2.2.3. Влияние температуры на теломеразную активность 66

2.3. Теломеразная РНК Н. polymorpha 67

2.3.1. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК

биоинформатическими методами 67

2.3.2. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК

биохимическими методами 68

2.3.3. Транскрипция гена - кандидата на роль теломеразной РНК в клетке 70

2.3.4. Нокаут гена hp TER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер 73

2.3.5. Предсказание вторичной структуры гена hp TER 76

2.3.6. Мутационный анализ матричного участка

теломеразной РНК Н. polymorpha 82

2.4. Теломераза Н. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5' конца матричного участка

в реакции обратной транскрипции in vitro 83

2.5. Заключение

90

3. Материалы и методы 94

3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы 94

3.2. Методики, использованные в работе 97

3.2.1. Определение концентрации ДНК в растворе 97

3.2.2. Клонирование гена hpTERT в вектор pUC19 из генома Н. polymorpha 98

3.2.3. Клонирование гена hpTERT в различные экспрессионные системы 98

3.2.4. Выделение и очистка рекомбинантного hpTERT 99

3.2.5. Проверка функциональности очищенного hpTERT в системе in vitro 100

3.2.6. Клонирование N-домена hpTERT в вектор рЕТЗОаТЕУ 100

3.2.7. Получение поликлональных антител против белка hpTERT 100

3.2.7.1. Выработка иммунного ответа у кролика 100

3.2.7.2. Проверка специфичности и эффективности связывания

антител с целевым белком методом Вестери-блот 101

3.2.8. Выделение теломеразы из клеток Н. polymorpha 101

3.2.8.1. Наращивание клеток и получение S100 экстракта 101

3.2.8.2. Определение суммарной концентрации белка в экстракте

с помощью измерения оптической плотности при 235 и 280 нм 103

3.2.8.3. Хроматография 103

3.2.9. Детекция теломеразной активности в системе in vitro 103

3.2.10. Выделение геномной ДНК Н. polymorpha 104

3.2.11. Клонирование области генома Н. polymorpha,

содержащей ген hpTER в вектор pUC 19_hpTER 105

3.2.12. Клонирование гена hpTER в шаттл вектор рКАМ556 105

3.2.13. Мутагенез 106

3.2.14. Нозери-блот анализ 106

3.2.15. Трансформация дрожжей Н. polymorpha 107

3.2.16. Анализ фенотипа полученных штаммов методом разбавлений 108

3.2.17. Анализ фенотипа полученных штаммов методом Саузерн блот 109

3.2.17.1. Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрану 109

3.2.17.2. Приготовление зондов 109

3.2.17.3. Гибридизация мембраны с радиоактивно меченным зондом 109 4. Выводы 111

Список литературы 112

Список сокращений

БСА бычий сывороточный альбумин

кДа Килодальтон

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ 1,4-дитио-0Ь-треитол

DEAE- диэтиламиноэтил-сефароза

сефароза

DEAE- теломераза, выделенная с помощью хроматографии на

фракция ДЭАЭ-сефарозе

н.о. нуклеотидных остатков

п.о. пар оснований

ПААГ Полиакриламидный гель

ПМСФ фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей ПЦР

РНК рибонуклеиновая кислота

мяРНК малая ядерная РНК

мяоРНК малая ядрышковая РНК

ТЕМЕД N,N,N' ,N! -тетраметилэтилендиамид

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

TER Теломеразная РНК

TERT Теломеразная обратная транскриптаза

Tris трис(гидроксиметил)аминометан

SDS додецилсульфат натрия

TMG триметилгуанозиновый кэп

Введение

Теломеры - это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмов; их основная функция состоит в поддержании стабильности генома [1]. ДНК теломер состоит из повторяющихся последовательностей (теломерных повторов). Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс. Основные компоненты теломеразы - теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, ТЕЯТ) и теломеразная РНК (ТЯ), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора на 3' конце хромосомы [2].

Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках - одна из причин старения организма [3]. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом [4,5]. Было показано, что теломераза достоверно активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии [6]. Изучение работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит понять механизм развития многих болезней и разработать новые подходы для их лечения.

1. Обзор литературы. Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез

1.1. Реакционный цикл теломеразы

Теломераза синтезирует длинные последовательности, состоящие из теломерных повторов, используя в качестве матрицы небольшой участок теломеразной РНК. Коровый фермент состоит из двух основных компонентов -теломеразной обратной транскриптазы и теломеразной РНК. Этих слагаемых достаточно для реконструкции теломеразной активности in vitro, тогда как in vivo требуется намного больше факторов для обеспечения работы фермента [7]. Теломераза представляет собой РНК-зависимую ДНК полимеразу, которая осуществляет реакцию обратной транскрипции по собственной РНК.

Каталитический цикл теломеразы включает две фазы: синтез единственного теломерного повтора с 3' конца теломеры и высвобождение матрицы из РНК-ДНК дуплекса для обеспечения возможности синтеза следующего повтора. Последовательный синтез множественных повторов по одной и той же матрице несвойственен обычным полимеразам и требует специализированного механизма для высвобождения матричного участка теломеразной РНК после каждого раунда репликации. Реакция инициируется связыванием 3' конца теломеры в 5' область матрицы с образованием гибридного короткого ДНК/РНК дуплекса, после чего происходит синтез одного теломерного повтора (Рис. 1.1). В случае теломеразы человека происходит обратная транскрипция шести нуклеотидов 5'-GGTTAG-3' [8]. По достижении конца матричного участка синтез нуклеотидов прекращается, а вновь синтезированная ДНК либо транслоцируется в начало матричного участка, либо диссоциирует от фермента. Транслокация представляет собой сложный мультистадийный процесс, точный механизм которого до сих пор неизвестен. Он включает несколько этапов: расплетение ДНК/РНК дуплекса, перемещение и отжиг ДНК в 5' область матрицы. Было показано, что транслокация матрицы происходит за пределами каталитического сайта теломеразы [9]. Присоединение нуклеотидов в рамках одного повтора происходит достаточно быстро, поэтому

скорость лимитирующим фактором является именно процесс транслокации [8Л0].

Теломера ХТмТГ 5' 3'-

тснт

сллисссллис1 ■ ш ■

СТТАЕ

тк

V6'

Синтез

* ♦ ♦ ♦ *

'СААиСССААис-111111

(ИГГЛВ^СТТАС

актнанын сайт

Транслокация

I

слдисс СААЦС 11111

СГТАС^ЙТТДК

I

Репозппио-ннрованне

матрицы

гааiiс с с аа1 *с ■

еТТ«ИбТТАВ

I

Разделение цепей

сла'.сссаат;с

щи

етТАОЗСГТА?

1

Рисунок 1,1. Модель реакционного цикла теломеразы человека [И]. После сборки активного теломеразнйго комплекса, который состоит из каталитически субъединицы теломеразы (ТЕКХ), -щломеразной РНК (ТЯ) и одноцепочечного 3" конца теломеры происходит добавление шести нуклеотидов по матричному участку теломеразной РПК. Освобождение матричного участка для нового акта синтеза происходит в несколько этапов и включает разделение ДНК/РНК гстсродуилекса. репозиционирование матрицы относительно вновь синтезированной ДНК и образование нового гетеродуллекса.

Способность синтезировать несколько повторов без диссоциации от матрицы называют процессивностью теломеразы. эффективность процесса обеспечивается многими факторами [12]. В составе каталитической субъединицы теломеразы содержится несколько Д11К - с вяз ы в а ю щ и х мотивов, которые обеспечивают удерживание теломеры вблизи фермента в процессе транслокации [13-15]. а также мотивы для связывания репозиционироваипого в процессе транслокации ДИК/РНК гибрида [16,17]. Мутации в этих мотивах влияют на процессивность теломеразы. Было показано, что в случае теломеразы

человека комплекс белков РОТ1/ТРР1 также является одним из факторов процессивности [18].

