Гормональная регуляция заключительных стадий оогенеза у низших позвоночных животных: Теоретические и практические аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.11, доктор биологических наук в форме науч. докл. Гончаров, Борис Федорович

• Гончаров, Борис Федорович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Гончаров, Борис Федорович

Актуальность темы

Гормональная регуляция оогенеза низших позвоночных животных на протяжении многих десятилетий остается в поле зрения многочисленных исследователей. Многие аспекты этой проблемы неоднократно освещались в обзорах, в том числе и в последнее время (Jalabert et а!., 1991; Redding, Patino, 1993; Nagahama, 1994; Specker, Sullivan, 1994; Nagahama et al., 1995; Tyler, Sumpter, 1996).

Несмотря на существенные успехи в исследовании механизмов гормональной регуляции двух заключительных этапов оогенеза - вителлогенеза и созревания ооцитов, малоизученным и малопонятным остается механизм, регулирующий переход от одного процесса к другому. Известно, что оба эти процесса происходят только при наличии в крови гонадотропного гормона (ГТГ). В период вителлогенеза ГТГ стимулирует образование стероидогенными клетками яичника эстрогенов, которые, в свою очередь, запускают и поддерживают синтез вителлогенина в печени. Вителлогенин поступает в яичник по кровеносной системе и поглощается ооцитом с помощью специфических рецепторов. Созревание ооцитов и овуляция у большинства видов запускается внешним стимулом, или стимулами, такими как фотопериод, температура, наличие нерестового субстрата, брачного партнера и т. д. Этот внешний стимул, воспринимаемый нервной системой через органы чувств, активирует деятельность отделов гипоталамуса, вырабатывающих и секретирующих гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ). Он стимулирует синтез и секрецию ГГГ, и концентрация ГТГ в крови за относительно короткий срок повышается в десятки п сотни раз. Этот выброс гормона и вызывает два сопряженных но времени процесса -созревание ооцита и овуляцию.

Благодаря тому, что уже достаточно давно сначала для амфибий, а зачем и л ля рыб, созревание ооцитов научились воспроизводить in \iiro. исследователям удалось выяснить механизм действия ГТГ в этот период. Было показано, что ГТГ действует не прямо на ооцит, а опосредованно, стимулируя образование и секрецию клетками ленки фолликула (ооцита, одетого оболочками) мейоз-индунирующего стероида, который запускает цепь теперь уже хорошо известных биохимических реакций. преобразующих ооцит в зрелую яйцеклетку (Nagahama et al., 1995). Показано, что у большинства изученных видов амфибий в этой роли выступает прогестерон, а у рыб 17а,20р-дигидрокси-4-прегнен-3-он (17а,20р-ДГП) (Jalabert et al., 1991).

Однако оставалось неясным, почему до определенного периода 1ТГ поддерживает процесс вителлогенеза, а в какой-то момент запускает процессы созревания и овуляции ооцитов. Теоретически можно было допустить существование четырех альтернативных механизмов перехода ооцитов от вителлогенеза к созреванию.

1. Каждый из этих процессов регулируется своим специфическим ГТТ, и в определенный момент оогенеза происходит смена индуктора.

2. ГГГ один. Характер же процесса, происходящего при его участии, определяется количеством гормона.

3. Гонадотропин или гонадотропины не вызывают переход от одного процесса к другому, а лишь регулируют скорость процессов. Сама же смена процессов происходит благодаря изменению ответа реагирующей системы, происходящему в результате самодифференцировки фолликула.

4. Роль ГТГ та же, что и в предыдущей модели, однако изменение ответа реагирующей системы происходит под влиянием какого-то (не относящегося к гонадотропинам) эндогенного, либо экзогенного фактора (например, температуры).

Для проверки этих гипотез необходимо было получить в очищенном виде и изучить свойства ГТГ.

Начиная с 60-х годов начали появляться работы по очистке ГТГ рыб, при этом авторы обнаруживали только один гормон, способный как поддерживать вителлогенез, так и индуцировать созревание и овуляцию ооцитов (Bursawa-Gerard, Fontaine, 1965; Yamazaki, Donaldson, 1968). Таким образом, казалось, что первая гипотеза может больше не приниматься в расчет. Однако позднее были получены неоспоримые доказательства существования у рыб двух ГТГ, различающихся как по структуре, так и по некоторым биологическим свойствам (см. Tyler, Sumpter, 1996). Тем не менее, их роль в регуляции вителлогенеза и созревания ооцитов остается пока не вполне выясненной. Два ГТГ, гомологичные фолликулостимулирующему (ФСГ) и лютеинизируюшему (ЛГ) гормонам млекопитающих и других высших позвоночных, были найдены и у амфибий еще раньше, однако их роль в регуляции гаметогенеза также остается малопонятной (Polzonettimagni et al., 1998).

Рассматриваемое направление исследований всегда было тесно связано с практикой разведения видов, используемых в народном хозяйстве, или в учебных и исследовательских целях. Неудачи, периодически возникающие при использовании методов гормональной стимуляции созревания половых продуктов, со всей очевидностью показывают несовершенство наших знаний в этой области.

Цели исследования

Целью нашего исследования было изучение гормональной регуляции заключительных этапов оогснеза у представителей двух классов низших позвоночных животных - амфибий и рыб, в частности, осетровых. Была поставлена задача выявить закономерности становления компетенции созревания и попытаться выяснить, какие эндогенные и экзогенные факторы влияют на этот процесс. Для изучения механизма действия ГТГ у осетровых рыб представлялось важным получить гормон в очищенном виде, изучить его физико-химические и биологические свойства и сравнить их со свойствами ГТГ карпа, как наиболее изученного ГТГ костистых рыб. Для проведения этих исследований необходимо было разработать высокочувствительный метод определения гонадотропной активности, а для изучения механизма действия ГТГ подобрать среду культивирования фолликулов осетровых рыб, которая позволяла бы in vitro получать индуцированное ГТГ созревание ооцитов.

Предполагалось также, опираясь на полученные результаты, разработать новые методические подходы, позволяющие повысить эффективность искусственного размножения низших позвоночных животных и, в частности, осетровых рыб

Научная новизна

При изучении становления способности фолликула в целом и ооцита в отдельности реагировать на соответствующие гормональные стимулы впервые обнаружено подавляющее действие гормонов гипофиза на созревание оонитон травяной лягушки, вызываемое in vitro прогестероном. Выяснено, что этот эффект воспроизводится и на других видах амфибий и на осетровых рыбах. Показано, что подавляющий эффект, так же как и стимулирующий, опосредован активностью клеток стенки фолликула. Получены данные, указывающие на то, что посредником подавляющего действия может быть цАМФ.

Впервые получен в высокоочищенном виде ГТГ представителя осетровых рыб -севрюги и изучены его физико-химические и биологические свойства. Обнаружено явление полиморфизма ГТГ севрюги. Получены фракции гормона, не содержащие общих изоформ, и показано, что в их действии есть качественные различия. Проведено сравнение ГТГ карпа и севрюги и показаны различия их физико-химических свойств и качественные различия к биологическом действии. Показано, что один и тот же ГТГ оказывает и подавляющее и стимулирующее действие на созревание ооцитов.

Впервые обнаружена высокая чувствительность осетровых рыб к структурному аналогу гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) млекопитающих.

Сформулированы представления, согласно которым основной механизм регуляции перехода ооцитов к созреванию сходен у позвоночных животных и связан с существованием более или менее выраженного периода компетенции созревания, во время которого ГТГ оказывает двойное (стимулирующее и подавляющее) действие, а созревание ооцита происходит, когда их соотношение меняется в пользу стимулирующего действия.

