Гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы в антикандидозной и антимикробной активности нейтрофилов у онкогематологических больных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Никифорова, Зоя Николаевна

• Никифорова, Зоя Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никифорова, Зоя Николаевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, ЕДИНИЦ И

ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Грибковая инфекция в онкологической клинике.

1.2 Нейтрофильные лейкоциты в системе антикандидозной и антимикробной резистентности организма.

1.3 Роль гранулоцитарного (Г - КСФ) и гранулоцитарно - макрофагально-го (ГМ - КСФ) колониестимулирующих факторов в регуляции функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы в антикандидозной и антимикробной активности нейтрофилов у онкогематологических больных»

Актуальность темы Инфекционные осложнения, в том числе микозы - одна из причин смертности у онкологических больных с сильно ослабленными механизмами иммунной защиты. К последним, в частности, относятся онкогема-тологические больные с нейтропенией после трансплантации костного мозга и курсов высокодозной химио - и лучевой терапии [31, 84, 99, 108].

Нейтрофильные лейкоциты (HJI) играют ключевую роль в защите организма от патогенной грибковой инфекции, о чем свидетельствуют тяжелые инфекционные осложнения, развивающиеся у больных с нейтропенией. Эффективность действия HJT определяется гомеостазом организма. HJI секретируют продукты, как с регуляторным действием, так и с эффектор-ной активностью, к последним, в частности, относятся активные формы кислорода (АФК) (супероксидный анион - радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал и др.) [53]. Развитие опухолевого процесса и противоопухолевая терапия оказывает модифицирующее действие на грану-лоцитопоэз онкологических больных, часто наблюдается снижение активности НЛ [8]. Механизмы этих дисфункций и их роль в противогрибковой и антимикробной активности HJI в настоящее время недостаточно ясны [8]. В последнее время, внимание исследователей сфокусировано на усилении механизмов естественной резистентности у онкогематологических больных в дополнение к противогрибковой терапии [46, 57, 86, 89, 94].

Миелоцитокины, к которым относятся рекомбинантные человеческие гранулоцитарно - макрофагальный (рчГМ - КСФ) и гранулоцитарный (рчГ-КСФ) колониестимулирующие факторы, в настоящее время широко используются при лечении нейтропении [3, 4, 14, 66, 75]. Способность мие-лоцитокинов стимулировать пролиферацию, дифференцировку и активность HJI вызывает интерес к их потенциальному применению при лечении инфекционных осложнений [32, 34, 57, 86, 94]. Показано, что миелоцитокины могут восстанавливать функции HJ1 и усиливать действие антибиотиков при инфекционных заболеваниях [78, 89, 100]. Имеются данные о положительном эффекте рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ как дополнительного средства при лечении грибковых инфекций у больных с нейтропенией. Полученные данные устанавливают не всегда однозначные изменения активности HJ1 под воздействием миелоцитокинов и тем самым вносят элементы противоречия [45, 88, 92, 100]. Тем не менее, биохимические механизмы действия рекомбинатных миелоцитокинов на общую антимикробную и антикандидозную активность HJI онкогематологических больных, изучены недостаточно.

В этой связи, исследование влияния рекомбинантных миелоцитокинов на антикандидозную и антимикробную активности HJI онкогематологических больных даст возможность изучить изменение кислородзависимых функций HJI и сможет способствовать разработке мероприятий, направленных на оптимизацию клинического эффекта при терапии микозов.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования явилось изучение биохимических механизмов действия гранулоцитарного и гранулоцитарно - макрофагального колониести-мулирующих факторов на кислородзависимую антикандидозную и антимикробную активность нейтрофильных лейкоцитов у онкогематологических больных. Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач:

1. Провести сравнительное исследование кислородзависимой антиканди-дозной и антимикробной активности нейтрофилов доноров и первичных онкогематологических больных.

2. Оценить роль НАДФН - оксидазы и миелопероксидазы нейтрофилов в изменении их антикандидозной и антимикробной активности.

3. Изучить особенности образования активных форм кислорода нейтро-фильными лейкоцитами при их взаимодействии с грибами различной вирулентности рода Candida.

4. В опытах in vitro изучить механизмы действия рекомбинантных грану-лоцитарного и гранулоцитарно - макрофагального колониестимули-рующих факторов на образование активных форм кислорода нейтрофи-лами.

5. Изучить в динамике эффект терапии с использованием рекомбинантных гранулоцитарного и гранулоцитарно - макрофагального колониестиму-лирующих факторов на антикандидозную и антимикробную активность нейтрофилов онкогематологических больных с нейтропенией.

Научная новизна

В настоящем исследовании разработаны собственные методические приемы, позволяющие изучать кислородзависимую антикандидозную и антимикробную активность HJ1 в норме и при злокачественных новообразованиях.

Впервые получены количественные данные по антикандидозной и антимикробной активности HJI у первичных пациентов с онкогематологиче-ской патологией.

В опытах in vitro изучены биохимические механизмы действия рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ на генерацию АФК нейтрофилами.

Впервые получены и проанализированы данные образования АФК нейтрофилами онкогематологических больных, получавших терапию с использованием миелоцитокинов (рчГ - КСФ, рчГМ - КСФ) и выявлены характерные закономерности в изменении антикандидозной и антимикробной активности HJI пациентов.

Научно - практическая значимость.

Изучение молекулярных механизмов действия гранулоцитарного и гра-нулоцитарно - макрофагального колониестимулирующих факторов на ан-тикандидозную и антимикробную активность HJ1 носит фундаментальный характер, имеет важное теоретическое и практическое значение. Обнаружение метаболических изменений в HJI больных позволяет раскрыть новые звенья молекулярных механизмов изменения антикандидозной и антимикробной активности HJI в процессе терапии рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ. Показатели кислородзависимой антикандидозной и антимикробной активности HJI доноров служат критерием для обнаружения патологических сдвигов в активности HJI у больных гемобластозами. Изучение биохимических механизмов действия рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ на HJ3 позволит корректировать их активность, оценивать эффективность схемы проводимой терапии, разрабатывать ее новые варианты.

Апробация диссертации.

Апробация диссертационной работы состоялась 30 сентября 2002 г. на совместной научной конференции лабораторий молекулярно - биологических методов исследования НИИ Канцерогенеза, микробиологической диагностики и лечения инфекций в онкологии, отделения трансплантации костного мозга, интенсивной химиотерапии и реанимации, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина РАМН

Основные положения работы были представлены на конференциях: «Инфекции в онкологии», Москва, 2001г.; «Инфекционные болезни» VII Национального Конгресса «Человек и лекарство» Москва, 2001; I Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, 2003 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 23 отечественных и 85 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 31 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Никифорова, Зоя Николаевна

ВЫВОДЫ

1. У первичных онкогематологических больных одномоментное и суммарное образование активных форм кислорода в нейтрофилах было достоверно снижено.

2. Снижение антикандидозной и антимикробной активности нейтрофилами пациентов связано с достоверным снижением миелопероксидазо - и НАДФН - зависимой генерации активных форм кислорода.

3. Из трех видов грибов рода Candida (C.albicans, С. glabrata, С. incon-spicua), менее патогенные грибы C.glabrata вызывали более интенсивное образование активных форм кислорода нейтрофилами.

4. В опытах in vitro рекомбинантные гранулоцитарный и гранулоцитарно - макрофагальный колониестимулирующие факторы увеличивали ки-слородзависимую антикандидозную активность нейтрофилов.

5. При терапии с использованием рекомбинантных гранулоцитарного и гранулоцитарно - макрофагального колониестимулирующих факторов у онкогематологических больных с нейтропенией наблюдалось увеличение кислородзависимой антикандидозной и антимикробной активности нейтрофилов, за счет усиления их миелопероксидазо - и НАДФН - зависимого образования активных форм кислорода.

6. Антикандидозная и антимикробная активность нейтрофилов больных увеличивалась в зависимости от кратности введения рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

7. Рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор оказывал нормализующее действие на кислородзависимую антикандидозную и антимикробную активность нейтрофилов у онкогематологических больных с грибково - бактериальными осложнениями.

8. Рекомбинантные человеческие гранулоцитарный и гранулоцитарно -макрофагальный колониестимулирующие факторы могут использовать

120 ся как дополнительное средство при профилактике и лечении грибко вых осложнений у онкогематологических больных с нейтропенией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфекционная патология остается наиболее частой и тяжелой среди всех осложнений, возникающих у онкогематологических больных [14, 18, 31, 44, 84, 108]. В настоящее время отмечается рост грибковой инфекции у иммунокомпрометированных больных. Во время аутопсии грибковая инвазия (кандидоз, аспергиллез) выявлялась у 20 % больных острыми лейкозами, у 10 - 15 % больных лимфомами или лимфогранулематозом и у 15 -25 % пациентов, которым была проведена ТКМ. Летальность, особенно в период нейтропении, при инвазивных микозах остается высокой [5, 6, 84]. При гематологических опухолях микозы в 20 - 40 % - диссеминированы и более 70 % из них фатальны. При вовремя назначенном лечении противогрибковыми препаратами от кандидоза погибает более 40 % больных. Если лечение кандидоза не проводится или препараты назначены поздно, летальность достигает 85 % [5, 6].