Функции теломеразной РНК не ограничиваются предоставлением матричного участка для синтеза теломерного повтора. Различные элементы сложной структуры молекулы участвуют в каталитической реакции присоединения нуклеотида, формируя каталитический центр фермента наравне с аминокислотами TERT и обуславливая тем самым эффективность добавления нуклеотидов в рамках одного повтора и возможность транслокации, обеспечивают ассоциацию различных белковых факторов и сборку комплекса, играют ключевую роль в процессах транспорта и регуляции теломеразы. Недавно появились факты, подтверждающие наличие у теломеразной РНК функций, не связанных с биогенезом теломеразного комплекса. Данный обзор литературы посвящен структуре и функциям теломеразной РНК, а также различным аспектам ее биогенеза.

1.2. Структура

Теломеразные РНК различных организмов очень сильно отличаются друг от друга по размеру, по нуклеотидной последовательности, по структуре. Так, длина теломеразных РНК реснитчатых простейших составляет от 147 до 205 нуклеотидов, в позвоночных - 312 - 559, в дрожжах - от 779 и достигает 2030 нуклеотидов [19,20]. Сравнительный и филогенетический анализ совместно со структурными исследованиями позволили представить модель вторичной структуры теломеразных РНК реснитчатых и позвоночных (Рис. 1.2 А, Б) [21,22]. Для дрожжевой теломеразной РНК задача оказалась более сложной ввиду большого размера молекулы и эволюционной подвижности теломеразной РНК дрожжей. В совокупности, исследования позволили выявить несколько элементов структуры высшего порядка, консервативных среди теломеразных РНК разных видов. Помимо матричного участка, по которому теломеразная каталитическая субъединица осуществляет синтез теломерной последовательности, все теломеразные РНК содержат элемент, ограничивающий матричный участок с 5' конца (5' template boundary element, или TBE). Также,

можно выделить протяженную петлю, которая включает матричный участок, предполагаемый псевдоузел и заканчивается спиралью [23]. В позвоночных эта структура составляет коровый домен и может быть комбинирована in trans с CR4/CR5 доменом и теломеразной обратной транскриптазой в системе реконструкции теломеразной активности. Считается, что шпилька IV реснитчатых и CR4/CR5 домен теломеразной РНК позвоночных несут одинаковую функцию. Образование псевдоузла и его важность для работы теломеразного комплекса была подтверждена структурными и функциональными исследованиями для теломеразной РНК позвоночных. В то же время, данные мутационного анализа по теломеразе реснитчатых указывают на то, что образование псевдоузла в теломеразной РНК необязательно для функционирования комплекса [24]. В модельной системе S. cerevisiae было показано, что участок, содержащий предполагаемый псевдоузел, связывает TERT. С другой стороны, для этого участка предложена альтернативная вторичная структура, которая включает 2 шпильки. Эти две модели не являются взаимно-исключающими и могут отражать молекулярное переключение структуры, необходимое для регуляции фермента [25]. Функционирование данного участка в качестве молекулярного переключателя между псевдоузлом и шпилькой было предположено и для теломеразной РНК человека на основании структурных исследований [26].

Теломеразная активность может быть реконструирована in vitro из транскрипта TER и рекомбинантной TERT для человека и Tetrahymena, однако до сих пор это не удалось для дрожжевой теломеразы, что значительно затрудняет анализ механизма комплекса и его структурно-функциональные исследования. Значительный шаг в области понимания архитектуры комплекса был сделан Томасом Чеком и сотрудниками, которые показали, что теломеразная активность может быть реконструирована в системе, содержащей Est2 (теломеразная каталитическая субъединица) и «минимальную теломеразную РНК» или мини-Т, которая содержит основные сайты взаимодействия с белками [27]. Создание мини-Т РНК основывалось на мутационном и делеционном анализе, который показал, что большая часть структуры теломеразной РНК дрожжей необязательна для функционирования

комплекса. Коровый домен TLC1 связывает Est2 и соединен спиралями с сайтами связывания Estl, Ku и Sm белков (Рис. 1.2 В). Длина наименьшей мини-Т, которая сохраняла функции теломеразной РНК, составляла 384 нуклеотида (исходная TLC1 содержит 1200 нуклеотидов). В отличие от теломеразы человека или простейших минимальная теломеразная РНК дрожжей, реконструированная in vitro с каталитической субъединицей, была непроцессивна. Нужно отметить, что подобное отсутствие процессивности наблюдается также в случае теломеразы S. cerevisiae дикого типа, выделенной из клеток.

На сегодняшний день не существует достоверной третичной структуры полноразмерной теломеразной РНК, а также теломеразной РНК или ее отдельных участков с белками теломеразного комплекса. Тем не менее, была решена структура ряда отдельных элементов теломеразной РНК, что позволило получить достаточно хорошее представление об архитектуре молекулы. Мы рассмотрим последовательно элементы структуры теломеразных РНК и современное представление об их функционировании. Неудивительно, что основной массив структурных данных относится к теломеразной РНК человека. Однако, данные исследований по филогенетическому сравнению теломеразных РНК, биохимические эксперименты и построение компьютерных моделей позволяют провести параллель со структурой теломеразных РНК других организмов, а также выявить новые закономерности в функционировании молекулы.

Рисунок 1.2. Общие элементы структуры высшего порядка для теломераэнъгх РНК различных организмов [22]. 11редсказания вторичной структуры представлены для теломеразных РНК а) реснитчатых б) позвоночных (Я sapiens) в) дрожжей (S. cerevisiae). Матричный участок. ТВН элемент и псевдоузел отмечены голубым, зеленым и синим цветом соответственно. Красным цветом отмечены мутации, вызывающие болезни. Элементы структуры, использованные при конструировании минм-Т РНК S. cerevisiae, обведены r серую рамку.

1.2.1. Псевдоузел

Псевдоузел, образованный элементами: Р2Ь-РЗ (Рис. 1.3 А), представляет самый консервативный элемент структуры теломеразных РНК. Было показано, что мутации двух нуклеотидов GC107/8 —> AG в шпильке РЗ, присутствующие у больных дискератозом, нарушают телом ераз ну ю активность за счет

дестабилизации псевдоузла [ 22]. Ранние структурные исследования методом ЯМР продемонстрировали существование двух альтернативных структур данного элемента I) псевдоузел, сформированный шпилькой РЗ и Р2Ь 2) шпилька Р2Ь. нестабилизированная дополнительными взаимодействиями. Выло показано, что мутации, ассоциированные с дискератозом, стабилизируют альтернативную копформацию, блокируя формирование псевдоузла, и выключают чел ом срази ую активность. Вместе с тем. удаление консервативного выпетливання в РЗ шпильке, которое ведет к дополнительной стабилизации псевдоузла, также уменьшает теломеразную активность в 2-10 раз. что может говорить о необходимости «дышащей» структуры для функционирования теломеразы [22 j. Несмотря на эти данные, ряд исследований говорят о том. что кон формация псевдоузла - единственно необходимая для теломеразной активности [19.28].