Практическая ценность

Разработан высокоточный и высокочувствительный метод сравнительного количественного определения гонадотропной активности гипофизов низших позвоночных, и, в частности, осетровых рыб. Предложен критерий отбора самок осетровых рыб, пригодных для получения качественных половых продуктов. Разработан и внедрен в практику промышленного осетроводства новый метод получения зрелых половых продуктов, основанный на применении суперактивного синтетического аналога ГнРГ. Разработаны методы гормональной стимуляции процессов размножения для ряда видов амфибий, в том числе редких и исчезающих.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Межлабораторном эмбриологическом семинаре ИБР, на Международных (Москва, 1969, Патрас, 1980) и Всесоюзных эмбриологических конференциях (Москва, 1981). на Всесоюзных совещаниях по осетроводству (Астрахань, 1969, 1979, 1984, 1986), на Всесоюзной конференции по раннему развитию рыб (Киев, 1978), на Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985), на Международных конференциях и симпозиумах по сравнительной эндокринологии (Монпелье, 1971; Найроби, 1974; Левен, 1990; Руан, 1996), на Конференциях европейских герпетологов (Прага, 1985; Будапешт, 1991), на Всемирном конгрессе по герпетологии (Кентербери, 1989). на Международных симпозиумах по осетровым рыбам (Бордо, 1989; Москва, 1993; Пьяченца, 1997), на Всесоюзном совещании по зоокультуре (Москва, 1986), на Всесоюзном совещании по репродуктивной физиологии рыб (Минск, 1991), на Международной конференции по разнообразию и сохранению осетровых рыб (Нью-Йорк, 1994), а также в ряде отечественных и зарубежных научно-исследовательских институтов.

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П.Филатова Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, в Лаборатории общей и сравнительной физиологии Музея естественной истории (Париж, Франция), в Лаборатории биологии размножения рыб Университета Бордо 1 (Франция) и в Национальном центре по совершенствованию управления сельским хозяйством, лесными и водными ресурсами (СЕМАОЯЕР), группа Бордо (Франция).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Основные опыты, связанные с изучением механизма гормональной регуляции заключительных этапов оогенеза, выполнены на фолликулах осетровых рыб (севрюги Acipenser stellalus\ русского A. gueldenstaedti, сибирского A. baeri и персидского A. persicus осетров) и амфибий (травяной лягушки Rana temporaria и зеленой жабы Bufo viridis). Этих представителей разных классов позвоночных животных объединяет не только сходное строение ооцитов, но и четкая сезонность процесса размножения. Процессы вителлогенеза и созревания ооцитов у них разделены во времени. Достигшие дефинитивного размера ооциты долгое время (для амфибий - это большая часть периода зимовки, а для осетровых -период миграции на нерестилища) находятся в состоянии компетенции созревания, то есть способны реагировать созреванием на воздействие гормонов. Выбор этих объектов исследования был связан с тем, что путем сопоставления закономерностей и механизмов гормональной регуляции у достаточно удаленных в таксономическом плане видов можно выявлять общие и, следовательно, наиболее консервативные элементы системы, возможно, участвующие в регуляции этих процессов у более широкого круга позвоночных животных. С другой стороны, изучение видов, имеющих экономическую ценность, к которым несомненно относятся осетровые рыбы, могло дать результаты, полезные для практики их искусственного разведения.

В ходе исследований возникала необходимость проверки выявленных закономерностей или решения определенных задач на более широком круге объектов. В связи с этим некоторые работы были проведены и на нескольких видах костистых рыб. Особенно же круг объектов был расширен, когда возникла необходимость разработки универсального метода для индукции процессов размножения у редких, исчезающих и «проблемных» видов амфибий.

Культивирование фолликулов амфибий и осетровых рыб. При проведении опытов in vitro для культивирования фолликулов бесхвостых амфибий был использован раствор Рингера для холоднокровных (Rugh, 1962), а для осетровых рыб сначала среда, предложенная М.Н.Скоблиной (1971), а затем модификация раствора Рингера (Гончаров, 1978). Фолликулы осетровых рыб и амфибий культивировали в маленьких чашках Петри или стеклянных пузырьках в 7,5, 5, или 2 мл среды по возможности при постоянной температуре. Прогестерон вносили в сухие чашки в виде спиртового раствора и после испарения спирта заполняли чашки средой.

Прогестерон использовали в концентрации 5 или I мкг/мл. Экстракт гипофиза ('31) готовили из гомогенизированных гипофизов, либо непосредственно перед этим извлеченных, либо ацетонированных. Время экстракции составляло около 1 ч при комнатной температуре В случае амфибий культивировали небольшие фр;н менты яичника, содержащие от одного до шести фолликулов, а в случае осетровых рыб одиночные фолликулы. Критерием созревания служило разрушение оболочки зародышевого пузырька (ядра ооцита), которое регистрировали при разрезании под бпнокуляром фиксированных кипячением ооцитов. В некоторых случаях использовали дополнительные критерии созревания, такие как способность созревшего ооцита не повреждаться при помещении в воду и способность к активации уколом. Продолжительность процесса созревания ооцитов измеряли в астрономических единицах, если температура культивирования была постоянной, или в т„ (см. Ое11аП и а!. 1993) при переменной температуре культивирования.

Определение продолжительности гормонозависимого периода (ГЗП) созревания ооцита. Сначала продолжительность ГЗП у осетровых рыб определяли путем двукратной отмывки фолликулов модифицированным раствором Рингера Однако после того, как были найдены условия, при которых П'Г не может осуществлять свое действие, а прогестерон способен это делать, был разработан метод (Гончаров, 1978; Гончаров и др., 1997), основанный на переносе фолликулов из модифицированного для осетровых рыб раствора Рингера, содержащего ГТГ, » обычный раствор Рингера для холоднокровных. Поскольку было показано, что продолжительность ГЗП зависит от дозы гормона (Гончаров, 1971а), а стандартных гонадотропных препаратов для низших позвоночных не существует, для получении сопоставимых результатов использовали маточный порошок ацетонированных гипофизов или препарат ГТГ севрюги (с-ГГГ).

Очистка гонадотропного гормона гипофиза севрюги. Для очистки с-ГТГ использовали обычные методы, используемые для очистки белков и, в частности", гликопротеинов. Так, были использованы: спиртовое просачивание, гель-фильтрация, хроматография на ионообменниках, препаративный электрофоре! и абсорбционная хрома roi рафия. Для определения гонадотропной активное m н ходе очистки использовали реакцию спермиации прудовой лягушки (Строганов и Алпатов, 1950; Fontaine, Cliauvel, 1961) и реакцию созревания ооцитов амфибий in vitro ( Iornton, 1971; Гончаров, 1971а).

Характеристика физико-химических свойств гонадотроиного гормона гипофиза севрюги. Молекулярную массу очищенного с-ГТГ определяли методом электрофореза в присутствии додецил сульфата натрия (Fairbanks et ai., 1971). Электрофоретическую подвижность фракций с-ГТГ определяли при постановке диск-электрофореза в полиакриламидном геле (7,5%). Аминокислотный состав определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе. Изоэлектрические точки (р!) фракций с-ГТГ определяли с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) (Winter et al., 1977). После кислотного гидролиза препарата определяли содержание гексоз (Tsugita, Akabori, 1959) и сиаловой кислоты (Warren, 1959). N-концевые аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии (Woods, Wang. 1967).

Статистический анализ. Для сравнения различных количественных характеристик использовали общепринятые статистические методы. Медианную эффективную дозу (Д50) и соотношение активности различных препаратов расчитывали с доверительными интервалами для Р=0,05 (Emmens, 1948). Продолжительность созревания 50% ооцитов (Т50) определяли после преобразование процентов в пробиты (Finney, 1971). Различия показателей альтернативной изменчивости оценивали с помощью теста Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Становление компетенции созревания. После того, как было выяснено, что у амфибий (Masui, 1967; Schuetz, 1967; Smith et al., 1968) и осетровых рыб (Детлаф, Скоблина, 1969) существует двухступенчатый механизм индукции созревания ооцитов, возник вопрос, появляется ли способность ооцитов реагировать созреванием на прогестерон раньше или одновременно со способностью фолликула реагировать созреванием оошгга на действие ГТГ. Попутно, начиная эту работу на травяной лягушке, виде с четко выраженной сезонностью размножения, мы хотели проверить, насколько важными для становления компетенции являются такие факторы как зимовка и достижение ооцитом дефинитивного размера. Самок отлавливали, начиная с июля, и проверяли in vitro способность их ооцитов и фолликулов реагировать на действие соответствующих гормонов. Было показано, что ооцит приобретает компетенцию созревания раньше, чем фолликул, но в обоих случаях до начала зимовки, в тот период, когда ооциты уже практически достигают дефинитивного размера.