В зависимости от периода течения онкогематологического заболевания, риск возникновения угрожающих жизни грибковых инфекций может быть разным. Но если раньше системные микозы встречались лишь у терминальных больных острым лейкозом, на фоне резистентного течения заболевания, то сейчас инвазивная грибковая инфекция возникает при остром лейкозе, как на этапах индукционной терапии, так и при проведении консолидации и в ремиссии [6].

Нейтропения является одним из основных факторов, предрасполагающих к развитию тяжелых форм кандидоза у онкогематологических больных [84, 108]. Степень и длительность нейтропении в значительной степени определяет количество инфекционных осложнений и их тяжесть. Клинически это было подтверждено в исследовании J.P. Bodey, который показал, что риск инфекционных осложнений превышает 50 % при уменьшении числа НЛ в крови ниже 0,5 *109/л [33]. Процент грибковых инфекций коррелирует с длительностью нейтропении. В последнее время, также отмечаются случаи возникновения диссеминированных грибковых инфекций у больных никогда не подвергавшихся ПХТ или ТКМ [88]. Таким образом, HJI играют ключевую роль в защите организма от патогенной грибковой инфекции. Тем не менее, не достаточно изучены механизмы киллинга C.albicans нейтрофилами больных при гемобластозах. Недостаточно ясно, какие факторы предрасполагают к развитию грибковой инфекции у пациентов: снижение количественного состава НЛ или, также, и изменение функциональной активности фагоцитов. Понимание механизмов киллинга грибов C.albicans нейтрофилами позволит использовать более эффективные методы в борьбе с этой инфекцией.

В нашей работе анализируется вопрос о роли процессов образования АФК нейтрофилами в изменении их антимикробной и антикандидозной активности у онкогематологических больных, которые часто подвержены инфекционным осложнениям. Особое место отводится коррекции состояния кислородзависимых антимикробных систем HJ1 у пациентов с нейтро-пенией после проведенной ПХТ и ТКМ. Система метаболизма кислорода в HJI - это сложноорганизованная система, состоящая из взаимосвязанных компонентов, что делает ее уникальной моделью для изучения любого воздействия на HJI, в том числе, как опухолевого процесса, так и проводимой терапии. Механизмы включения АФК в поддержание гомеостаза HJI у онкологических больных, особенно после ПХТ и ТКМ не совсем ясны, что делает перспективными исследования в этом направлении. Приведенные в данной работе факты демонстрируют сложные многосторонние механизмы участия системы генерации АФК в этом процессе.

Можно было предположить, что воздействие опухолевого процесса на организм больного не может не сказаться на функционировании этой системы. Возникал вопрос - насколько глубоко это поражение, какие сегменты образования АФК оно затрагивает, какие тенденции возникают на разных этапах лечения онкогематологических пациентов и как это коррелирует с отдельными антимикробными функциями нейтрофилов. Отказ от традиционного подхода в оценке патологических сдвигов в НЛ у онкогематологических больных позволил посмотреть на эту проблему с другой точки зрения и обнаружить нарушения в метаболизме кислорода, которые имели как общие, так и специфические черты для антимикробной и антигрибковой активности HJI.

Антимикробная активность HJI включает кислород - независимый и -зависимый механизмы. Важную роль в эффективности кислородзависимо-го киллинга грибов нейтрофилами играют, в частности, две ферментные системы: НАДФН - оксидаза и МПО. НАДФН - оксидазный путь метаболизма кислорода приводит к образованию супероксидного анион радикала [27]. МПО - зависимый путь включает образование других АФК [53]. Дефект какой-либо из этих ферментных систем приводит к снижению реактивности HJI.

Учитывая важную роль ферментов метаболизма кислорода в активности НЛ, мы использовали высокочувствительный XJ1 метод для оценки их роли в антимикробной и антикандидозной активности НЛ. Хемилюминес-центный метод позволил получить информацию о функционировании системы генерации АФК без необратимой деструкции НЛ, исследовать кинетику внутри - и внеклеточного образования АФК под влиянием разнообразных факторов. Хемилюминесцентный метод оказался эффективным и информативным способом оценки реактивности НЛ. Методические задачи, которые предстояло решить при проведении данного исследования, включали установление оптимальных соотношений ингредиентов и их концентраций, подбор времени инкубации НЛ и т.д. Применялись две взаимодополняющие методики, с использованием в качестве усилителей хемилю-минесценции люминола и люцегинина, что позволило изучать качественный состав АФК. ЛХЛ измеряла весь пул АФК и отражала активность

МПО, а ЛЦХЛ - регистрировала образование супероксидного анион - радикала и оценивала активность НАДФН - оксидазы. Хорошо изученный метаболический путь образования АФК в нейтрофилах позволил использовать различные комбинации уровней ЛХЛ и ЛЦХЛ для оценки активности ферментов этого каскада и повысить надежность полученных результатов. Сложный вид кинетической кривой ХЛ - ответа нейтрофилов определяется взаимодействием целого ряда факторов, таких как внутри - и внеклеточная генерация АФК, дегрануляция клеток, освобождение МПО и др. По этой причине анализ ХЛ данных проводился с применением различных математических критериев, часть из которых была предложена впервые. Биологический смысл некоторых из них целесообразно рассмотреть подробнее в начале обсуждения полученных данных. Традиционно изменения в ХЛ фиксируются с помощью значений максимальной амплитуды ХЛ и площади под кривой хемилюминесценции. Необходимо отметить, что оба эти параметра, характеризуя один феномен - генерацию нейтрофилами АФК, отражают различные стороны процесса. Максимальная амплитуда ХЛ является показателем одномоментного выброса АФК и характеризует функциональную однородность популяции нейтрофилов. Площадь под кривой ХЛ является интегральным критерием и отражает усредненную способность клетки к продукции АФК. В целях стандартизации показателей ХЛ анализа использовали не только абсолютные значения ХЛ, но и относительные величины, такие как введенный нами параметр К, определяющий качественный состав АФК. Антикандидозную и антимикробную активность НЛ оценивали при стимуляции фагоцитов опсонизированными грибами С.albicans и 03, соответственно. Результаты проведенного исследования позволяют считать, что выбранные параметры оказались адекватными для определения ХЛ методом функционального состояния КЗАА и КЗАМА нейтрофилов у здоровых доноров и онкологических больных, а также для оценки в опытах in vitro эффекта рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ на генерацию АФК нейтрофилами.

Учитывая новизну исследования, хотелось охватить широкий контингент онкогематологических больных с различными по этиологии и патогенезу заболеваниями, которых, тем не менее, объединяло то, что после проведенного противоопухолевого курса лечения они находились в состоянии нейтропении. Широкий диапазон нозологических форм был избран для выяснения степени универсальности используемых методик при оценке корректирующего эффекта последующей терапии миелоцитокинами на общие антимикробные свойства HJI. В работе предпринята попытка раскрыть динамику метаболических сдвигов, происходящих в HJ1 пациентов под действием рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ, определить меру их перестройки, найти как общие закономерности при воздействии обоих препаратов, так и выяснить специфические закономерности. Полученный в данной работе материал, с нашей точки зрения, может способствовать пониманию механизмов, обеспечивающих регуляцию реактивности HJI у онкогематологических больных в процессе нейтропении и ее лечения миелоцитокинами.

В начале обсуждения полученных результатов следует отметить особенности кислородзависимой антикандидозной активности HJI доноров, которые вытекали из анализа данных по стимуляции HJI доноров С. albicans и ОЗ. По нашим данным, в антимикробной и антикандидозной активности HJI важное место занимают как МПО, так и НАДФН - оксидаза. В тоже время за киллинг грибов в большей степени был ответственен МПО - зависимый механизм образования АФК, что согласуется с данными других авторов [12, 74, 98]. Так Marodi L. и соавторы [74] показали, что киллинг C.albicans происходил только в присутствии HJI с неповрежденными МПО - и НАДФН - оксидазной системами HJI. В другом исследовании [98] показали уменьшение киллинга C.albicans нейтрофилами при добавлении в клеточную систему ингибиторов образования -02 , Н202, ОН и гипохлорной кислоты. Таким образом, снижение активности МПО нейтрофилов при различных онкогематологических патологиях и в результате лечения может являться одной из важных причин возникновения и развития грибковой инфекции у онкогематологических больных.