ЯМР-структура была решена для минимального псевдоузла, где выпетленный U177 удален для стабилизации структуры. Она представляет собой компактный псевдоузел II типа с тройной спиралью, образованный между нуклеотидами U109-U122-A104. UÍ10-UI23-A105, Ш11-U124-AI06 [28] (Рис. 1.3 Б). Необходимость образования тройной спирали U-A*U была показана путем сравнения термодинамической стабильности мутированных псевдоузлов и псевдоузлов с компенсаторными мутациями, а также влияния этих структур на теломеразную активность [28], Предсказанные псевдоузлы в реснитчатых меньше, чем в дрожжах или позвоночных, однако анализ 28 последовательностей реснитчатых теломеразпых РНК выявил возможное образование 1-2 тройных взаимодействий нуклеотидов и в них [29].

Методами компьютерного моделирования было показано, что удаление U177 нуклеотида может сильно сказываться на третичных взаимодействиях в псевдоузле. Более того, замена 2'-ОН нуклеотида А176, расположенного перед U177, на 2"-ОМе или 2'-П приводила к уменьшению теломеразной активности в 2 раза, что позволило предположить непосредственное участие гидроксила А1 76 в катализе [30]. Структура псевдоузла дикого тина, содержащего U177 (PK.WT) была смоделирована на основе предыдущих данных по минимальному псевдоузлу (PKDU). а также ЯМР RDCs [31]. Конформация PKDU

стабилизирована дополнительным тройным взаимодействием С112-G178-U103, которое прерывается присутствием U177 в PKWT, Основываясь на полученной структуре, можно сказать, что UI77 лежит над 2'-OII группой пуклеотида Л177 и предположить, что он блокирует доступ к нуклеотиду А177 во время катализа. С другой стороны, анализ динамики U177 методом ilMP (спиновая релаксация) показал, что данный нуклеотид очень подвижен, таким образом, он может служить шарниром для обеспечения большей гибкости пуклеотида А176 и облегчать катализ. Для обоих псевдоузлов анализ плавления выявил значительную стабильность Хугстиновской Ll-А пары между петлями J2b3 и J2a3, Возможно, что эта пара играет решающую роль в формировании пссвдоузла [30].

Рисунок 1.3. Структура корового домена hTR [19J а) последовательность и Вторичная структура псевдоузла, который может быть разделен на 4 субдомсна: Р2а-J2a-P2a. 1 (голубой-еерый-желтьга). P2a-J2a/b-P2b (жедгьтй-зеле и ый-красный). Р2Ь-РЗ псевдоузел (красный-розовый), PI (темно-зеленый), б) ЯМР структура элемента Р2а-J2a/b-P2b (PDB ID 2L3E). Элемент J2a/b образует S-образную петлю, конформация которой обеспечивает минимальный сдвиг между спиралями Р2а и Р2Ь.

Непосредственно за высоко-консервативным Р2Ь-РЗ узлом располагается выпет.чивание J2a/b. которое связывает псевдоузел и шпильку Р2а. Это выпетливание характеризуется низкой консервативностью, за исключением относительно консервативного G с 5' конца (61% в позвоночных, 83% в млекопитающих). Исследования показали, что замена данного выпетливания в теломеразной РНК человека на последовательности! мыши оказывает незначительный эффект па теломеразную активность. Данный результат позволил усомниться в том, чтобы этот элемент играл важную роль в работе теломеразы, с другой стороны, его позиция консерват ивна, а длина теломеразной РНК млекопитающих составляет 5 пуклеотидов. Структура этого элемента вместе с окружающими его нуклеотидами спиралей Р2а и Р2Ь была решена в работе [32]. J2a/b образует изгиб, изменение в направлении сахарофосфатного остова происходит в середине изгиба на нуклеотидс IJ86, что приводит к S-образной конформации J2a/b элемента таким образом, что между спиралями ,12а и J2b практически пет смешения. Подобная структура наблюдается для второго домена IRES вируса гепатита С, Более широкий поиск с неканоническими парами, обрамляющими петлю, выявил еще две последовательности, формирующие аналогичную структуру, также с образованием S-конформации. Таким образом, петля J2a/b представляет редкий структурный мотив. Характеристика динамики данного элемента с использованием методов J-IMP выявила меньшую. по сравнению с ожидаемой, гибкость петли. Систематический мутационный анализ, включающий проверку влияния длины и нуклеотидной последовательности на теломеразную активность, показал важность изгиба и ограниченной подвижности J2ä/b элемента для процесснвности теломеразы [32].

С другой стороны псевдоузла hTR располагается домен P2a.l-J2a.l-P2a, где Р2.1 представляет дополнительный элемент, специфичный для млекопитающих. Биохимические исследования показали, что некоторые иуклеотидные замены в этом участке, в том числе, мутация C27G, встречающаяся у больных с ап ластичной анемией, приводят к уменьшению теломеразной активности [19].

Решить структуру данного элемента с помощью ЯМР анализа не представлялось возможным ввиду высокой подвижности составляющих его пуклеотидов. Для того чтобы получить представление о его копформации использовали данные ЯМР, а также методы компьютерного моделирования. Несмотря на значительные коиформаииоппые изменения J2a. i элемента, общая подвижность между спиралями Р2.1 и Р2а ограничена. Это наблюдение согласуется с данными о том. что нарушение двойной спирали фланкирующей J2a.l шпильки приводит к уменьшению теломеразной активности, а теломеразная РНК других позвоночных, кроме млекопитающих, имеет протяженную Р2а шпильку без J2a. 1 выпетливания.

Структура всего корового домена теломеразной РНК человека была опубликована па основе анализа FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) между флуоресцентно меченными олигопуклеотидами, гибридизующимися к одпоцепочечным участкам теломеразной РНК. С помощью методов молекулярного моделирования были проанализированы расстояния, полученные измерением резонансного переноса энергии и вторичная структура молекулы. В результате сумма данных позволила получить трехмерную модель каталитического домена теломеразной РНК человека с разрешением 6.5-8 Á [33J {Рис. 1.4 А). Одна из основных важных характеристик полученной модели -позиционирование матричного участка рядом с псевдоузлом, и координирование консервативных пуклеотидиых остатков в непосредственной близости друг от друга. Другой подход к решению структуры псевдоузла был продемонстрирован в работе [32], где методы компьютерного моделирования совмещены с анализом данных ЯМР. Различия этих двух полученных моделей относятся к локальным структурным элементам и к взаимной ориентации спиралей, однако обе показывают открытую коиформациго псевдоузла и основной межспиральныГг изгиб, присутствующий в середине .Т2а/Ь выпетливания (Рис. 1.4 Б). Небольшой поворот между Р2а и Р2Ь, обеспечиваемый этим изгибом, координирует консервативный пуклеотид U177 и Т ОН группу пуклеотида А176 па внутреннюю поверхность корового домена в 5' конец матричного участка, где должен находиться активный сайт. Несмотря па то, что сайты связывания TERT

и KOpOBörö домена тел ом ер ä3Hüi PIIK не были идентифицированы, модель Р2/РЗ псевдоузла хорошо вписывается в кристаллическую структуру T14R Г Triboltum castcineum [34,35J. Псевдоузел можно наложить параллельно или перпендикулярно месту стыковки матричного участка, праймера и полости TERT, оба способа наложения моделируют РНК таким образом, что подвижность ,!2а/Ь петли позволит протащить матричный участок через активный сайт в процессе синтеза теломерного повтора.

Б

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Смекалова, Елена Михайловна

выводы

1. Идентифицированы гены каталитической субъединицы теломеразы и теломеразной РНК в дрожжах Н. polymorpha.

2. Разработан метод получения каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha, пригодной для структурных и функциональных исследований. Показано, что в отсутствие полноразмерной теломеразной РНК белок обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

3. N-концевой домен каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha и белок Est3 S. cerevisiae димеризуются in vitro.