Несмотря на то, что понижение температуры до 4°С (температура зимовки) не является необходимым условием для становления компетенции созревания ооцитов у травяной лягушки, температурный фактор может принимать участие в регуляции гаметогенеза. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором самки были помещены в температурные условия зимовки за 1,5 месяца до наступления среднего срока естественной зимовки. В этот момент вителлогенез у них не был закончен, и их фолликулы не реагировали ни на прогестерон, ни на гормоны гипофиза. Через три месяца искусственной зимовки ооциты не увеличились в объеме (он составлял 0.59 от дефинитивного объема), но при этом все ооциты приобрели способность реагировать созреванием in vitro на прогестерон, и от 34 до 100% фолликулов реагировали созреванием ооцита на действие гормонов гипофиза.

Таким образом, ни зимовка, ни достижение ооцитом дефинитивного размера у травяной лягушки не являются непременными условиями появления компетенции созревания, хотя понижение температуры и может существенно влиять на соотношение процессов вителлогенеза и созревания. Механизм этого влияния остается до сих пор не вполне ясным.

В опытах rio изучению времени появления чувствительности фолликула и ооцита к гормонам был также использован вариант совместного действия этих гормональных препаратов, поскольку было известно (Masni, 1967), что такое воздействие является более эффективным для индукции овуляции in vitro у самок леопардовой лягушки Rana pipiens, взятых из зимовки задолго до начала нереста. В опытах на фолликулах самок, отловленных до начала зимовки в тот момент, когда их ооциты уже приобрели способность реагировать на прогестерон, а гормоны гипофиза не оказывали стимулирующего действия, было обнаружено, что ЭГ частично или полностью подавляет созревание, вызываемое прогестероном. По мере приближения времени зимовки этот подавляющий эффект исчезал. На основании этих опытов было сделано заключение о том, что становление компетенции созревания у травяной лягушки проходит несколько стаций:

1) ооциты становятся чувствительными к прогестерону, но их реакция подавляется при воздействии на фолликул гормонами гипофиза;

2) то же, но гормоны гипофиза не оказывают ни подавляющего, ни стимулирующего действия;

3) ооциты реагируют созреванием и на прогестерон, и при воздействии на фолликул гормонами гипофиза.

Такие же стадии становления компетенции были найдены и у другого представителя бесхвостых амфибий - озерной лягушки (Rana ridibunda). Интересно, что если у травяной лягушки - вида с единовременным нерестом, в каждый данный момент в яичнике находились фолликулы на одной или двух соседних стадиях компетенции, то у порционно нерестящегося вида - озерной лягушки - на всех грех стадиях. И, наконец, прохождение фолликулами тех же стадий становления компетенции было показано на осетровых рыбах (Гончаров, 19696).

При сравнении чувствительности фолликулов осетровых рыб к гормонам гипофиза in vitro и in vivo не всегда обнаруживалось соответствие полученных результатов. У некоторых самок фолликулы не отвечали на гормоны гипофиза in vitro, однако после инъекции им суспензии гипофизов происходило созревание ооцитов и овуляция. В связи с этим возник вопрос о том, является ли среда культивирования, которую мы использовали, оптимальной для выявления чувствительности фолликулов осетровых рыб к гормонам гипофиза.

Влияние состава среды культивирования на способность фолликулов осетровых рыб реагировать созреванием ооцитов на действие гонадотропных гормонов гипофиза и прогестерон. Первоначально мы использовали среду культивирования (Скоблина, 1971), рН которой доводили бикарбонатом натрия. Поскольку результаты варьировали от опыта к опыту, было решено перепроверить влияние pli л состава среды на способность фолликулов севрюги реагировать созреванием ооиита на действие гормонов гипофиза. Оказалось, что при увеличении в растворе Рингера концентрации NaHCOj до 500 мг/л (рН 8), на ГТГ реагируют фолликулы лишь очень немногих самок. При дальнейшем увеличении концентрации NaHCOj до 2 г/л рН практически не изменяется, однако процент самок, фолликулы которых реагируют на ГТГ, существенно увеличивается. Тот же результат был получен и при увеличении концентрации NaCI, а не NaHCOj. Из этого следует, что для получения реакции фолликулов осетровых рыб на ГТГ in vitro важным фактором является тоничность среды культивирования. Однако пороговое значение тоничности среды, при котором возможна реакция на ГТГ, не является универсальным дли всех самок и зависит от физиологического состояния фолликулов. Мы обнаружили также, что при определенных концентрациях NaHCOj среда сама начинает вызывать созревание ооцитов. При этом происходит не только разрушение оболочки зародышевого пузырька, но и преобразование цитоплазмы и кортекса, позволяющее зрелому яйцу не повреждаться в воде и активироваться под влиянием соответствующего стимула. Нижнее значение концентрации NaHCOj, при котором происходит негормональная индукция созревания, также зависит от физиологического состояния фолликулов и чаще всего находится в диапазоне 1,5 -3,5 г/л. При проведении опытов мы обычно использовали раствор Рингера, содержащий 1,5-2 г/л NaHC03, так как такая среда обеспечивает реакцию фолликулов большинства самок на ГТГ, но не вызывает созревания ооцитов Концентрация NaHCOj влияет не только на способность фолликулов отвечать на действие ГТГ, но и на их чувствительность к этим гормонам (Гончаров, 1978; Гончаров и др., 1997).

Влияние указанных выше параметров среды было изучено нами на трех видах осетровых рыб - севрюге, персидском и сибирском осетрах (Гончаров и др , 1997). При этом были получены сходные закономерности. Напротив, опыты с использованием различных сред, проведенные нами на фолликулах травяной лягушки и зеленой жабы, показали, что для первого вида оптимальной средой с точки зрения чувствительности фолликулов к гормонам гипофиза является классический раствор Рингера, а для второго вида - раствор Рингера, в котором концентрация №НСОз увеличена до 400 мг/л. Таким образом, оптимальный состав среды зависит не только от физиологического состояния фолликулов, но и, вероятно, является видоспецифичным.

Следует отметить, что параллельно с изучением влияния состава среды на способность фолликулов отвечать созреванием ооцитов на действие ГТГ мы исследовали влияние тех же сред на реакцию ооцитов на прогестерон. Практически во всех средах и для всех самок процент созревания был равен 100. Результаты опытов на осетровых рыбах позволили нам разработать новый метод определения продолжительности ГЗП.

Гормонозависимый период созревания ооцитов. При изучении влияния ГТГ на созревание ооцитов для получения сравнимых результатов важно знать, каково физиологическое состояние взятых в опыт фолликулов. Давно известно, что чувствительность фолликулов к ГТГ и продолжительность ГЗП претерпевают сезонные изменения. Тем не менее, для характеристики фолликулов в основном используется их размер. В ряде работ авторы указывают продолжительность ГЗП (Детлаф, Шмерлинг, 1968; Скоблина, 1968). При этом ГЗП определяли путем помещения фолликулов в среду, содержащую гормоны гипофиза, на определенный срок, после чего фолликулы отмывали в нескольких порциях среды, не содержащей гормоны, и затем оставляли в ней для завершения процесса созревания ооцитов.