Непосредственное распознавание грибов и последующая активация HJI осуществляется при взаимодействии маннан - связывающего рецептора HJI с маннаном на клеточной стенке С.albicans. Известно, что важную роль при киллинге патогенов нейтрофилами занимают также опсонины. Опосредованное опсонинами связывание грибов обеспечивается рецепторами к Fc - фрагментам антител и рецепторам комплимента CR1, CR3, С5, СЗЬ, iC3b [16]. Однако роль маннан - и опсонин - опосредованного взаимодействия HJI с грибами С.albicans в образовании АФК окончательно не установлена. При сравнении различных режимов опсонизации С. albicans, установили, что опсонизированные и отмытые грибы С.albicans в большей степени (в 2 раза) вызывали образование АФК нейтрофилами, чем неопсо-низированные. Таким образом, максимальный эффект достигался при со-четанном действии двух выше названных механизмов. Полученные данные согласуются с исследованием [87], в котором авторы показали, что киллинг грибов HJI происходит как при опсонизации грибов, так и без опсонизации С.albicans. Таким образом, нарушения обоих систем лиганд -рецепторного взаимодействия могут значительно изменять антикандидозную активность HJI. Дополнительно следует отметить роль растворимых факторов в периферической крови пациентов, которые могут снижать киллинг грибов HJL Последний вывод подтверждается опытами с не отмытыми опсонизированными С. albicans.

Спектр грибковых патогенов у онкогематологических пациентов в последние годы значительно изменился, так все чаще регистрируются инфекции, вызываемые грибами Candida поп - albicans. По данным клиники РОНЦ им. Н.Н. Блохина, из патологического материала онкогематологических больных чаще всего выделяют грибы: C.albicans, C.inconspicua, C.glabrata. Биохимические механизмы, связанные с ускользанием грибов от защитных систем организма давно привлекают исследователей, однако связь этой проблемы с дисфункцией метаболизма кислорода в HJI отражена в небольшом количестве работ. Так, по мнению авторов [40], грибы Candida spp. могут угнетать кислородзависимую активность нейтрофилов, в частности, за счет тирозола (2, 4 - (гидроксифенил) - этанол) [40], который ингибирует ЛХЛ нейтрофилов, при их стимуляции C.albicans и ОЗ. По мнению этих авторов, генерация АФК нейтрофилами зависит от степени образования тирозола различными видами грибов Candida spp. Проведенные нами исследования показали, что при стимуляции НЛ доноров тремя видами грибов Candida: C.albicans, С. glabrata, С. inconspicua, все названные грибы активировали «респираторный взрыв» в НЛ, однако в большей степени вызывали образование АФК - грибы С. glabrata (на 26%), менее патогенные из представленных видов. Следует указать, что выявленное различие относилось только к МПО зависимому механизму, который, как уже отмечалось, в основном и отвечает за КЗАА нейтрофилов. Учитывая высокую антигрибковую активность метаболитов кислорода, увеличение ЛХЛ ответа может коррелировать с повышенным киллингом дрожжей, и зависеть от патогенности данного вида грибов [40, 58]. Необходимо учитывать и различную чувствительность отдельных грибов к продуктам МПО, в частности к гипохлориту и монохлорамину. Вариация чувствительности, по мнению авторов [16], в этом случае может быть связана с повышенным содержанием в грибах СОД и каталазы. Следует отметить, что эти данные получены при изучении экстрактов из C.albicans и C.parapsilosis, тогда как интактные живые грибы СОД и каталазную активность не проявляли. Не исключено и участие МПО - независимых антигрибковых путей в НЛ. Одна из таких возможностей, по данным ряда авторов [40, 53], связана с утилизацией Н202 по реакции Фентона и Хаберта

Вайса с образованием очень токсичного гидроксильного радикала. В последнее время, повышенное внимание уделяется также окиси азота и продукту ее взаимодействия с супероксидным анион - радикалом - пирокси-нитрилу. Намечающийся прогресс в изучении биохимических механизмов киллинга грибов. HJT позволит направленно изменять отдельные звенья этой сложной цепи и стимулировать наиболее эффективные пути для борьбы с конкретным видом патогена.

Ранее было показано, что у онкогематологических больных опухолевый процесс оказывает модифицирующее действие на гранулоцитопоэз, часто наблюдается снижение реактивности полинуклеаров (при острых лейкозах снижена активность щелочной фосфатазы, лактоферрина, эластазы; при неходжинских лимфомах нарушается фагоцитоз и бактерицидная способность HJI) [8]. Тем не менее, образование АФК нейтрофилами первичных онкогематологических больных не достаточно изучено. Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о том, что опухолевый процесс оказывает значительное влияние на окислительный метаболизм в НЛ первичных онкогематологических больных. Воздействию в той или иной степени подвергается весь метаболический каскад кислорода в НЛ. Используя нейтрофилы как модельную систему для изучения эффекта опухоли, удалось косвенно подтвердить мнение о существовании факторов воздействия в организме больного, изменяющих генерацию АФК нейтрофилами. Для изученной группы больных, которая включала пациентов с различными гемобластозами, отмечается достоверное снижение всех характеристик генерации АФК по отношению к здоровым донорам.

При сравнении показателей люминол - и люцегинин - зависимой фоновой хемилюминесценции НЛ у первичных онкогематологических больных показано, что снижается генерация как продуктов системы МПО, так НАДФН - оксидазы по сравнению с донорами. Результаты исследования позволяют предположить, что факторы опухоли влияют на ферменты метаболизма кислорода в HJI, изменяя токсические свойства HJT пациентов. Следует отметить, что спонтанная XJI оценивает взаимодействие HJI со стенками виалы и характеризует процессы, связанные с адгезией. Таким образом, представленные данные продемонстрировали отчетливое снижение адгезивных свойств HJI первичных онкогематологических больных.

У первичных онкогематологических больных наблюдалось уменьшение как кислородзависимой антимикробной, так и антикандидозной активности HJL Однако, при сравнении показателей индуцированной XJI видно, что генерация АФК при активации ОЗ, изменена в большей степени по сравнению с активацией нейтрофилов C.albicans. Не исключено, что наблюдаемое отличие связано с различным повреждающим эффектом факторов опухолевого процесса на рецепторные системы HJT. То, что опухолевый процесс затрагивает синтез супероксида в антимикробной активности НЛ, подтверждено исследованиями других авторов [73].

Можно предположить, что развитие опухолевого процесса по - разному влияет на способности НЛ к одномоментному, быстрому выбросу АФК и к суммарной генерации. Возможно, это также обусловлено наличием функционально различных субпопуляций нейтрофилов с разной динамикой генерации АФК, а различия в изменении максимальной амплитуды и свето-суммы ЛХЛ нейтрофилов больных - отражают неодинаковое влияние злокачественного процесса на эти популяции.

Низкая реактивность НЛ первичных онкогематологических больных, по данным индуцированной ХЛ, служит неблагоприятным прогностическим признаком в отношении развития инфекционных осложнений [7]. Учитывая, что величина ХЛ связана с количеством и качественным составом АФК, а также, принимая во внимание участие АФК в передаче внутриклеточной и межклеточной сигнальной информации [90], можно предположить изменение широкого спектра регуляторных функций, выполняемых НЛ больных. Сопоставляя полученные данные с работами других авторов, которые использовали в качестве стимуляторов HJI хемотактический пептид ФМЛП и РМА, можно заключить, что изменения реактивности НЛ связаны с нарушением передачи сигнальной информации [22, 63]. Снижение метаболизма кислорода НЛ больных можно также объяснить истощением их резервных возможностей на фоне развивающейся патологии, то есть уменьшением способности клетки реагировать увеличением продукции АФК в ответ на рецептор - зависимую активацию.

После применения противоопухолевой терапии (ПХТ, ТКМ, лучевой терапии) усиливается иммунодефицитное состояние онкогематологических пациентов. Известно, что действие ряда противоопухолевых препаратов угнетает кроветворение пациентов, оказывает повреждающее действие на зрелые клетки иммунной системы и клетки естественной резистентности, а наиболее частым осложнением является нейтропения. Больные с нейтро-пенией часто подвергнуты инфекционным осложнениям и составляют основную группу риска при острых лейкозах и лимфомах после интенсивных режимов химиотерапии [47, 48, 51]. В этой связи особенно важным становится быстрая и точная оценка состояния антимикробной и антигрибковой активности пула НЛ у больного. Поэтому следующим этапом явилось изучение особенностей образования АФК у больных с нейтропе-нией (III - IV степень) после окончания ПХТ или ТКМ. Выполненное исследование показало резкое уменьшение спонтанной и активированной ХЛ нейтрофилов, что указывало на угнетение реактивности покоящихся НЛ (снижение адгезивных свойств) и их антимикробной и антикандидозной активности по сравнению с донорами. Отметили достоверное увеличение по сравнению с донорами доли супероксида в общей продукции АФК в 2,4 и 2 раза при стимуляции фагоцитов грибами С.albicans и 03, соответственно. Необходимо указать на более выраженную супрессию кислород-зависимой антикандидозной активности НЛ. Наши данные согласуются с ранее полученными результатами. Dyke K.Y. в своей работе сообщает [42] об снижении XJI - ответа у онкологических больных, в том числе у пациентов с гемобластозами.