4. Охарактеризована теломеразная активность Н. polymorpha. Теломераза Н. polymorpha использует дополнительный нуклеотид (А 170) с 5' конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in vitro, тогда как in vivo результат обратной транскрипции А170 не детектируется.

2.5. Заключение

Для того чтобы идентифицировать теломеразную PIIK И. polymorpha мы использовали сочетание биохимического и б и оинфор магического подходов. Нокаут гена-кандидата на роль теломеразной РНК (hpTER) приводил к предсказанному фенотипу укорачивающихся тело мер. тогда как трансфскция плазмиды. несущей hpTER ген обеспечивала жизнеспособность клеток и восстанавливала теломеразную активность. Мутации в участке гена bpTER. комплементарном теломере приводили к синтезу теломеразой альтернативной последовательности. В совокупности результаты эксперимента подтверждают функционирование гена hpTER в качестве теломеразной РНК Н, polymorpha.

Мы показали, что длина исходного транскрипта составляет 824 нуклеотида. Это достаточно скромный размер по сравнению с другими дрожжевыми теломеразными РНК, длина которых больше 1000 и достигает 1817 нуклеотидов [701. Первичная структура гена íipTER не может быть выравнена с генами теломеразных РНК других дрожжей, что объясняется низкой гомологией данного гена. Тем не менее, можно проследить элементы структуры высшего порядка, характерные для теломеразных РНК: псевдоузел, Estl - связывающую шпильку, TWJ элемент (three-way-junction или трехсторонний узел). Удивительно, но нам не удалось идентифицировать сайт связывания Sm белков, - один из наиболее консервативных элементов первичной структуры теломеразной РНК в дрожжах.

Матричный участок теломеразной РНК Н. polymorpha включает 17 нуклеотидов, полностью комплементарных теломерной последовательности. Мы показали, что нуклеотиды со 178 по 171 используются для синтеза ДНК. В эксперименте с HD1 олигонуклеотидом мы наблюдали обратную транскрипцию 181-179 нуклеотидов, однако эффективность этого процесса значительно ниже. Таким образом, участок в 9 нуклеотидов (181-177) потенциально может служить для начального позиционирования праймера. Известно, что эта область отделена псевдоузлом от остальной молекулы РНК, обычно ее длина не превышает половины теломерного повтора. Размер участка, используемого для отжига хромосомы, играет важную роль в работе теломеразы. В отличие от теломеразной РНК мыши, где длина области позиционирования теломеры составляет 2 нуклеотида, человеческая теломеразная РНК (5 нуклеотидов для отжига праймера) процессивна in vitro [12]. Так же, как и большинство других дрожжевых теломераз, теломераза Н. polymorpha не процессивна in vitro. Возможно, что такой необычно длинный участок отжига праймера обеспечивает гомогенность теломер Н. polymorpha, не характерную для других дрожжей. В данной работе мы проанализировали последовательности теломер Н. polymorpha, полученные из данных по секвенированию штамма DL1-1. Мы детектировали незначительную гетерогенность, которая может быть выражена паттерном 5'-GGGTGGCG3.5T-3', в то время как область матричного участка теломеразной РНК, ответственная за вариабельное количество гуанинов, содержит 4 цитозина. В соответствии с литературными данными этот тип гетерогенности объясняется проскальзыванием фермента по матрице и наблюдается в случае, когда матрица содержит несколько одинаковых нуклеотидов подряд [131].

Мы обнаружили различие в работе теломеразы in vitro и in vivo. Теломераза, выделенная in vitro, использует для синтеза нуклеотид Al 70, расположенный непосредственно с 5' конца от матричного участка, и эффективность этого процесса очень высока. Последовательность нуклеотидов, получаемая в результате работы теломеразы in vitro, выглядит как 5'-GGGTGGCGT-3', в то время как in vivo за паттерном 5'-GGGTGGCG-3' всегда следует «G». В теломеразе процесс обратной транскрипции ограничен с 5' конца РНК-шпилькой (TBE, template boundary element - ограничивающий элемент). Мутации, нарушающие структуру этого элемента, могут привести к обратной транскрипции нетеломерной последовательности за матричным участком теломеразной РНК, нарушениям в использовании РНК матрицы и изменениям в процессивности теломеразы [132-133]. Известно, что С-домен теломеразной обратной транскриптазы стабилизирует матричный граничный элемент, непосредственно взаимодействуя с РНК-шпилькой [133]. Делеции в С-концевом домене hTERT приводили к синтезу последовательности за пределами матричного участка. Эти данные позволяют предположить, что включение нетеломерного нуклеотида теломеразой Н. polymorpha in vitro может быть связано с положением, структурой граничного элемента, либо с его способностью связывать hpTERT. Данное предположение подтверждается анализом мутанта А170С, в котором эффективность присоединения последнего нуклеотида была значительно снижена, а предполагаемая вторичная структура граничного элемента дополнительно стабилизируется взаимодействием С170-G203.

Мы не зафиксировали ни одного случая присутствия тимина после паттерна 5'-GGGTGGCG-3' в теломерах Н. polymorpha, однако, удлинение теломер в штамме, мутантном по теломеразной РНК в позиции А170С позволяет говорить о важности присоединения теломеразой нетеломерного нуклеотида in vivo. Невозможность зафиксировать тимин в искомой позиции может являться следствием действия нуклеазной активности, которая ассоциирована с теломеразой [134]. В таком случае, нуклеазная активность может обеспечивать корректирующую активность и удалять нетеломерный нуклеотид, ее эффективность может быть нарушена в процессе выделения теломеразы. Другое возможное объяснение заключается в том, что включение тимина - это особенность именно непроцессивной формы теломеразы Н. polymorpha. Находясь в процессивном состоянии, теломераза реплицирует теломерную ДНК без включения нетеломерного нуклеотида. Но для того чтобы диссоциировать с теломеры, теломераза переключается в непроцессивное состояние, возможно, что этот процесс сопряжен со структурными изменениями комплекса. В таком случае обратная транскрипция аденина 170 будет происходить только на самом конце теломеры, а детекция этого события может быть затруднена вследствие клеточных процессов или в результате выделения геномной ДНК. В рамках этой гипотезы можно предположить, что добавление нетеломерного нуклеотида служит маркером теломеры, которая только что подверглась удлинению ферментом. В таком случае, теломераза не сможет использовать в качестве субстрата олигонуклеотид, заканчивающийся нетеломерной последовательностью 5'-GGGTGGCGT-3', что мы и наблюдали в эксперименте in vitro.

3. Материалы и методы

3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

- NaCl, NaOAc, Na2HP04, КН2Р04, KCl, КОАс, MgCl2, Mg(OAc)2, СаС12, MnCl2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, H3B03, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, кеиленцианол, бромистый этидий, глицерин фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;

- SDS, акриламид, ]Ч,1Ч'-метиленбисакриамид, 1,4-дитиотреитол (DTT), Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия;

- Д-глюкоза, 2-меркаптоэтанол, К,Ы,К',>Г-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), РНазин, насыщенный ТЕ фенол, рибонуклеаза А фирмы Helicon, Россия

- уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон фирмы Химмед, Россия;

- водонасыщенный фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия;

- этанол фирмы Ферейн, Россия;

- аминокислоты: лейцин, триптофан, гистидин, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин; сахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза А фирмы Sigma, Германия;

- полиэтиленгликоль 4000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия;

- бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США;

- легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия;

- [a-32P]dGTP, [у-32Р]АТР фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США;

- олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол и ДНК синтез, Россия;

- Литиказа фирмы Seikagatu, Япония;

- стрептавидин-сефароза (Streptavidin Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США;

- диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) (DE-52) фирмы Whatman BioSystems Ltd, США;

- Ni-NTA агароза, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Qiagen, Еермания;

- мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, фирмы Amersham-Pharmacia Biotech, США;

- набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Еермания;

- фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta, Еермания;

- 20 мл центриконы фирмы Sartorius, США;

- ДНКаза I (DNase I, RNase-free), Т4 ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа Т4, эндонуклеазы рестрикции и фирменные буферные растворы к ним фирм MBI Fermentas, Литва и Roche, Франция;

- штамм Н. polymorphe DL 1-1 был любезно предоставлен Михаилом Агафоновым (Москва);

- плазмида pET30aTEV была любезно предоставлена Даниелой Родэс, Кэмридж, Великобритания.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Смекалова, Елена Михайловна, 2012 год

Список литературы

1. Greider, C.W., Blackburn, E.H., The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. II Cell, 1987, 51(6), 887-98.