Для работы с осетровыми рыбами нами был разработан новый более удобный и точный способ, основанный на перенесении фолликулов из среды, содержащей гормоны гипофиза и обеспечивающей их действие, в обычный раствор Рингера, в котором созревание ооцитов происходит только в присутствии прогестерона. Таким образом можно определить, за какое время под влиянием ГТГ фолликулярные клетки передают сигнал, способный вызвать созревание ооцита. Сопоставление двух методов определения продолжительности ГЗП (отмывка и перекладывание) показало, что при использовании отмывки продолжительность ГЗП всегда бывает меньше (Гончаров и др., 1997).

Возможность прерывания действия ГТГ переносом фолликулов в среду, обеспечивающую реакцию только на прогестерон, позволило установить важные для понимания механизма действия ГТГ закономерности. Оказалось, что действие ГТГ суммируется, если фолликулы обрабатывать гормоном не непрерывно, а в течение двух периодов, разделенных периодом пребывания их в среде, не содержащей ГТГ и прерывающей его действие. Другой опыт состоял в обработке фолликулов ГТГ в течение периода меньшего, чем продолжительность ГЗП. Вслед за этим проводились сравнение скорости созревания ооцитов, прошедших такую предобработку и контрольных ооцитов. У первых Т50 всегда оказывалось меньше. Результаты этих опытов показывают, что для образования сигнала, необходимого для созревания ооцита, действие ГТГ не обязательно должно быть непрерывным и сигнал, меняющий состояние ооцита, начинает действовать до завершения ГЗП.

Изучение физиологического состояния фолликулов севрюг сразу после вылова и после доставки рыб на рыбоводный завод показало, что продолжительность ГЗП коррелирует с продолжительностью индуцированного прогестероном созревания 50% ооцитов (Т50) (рис. 1).

18 16 И

5 7 9 II

Т50,Т„

Рис. 1. Взаимозависимость продолжительности ГЗП и Т50, определенных для фолликулов, взятых у самок севрюги сразу после отлова (•) и перед инъекцией гормонального препарата на рыбоводном заводе (О).

Следовательно, становление компетенции клеток стенки фолликула и ооцита происходит согласованно. Это наблюдение позволило разработать новый метод прижизненною определения пригодных для размножения самок осетровых рыб. (см. раздел «Критерий отбора самок осетровых рыб .»).

Очистка гонадотропного гормона гипофиза севрюги (с-ГТГ). К началу наших работ ГТГ был очищен из гипофизов только двух видов рыб - карпа (Cyprinus carpió) (Fontaine, Gerard, 1963) и чавычи (Oncorhynchus tshawytscha) (Yamasaki, Donaldson, 1968). При этом у обоих видов было найдено только по одному ГТГ.

Первая попытка использовать метод, разработанный для очистки ГТГ карпа, для очистки ГТГ севрюги оказалась неудачной. В ходе первичной экстракции белков было потеряно свыше 90% гонадотропной активности. Впоследствии нам удалось подобрать условия, которые позволили провести экстракцию, обеспечившую сохранение 84% гонадотропной активности. После гель-фильтрации на Сефадексе G-100 и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, концентрации, диализа, еще одной гель-фильтрации на Сефадексе G-100 и лиофилизации была получена фракция, которая согласно четырем тестам (спермиация у прудовой лягушки (Rana eseulenta), созревание in vitro ооцитов травяной лягушки, серой жабы (Bufo bufo) и севрюги) имела в 10-14 раз большую удельную активность, чем исходный порошок ацетонированных гипофизов севрюги, а выход активности составил 21%. Проанализировав потери на всех этапах, мы несколько изменили схему очистки, что позволило повысить выход гонадотропной активности до 37%. В табл. 1 приведены этапы очистки с-ГТГ и выход белка и активности на каждом из них (Burzawa-Gerard et al., 1975a).

Физико-химические свойства гонадотропного гормона севрюги. Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле (7.5%) показал присутствие в препаратах с-ГТГ (первая и вторая очистки) трех совпадающих фракций с коэффициентом относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) равным 0.27, 0.31 и 0.35. Первые две фракции были представлены примерно рапными количествами и проявляли согласно тесту спермиапии лягушки гонадотропную

Таблица 1. Характеристика основной гонадотропной фракции, полученной на каждом этапе очистки гонадотропного гормона гипофиза севрюги

Этап очистки Гонадотропная активность3 Масса (мг) Оптическая плотность

Порошок ацетонированных гипофизов

После спиртового просачивания 684

После диализа 726

После концентрации 756

После фильтрации на

Сефадексе в-100

После хроматографии на

ДЭАЭ-целлюлозе

После диализа под вакуумом 268

После фильтрации на

Сефадексе С-100

После лиофилизации 284 263 а Гонадотропная активность выражена в мг с-ГТГ, полученного в результате первой очистки. В качестве биотеста использовали реакцию созревания in vitro ооцитов серой жабы. Ошибка определения не превышала 20% при р=0.05; 6 Оптическую плотность определяли при длине волны 276 нм. активность, третья же фракция была менее выражена, а гормональная активность с помощью этого теста в ней не выявлялась. Дальнейшее разделение фракций было осуществлено с помощью препаративного электрофореза. В чистом виде была выделена первая фракция, и был определен ее аминокислотный состав. Он оказался сходным с аминокислотным составом ГТГ карпа, хотя и отличался от него по относительному содержанию ряда аминокислотных остатков (Burzawa-Gerard et а}., 1975b).

Известно, что ГТГ всех изученных до настоящего времени позвоночных являются гетеродимерами, то есть состоят из двух нековалентно связанных субъединиц (а и Р). Как показали наши исследования, с-ГТГ не является исключением. При воздействии на с-ГТГ диссоциирующими агентами, такими как мочевина, пропионовая кислота и низкий рН, происходит диссоциация гормона. Электрофорез выявляет в таких препаратах две полосы с коэффициентом ОЭП равным 0,53 и 0,59 или 0,59 и 0,65 в зависимости от того, какая из разделенных с помощью препаративного электрофореза фракций исследовалась. Обработанные диссоциирующими агентами препараты с-ГТГ теряют существенную часть своей гонадотропной активности (Burzawa-Gerard et al., 1975b). Было показано также, что очищенный с-ГТГ содержит 8,7% гексоз, то есть является гликопротеином, подобно ГТГ других позвоночных животных. Сходной с ГТГ других позвоночных животных оказалась и молекулярная масса с-ГТГ (30 - 32 кД) (Kuznetzov et al., 1983).

Выделенные субъединицы оказались способными к реассоциации и к ассоциации с субъсдиницами ГТГ карпа, что было продемонстрировано с помощью электрофореза и по восстановлению биологической активности (Burzawa-Gerard, Goncharov, 1980).

Полиморфизм гонадотропного гормона гипофиза севрюги. В литературе есть немало данных, указывающих на универсальность явления микрогстерогенности или полиморфизма гликопротеиновых гормонов гипофиза и плаценты (см. Wakabayashi, 1980). Несмотря на то, что существование различающихся по заряду молекул этих гормонов известно довольно давно (Jiilisz, Tertrin-Clary, 1974; Pierce, 1974; Sairam, Papkoff, 1974), многие вопросы, касающиеся природы этого явления и его роли в регуляции функции органов-мишеней, остаются не до конца выясненными. В литературе можно найти прямо противоположные мнения о значении этого явления. Одни авторы лишь вскользь упоминают о нем, как о чем-то само собой разумеющемся, но не играющем какой либо физиологической роли, тогда как другие приписывают изоформам статус разных гормонов полоспецифичных или выполняющих разные функции. Попытки понять природу этого явления долгое время не приводили к успеху (Courte et al., 1972; Та mura-Takaliashi, Ui, , 1977; Roos et al., 1975; Davy et al., 1977; Jacobson et al., 1977).