С учетом приведенных выше данных можно говорить о том, что у первичных онкогематологических больных после противоопухолевого лечения активность МПО - и НАДФН - оксидазной системы HJI значительно изменены. На фоне нейтропении и снижения кислородзависимого токсического потенциала HJI у этих пациентов увеличивается количество эпизодов грибковой и бактериальной инфекции.

В связи со снижением реактивности HJI при гемобластозах, актуальным является коррекция их активности. Перспективным, по нашему мнению, для этих целей, являются рчГМ - КСФ и рчГ - КСФ. До недавнего времени рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ рассматривались исключительно как гемопоэти-ческие факторы роста, влияющие на пролиферацию и дифференцировку нейтрофилов и снижающие продолжительность и тяжесть нейтропении. Однако в последнее время стало очевидным, что эти миелоцитокины обладают множеством других клинически значимых плеотропных свойств [86, 88]. Они играют важную роль в регуляции иммунного ответа через эффек-торные клетки и участвуют в воспалительном процессе [50, 56, 57, 65]. Тем не менее, существуют противоречивые данные о влиянии рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ на антикандидозную и антимикробную активность HJI [45, 61, 65, 92]. Изучалась их способность влиять на образование АФК нейтрофилами доноров, при стимуляции HJ1 грибами C.albicans, ОЗ и РМА в опытах in vitro.

Полученные нами данные в опытах in vitro показали, что предварительная инкубация НЛ в течение 60 минут с рчГ - КСФ (100 Ед/мл) не оказывала существенного влияния на спонтанную генерацию АФК. Таким образом, рчГ - КСФ в данных условиях самостоятельно не влиял на функции покоящихся НЛ доноров. Наши данные не подтвердили результаты работы [107], в которой показано, что при инкубации НЛ с рчГ - КСФ

50 нг/мл) в течение 30 минут увеличивается адгезия HJL Возможно, что наблюдаемые отличия были связаны с разницей во времени инкубации HJI с рчГ - КСФ и активности препарата.

Тем не менее, при последующей стимуляции HJI грибами С. albicans, наблюдалось достоверное увеличение показателей ЛХЛ по сравнению с контролем. Показатели одномоментной генерации супероксидного анион - радикала превышали контрольные значения, тогда как суммарное образование 02 не отличалось от показателей контроля. При этом доля -02 в общей продукции АФК снижалась (в 1,4 раза) по сравнению с контролем. Таким образом, под действием рчГ - КСФ в опытах in vitro преимущественно увеличивалась МПО - зависимая антикандидозная активность НЛ, что согласуется с результатами исследований [77, 87], в которых показано, что обработка рчГ - КСФ нейтрофилов доноров увеличивает их общую антикандидозная активность.

При стимуляции НЛ, предварительно инкубированных с рчГ - КСФ, оп-сонизированным зимозаном, наблюдали в равной степени достоверное увеличение как МПО -, так и НАДФН - зависимой генерации АФК. Относительный вклад -02 в общую генерацию АФК не отличался от контроля. При активации НЛ, инкубированных с рчГ - КСФ, РМА (стимулятором ПК

- С) выявили значительное увеличение МПО - и НАДФН - зависимого образования АФК по сравнению с контролем. Исследователями [67] показана способность рчГ - КСФ увеличивать мобилизацию цитозольного кальция в НЛ. Таким образом, активация ПК - С может происходить за счет увеличе

У 4ния уровня внеклеточного Са и приводить к активации НАДФН - оксида-зы и последующему превращению 02 в -02~. Существуют данные, что рчГ

- КСФ также увеличивает генерацию -02 в ответ на воспалительный хе-моатрактант ФМЛП [32, 60, 107].

Полученные результаты и данные других авторов [60, 107] указывают на то, что рчГ - КСФ усиливает стимуляцию «кислородного взрыва» в НЛ при действии различных активаторов. В результате активируются как МПО, так и НАДФН - оксидаза. Можно предположить важную роль в этих про

О Ацессах внутриклеточного Са и различных протеинкиназ, в том числе ПК - С, участвующих в передаче внутриклеточной сигнальной информации.

В отличие от рчГ - КСФ, рчГМ - КСФ усиливал генерацию АФК покоящимися HJI доноров, увеличивая адгезивные свойства HJL Полученные данные согласуются с предположением, что действие рчГМ - КСФ в организме носит первично локальный характер. Г - КСФ циркулирует в крови, в то время как ГМ - КСФ остается в очаге инфекции, способствуя адгезии и активации HJI в месте инфекции [88].

При последующей стимуляции HJI грибами С. albicans, наблюдали достоверное увеличение показателей как ЛХЛ, так и ЛЦХЛ по сравнению с контролем, что указывало на усиление МПО - и НАДФН - зависимой ан-тикандидозной активности НЛ. Следует отметить увеличение (на 44 %) доли -02 в общей продукции АФК по сравнению с контролем. Наши данные согласуются с результатами работы [61], в которой показано, что рчГМ - КСФ увеличивает образование Ог нейтрофилами при стимуляции НЛ грибами С. albicans, T.glabrata.

При активации НЛ опсонизированным зимозаном не наблюдали отличий в МПО - и НАДФН - зависимом образовании АФК между контролем и нейтрофилами, инкубированными с рчГМ - КСФ. Полученные данные подтверждают результаты исследования [71], в котором отмечено, что после инкубации НЛ с рчГМ - КСФ, образование АФК не изменялось по сравнению с контролем для ЛХЛ, при стимуляции НЛ не опсонизированным зимозаном, опсонизированным зимозаном или зимозаном обработанным IgG. Различный эффект рчГМ - КСФ на последующую активацию нейтрофилов С. albicans и 03, по нашему мнению, можно объяснить различным действием рчГ - КСФ на экспрессию рецепторов к опсонинам и маннан - связывающим рецепторам на цитоплазматической мембране НЛ, кроме того, процессы фагоцитоза С. albicans и 03 отличаются. Можно предположить, что рчГМ - КСФ избирательно увеличивает чувствительность рецепторов HJI, влияя, таким образом, на их антимикробную активность.

При последующей стимуляции нейтрофилов РМА, наблюдали снижение светосуммы JIXJI на 28% и увеличение показателей для ЛЦХЛ по сравнению с контролем. Доля 02 в общей продукции АФК увеличивалась по сравнению с контролем в 2,25 раза. Наши данные отличались от результатов работы [104], в которой отметили, что ГМ - КСФ не влияет на образование АФК нейтрофилами, стимулированными РМА. Расхождение в полученных результатах, по нашему мнению, можно объяснить различными условиями проведения опытов. Так в работе [104] использовались более низкие концентрации РМА, время инкубации НЛ составляло 3 0 мин, а реальная активность ГМ - КСФ авторами не указывалась. Необходимо учитывать также, что в наших опытах использовался сертифицированный препарат лейкомакс, тогда как автором [104] применялся рчГМ - КСФ, полученный другими исследователями. Кроме того, наши данные по ЛХЛ отмечают супрессивный эффект последующей стимуляции РМА на МПО -зависимую генерацию АФК и дополняют данные работы [104]. Интересно отметить, что образование -02 нейтрофилами, инкубированными с рчГМ -КСФ, увеличивалось при стимуляции НЛ хемоатрактантами ФМЛП, С5а des Arg, ЛТБ4 [104]. Weisbart и соавторы [104] считают, что усиление эффекта ФМЛП при действии ГМ - КСФ связано с увеличением экспрессии ФМЛП рецепторов на цитоплазматической мембране НЛ, тогда как в случае РМА, который непосредственно активирует ПК - С, ситуация отличается. Однако данные, полученные в опытах in vivo [96] показывают, что премирующий эффект рчГМ - КСФ нельзя объяснить только на основании экспрессии рецепторов к ФМЛП, так как усиление генерации супероксида наблюдается и для РМА.

Анализ литературных данных и представленных нами результатов, показал, что биохимические механизмы активации кислородзависимой антимикробной и антикандидозной активности рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ имеют схожие и отличительные черты. В настоящее время известно, что эффекты обоих миелоцитокинов связаны со специфическим взаимодействием их с рецепторами на цитоплазматической мембране клеток, что приводит к активации систем передачи сигналов в клетках (SHP - 2, CBL, STATs, РБК) схожих для Г - КСФ и ГМ - КСФ. Показано, что рчГ - КСФ регулирует экспрессию FcyR I (CD64) рецепторов на НЛ, и может регулировать количество и/или аффиность маннан - связывающих рецепторов на НЛ, приводя к более эффективному взаимодействию НЛ с грибами С.albicans [87, 97].