2. Blackburn, E.H., The end of the (DNA) line. II Nat Struct Biol, 2000, 7(10), 847-850.

3. Martin, G.M., The biology of aging: 1985-2010 and beyond. // FASEB J, 2011, 25(11), 375662.

4. Walne, A.J., Dokal, I., Advances in the understanding of dyskeratosis congenita. II Br J Haematol, 2009,145(2), 164-72.

5. Robart, A.R., Collins, K., Investigation of human telomerase holoenzyme assembly, activity, andprocessivity using disease-linked subunit variants. II J Biol Chem, 2010, 285 (7), 437586.

6. Donate, L.E., Blasco, M.A., Telomeres in cancer and aging. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2011, 366(1561), 76-84.

7. Shcherbakova, D.M., Zvereva, M.E., Shpanchenko, O.V., Dontsova, O.A., Telomerase: structure and properties of the enzyme, characteristics of the yeast telomerase. II Mol Biol (Mosk), 2006, 40(4), 580-94.

8. Morin, G.B., The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. I I Cell, 1989, 59(3), 521.

9. Qi, X., Xie, M., Brown, A.F., Podlevsky, J.D., Chen, J.J., RNA/DNA hybrid binding affinity determines telomerase template-translocation efficiency // EMBO J, 2011, 31(1), 150-61.

10. Greider, C.V., Telomerase isprocessive. II Mol Cell Biol, 1991,11(9), 4572-80.

11. Podlevsky, J.D., Chen, J.J., It all comes together at the ends: Telomerase structure, function, and biogenesis. //Mutat Res, 2012, 730(1-2), 3-11.

12. Chen, J.L., Greider, C.V., Determinants in mammalian telomerase RNA that mediate enzyme processivity and cross-species incompatibility. II EMBO J, 2003, 22(2), 304-14.

13. Jacobs, S.A., Podell, E.R., Cech, T.R., Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. II Nat Struct Mol Biol, 2006, 13(3), 218-25.

14. Zaug, A.J., Podell, E.R., Cech, T.R., Mutation in TERT separates processivity from anchor-site function. II Nat Struct Mol Biol, 2008,15(8), 870-2.

15. Wyatt, H.D., Lobb, D.A., Beattie, T.L., Characterization of physical and functional anchor site interactions in human telomerase. I I Mol Cell Biol, 2007, 27(8), 3226-40.

16. Xie, P., A modified model for translocation events of processive nucleotide and repeat additions by the recombinant telomerase. H Biophys Chem, 2010,153(1), 83-96.

17. Lue, N.F., Lin, Y.C., Mian, I.S., A conserved telomerase motif within the catalytic domain of telomerase reverse transcriptase is specifically required for repeat addition processivity. II Mol Cell Biol, 2003, 23(23), 8440-9.

18. Latrick, C.M., Cech, T.R., POT1-TPP1 enhances telomerase processivity by slowing primer dissociation and aiding translocation. I I EMBO J, 2010, 29(5), 924-33.

19

20

21

22

23.

24,

25,

26,

27,

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

Zhang, Q., Kim, N-K., Feigon, J., Architecture of human telomerase RNA. II Proc Natl Acad Sci, 2011,108(51), 20325-32.

Dandjinou, A. T., Levesque, N., Larose, S., Lucier, J.-F., Elela, S.A., Wellinger, R.J. A phylogenetically based secondary structure for the yeast telomerase RNA II Curr Biol, 2004, 14(13), 1148-58.

Chen, J.L., Blasco, M.A., Greider, C.W., Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. //Cell, 2000,100(5), 503-514.

Theimer, C.A., Feigon, J., Structure and function of telomerase RNA. II Curr Opin Struct Biol, 2006,16(3),307-18.

Wyatt, H.D., West, S.C., Beattie, T.L., InTERTpreting telomerase structure and function II Nucleic Acids Res, 2010, 38(17), 5609-22.

Cunningham, D.D., Collins, K., Biological and biochemical functions of RNA in the tetrahymena telomerase holoenzyme II Mol Cell Biol, 2005, 25(11), 4442-54. Tzfati, Y., Knight, Z., Roy, J., Blackburn, E.H., A novel pseudoknot element is essential for the action of a yeast telomerase II Genes Dev, 2003,17(14), 1779-88.

Comolli, L.R., Smirnov, I., Xu, L.F., Blackburn, E.H., James, T.L., A molecular switch underlies a human telomerase disease. I I Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(26), 16998-17003. Zappulla, D.C., Cech, T.R., Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. II Proc Natl Acad Sci, 2004,101(27), 10024-9.

Theimer, C.A., Blois, C.A., Feigon, J., Structure of the human telomerase RNA pseudoknot reveals conserved tertiary interactions essential for function. II Mol Cell, 2005, 17(5), 67182.

Ulyanov, N.B., Shefer, K., James, T.L., Tzfati, Y., Pseudoknot structures with conserved base triples in telomerase RNAs of ciliates II Nuclei Acids Res, 2007, 35(17), 6150-60. Qiao, F., Cech, T.R., Triple-helix structure in telomerase RNA contributes to catalysis. // Nat Struct Mol Biol, 2008,15(6), 634-40.

Kim, N.K., Zhang, Q., Zhou, J., Theimer, C.A., Peterson, R.D., Feigon, J., Solution structure and dynamics of the wild-type pseudoknot of human telomerase RNA. I I J Mol Biol, 2008, 384(5), 1249-61.

Zhang, Q., Kim, N.K., Peterson, R.D., Wang, Z., Feigon, J., Structurally conserved five nucleotide bulge determines the overall topology of the core domain of human telomerase RNA. //ProcNatl Acad Sci, 2010,107(44), 18761-8.

Gavory, G., Symmons, M.F., Krishnan, Ghosh Y., Klenerman, D., Balasubramanian, S., Structural analysis of the catalytic core of human telomerase RNA by FRET and molecular modeling II Biochemistry, 2006, 45(44), 13304-11.

Gillis, A.J., Schuller, A.P., Skordalakes, E., Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. //Nature, 2008, 455(7213), 633-7.

35

36

37

38

39

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., SkordalaJkes, E., Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. II Nat Struct Mol Biol, 2010,17(4), 513-8.

Brown, Y., Abraham, M., Pearl, S., Kabaha, M.M., Elboher, E., Tzfati, Y., A critical three-way junction is conserved in budding yeast and vertebrate telomerase RNAs. I I Nucleic Acids Res, 2007, 35(18), 6280-9.

Gunisova, S., Elboher, E., Nosek, J., Gorkovoy, V., Brown, Y., Lucier, J.-F., Laterreur, N., Wellinger, R.J., Tzfati, Y., Tomaska, L., Identification and comparative analysis of telomerase RNAs from Candida species reveal conservation of functional elements II RNA, 2009,15(4), 546-59.