Впервые мы обнаружили полиморфизм с-ГТГ, когда попытались проверить методом электрофореза чистоту выделенного нами гормона. Как уже было сказано, в препарате были обнаружены три различающиеся по ОЭП фракции, две из которых обладали согласно гесту спермиации лягушки гонадотропной активностью. Позднее этот препарат был подвергнут изоэлсктрофокусированию (ИЭФ) в полиакриламидном геле с последующим анализом гонадотропной активности фракций с помощью более чувствительного теста - созревания in vitro ооцитов зеленой жабы. В результате ИЭФ с-ГТГ распадался на пять хорошо обособленных групп полос, общее число которых было не менее 10 (рис. 2, Т). 75 70 65 50 55 5.0 45 рН

Рис. 2. Изоэлектрофокусирование препаратов с-ГТГ, тотального (Т) и субфракций (А, Б, В, Г). На гель наносили по 100 мкг препарата.

Подробный анализ активности всех фракций, полученных в ходе очистки на каждом этапе, как использованных, так и не использованных для получения препарата с-ГТГ (вторая очистка), выявил этап, на котором происходила потеря существенной ее части. Наибольшие потери ее происходили при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, которая подобно электрофорезу разделяет молекулы по заряду. В связи с этим мы решили выделить субфракции с-ГТГ, включая те, которые раньте отбрасывали из-за их низкой активности и опасения загрязнения препарата другими белками. Для того, чтобы эффективнее разделить субфракции гормона, при элюции адсорбированных на ДЭАЭ-целлюлозе белков был использован более пологий градиент концентраций №ОН-глицинового буфера (рН 9,4). Были получены четыре субфракции с-ГТГ. Гель-фильтрация на Сефадексе О-ЮО показала, что субфракции Б и В практически гомогенны, а в субфракциях А и Д есть небольшое количество примесей - веществ с большей молекулярной массой, не обладающих юнадотрошюй активностью. Фракции, входящие в основной пик белков с коэффициентом распределения (Кц) 0,29-0,32, были лиофилизированы. В результате было получено ощутимое количество (десятки миллиграммов) каждой из субфракций с-ГТГ, достаточное для проведения разнообразных исследований.

В дальнейшем мы попытались ответить на два вопроса: что определяет различие в зарядах молекул с-ГТГ и могут ли разные изоформы гормона играть разную роль в ре гул я ц и и га метоге н еза.

Анализ полученных нами субфракций показал, что они отличаются по ОЭП, причем эти значения соответствуют порядку элюции субфракций с ДЭАЭ-целлюлозы. Напротив, электрофорез в присутствии додецил сульфата натрия выявлял основной компонент с молекулярной массой 30 - 32 кД и небольшую примесь белков с молекулярной массой 17 и 60 кД. После прогревания образцов при 100°С в течение 2 мин в присутствии \% додецил сульфата натрия выявлялся только один компонент с молекулярной массой 17 кД, что хорошо укладывается в представление о субъединичном строении ГТГ и свидетельствует о том, что в наших препаратах находятся молекулы одинаковой молекулярной массы. Подтверждение этому было получено и при аналитическом ультрацентрифугировании. Все субфракции с-ГТГ (А,Б,В и Г), а также тотальный препарат из предыдущей (второй) очистки (с-ГТГ-Т) осаждались как практически гомогенные белки с коэффициентом седиментации равным 2. И, наконец, не было обнаружено никаких различий в иммунологических свойствах имеющихся в нашем распоряжении препаратов с-ГТГ. 15 опытах по иммунодиффузии все пять препаратов давали по одной полосе преципитации с поливалентной сывороткой, выработанной против с-ГГГ-Т и с-ГТГ-Г (Кпгпе17.0У е( а!., 1983).

И ЭФ всех препаратом и последующее определение гонадотропной амшшости (рис. 3) показало, что белки всех ныявляемых полос обладают способностью индуцировать in vitro созревание ооцитов зеленой жабы. Хорошо видно также, чю каждый препарат имеет собственный спектр изофррм, причем соседние препараты имеют общие компоненты, и только крайние препараты (А и Г) практически не содержат общих полос. препаратов с-ГГТ ( тотального -Т и субфракций А, В. 15, Г) и экстракта гипофиза (.ЭГ) смеси гипофизов обоих полов и индивидуальных жпофизов самцов и самок. На гель наносили по 25 мкг препаратов Т, А, Б, В и 50 мкг с ГТГ Г и экс тракт 500 мгк гипофизов. Гонадотропную активность определяли в 3 мм полосках ie.ni . помощью теста созревания in vitro ооцитов зеленой жабы. На каждую тчку использовали по 70-90 фолликулов.

Для того, чтобы выяснить не является ли полиморфизм с-ГГТ результатом модификации части молекул в ходе очистки, мы провели также И ЭФ -Л севрюги. Можно видеть, что в экстракте присутствуют практически »ее те ас изоформм чю и в очищенных препаратах (рис.3). Некоторый сдвиг спектра изоформ » с ГТГ Г по сравнению со спектром ЭГ связан с тем, что в ходе очистки формы с низкими значениями pi были отброшены и соотношение изоформ было сдвинуто в сторону молекул с большими значениями pl. В ряде работ показано, что полиморфизм гликопротеиновых гормонов связан с наличием на N-конце остатков различных аминокислот (Liu et al., 1972; Sairam 1979), хотя в других работах такой связи обнаружено не было (Davy et al., 1977; Dtckers et al., 1977). При анализе N-концевых аминокислот во всех препаратах с-ГГГ нами были обнаружены тирозин и лейцин, а в с-ГТГ-Г еще и глицин. Очевидно, что полиморфизм с-ГТГ никак нельзя объяснить разнообразием N-концсвых аминокислот его субъединиц.

Другой причиной полиморфизма с-ГГГ по заряду молекул гормонов могло быть разное количество сиаловой кислоты в углеводной части молекулы, однако наши определения показали, что все субфракции с-ГТГ содержат равное и небольшое ее количество (около одного остатка на молекулу).

В настоящее время для ЛГ млекопитающих найдено объяснение природы полиморфизма. Оказалось, что молекулы ЛГ по-разному сульфатированы, что и объясняет различие в зарядах молекул (Smith, Baenziger, 1992). Кроме того, показано, что и у млекопитающих (Stewart, Mäher, 1991), и у рыб (Kobayashi et al. 1997) есть несколько копий генов, кодирующих субъединицы ГГГ.

Таким образом, полиморфизм гликопротеиновых гормонов может быть связан с различиями в заряде как углеводной части молекулы, так и полипеитидной цепочки.

Роль полиморфизма гонадотропннов в регуляции гаметогенеза. Прежде всего нами было проверено предположение о существовании у рыб полоспецифичных форм ГГГ (Idler et al., 1975; Breton et al., 1978; Бурлаков и др., 1979; Бурлаков, Хапчаева, 19S2. 1984; Зенкевич и др. 1981; 1985). Мы провели ИЭФ экстрактов индивидуальных гипофизов самцов и самок севрюги (Гончаров и др. 1983). Результаты одного из опытов представлены на рис. 3. Спектр изоформ с-ГТГ оказался сходным для гипофизов самцов и самок и для смеси гипофизов. Отсутствие изоформ с низкими значениями pi в случае ЭГ самки 2 и самца 2 объясняется тем. что именно эти гипофизы имели меньшую удельную активность, и при использовании одинакового количества экстракта (500 мкг) чувствительность тест системы оказалась недостаточной, чтобы их выявить. Таким образом, гипотеза о существовании полоспепифичных форм ГТГ кажется нам в настоящее время мало обоснованной. Вероятнее, что при использовании недостаточно чувствительных методов в случаях различного количественного соотношения изоформ в гипофизах самцов и самок некоторые из них не выявляются и это создает иллюзию качественного различия спектров их изоформ. Опыты с индивидуальными гипофизами показали также, что полиморфизм с-ГТГ не связан с индивидуальной генетической изменчивостью молекулы гормона.