Основываясь на полученных in vitro данных, можно было предположить, что используемые в клинической практике рчГ - КСФ и рчГМ -КСФ, способны изменять кислородзависимую антикандидозную и антимикробную активность НЛ у онкогематологических больных. Для подтверждения этого тезиса провели сравнительное исследование антикандидозной и антимикробной активности НЛ в группе онкогематологических больных до, и после начала терапии рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ. По результатам гемограмм, у всех пациентов была нейтропения III - IV степени ВОЗ.

При анализе данных, пациентов условно разделили на 3 группы, в зависимости от продолжительности терапии рчГ - КСФ: в I группе проводили терапию 1 - 2 дня, во второй группе - 3 - 4 дня; в III группе - 5 - 8 дней терапии. Во всех изучаемых группах больных очаги инфекции у пациентов не выявлялись, посевы крови были отрицательными.

Введение рчГ - КСФ вызывает быстрое дозо - зависимое увеличение числа НЛ в периферической крови пациента [4, 88]. Оно обусловлено уменьшением времени их созревания, увеличением числа делений клеток и ускоренным выходом HJI в кровь. Образовавшиеся при введении рчГ -КСФ нейтрофилы, появляются в периферической крови через 1-2 дня (обычное время созревания -4-7 дней) [80, 89]. По нашим данным, после начала терапии рчГ - КСФ, число лейкоцитов во II группе онкогематологических больных было равно или превышало 1000 клеток/мкл, а АЧН впервые сравнялось или превысило 500 клеток/мкл на 6 день после лечения, тогда как в I группе больных - на 10 день после начала терапии. Таким образом, полученные результаты согласуются с данными литературы, по которым временной период, связанный с нормализацией АЧН критически зависит от длительности рчГ - КСФ терапии и дозы вводимого препарата [35, 51, 89]. Необходимо подчеркнуть, что эффект рчГ - КСФ терапии на длительность восстановления АЧН, носит индивидуальный характер и во многом определяется предшествующим блоком ПХТ, состоянием депо HJI у пациента и рядом других факторов.

Важным аспектом исследования является изучение в динамике кисло-родзависимой антимикробной и антикандидозной активности HJI при проведении рчГ - КСФ терапии. Полученные данные показывают, что состояние реактивности HJI у пациентов с нейтропенией должно постоянно контролироваться на всех этапах терапии рчГ - КСФ и после ее завершения. Активность периферических HJI, особенно на первом этапе, когда полного обновления и восстановления пула HJI еще не произошло, является важным фактором, от которого зависит предрасположенность пациента к инфекциям. Как показывают наши данные, изменения активности HJI в процессе терапии рчГ - КСФ носили сложный характер, имелись максимумы и минимумы в их активности в процессе терапии. Характер изменения реактивности HJT указывает на сложную цепь событий, связанных с активацией HJI в процессе рчГ - КСФ терапии. По всей видимости, на первом этапе, в основном, активируются периферические HJI самим КСФ. В дальнейшем активации подвергаются депо HJI, и стимулируется миелопоэз.

Ill

Через некоторое время к этим процессам подключаются другие факторы, которые вырабатываются в организме пациента в ответ на действие рчГ -КСФ, например интерлейкины (ИЛ - 1, ИЛ - 6, ИЛ - 8). Как и в случае с АЧН, предшествующая терапия пациента влияет на образования АФК нейтрофилами в процессе рчГ - КСФ терапии.

Выше было показано, что образование АФК нейтрофилами пациентов до начала терапии рчГ - КСФ было супрессировано. МПО - зависимая генерация АФК покоящимися НЛ в I и II группах больных, в отличие от опытов in vitro, увеличивалась в процессе терапии рчГ - КСФ. НАДФН -оксидазная активность НЛ в I группе пациентов в процессе терапии практически не изменялась, тогда, как во II группе наблюдалось ее увеличение (через 72 часа).

После отмены препарата, образование АФК снижалось в изучаемых группах, оставаясь ниже показателей для доноров. Показатели достигали исходных уровней в I группе и оставались выше начальных уровней во II группе пациентов. Генерация АФК покоящимися НЛ больных увеличивалась в процессе терапии в зависимости от кратности введения рчГ - КСФ. В отличие от опытов in vitro, при терапии рчГ - КСФ наблюдалось повышение ЛХЛ и ЛЦХЛ, что указывало на увеличение реактивности (адгезивных свойств) покоящихся НЛ больных. Полученные различия в опытах можно объяснить тем, что, после терапии рчГ - КСФ, по данным авторов [105], значительно увеличиваются уровни ФНО - а в сыворотке крови, и они предположили, что повышенные в процессе терапии уровни ФНО - а, ГМ - КСФ и ИЛ - 8 в сыворотке крови могут активировать и усиливать функции НЛ человека. Известно, что ИЛ - 8, ФНО - а активируют адгезию НЛ [10]. Таким образом, рчГ - КСФ увеличивая уровень других цитокинов, может опосредованно влиять на адгезивные свойства НЛ пациентов.

При стимуляции НЛ больных I и II группы грибами C.albicans, наблюдали увеличение ЛХЛ и ЛЦХЛ в обеих группах пациентов относительно начальных значений. В I группе генерация АФК нейтрофилами достигала максимальных значений относительно начальных уровней через 24 часа после начала терапии, тогда как во II группе - через 72 часа. Более продолжительное введение препарата во II группе пациентов приводило к увеличению максимального значения светосуммы ЛХЛ в 3,34 раза по сравнению с I группой. В тоже время, по данным ЛЦХЛ, НАДФН - зависимое образование АФК нейтрофилами пациентов II группы увеличивалось в меньшей степени по сравнению с начальными уровнями. Следует отметить, что во всех группах пациентов появлялась тенденция к уменьшению доли 02 в общей генерации АФК. Полученные результаты согласуются с данными других авторов [65, 100], которые отметили, что антикандидозная активность нейтрофилов ВИЧ - пациентов увеличивается относительно исходного уровня через 72 часа после начала введения рчГ -КСФ.

Через 48 часов после отмены рчГ - КСФ, генерация АФК снижалась -в I группе пациентов до начальных показателей; во II группе больных оставались выше исходных значений. Следует отметить, что уровни АФК в I и II группе были ниже показателей для доноров после отмены терапии, тогда как АЧН в этих группах пациентов продолжала увеличиваться.

Данные ХЛ анализа свидетельствуют о том, что при терапии с использованием рчГ - КСФ у онкогематологических больных с нейтропенией наблюдалось дозо - зависимое увеличение КЗАА нейтрофилов, за счет усиления их МПО - и НАДФН - зависимого образования АФК. Следует подчеркнуть, что подобно опытам in vitro, в большей степени увеличивалась МПО - зависимая антикандидозная активность пациентов, что отражалось на снижении вклада -02 в общую продукцию АФК.

Наши результаты согласуются с полученными ранее данными [46], в которых показали, что при введении донорам рчГ - КСФ (300 мкг/день, подкожно, в течение 6 дней) антигрибковая активность HJI увеличивалась дозо - зависимо.

При стимуляции нейтрофилов ОЗ, генерация АФК во всех группах пациентов была супрессирована до начала терапии рчГ - КСФ по сравнению с донорами. По мере введения препарата наблюдалось увеличение индуцированной опсонизированным зимозаном JIXJI и тенденция к увеличению ЛЦХЛ. Максимальное увеличение ЛХЛ(ОЗ) и ЛЦХЛ(ОЗ) в I группе достигалось через 24 часа после начала терапии рчГ - КСФ, а во II группе пациентов - через 72 часа. Более продолжительное введение препарата во II группе пациентов приводило к увеличению максимального значения ЛХЛ(ОЗ) в 2,6 раза по сравнению с I группой. Через 48 часов после отмены терапии, индуцированная опсонизированным зимозаном ЛХЛ и ЛЦХЛ снижались - в I группе пациентов до исходных показателей; во II группе больных оставались выше начальных значений.

Полученные данные согласуются с результатами опытов in vitro. Под действием рчГ - КСФ, как в опытах in vitro, так и в опытах in vivo наблюдалось увеличение МПО - и НАДФН - зависимого образования АФК нейтрофилами, что по-нашему мнению, связано с эффектом самого рчГ - КСФ на экспрессию рецепторов к опсонинам. Таким образом, рчГ - КСФ дозо -зависимо увеличивал КЗАМА нейтрофилов в процессе терапии за счет увеличения генерации АФК, что согласуется с данными работы [78] по антимикробной активности НЛ онкологических больных после цитостати-ческой терапии. Тем не менее, наши данные не подтверждают результаты работы [67], в которой показано, что при введении рчГ - КСФ донорам не изменяется продукция супероксидного - анион радикала на 4 день после начала терапии в НЛ, стимулированных ОЗ. По - нашему мнению, это можно объяснить различием в используемых препаратов (рчГ - КСФ) и дозах, а также исходным состоянием НЛ, так как авторы проводили терапию для доноров. Однако авторы отметили увеличение генерации 02 при стимуляции нейтрофилов доноров ФМЛП и отсутствие эффекта усиления образования АФК при активации нейтрофилов РМА.