Robart, A.R., O'Connor, C.M., Collins, K., Ciliate telomerase RNA loop IV nucleotides promote hierarchical RNP assembly and holoenzyme stability. II RNA, 2010,16(3), 563-71. Leeper, T.C., Varani, G., The structure of an enzyme-activating fragment of human telomerase RNA. I I RNA, 2005,11(4), 394-403.

Leeper, T., Leilliot, N., Varani, G., The solution structure of an essential stem-loop of human telomerase RNA. //Nucleic Acids Res, 2003, 31(10), 2614-21.

Kim, N.K., Theimer, C.A., Mitchell, J.R., Collins, K., Feigon, J., Effect of pseudouridylation on the structure and activity of the catalytically essential P6.1 hairpin in human telomerase RNA. II Nucleic Acids Res, 2010, 38(19), 6746-56.

Kiss, T., Favet, E., Jady, B.E., Richard, P., Weber, M., Biogenesis and intranuclear trafficking of human box C/D and H/ACA RNPs. II Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2006, 71,407-17.

Egan, E.D., Collins, K., Specificity and stoichiometry of subunit interactions in the human telomerase holoenzyme assembled in vivo. II Mol Cell Biol, 2010, 30(11), 2775-86. Ganot, P., Caizergues-Ferrer, M., Kiss, T., The family of box ACA small nucleolar RNAs is defined by an evolutionarily conserved secondary structure and ubiquitous sequence elements essential for RNA accumulation. // Genes Dev, 1997,11(7), 941-56. Dez, C., Henras, A., Faucon, B., Lafontain, D., Caizergues-Ferrer, M., Henry, Y., Stable expression in yeast of the mature form of human telomerase RNA depends on its association with the box H/ACA small nucleolar RNP proteins Cbf5p, Nhp2p and NoplOp II Nucleic Acids Res, 2001, 29(3), 598-603.

Theimer, C.A., Jady, B.E., Chim, N., Richard, P., Breece, K.E., Kiss, T., Feigon, J., Structural and functional characterization of human telomerase RNA processing and cajal body localization signals// Mol Cell, 2007, 27(6), 869-81.

Chapon, C., Cech, T.R., Zaug, A. J., Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast. II RNA, 1997, 3(11), 1337-51.

Seto, A.G., Zaug, A.J., Sobei, S.G., Wolin, S.L., Cech, T.R., Saccharomyces cerevisiae telomerase is an Sm small nuclear ribonucleoprotein particle H Nature, 1999, 401(6749), 898.

49

50

51

52

53

54

55,

56

57.

58,

59.

60.

61.

62.

63,

64.

65.

66.

Khusial, P., Plaag, R., Zieve, G.W., LSm proteins form heptamerie rings that bind to RNA via repeating motifs. H Trends Biochem Sei, 2005,30(9), 522-8.

Leonardi, J., Box, J.A., Bunch, J.T., Baumann, P., TER I, the RNA subunit offission yeast telomerase. //Nat Struct Mol Biol, 2008,15(1), 26-33.

Wilusz, J.E., Spector, D.L., An unexpected ending: noncanonical 3' end processing mechanisms. II RNA, 2010, 16(2), 259-66.

Box, J.A., Bunch, J.T., Tang, W., Baumann, P., Spliceosomal cleavage generates the 3' end of telomerase RNA. //Nature, 2008, 456(7224), 910-4.

Jamonnak, N., Creamer, T.J., Darby, M.M., Schaughency, P., Wheelan, S.J., Corden, J.L., Yeast Nrdl, Nab3, and Senl transcriptome-wide binding maps suggest multiple roles in post-transcriptional RNA processing. II RNA, 2011, 17(11), 2011-25.

Greider, C.W., Blackburn, E.H., A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. //Nature, 1989, 337(6205), 331-7. Lingner, J., Hendrick, L.L., Cech, T.R., Telomerase RNAs of different ciliates have a common secondary structure and a permuted template I I Genes Dev, 1994, 8(16), 1984-98. Witkin, K.L., Collins, K., Holoenzyme proteins required for the physiological assembly and activity of telomerase. II Genes Dev, 2004, 18(10), 1107-18.

Aigner, S., Lingner, J., Goodrich, K.L., Grosshans, C.A., Shevchenko, A., Mann, M., Cech, T.R., Euplotes telomerase contains an La motif protein produced by apparent translational frameshifting II EMBO J, 2000,19(22), 6230-9.

Aigner, S., Postberg, J., Lipps, H.J., Cech, T.R., The Euplotes La motif protein p43 has properties of a telomerase-specific subunit. II Biochemistry, 2003, 42(19), 5736-47. O'Connor, C.M., Collins, K., A novel RNA binding domain in tetrahymena telomerase p65 initiates hierarchical assembly of telomerase holoenzyme. II Mol Cell Biol, 2006, 26(6), 2029-36.

Witkin, K.L., Prathapam, R., Collins, K., Positive and negative regulation of Tetrahymena telomerase holoenzyme. 11 Mol Cell Biol, 2007, 27(6), 2074-83.

Gallardo, F., Chartrand, P., Telomerase biogenesis: The long road before getting to the end. II RNA Biol, 2008, 5(4), 212-5.

Mitchell, J.R., Cheng, J., Collins, K., A box H/ACA small nucleolar RNA-like domain at the

human telomerase RNA 3' end. II Mol Cell Biol, 1999,19(1), 567-76.

Collins, K., Mitchell, J.R., Telomerase in the human organism. II Oncogene, 2002, 21(4),

564-79.

Li, S., Blackburn, E.H., Expression and suppression of human telomerase RNA. II Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2006, 71, 211-216.

Jady, B.E., Richard, P., Bertran, E., Kiss, T., Cell cycle-dependent recruitment of telomerase RNA and Cajal bodies to human telomeres. II Mol Biol Cell, 2006,17(2), 944-54. Fu, D., Collins, K., Distinct biogenesis pathways for human telomerase RNA and H/ACA small nucleolar RNAs. //Mol Cell, 2003,11(5), 1361-72.

67

68

69

70

71

72

73.

74,

75,

76,

77,

78,

79.

80.

81.

Kim, M.M., Rivera, M.A., Botchkina, I.L., Shalaby, R., Thor, A., Blackburn, E.H., A low threshold level of expression of mutant-template telomerase RNA inhibits human tumor cell proliferation II Proc Natl Acad Sci, 2001, 98(14), 7982-7.

Hug, N., Lingner, J., Telomere length homeostasis. II Chromosoma, 2006,115(6), 413-25. Takata, H., Tanaka, Y., Matsuura, A., Late S phase-specific recruitment of Mrell complex triggers hierarchical assembly of telomere replication proteins in Saccharomyces cerevisiae. II Mol Cell, 2005,17(4), 573-83.

Gallardo, F., Laterreur, N., Cusanelli, E., Quenzar, F., Querido, E., Wellinger, R.J., Chartrand, P., Live cell imaging of telomerase RNA dynamics reveals cell cycle-dependent clustering of telomerase at elongating telomeres // Mol Cell, 2011, 44(5), 819-27. Gallardo, F., Olivier, C., Dandjinou, A.T., Wellinger, R.J., Chartrand, P., TLC1 RNA nucleo-cytoplasmic trafficking links telomerase biogenesis to its recruitment to telomeres. // EMBO J, 2008, 27(5), 748-57.

Ferrezuelo, F., Steiner, B., Aldea, M., Futcher, B., Biogenesis of yeast telomerase depends on the importin mtrlO. II Mol Cell Biol, 2002, 22(17), 6046-55.