Изучение возможной различной роли изоформ в регуляции гаметогенеза имело смысл только в случае, если они секретируются в кровеносную систему и, следовательно, могут оказывать in vivo действие на ткани мишени и если существуют различия в их биологическом действии. Для ГТГ млекопитающих известно, что большинство из них, если не все, секретируются в кровь (см. Ulloa-Aguirre et al., 1995).

Для ответа на вопрос, существуют ли различия в биологическом действии изоформ с-ГТГ были использованы два подхода (Гончаров, Кузнецов, 1981; Goncharov et al., 1983). Первый заключался в сравнении удельной активности гормональных препаратов в различных тест системах. Удельная активность первых трех препаратов практически не отличалась, тогда как с-ГТГ-Г был в два-три раза менее активен, если определение гонадотропной активности проводили по реакции созревания ооцитов трех разных видов, и не отличался от других препаратов при их тестировании по реакции спермиации травяной лягушки. Эти результаты нельзя объяснить наличием в с-ГТГ-Г значительных примесей неактивных компонентов. Оставалось предположить, что либо с-ГТГ-Г содержит компонент, активный по отношению к спермиации и неактивный по отношению к созреванию ооцитов, либо в действии различных изоформ есть качественные различия. Для выбора между этими двумя возможностями мы сопоставили профиль белков, полученный после ИЭФ с-ГТГ-Г и профили гонадотропной активности этого же препарата, определенной по реакции созревания ооцитов зеленой жабы и спермиации травяной лягушки. Они практически совладали. Следовательно, можно говорить о качественных различиях в действии различных изоформ.

Помимо этого мы использовали второй подход, который ранее позволил выявить качественные различия в действии ЭГ разных видов на созревание in vitro ооцитов амфибий (Гончаров, 1971 в). Он заключается в сопоставлении формы дозовых кривых при использовании фолликулов амфибий, находящихся в таком физиологическом состоянии, при котором большие дозы ГТГ оказывают подавляющее действие на созревание. На рис. 4 представлены результаты этих опытов.

Рис. 4. Сравнение активности двух субфракций с-ГТГ- А (•) (верхняя шкала оси абсцисс) и -Г (О) (нижняя шкала оси абсцисс) по реакции созревания in vitro ооцитов зеленой жабы. Опыт поставлен на фолликулах четырех самок. Число фолликулов на дозу: 40-80 (две верхние самки) и 100-180 (две нижние) концентрация препарата, UKi/мл

Видно, что при смешении шкал концентраций в соответствии с различием в два раза по удельной активности дозовые кривые при увеличении концентрации препаратов сначала практически совпадают, а затем расходятся таким образом, что у всех четырех самок процент созревания ооцитов, вызываемый двумя наибольшими концентрациями препарата, оказывается выше для с-ГТГ-Г. Как будет видно из дальнейшего изложения, для объяснения этих качественных различий необходимо рассмотреть вопрос о механизме обнаруженного нами и уже описанного в разделе "Становление компетенции созревания" подавляющего действия суспензии гипофизов на созревание ооцитов, вызываемое прогестероном.

Сравнение свойств гонадотропинов севрюги и карпа. Уже первые попытки применить к с-ГТГ условия очистки, разработанные для ГТГ карпа (к-ГТГ). показали, что мы имеем дело с молекулами, существенно различающимися но своим свойствам. с-ГТГ оказался менее кислой молекулой, теряющей в условиях высокой ионной силы биологическую активность, и более резистентной к диссоциирующим агентам. Он отличался от к-ГТГ по аминокислотному составу и электрофоретической подвижности. Нас же в первую очередь интересовало сравнение биологических свойств этих гормонов. К тому времени в литературе имелось большое число работ, в которых были показаны различия в действии препаратов гипофизов разных видов рыб (см. Pickford, Atz, 1957; Ball, 1960; Dodd, 1960), и была сформулирована гипотеза о видовой (синонимы: зоологической, таксономической и филогенетической) специфичности ГТГ рыб. Однако из-за отсутствия очищенных препаратов все эти работы были выполнены с ЭГ или грубыми фракциями, поэтому возникал вопрос о том, в какой мере эти различия связаны со свойствами самих гонадотропинов, а в какой - обязаны вмешательству в их действие каких-то иных компонентов гипофиза. Известно было только, что дозовые кривые активации аденилатциклазы в гомогенатс яичника золотой рыбки (Ca/msius auratus) для к-ГТГ и ГТГ чавычи различаются (Fontaine et al., 1972).

В той же тест системе различия в действии с-ГТГ и к-ГТГ оказались еще более значительными (Burzawa-Gerard et al., 1976; Гончаров и др., 1976). Действие к-ГТГ проявлялось уже с минимальной дозы (1 мкг/мл) и выходило на плато при дозе в

100 мкг/мл, в то время как с-ГТГ очень незначительно стимулировал образование цАМФ только при применении максимальной из использованных доз (I мг/мл). Такой метод сравнения гонадотропной активности по первичной биохимической реакции может оказаться неверным, если конечный эффект гормона не прямо пропорционален количеству производимого под его влиянием вторичного мессепджера. В связи с этим мы провели сравнительное количественное определение гонадотропной активности по конечным реакциям - спермиации и созреванию ооцитов in vitro, используя фолликулы нескольких видов амфибий и севрюги. Результаты этих определений представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сравнение удельной гонадотропной активности очищенных гонадотропинов севрюги и карпа тест-объект тест-реакция номер опыта соотношение активности с-ГТГ/к-ГТГ

Прудовая лягушка спермиация 1 2,6 (1,7 - 3,7)

2 3,1 (1,8 - 5,6) i 3 1,7 (1,5 - 2,0)

Травяная лягушка 1 1,7 (1,4 - 2,1) созревание ооцитов 1 13,7 (12,4 - 14,9)

2 11,6 (10,4 - 12,9)

Серая жаба « 1 27,7 (25,1 - 30,4)

Севрюга « 1 15,4 (13,7 - 17,2)

Бросается в глаза разнообразие соотношений удельной активности с-ГТГ и к-ГТГ. Так, с-ГТГ был в 2-3 раза более активным, чем к-ГТГ по реакции спермиации на двух видах амфибий. При использовании же теста созревания in vitro ооцитов одного из этих видов (травяная лягушка) активность с-ГТГ оказалась в 12-14 раз большей, чем активность к-ГТГ. Близкое к этому соотношение активностей было получено и на севрюге. Казалось бы, что в этом варианте можно было ожидать наибольших различий, так как один из тестируемых препаратов воздействовал на гомологичные рецепторы. Однако это соотношение было еще больше при использовании фолликулов серой жабы. Из результатов этих опытов следуе), что хотя оба гормональных препарата вызывают 100% эффект во всех гест системах, в их действии есть качественные различия. Под качественными мы понимаем такие различия, которые нельзя объяснить разной концентрацией гормона в исследуемых препаратах. Полученные результаты свидетельствуют о том, что качественные различия (в данном случае не связанные с количеством рсиспторои) есть и в ответе разных реагирующих систем - семенника и фолликулов, когда речь идет ой одном и том же виде, или в ответе фолликулов разных видов. На основании этих результатов мы сделали вывод о половых различиях в рецепции гормонального стимула и об изменении в эволюции рецепторной системы, трансформирующей действие ГГГ в биологический эффект (Гончаров и др., 1976). В настоящее время этот вывод требует определенной коррекции.