Как видно из опытов in vitro и in vivo, рчГ - КСФ способен усиливать эффект различных активаторов на генерацию АФК нейтрофилами онкогематологических больных и доноров. Степень ответа HJI на активаторы под влиянием рчГ - КСФ зависит от природы стимуляторов и рецепторов к ним на цитоплазматической мембране HJI.

Отдельную, III группу, составляли больные после высокодозной полихимиотерапии и трансплантации костного мозга. Терапию рчГ - КСФ проводили в течение 5-8 дней. После начала терапии рчГ - КСФ, число лейкоцитов у этих больных было равно или превышало 1000 клеток/мкл, а АЧН впервые сравнялось или превысило 500 клеток/мкл на 10 день после лечения. Длительное восстановление АЧН больных свидетельствует о более выраженной супрессии кроветворения по сравнению с I и II группой пациентов.

В процессе терапии, у этих пациентов отслеживалось постепенное увеличение относительно начальных показателей параметров спонтанной и индуцированной (С.albicans) JIXJT и ЛЦХЛ, которые достигали максимальных значений через 72 часа и превышали значения для доноров. Отмена препарата вызывала снижение этих показателей, которые после окончания терапии приближались к значениям для доноров. Таким образом, в этой группе пациентов наблюдали увеличение активности покоящихся НЛ и усиление их антикандидозной активности.

При введении онкогематологическим больным рчГМ - КСФ, наблюдали схожие закономерности изменения функциональной активности НЛ пациентов. Способность покоящихся и активированных НЛ пациентов гемо-бластозами к образованию АФК после проведенного курса ПХТ была су-прессирована по сравнению с донорами.

В процессе терапии рчГМ - КСФ функциональная активность (адгезивные свойства) покоящихся НЛ больных увеличивалась и после отмены препарата возвращалась к начальным показателям. Наши данные согласуются с результатами, полученными R.Sullivan и его коллегами [96]. Авторы в своей работе показали увеличение генерации -02 покоящимися HJI онкологических больных относительно начальных значений в процессе терапии рчГМ - КСФ.

В процессе терапии рчГМ - КСФ, показатели индуцированных C.albicans ЛЦХЛ и ЛХЛ увеличивались относительно начальных показателей и достигали максимальных значений через 24 и 72 часа после начала терапии, соответственно. После отмены препарата НАДФН - зависимое образование АФК нейтрофилами пациентов снижалось относительно максимальных показателей, но оставалось выше начальных данных. МПО -зависимая генерация АФК не изменялась после отмены препарата. До начала терапии относительный вклад -02 в общую долю АФК был выше в 2,4 раза по сравнению с донорами и снижался в процессе терапии рчГМ -КСФ по сравнению с начальными показателями. Гемопоэз у больных восстанавливался на 5 день после начала лечения. Таким образом, при терапии с использованием рчГМ - КСФ у онкогематологических больных наблюдалось увеличение антикандидозной активности нейтрофилов, за счет усиления их МПО - и НАДФН - зависимого образования АФК. Наши результаты, согласуются с данными, приведенными в [48], где описывается увеличение антикандидозной активности НЛ под влиянием ГМ - КСФ. Введение рчГМ - КСФ онкологическим больным с солидными опухолями [96] увеличивает генерацию супероксидного анион - радикала НЛ, стимулированными ФМЛП и РМА, что свидетельствует об увеличении общей антимикробной активности НЛ больных после терапии рчГМ - КСФ.

Существовали некоторые особенности изменения функциональной активности НЛ больных гемобластозами, у которых до начала терапии рчГ - КСФ, при микробиологическом исследовании обнаруживали грибы С.albicans и бактерии Staphilococcus aureus, энтерококки. У пациентов после проведенного курса ПХТ наблюдали фебрильную нейтропению (III -IV степени, ВОЗ). Больным назначали рчГ - КСФ, антигрибковую (амфо-терицин Б) и антибактериальную (карбапенемы, цефалоспорины, аминог-ликозиды, ванкомицин) терапию.

Необходимо отметить, что в отличие от предыдущих групп пациентов, до начала терапии, образование супероксидного - анион радикала покоящимися и активированными НЛ, значительно превышало норму. Высокие исходные показатели НАДФН - зависимого образования АФК нейтрофилами больных не были связаны с действием антимикробной терапии [52, 72], а определялись наличием грибково - бактериальной инфекции. Резкое усиление генерации 02 в НЛ с одной стороны направлено на защиту организма от инфекций, а с другой - может приводить к существенному повреждению тканей и органов [27, 88]. Показатели спонтанной и индуцированной ЛХЛ были достоверно ниже показателей для доноров и свидетельствовали о нарушении их МПО - зависимого антимикробного потенциала.

Через 3 и 24 ч после начала терапии с рчГ - КСФ уровни спонтанной амплитуды ЛЦХЛ и показатели индуцированной ЛЦХЛ(С. albicans) и ЛЦХЛ(ОЗ) для нейтрофилов больных оставались выше нормы. Эти данные указывали на то, что после однократного введения препарата не происходило нормализации активности НАДФН - оксидазы нейтрофилов и уровни супероксидного анион - радикала оставались повышенными.

Через 144 часа после начала терапии рчГ - КСФ, отмечалось достоверное снижение параметров ЛЦХЛ и увеличение ЛХЛ, которые через 360 часов приближались к значениям для доноров. Данные ХЛ анализа свидетельствуют о том, что при терапии с использованием рчГ - КСФ у онкогематологических больных с нейтропенией наблюдалось быстрое увеличение МПО - зависимой антикандидозной активности НЛ и выход ее на уровни выше исходных показателей после окончания терапии. Учитывая определяющую роль продуктов миелопероксидазы (НОС1, ОН- и др.) в антикандидозной активности НЛ, это должно приводить к увеличению их КЗАА.

Следует отметить, что начальные показатели коэффициентов К {C.albicans) и К(ОЗ) были выше по сравнению с донорами (в 1,8 и 3 раза, соответственно), что указывало на увеличение относительной доли Ог в общей продукции АФК. В процессе терапии этот показатель приближался к показателям для доноров.

Таким образом, под действием рчГ - КСФ происходила нормализация функциональной активности покоящихся НЛ и их кислородзависимой антикандидозной и антимикробной активности. По - видимому, рчГ - КСФ защищает организм от токсического действия липополисахаридов. Pajkrt D. и его коллеги [82] показали, что терапия с использованием рГ -КСФ предотвращает ЛПС - индуцированное скопление НЛ в легких при эндотоксемии E.coli у доноров и приводит к уменьшению продукции про-воспалительных цитокинов (ФНО - а), уменьшая чрезмерную воспалительную реакцию организма [82, 88].

Суммируя полученные данные, можно отметить, что рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ повышали антикандидозную и антимикробную активность НЛ в опытах in vitro и in vivo. В процессе терапии рчГ - КСФ или рчГМ -КСФ онкогематологическим больным, увеличивалась МПО - и НАДФН -зависимая антикандидозная и антимикробная активность НЛ, за счет усиления образования АФК. Следует подчеркнуть, что при терапии рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ, МПО - зависимая антикандидозная активность НЛ увеличивалась в большей степени, чем НАДФН - зависимая. Тем не менее, после стандартного курса терапии с использованием миелоцитокинов, КЗАА и КЗАМА нейтрофилов пациентов не достигала значений для доноров, что является основанием для индивидуальной коррекции используемой терапии у больных. Обнаружение выраженных различий в молекулярных механизмах действия рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ позволит более рационально и целенаправленно использовать эти препараты для усиления реактивности HJI. По нашему мнению, рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ терапия может использоваться как дополнительное средство при профилактике и лечении грибковых осложнений у больных с нейтропенией.

Следует отметить, что индивидуальный мониторинг реактивности HJI онкогематологических больных в процессе терапии миелоцитокинами позволит своевременно выявить нормализацию их антикандидозной и антимикробной активности, решить вопрос о назначении, сроков проведения и отмены терапии миелоцитокинами как дополнительного средства к противогрибковой терапии. Это подтверждают рассмотренные в работе клинические случаи, демонстрирующие целесообразность сочетания рчГ - КСФ и противогрибкового препарата (амфотерицина Б), который как показали в работе [72], угнетает образование АФК нейтрофилами.

Бывают ситуации (клинический случай №3) при которых даже длительное введение рчГ - КСФ не приводит к восстановлению гемопоэза и ки-слородзависимых антимикробных свойств HJI, в то время как сочетанное использование рчГ - КСФ и рчГМ - КСФ оказывается перспективным в этом случае. Поэтому, важным представляется дальнейшее изучение ки-слородзависимой антикандидозной и антимикробной активности нейтрофилов при сочетанном применения миелоцитокинов (рчГ - КСФ, рчГМ -КСФ) и/или ИФН - у у онкогематологических больных при грибковых инфекциях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никифорова, Зоя Николаевна, 2003 год

1. Быков В. Л. Патогенез и морфогенез кандидоза при иммуносупрессии. // Архив патологии, 1990, №10, с.35-38.