Stellwagen, A.E., Haimberger, Z.W., Veatch, J.R., Gottschling, D.E., Ku interacts with telomerase RNA to promote telomere addition at native and broken chromosome ends. // Genes Dev, 2003,17(19), 2384-95.

Tomlinson, R.L., Ziegler, T.D., Supakorndej, T., Terns, R.M., Terns, M.P., Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres. II Mol Biol Cell, 2006, 17(2), 95565.

Wright, W.E., Tesmer, V.M., Liao, M.L. Shay, J.W., Normal human telomeres are not late replicating. II Exp Cell Res, 1999,251(2), 492-9.

Cristofari, G., Adolf, E., Reichenbach, P., Sikora, K., Terns, R.M., Lingner, J. Human telomerase RNA accumulation in Cajal bodies facilitates telomerase recruitment to telomeres and telomere elongation. II Mol Cell, 2007, 27(6), 882-9.

Zhu, Y., Tomlinson, R.L., Lukowiak, A.A., Terns, R.M., Terns, M.P., Telomerase RNA accumulates in Cajal bodies in human cancer cells. II Mol Biol Cell, 2004,15(1), 81-90. Tomlinson, R.L., Abreu, E.B., Ziegler, T., Ly, H., Counter, C.M., Terns, R.M., Terns, M.P., Telomerase reverse transcriptase is required for the localization of telomerase RNA to cajal bodies and telomeres in human cancer cells. II Mol Biol Cell, 2008,19(9), 3793-800. Fu, D., Collins, K., Purification of human telomerase complexes identifies factors involved in telomerase biogenesis and telomere length regulation. II Mol Cell, 2007, 28(5), 773-85. Evans, S.K., Lundblad, V., Estl and Cdcl3 as comediators of telomerase access. II Science, 1999, 286(5437), 117-20.

Taggart, A.K., Teng, S.C., Zakian, V.A., Estlp as a cell cycle-regulated activator of telomere-bound telomerase. // Science, 2002, 297(5583), 1023-6.

82

83

84

85

86

87.

88,

89.

90,

91.

92.

93.

94.

95.

96.

Sharanov, Y.S., Zvereva, M.I., Dontsova, O.A., Saccharomyces cerevisiae telomerase subunit Est3p binds DNA and RNA and stimulates unwinding of RNA/DNA heteroduplexes. II FEBS Lett, 2006, 580(19), 4683-90.

Shubernetskaya, O., Logvina, N., Sharanov, Y., Zvereva, M., Yeast telomerase protein Est3 is a novel type of GTPase. II Biochimie, 2011, 93(2), 202-6.

Fu, D., Collins, K., Human telomerase and Cajal body ribonueleoproteins share a unique specificity ofSm protein association. I I Genes Dev, 2006, 20(5), 531-6. Lee, C.L., Hsiao, H.H., Lin, C.W., Wu, S.P., Huang, S.Y., Wu, C.Y., Wang, A.H., Khoo, K.H., Strategic shotgun proteomics approach for efficient construction of an expression map of targeted protein families in hepatoma cell lines. //Proteomics, 2003, 3(12), 2472-86. Ford, L.P., Suh, J.M., Wright, W.E., Shay, J.W., Heterogeneous nuclear ribonueleoproteins CI and C2 associate with the RNA component of human telomerase. 11 Mol Cell Biol, 2000, 20(23), 9084-91.

Wong, J.M., Collins, K., Telomerase RNA level limits telomere maintenance in X-linked dyskeratosis congenita. // Genes Dev, 2006, 20(20), 2848-58.

LaBranche, H., Dupuis, S., Ben-David, Y., Bani, M.R., Wellinger, R.J., Chabot, B., Telomere elongation by hnRNP A J and a derivative that interacts with telomeric repeats and telomerase. II Nat Genet, 1998,19(2), 199-202.

Venteicher, A.S., Artandi, S.E., TCAB1: driving telomerase to Cajal bodies. II Cell Cycle, 2009, 8(9), 1329-31.

Dokal, I., Dyskeratosis congenita. // Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2011, 2011, 480-6.

Cairney, C.J., Keith, W.N., Telomerase redefined: integrated regulation of hTR and hTERT for telomere maintenance and telomerase activity. I I Biochimie, 2008, 90(1), 13-23. Soder, A.I., Going, J.J., Kaye, S.B., Keith, W.N., Tumour specific regulation of telomerase RNA gene expression visualized by in situ hybridization. II Oncogene, 1998,16(8), 979-83. Soder, A.I., Hoare, S.F., Muir, S., Going, J., Parkinson, E.K., Keith, W.N., Amplification, increased dosage and in situ expression of the telomerase RNA gene in human cancer. II Oncogene, 1997,14(9), 1013-21.

Saretzki, G., Petersen, S., Petersen, I., Kolble, K., von Zglinicki, T., hTERT gene dosage correlates with telomerase activity in human lung cancer cell lines. // Cancer Lett., 2002, 176(1), 81-91.

Zhao, J.Q., Hoare, S.F., McFarlane, R., Muir, S., Parkinson, E.K., Black, D.M., Keith, W.N., Cloning and characterization of human and mouse telomerase RNA gene promoter sequences. //Oncogene, 1998,16(10), 1345-50.

Zhao, J., Bilsland, A., Hoare, S.F., Keith, W.N., Involvement of NF-Y and Spl binding sequences in basal transcription of the human telomerase RNA gene. FEBS Lett, 2003, 536(1-3), 111-19.

97. Kyo, S., Takakura, M., Taira, T., Kanaya, T., Itoh, H., Yutsudo, M., Ariga, H., Inoue, M., Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT). //Nucleic Acids Res, 2000, 28(3), 669-77.

98. Zhao, J.Q., Glasspool, R.M., Hoare, S.F., Bilsland, A., Szatmari, I., Keith, W.N., Activation of telomerase rna gene promoter activity by NF-Y, Spl, and the retinoblastoma protein and repression by Sp3. II Neoplasia, 2000, 2(6), 531-39.

99. Johnson-Pais, T., Degnin, C., Thayer, M.J., pRB induces Spl activity by relieving inhibition mediated by MDM2. //ProcNatl Acad Sci, 2001, 98(5), 2211-16.

100. Cong, Y.S., Wright, W.E., Shay, J.M., Human telomerase and its regulation. II Microbiol Mol Biol Rev, 2002, 66(3), 407-25.

101. Bilsland, A.E., Stevenson, K., Atkinson, S., Kolch, W., Keith, W.N., Transcriptional repression of telomerase RNA gene expression by c-Jun-NH2-kinase and Spl/Sp3. II Cancer Res, 2006, 66(3), 1363-70.

102. Anderson, C.J., Hoare, S.F., Ashcroft, M., Bilsland, A.E., Keith, W.N., Hypoxic regulation of telomerase gene expression by transcriptional and post-transcriptional mechanisms II Oncogene, 2006, 25(1), 61-9.

103. Glasspool, R.M., Burns, S., Hoare, S.F., Svensson, C., Keith, W.N., The hTERT and hTERC telomerase gene promoters are activated by the second exon of the adenoviral protein, E1A, identifying the transcriptional corepressor CtBP as a potential repressor of both genes. II Neoplasia, 2005, 7(6), 614-22.

104. Hoare, S.F., Bryce, L.A., Wisman, G.B., Burns, S., Going, J.J., van der Zee, A.G., Keith, W.N., Lack of telomerase RNA gene hTERC expression in alternative lengthening of telomeres cells is associated with methylation of the hTERC promoter II Cancer Res, 2001, 61(1), 27-32.