В литературе появились противоречивые и не совпадающие с нашими данные о соотношении удельной гонадотропной активности ЭГ белого осетра (Atipemer transmontanus) и карпа, определенном с помощью созревания in vino ооцитов белого осетра (Doroshov, Lutes. 1983, Lutes, 1985). С другой стороны, в практике разведения осетровых рыб в тех странах, где их гипофизы были недоступны, стали использовать гипофизы карпа в дозах (в мг/кг массы рыбы), всего в два раза превышающих дозы гипофиза осетровых рыб, обычно используемые для стимуляции овуляции in vivo у осетровых рыб. Разные соотношения активности гипофиза карпа и осетровых рыб и их ГТГ в цитированных выше работах и наших исследованиях (см. табл. 2) можно было объяснить и разным содержанием ГТГ в разных препаратах, и различиями в действии гипофизов разных видов осетровых рыб. Однако было еще и отличие в методике тестирования этих препаратов на фолликулах осетровых рыб in viim. Мы использовали модифицированный для осетровых рыб раствор Рингера (Гончаров. 1978), а американские исследователи - среду Лейбовича (L-15). Для того, чтобы выяснить, не может ли это быть причиной наблюдавшихся расхождений, мы поставили опыты по влиянию этих сред на соотношение активности ЭГ и очищенных препаратов севрюги и карпа, используя фолликулы сибирского осетра (Williot, Goncharov, 1988). Результат оказался неожиданным. Это соотношение варьировало в очень широких пределах (от 2 до 26) и зависело как от среды культивирования, так и от физиологического состояния фолликулов. В качестве контроля в этих опытах мы определяли соотношение активности ЭГ и очищенного ГТГ и для карпа, и для севрюги. Оно. напротив, было очень близким и не зависело ни от среды, ни от самки. Таким образом, стало ясно, что нельзя говорить о половых различиях в ответе гонад, если разное соотношение активности получено на разных полах в разных системах (in vitro и in vivo).

Эти опыты ставят вопрос о том, каким образом одинаковые среды по-разному влияют на активность разных ГТГ или какие изменения в реагирующей системе в разных средах приводят к тому, что соотношение активности одних и тех же препаратов меняется. Понятно, что исходя из известного механизма стимуляции созревания ооцитов ГТГ, связанного только с образованием мейоз-индуцирующего стероида, нельзя объяснить эти и многие другие имеющиеся в литературе и обнаруженные нами явления. Однако, как это будет показано дальше, это не единственное действие ГТГ на созревание ооцитов.

Подавляющее действие гонадотропинов на созревание ооцитов. В разделе «Становление компетенции созревания» мы описали подавляющее действие суспензии гипофизов на созревание ооцитов травяной лягушки, вызываемое in vitro прогестероном. Для выявления компетенции созревания мы использовали гомологичные гипофизы в принятой в то время концентрации (1 гипофиз на 15 мл среды) и фиксировали ооциты через 36-48 ч. Период, когда у травяной лягушки можно было обнаруживать подавляющее действие, был очень коротким. Однако оказалось, что и позднее, в ходе зимовки, ЭГ оказывает транзиторное подавляющее действие, то есть тормозит созревание, вызываемое прогестероном. В зависимости от состояния фолликулов торможение может продолжаться при инкубации при комнатной температуре от получаса до многих часов. Таким образом, существенно расширились временные возможности для изучения подавляющего (тормозящего) действия суспензии гипофизов на созревание ооцитов. Кроме того, выяснилось, что при определенном состоянии фолликулов, при котором гормоны гипофиза в определенной концентрации оказывают подавляющее или тормозящее действие на созревание ооцитов, вызываемое прогестероном, меньшие дозы того же гипофизарного препарата способны оказывать стимулирующий эффект, причем и для стимулирующего, и для подавляющего эффекта Д50 существенно меняется в ходе оогенеза. Таким образом, варьируя концентрацию гонадотропного препарата, стало возможным изучать оба эффекта на фолликулах одной и той же самки.

Возникло три вполне естественных вопроса: с каким компонентом гипофиза связано подавляющее действие, каков его механизм и играет ли оно какую-либо роль в регуляции оогенеза в организме самки.

Прежде всего было показано, что подавляющее действие специфично для ЭГ, поскольку экстракт ткани мозга лягушки не воспроизводит этот эффект, даже при более высокой (в два-три раза) концентрации. Слабым подавляющим действием на созревание ооцитов озерной лягушки обладал хорионический гонадотропин (Гончаров, 1971в). Следовательно, подавляющее действие ЭГ могло быть связано с ГТГ, но для проверки этого предположения необходимы были опыты с гомологичными гормонами. Они были осуществлены после того, как нами был выделен с-ГТГ (Вигеаша-Сегагс! е1 а!., 1975а). Оказалось, что в гомологичной системе он способен подавлять созревание ооцитов, вызываемое прогестероном. Более того, сравнение соотношения удельной стимулирующей и подавляющей активности препарата с-ГТГ и экстракта порошка ацетонированных гипофизов, из которого этот гормон был очищен, показало, что они практически не отличаются (рис. 5) и, следовательно, обе активности суть свойства одних и тех же молекул.

Мы попытались также выяснить механизм подавляющего действия ГТГ. Как и в случае стимулирующего, подавляющее действие ГТГ на созревание ооцитов оказалось опосредованным активностью клеток стенки фолликула, поскольку при удалении фолликулярных оболочек после предобработки фолликулов травяной лягушки раствором трипсина и версена тормозящее действие суспензии гипофизов не ироявляось (Гончаров, 1971в).

Первоначально (ОопсЬагчте, 1972) было выдвинуто предположение о том, что посредником подавляющего действия ГГГ может быть эстроген. Для этого было немало оснований. ГГГ стимулируют образование эстрогенов, эстрогены образуются

Рис. 5. Отношение удельной активности экстракта гипофиза (ЭГс) и очищенного гонадотропного гормона гипофиза севрюги (с-ГТГ), определенной по реакции созревания ооцитов севрюги in vitro (а) и по реакции подавления созревания ооцитов, вызываемого прогестероном (б). в большом количестве в период вителлогенеза, на смену которого приходит период созревания. Впрямую показано подавляющее действие эстрогенов на созревание ооцитов амфибий, вызываемое ЭГ. н на образование прогестерона под влиянием ЭГ (Scliuetz, 1972; Spiegel et al., 1978; Mulner and Ozon, 1981; Baulieu, 1983; Lin, Schuetz, 1983, 1985). Однако наши опыты не подтвердили это предположение. Эстралиол-17fi не подавлял созревание оопитов севрюги, вызываемое прогестероном. Оставались, однако, сомнения, не связано ли это с неверно выбранным гормоном или дозой. Другой подход дал более определенный, ответ на вопрос о возможном участии эстрогенов в подавляющем действии ГТГ (рис. 6). На фолликулах зеленой жабы и севрюги было показано, что аминоглютетимид - ингибитор превращения прегненолона в прогестерон - не влияет на созревание, вызываемое прогестероном, подавляет стимулирующее действие ЭГ и це влияет на его подавляющее действие.

Роль посредника подавляющего действия ГТГ мог также играть цАМФ. Известно, что при действии ГТГ на яичник рыб и амфибий происходит увеличение образования цАМФ, участвующего в стимуляции стероидогенеза. Кроме того, и цАМФ, и агенты, увеличивающие образование цАМФ, способны обратимо подавлять созревание ооцитов, индуцированное прогестероном у амфибий и рыб (см. Jalabert et al. 1991). Следует отметить, что подавляющее действие кАМФ на созревшие ооцигы, %

Jn п+эг

Щ + аминоглютетимид

1/30 1/60 1/120 1/30 1/60 1/ концентрация экстракта гипофиза (гип/мл)

Рис. 6. Влияние аминоглютетимида на созревание ооцитов зеленой жабы, вызываемое in vitro прогестероном (П), экстрактом гипофиза (ЭГ) и обоими препаратами вместе (П + ЭГ). созревание ооцитов рассматривают не в связи с действием ГТГ, а в связи с действием прогестерона, который снижает уровень цАМФ в ооците (см. Baiilieu, 1983; Maller, 1985). Для решения вопроса о возможной роли цАМФ в качестве посредника подавляющего действия ГТГ был поставлен ряд опытов.