2. Владимиров Ю. А., Шерстнёв М. П. Хемилюминесценция клеток животных. // Итоги науки и техники. Серия Биофизика. 1989, Т. 24, с. 48 -64.

3. Волкова М. А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор гра-ноцит и его клиническое применение.// Терапевтический архив, 1998, № 4, с.80 84.

4. Клиническая онкогематология. / Под ред. Волковой М. А. 2001, М.: «Медицина» - 576 с.

5. Клясова Г. А. Микотические инфекции: клиника, диагностика, лечение. // Инфекции и антимикробная терапия, 1999, Т.2, №6, с. 184 189.

6. Клясова Г. А., Савченко В. Г. Микотические инфекции у больных гемобластозами. // Проблемы гематологии, 1997, № 1, с. 17 25.

7. Мацнер Я. Дисфункция гранулоцитов при гематологических заболеваниях.//Гематология и трансфузиология, № 5, 1993, стр.41- 43

8. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. 1983г, Новосибирск: Наука, 255 стр.

9. Невмятулин А. Л., Зеленова Е. Г., Маянский А. Н. Сравнительная оценка метаболизма нейтрофилов по реакциям хемилюминесценции и восстановления нитросинего тетразолия. // Лаб. дело, 1985, N 6, с. 347 -348.

10. Нестерова И. В., Колесникова Н. В. Цитокиновая регуляция и функционирующая система нейтрофильных гранулоцитов. // Гематология и трансфузиология, 1999, Т. 44, № 2, с. 43 47.

11. Покровская О.Л., Фролова Е. В., Караев 3. О. Иммуномодулирующие свойства грибов рода Candida. И ЖМЭИ, 1988, № 10, с.79 84.

12. Полякова М.И, Караев З.О, Сардыко Н.В. Фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных хроническим кандидозом кожи и слизистых оболочек.// ЖМЭИ, 1991, № 2, с 63 65.

13. Попов Г.А., Конев В.В. К механизму хемилюминесценции люминола в липоксигеназной реакции.// Теоретические и методические основы био-хемилюминесценции.// Материалы симпозиума " Биохемилюминесцен-ция в медицине и с/х ", 1986.

14. Птушкин В.В., Сидоренко С.В. Лечение и профилактика инфекций у больных с нейтропенией. // Учебно методическое пособие для врачей, М., 2000 г.

15. Сергеев А.Ю. Иммунитет при кандидозе. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 1999, № 1, с. 91- 100.

16. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение. 2001, М.: «Триада-X», 472 с.

17. Сизякина Л.П., Докукина И.Л., Шемшура А. Б. Возможность использования гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (филгра-стим) в лечении ВИЧ больных. // Иммунология, 2000, № 1, с. 10 - 12.

18. Смолянская А.З., Дмитриева Н.В., Кулага Е.В., Петухова И.Н. Грибковая инфекция в онкологической клинике. // Антибиотики и химиотерапия, 1999, Т. 44, № 4, с. 25 30.

19. Токмаков А.А., Васильев В.Ю. Исследование роли активных форм кислорода в индукции люминолзависимой хемилюминесценции макрофагов.//Биохимия, 1991, Т. 56, вып.2, с.250 257.

20. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения.// Иммунология, 2000, № 5, с.4 7.

21. Хохлов С.Е., Пахомова Е.Н., Быков В.Л. Взаимодействие нейтрофильных гранулоцитов с грибами Candida albicans при формировании микотических очагов в условиях иммуносупрессии.// ЖМЭИ, 1990, № 10, с.35 38.

22. Чердынцева Н.В., Богданин Н.В., Небера С.А., Васильев Н.В. Состояние нейтрофильных гранулоцитов у больных со злокачественными новообразованиями. // Вопросы онкологии, 1992, Т. 38, с.182 187.

23. Черепанова Е.А., Тузов М.Ю., Гордиенко С.М. Хемилюминесценция очищенной популяции гранулоцитов и цельной крови. Действие различных факторов.//Лаб. дело, 1987, №8, с. 610 614.

24. Allen R. С. Phagocytic leukocyte oxygenation activities and chemilumines-cence: a kinetic approach to analysis. Meth. Enzyrn., 1984, v. 133, p. 449 -493.

25. Andres Vazguez Torres and E. Balish. Macrophages in resistance to candidiasis. - Microbiol. Mol. Biol.Rev., 1997, v. 61 (2), p. 170 - 192.

26. Ashitani J., Nakazato M., Mukae H., Taniguchi H., Date Y., Matsukura S. Recombinant granulocyte colony stimulating factor induces production of human neutrophil peptides in lung cancer patients with neutropenia. - Reg. Peptides, 2000, v.95, p. 87 - 92.

27. Babior B.M. NADPH oxidase: an update. Blood, 1999, v.93 (5), p. 1464 -1476.

28. Basu S., Hodgson G., Zhang H.H., et all "Emergency" granulopoiesis in G-CSF deficient mice in response to Candida albicans infection. - Blood, 2000, v.95 (12), p. 3725-33

29. Bettelheim P., Andreeff M., Taftiri A. et all Recombinant human granulocyte- macrophage colony stimulating factor in combination with standart induction chemotherapy in de novo acute myeloid leukemia. Blood, 1991, v. 77(4), p. 700-711.

30. Blot S., Vandewoude K., Hoste E., Poelaert J., Colardyn F. Outcome in critically ill patients with candidal fungaemia: Candida albicans vs. Candida glabrata. J. Hosp. Infect., 2001, v.47 (4), p. 308 - 13.

31. Bober L. A., Bhalla S.C., Anaissie E.J. The effect of GM CSF and G - CSF on human neutrophil function. - Immunopharmacology, 1995, v.29 (2), p.l 11119

32. Bodey G.P., Anaissie E., Gutterman J., Vadhan Raj S. Role of granulocyte-macrophage colony - stimulating factor as adjuvant therapy for fungal infection in patients with cancer. - Clin. Infect. Dis., 1993, v. 17 (4), p. 705 - 7

33. Bouchama A., Khan В., Djazmati W., Shukri K. Hematopoietic colony-stimulating factors for neutropenic patients in the ICU. Intensive Care Med., 1999, v. 25, p. 1003 - 1005.

34. Buck A.M., Jayaram Y., and Hogg N. Colony stimulating factors and interferon - gamma differentially affect cell surface molecules shared by monocytes and neutrophils. - Clin. Exp. Immunol., 1990, v. 81, p. 339 - 345.

35. Cebon J., Layton J.E., Maher D., Morstyn G. Endogenous hemopoietic growth factors in neutropenia and infection. Br. J. Haematology, 1994, v. 86, p.265 - 274.

36. Clark R.A. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase. J. Inf. Dis., 1999, v. 179, suppl. 2, p. S 309 -17.

37. Cremer J., Vabou V., Braveny I. 2,4 (Hydroxy - phenyl) - ethanol, an anti-oxidative agent produced by Candida spp., impairs neutrophilic yeast killing in vitro. - FEMS Microbiol. Let., 1999, v. 170, p. 319 - 325.

38. Dinauer (Chair) M.C., Lekstrom Himes J. A. and Dale D.C. Inherited neutrophil disorders: molecular basis and new therapies. - Haematology, 2000, v. 45, p. 303-318.

39. Dyke K.Y. and Dyke C.V. Cellular chemiluminescence associated with disease states. Meth. Enzym., 1984, v.133, p.493 - 507.

40. Forehand J. R., Johnston R.B. and Bomalaski J.S. Phospholipase A2 activity in human neutrophils - stimulation by lipopolysacharide and possible involvement in priming for an enhanced respiratory burst. - J. Immunol., 1993, v. 151, p. 4918-4925.

41. Gauzit R. Epidemiology and prognostic factors of systemic candidiasis in intensive care units., Ann. Fr. Anesth. Reanim., 2001, v.20 (4), p. 394 9 (Abstract).

42. Geller R.B. The Use of cytokines in the treatment of patients with acute myelocytic leukemia. Top. Supp. Care. Oncology, 1997, v.2 (23), p.4 - 7.

43. Giles F. J. Monocyte macrophages, granulocyte - macrophage colony -stimulating factor, and prolonged survival among patients with acute myeloid leukemia and stem cell transplants. - Clin. Inf. Dis., 1998, v. 26, p.1282 - 89.

44. Gorden I., Hartung Т., Leist M., et all Granulocyte colony stimulating factor treatment protects rodents against lipopolysacharide - induced toxicity via suppression of systemic tumor necrosis factor - alpha. - J. Immunology, 1992, v. 149, p. 918-924.

45. Hampton M.B., Kettle A. J. and Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase and bacterial killing. Blood, 1998, v. 92 (9), p. 3007-3017.