105. Guilleret, I., Yan, P., Guillou, L., Braunschweig, R., Coindre, J.M., Benhattar, J., The human telomerase RNA gene (hTERC) is regulated during carcinogenesis but is not dependent on DNA methylation.// Carcinogenesis, 2002, 23(12), 2025-30.

106. Serakinci, N., Hoare, S.F., Kassem, M., Atkinson, S.P., Keith, W.N., Telomerase promoter reprogramming and interaction with general transcription factors in the human mesenchymal stem cell. //Regen. Med, 2006,1(1), 125-31.

107. Atkinson, S.P., Hoare, S.F., Glasspool, R.M., Keith, W.N., Lack of telomerase gene expression in alternative lengthening of telomere cells is associated with chromatin remodeling of the hTR and hTERT gene promoters II Cancer Res., 2005, 65(17), 7585-90.

108. Blasco, M.A., Lee, H.W., Hande, M.P., Samper, E., Lansdorp, P.M., DePinho, R., Greider, C.W., Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. II Cell, 1997,91(1), 25-34.

109. Gonzalez-Suarez, E., Samper, E., Flores, J.M., Blasco, M.A., Telomerase-deficient mice with short telomeres are resistant to skin tumorigenesis. 11 Nat Genet, 2000, 26(1), 114-7.

110. Kedde. M., lc Sage. C., Duursma. A., Zlotorynski, E., van Leeuwen, B„ Nijkamp, W.,

Beijersbergen. R.. Agami, R., Telomerase-independent regulation of ATR by human telomerase RNA. // J Biol Chem, 2006, 281(52), 40503-14.

111. Jacobs, S.A., Podell, E.R., Wuttke, D.S., Cech, T.R., Soluble domains of telomerase reverse transcriptase identified by high-throughput screening. H Protein Sci, 2005,14(8), 2051-58.

112. Clemons, W.M.Jr., May, J.L., Wimberly, B.T., McCutcheon, J.P, Capel, M.S., Ramakrishnan,

V., Structure of a bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 A resolution. II Nature, 2000, 400(6747), 833-840.

113. Levine, D.W., Cooney, C.L., Isolation and characterization of a thermotolerant methanol-

utilizingyeast. II Appl Microbiol, 1973, 26(6), 982-990.

114. Eldarov, M.A., Mardanov, A.V., Beletsky, A.V., Ravin, N.V., Skryabin, K.G., Complete

sequence and analysis of the mitochondrial genome of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL-1.1 IFEMS Yeast Res, 2011,11(6), 464-472.

115. Sohn, J.H., Choi, E.S., Kang, H.A., Rhee, J.S., Rhee, S.K., A family of telomere-associated

autonomously replicating sequences and their functions in targeted recombination in Hansenula polymorpha DL-1. //J Bacteriol, 1999,181(3), 1005-13.

116. Sohn, J.H., Choi, E.S., Kim C.H., Agaphonov M.O., Ter-Avanesyan M.D., Rhee, J.S., Rhee,

S.K., A novel autonomously replicating sequence (ARS) for multiple integration in the yeast Hansenula polymorpha DL-1. II J Bacteriol, 1996,178(15), 4420-8.

117. Gellissen, G. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. I I Appl Microbiol

Biotechnol, 2000, 54(6), 741-50.

118. Autexier, C., Lue, N.F., The structure and function of telomerase reverse transcriptase. II

Annu.Rev.Biochem, 2006, 75, 493-517.

119. O'Connor, C.M., Lai, C.K., Collins, K., Two purified domains of telomerase reverse

transcriptase reconstitute sequence-specific interactions with RNA. II J Biol Chem, 2005, 280(17), 17533-9.

120. Lee, S.R., Wong, J.M., Collins, K., Human telomerase reverse transcriptase motifs required

for elongation of a telomeric substrate. IIJ Biol Chem, 2003, 278(52), 52531-6.

121. Moriarty, T.J., Ward, R.J., Tabovski, M.A., Autexier, C., An anchor site-type defect in human

telomerase that disrupts telomere length maintenance and cellular immortalization II Moll Biol Cell, 2005,16(7), 3152-61.

122. Lai, C.K., Miller, M.C., Collins, K., Template boundary definition in Tetrahymena telomerase.

II Genes Dev, 2002,16(4), 415-20.

123. Moriarty, T.J., Huard, S., Dupuis, S., Autexier, C., Functional multimerization of human

telomerase requires an RNA interaction domain in the N terminus of the catalytic subunit II Mol Cell Biol, 2002, 22(4), 1253-65.

124. Zhang, M.L., Tong, X.J., Fu, X.H., Zhou, B.O., Wang, J., Liao, X.H., Li, Q.J., Shen, N„ Ding,

J., Zhou, J.Q., Yeast telomerase subunit Estlp has guanine quadruplex-promoting activity that is requiredfor telomere elongation II Nat Struct Mol Biol, 2010,17(2), 202-9.

125. Schaffitzel, C„ Postberg. J., Paeschke, K., Lipps, H.J.. Probing telomeric G-quadruplex DNA structures in cells with in vitro generated single-chain antibody fragments. // Methods Mol Biol, 2010, 608, 159-81.

126. Bosoy, D., Lue, N.F., Yeast telomerase is capable of limited repeat addition processivity. II Nucleic Acids Res., 2004, 32(1), 93-101.

127. Petrov, A.V., Dokudovskaya, S.S., Sokolov, K.A., Lavrik, O.I., Favre, A., Dontsova, O.A., Bogdanov, A.A., Telomerase from Saccharomyces cerevisiae contains several protein submits and may have different activities depending on the protein content. II FEBS Lett, 1998, 436(1), 35-40.

128. Kachouri-Lafond, R., Dujon, B., Gilson, E., Westhof, E., Fairhead, C., Teixeira, M.T., Large telomerase RNA, telomere length heterogeneity and escape from senescence in Candida glabrata II FEBS Lett, 2009,583(22), 3605-3610.

129. Agaphonov, M.O., Poznyakovski, A.I., Bogdanova, A.I., Ter-Avanesyan, M.D., Isolation and characterization of the LEU2 gene of Hansenula polymorpha. II Yeast, 1994,10(4), 50913.

130. Agaphonov, M., Romanova, N., Choi, E.S., Ter-Avanesyan, M., A novel kanamycin/G418 resistance marker for direct selection of transformants in Escherichia coli and different yeast species. II Yeast, 2010, 27(4), 189-195.

131. Forstemann, K., Lingner, J., Molecular basis for telomere repeat divergence in budding yeast. // Mol Cell Biol, 2001, 21(21), 7277-86.

132. Box, J.A., Bunch, J.T., Zappulla, D.C., Glynn, E.F., Baumann, P., A flexible template boundary element in the RNA subunit of fission yeast telomerase. II JBC, 2008, 283(35), 24224-33.

133. Moriarty, T.J., Marie-Egyptienne, D.T., Autexier, C., Regulation of 5' template usage and incorporation of noncognate nucleotides by human telomerase. II RNA, 2005, 11(9), 144860.

134. Huard, S., Autexier, C., Human telomerase catalyzes nucleolytic primer cleavage. I I Nucleic Acids Res, 2004, 32(7), 4059-70.

135. Walker, J.M., The protein Protocols Handbook: a laboratory manual. II Humana Press, Totowa, New Jersey, 2006.

136. Lundblad, V., Blackburn, E.H., An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues estl- senescence. // Cell, 1993, 73(2), 347-60.

137. Maniatis, T, Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular cloning: a laboratory manual. II Cold Spring Harbor Laboratory, 1992, 387-389.