46. Heberer M., Ernst M., Durig M., et all Measurement of chemiluminescence in freshly drawn human. II Clinical application of zymosan induced chemiluminescence. - Blood. Klinisch. Wochen, 1982, v.60, p. 1443 - 1448.

47. Hefeman D.G., Lucas Z.J. Polymorphonuclear leukocyte mediated, antibody - dependent, cellular cytotoxicity against tumor cells dependence on oxygen and the respiratory burst. - J. Immunol., 1997, v.123, N 1, p.55 - 62.

48. Jones T.C. Use of granulocyte macrophage colony - stimulating factor (GM - CSF) in prevention and treatment of fungal infections. - Eur. J. Cancer, 1999, v.35, suppl.3, p. S8 - S10.

49. Kan V.L., Gerber A., and Bennett J.E. Enhanced oxidative killing of azole -resistant Candida glabrata strains with ERG 11 Deletion. Antimic. Agen. Chem., 1996, v.40 (7), p. 1717 - 1719.

50. Kawakami M., Tsutsumi H., Kumakawa Т., et all. Levels of serum granulocyte colony stimulating factor in patients with infection. - Blood, 1990, v.76,p.l962- 1964.

51. Kullberg B.J., Netea M.G., Vonk A.G., van der Meer J.W. Modulation of neutrophil function in host defense against disseminated Candida albicans infection in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1999, v. 26, p. 299 -307.

52. Kuritzkes D.R. Neutropenia, neutrophil dysfunction, and bacterial infection in patients with human immunodeficiency virus disease: the role of granulocyte colony stimulating factor. - Clin. Infect. Dis., 2000, v.30 (2), p. 256 -60.

53. Kurzrock R. Hematopoietic growth factors. Principles of Biotherapeutics, 2000.

54. Leavey P.J., Sellins K.S., Thurman G., Elsi D., et all In vivo treatment with granulocyte colony stimulating factor results in divergent effects on neutrophil functions measured in vitro. - Blood, 1998, v.92 (11), p. 4366 - 4374.

55. Leino L., Nuutila J., Pelliniemi T.T., Rajamaki A. Human recombinant GM-CSF selectively primes receptor mediated respiratory burst of neutrophils in vitro. Immunol. Lett., 1993, v. 38 (l),p. 26-31.

56. Leiscke G. J., Burgess A.W. G CSF and GM - CSF. - N. Engl. J. Med., 1992, v. 327, p. 28-35.

57. Liles W.C., Huang J.E. Granulocyte colony stimulating factor administered in vivo augments neutrophil - mediated activity against opportunistic fungal pathogens. - J. Infect. Dis., 1997, v. 175 (4), p.1012 - 50ther.

58. Lindemann A., Herrmann F., Oster W., Haffner G., Meyenburg W., Souza L. M., Mertelsmann R. Hematologic effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor in patients with malignancy. Blood, 1989, v. 74 (8), p. 2644-2651.

59. Marzzullo L., Souza L.C., Campa A. Effect of amphotericin В associated with a lipid emulsion on the oxidative burst of human polymorphonuclear leukocytes. Gen. Pharmacol., 1997, v. 28 (2), p. 203 - 7.

60. Maridonneau Parini I., Tringale S.M. and Tauber A. I. Identification of distinct activation pathways of the human neutrophil NADPH - oxidase. -J.Immunol., 1986, v. 137, N 9, p.2925 - 2929.

61. Marodi L., Forehand J.R., Johnston R.B. Mechanisms of host defense against Candida species. II. Biochemical basis for the killing of Candida by mononuclear phagocytes. J. Immunol., 1991, v. 146 (8), p. 2790- 94.

62. Maurie C., Dall D.C., Mackey M.C. Cyclical neutropenia and other periodic hematological disorders: a review of mechanisms and mathematical models. Blood, 1998, v.92 (8), p. 2629 - 2640.

63. Natarajan U., Brummer E., and Stevens D.A. Effect of granulocyte colony -stimulating factor on the candidacidal activity of polymorphonuclear neutrophils and their collaboration with fluconazole. Antimicrob. Ag. Chem., 1997, v. 41 (7), p.1575 - 78.

64. O'Flaherty J.T., Kuroki M., Nixon A.B., et all 5 oxo - eicosanoids and hematopoietic cytokines cooperate in stimulating neutrophil function and the mitogen - activated protein kinase pathway. - J. Biol. Chem., 1996, v. 271 (30), p. 17821 - 17828.

65. Okada Y., Kawagish M., and Kusaka M. Effect of recombinant human granulocyte colony stimulating factor on human neutrophil adherence in vitro. -Experientia, 1990, v. 46, p. 1050 - 52.

66. Pajkrt D., Manten A., van der Poll Т., et all Modulation of cytokine release and neutrophil function by granulocyte colony stimulating factor during en-dotoxemia in humans. - Blood, 1997, v. 90 (4), p, 1415 - 1424.

67. Pitzurra L., Fringuelli R., Peritos, et all A new azole derivative of 1,4 ben-zothiazine increases the antifungal mechanisms of natural effector cells. -Antimic. Ag. Chem., 1999, v. 43 (9), p.2170 - 2175.

68. Ribaud P. Fungal infections and the cancer patient. Eur. J. Cancer, 1997, v.33, suppl.4, p. s50 - s54.

69. Rodenas Y., Mitjavila М.Т., Carbonell T. Nitric oxide inhibits superoxide production by inflammatory polymorphonuclear leukocytes. Amer. J. Physiol, 1998, v. 274, N 3, p.827 - 830.

70. Rodriguez Adrian L. J., Grazziuti M. L., Rex J. H. and Anaissie E.J. The potential role of cytokine therapy for fungal infections in patients with cancer: is recovery from neutropenia all that is needed? - Clin. Inf. Dis., 1998, v. 26, p. 1270-8.

71. Rowe J. M. Treatment of acute myeloid leukemia with cytokines: effect on duration of neutropenia and response to infection. Clin. Inf. Dis., 1998, v. 26, p. 1290- 1294.

72. Sattler M., Winkler Т., Verma S., et all Hematopoietic growth factors signal through the formation of reactive oxygen species. Blood, 1999, v.93 (9), p. 2928 -2935.

73. Saunders G. G CSFs in daily pharmaceutical practice. - Eur. J. Clin. Pharm., 2001, v.3 (4), p.257 - 263.

74. Steinshamn S., Bergh K., Wage A. Effects of stem cell factor and granulocyte colony stimulating factor on granulocyte recovery and Candida albicans infection in granulocytopenic mice. - J. Infect. Dis., 1993, v. 168, p.1444-8.

75. Stevens D. A. Combination immunotherapy and antifungal chemotherapy. -Clin. Inf. Dis., 1998, v. 26, p. 1266 9.

76. Stryckmans P. A. Growth factors in the therapy of acute myeloid leukemia. -Top. Supp. Care Oncol., 1997, v.2 (23), p.l 2.

77. Sullivaan R., Fredette J.P., Socinski M. Et all Enhancement of superoxide anion release by granulocytes harvested from patients receiving granulocyte -macrophage colony stimulating factor. - Br. J. Haematol., 1989, v.71, p. 475 - 479.

78. Trick W.E., Fridkin S.K., Edwards J.R., Hajjeh R.A., Gaynes R.P. Secular trend of hospital acquired candidemia among intensive care unit patients in the United States during 1989 - 1999. - Clin. Infect. Dis., 2002, v.35 (5), p.627 - 30 (Abstract).

79. Verbeek W., Wormann В., Koch P., Aul C., et all S HAM induction chemotherapy with or without granulocyte - macrophage colony - stimulating factor in patients with high - risk myelodysplastic syndrome. - Ann. Hematol., 1997, v. 74, p.205 -208.

80. Weisbart R.H., Golde D.W., Clark S.C., Wong G.G. and Gasson J.C. Human granulocyte macrophage colony - stimulating factor is a neutrophil activator. - Nature, 1985, v. 314 (28), p. 361 - 363.133

81. Weisbart R.H., Kwan L., Golde D.W., Gasson J.C. Human granulocyte -macrophage colony stimulating factor primes neutrophils for enhanced oxidative metabolism in response to the major physiological chemoattractants. -Blood, 1987, v. 69, p. 18-21.

82. Xu S., Hoglund M., Hakansson L., Venge P. Granulocyte colony stimulating factor (G - CSF) induces the production of cytokines in vivo. - Br. J. Haematol., 2000, v.108 (4), p. 848 - 53.

83. Xu S., Hoglund M., and Venge P. The effect of granulocyte macrophageлcolony stimulating factor on the degranulation of secondary granule proteins from human neutrophils in vivo may be indirect. - Brit. J. Haematol-ogy, 1996, v. 93, p. 558-568.

84. Zinner S.H. Antimicrobial therapy in cancer patient studies from the EORTC International Antimicrobial Therapy Cooperative Group. Eur. J. Cancer, 1997, v.33, suppl.4, p. S 44 - S49.