Ранее нами было показано, что ЭГ продолжает оказывать подавляющее действие, даже если он добавлен через несколько часов после приведения фолликулов в контакт с прогестероном, причем этот промежуток времени варьирует у разных самок. Это тем более интересно, что прогестерон очень быстро запускает процесс созревания, и первые изменения в ооците регистрируются уже через I мин (Chien et al., 1991; Kostellow et al., 1996). Сравнение способности ЭГ и дбцАМФ подавлять созревание ооцитов, вызываемое прогестероном, показало, что для обоих препаратов она исчезает практически в одно и то же время, зависит от дозы и при использовании нескольких концентраций удается найти такие, при которых кривые практически совпадают (рис. 7). Усиление подавляющего действия ЭГ и хорионического гонадотропина актиномицином Д было показано также на

Рис. 7. Влияние экстракта гипофиза (ЭГ) и дбцАМФ, добавленных чере! разное время после начала инкубирования фолликулов зеленой жабы в присутствии прогестерона (П), на созревание ооцитов. шпорцевой и травяной лягушке (Скоблина и др., 1993; Skoblina et al., 1995). Более того, этими авторами было показано, что обработка фолликулов большой концентрацией суспензии гипофизов и актиномицином Д приводит к существенно более высокому уровню образования цАМФ по сравнению с обработкой только суспензией гипофизов. Способность актиномицина Д увеличивать образование цАМФ описана и для клеток гранулезы крыс (Strulovici et al., 1981;Knecht et al., 1984).

Сезонное уменьшение чувствительности к подавляющему действию ГТГ может быть связано с тем, что существенно меняется чувствительность ооцита к подавляющему действию цАМФ. В наших опытах фолликулы зеленой жабы различались по чувствительности к подавляющему действию дбцАМФ почти на два порядка. Чувствительность фолликулов тех же самок к подавляющему действию ГТГ также варьировала в широких пределах и в целом соответствовала чувствительности к дбцАМФ (рис. 8). Это также свидетельствует о том, что посредником подавляющего действия ГТГ на созревание ооцитов может быть цАМФ.

Труднее всего ответить на вопрос, может ли подавляющие действие ГТГ участвовать в регуляции оогенеза в организме самки. Дело в том, что in vitro малые созревшие ооциты, %

0.00026 0.0005 0.001 0.0021 0.0042 0.0083 0.0167 0.0333 0.0667 концентрация экстракта гипофиза (гин/мл) созревшие ооциты, %

0.390 0.781 1.563 3.125 6.25 12.5 концентрация дбцАМФ (мкг\мл) Рис. 8. Влияние экстракта гипофиза и дбцАМФ на созревание ооцитов зеленой жабы, индуцируемое прогестероном. Фиксация проводилась в то время, когда процент созревших ооцитов в растворе прогестерона достигал или был близок к 100. дозы гормона стимулируют, а большие подавляют созревание ооцитов, тогда как в организме самки, наоборот, при низких концентрациях ГТГ в крови созревание и овуляция ооцитов не происходят, а для их индукции необходимо повышение концентрации гормона. Возможно, причина этого несоответствия кроется в условиях проведения опытов in vitro. Как показали наши исследования, используемая среда культивирования фолликулов осетровых рыб явно способствует стимулирующему действию ГТГ на созревание оопитов, либо действуя сиисргидно с гормонами, либо даже полностью воспроизводя ero действие (Гончаров и др., 1997). Это может быть связано с тем, что эта среда противодействует проявлению in vitro подавляющего действия ГТГ.

Поскольку ранее (Гончаров, 1971 в) мы выдвигали в качестве объяснения видовой специфичности действия гонадотропинов разных видов предположение о разном соотношении у них стимулирующей и подавляющей созревание ооцитов активности, а недавно нами (Williot, Goncharov, 1998) было обнаружено, что соотношение удельной активности двух ГТГ (карпа и севрюги) существенным образом зависит от состава среды инкубирования, резонно было посмотрен,, как разные среды влияют на подавляющее и стимулирующее действие ГТГ. Результаты такого опыта представлены на рис. 9.

Рис. 9. Влияние различных сред культивирования на чувствительность фолликулов сибирского осетра к с-ГТГ, стимулирующему созревание и тормозящему созревание ооцитов, вызываемое 17«,20р-дигидрокси-4-прегнен-3-оном (17а,20р-ДГП).

Оказалось, что в модифицированном для осетровых рыб растворе Рингера чувствительность фолликулов к стимулирующему действию ГТГ, действительно, существенно выше, а к подавляющему - существенно ниже по сравнению со средой

Лейбовича. Нельзя исключить, что среда Лейбовича, существенно более богатая различными компонентами, лучше имитирует условия действия ГТГ в организме самки.

Таким образом, есть основания предполагать, что в норме при воздействии на фолликул ГГГ оказывает на созревание ооцита двойное (подавляющее и стимулирующее) действие.

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИСКУССТВЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ

РЫБ И АМФИБИЙ

Искусственное размножение осетровых рыб стало возможным после разработки Н.Л.Гербильским (1941) метода гипофизарных инъекций. Применявшийся в течении многих десятилетий в практике промышленного осетроводства этот в целом эффективный метод дает время от времени осечки. И каждый раз встает вопрос о том, что же является причиной неудачи. Теоретически это может быть либо ошибка в гормональной стимуляции, например, применение неадекватной дозы препарата гипофизов или неадекватная схема гормональной стимуляции, либо состояние гонад производителей, развитие которых не достигло той стадии или состояния, на которой или при котором фолликулы способны реагировать на гормоны гипофиза, либо потеря этой способности под влиянием неблагоприятных факторов.

Новый метод сравнительного количественного определения гонадотроппой активности гипофизов низших позвоночных. Для того, чтобы избежать ошибок с дозировкой препарата ацетонированных гипофизов, была организована централизованная их заготовка и тестирование. На осетровые рыбоводные заводы поступает препарат, на котором указана активность, выраженная в лягушачьих единицах (тест - реакция спермиации) (Алпатов, Строганов, 1950). Исследователи, работающие с препаратами гипофизов осетровых рыб, для стандартизации активности используют также вьюновые единицы (тест - реакция овуляции ¡п т-о) (Казанский. Нусенбаум, 1947). Есть все основания полагать, что стандартизация •гонадотроппой активности гипофизов низших позвоночных такими способами неправомерна, поскольку ни самки вьюна, ни самны лягушек не могут иметь стандартную чувствительность к гонадотропинам (см. Гончаров, 1981). На практике определенная стандартизация, видимо, достигается просто за счет использования при инъекции смеси достаточно большого числа гипофизов. Их заготовка происходит обычно в определенный сезон - весной или осенью, когда производители заходят в реки на нерест и их гипофизы содержат наибольшее количество ГТГ (Баранникова, 1949) Таким образом, упомянутые выше методы можно использовать только для сравнительного количественного определения гонадотропной активности. В начале 70-х годов был предложен новый метод (Топпоп, 1971; Гончаров, 1971а,б, 1972), основанный на способности фолликулов амфибий и осетровых рыб /л \-i1ro реагировать созреванием ооцитов на действие гонадотропных гормонов. Позднее этот метод был адаптирован для определения гонадотропной активности гипофизов и различных препаратов с использованием фолликулов форели (За1аЬеП и а1 , 1974) и в настоящее время используется на разных видах. Этот метод обладает рядом преимуществ. В первую очередь, поскольку в качестве реагирующей единицы используется фолликул, а не особь, можно с большей легкостью увеличить их число па дозу и, следовательно, уменьшить статистическую ошибку определения. Он также более чувствителен, что особенно важно при проведении исследовательских работ, например, при очистке гонадотропных гормонов. И, наконец, тестирование проводится в гомологичной системе, что исключает риск вмешательства негонадотропных гормонов, которые в гстерологичсской системе могут проявлять несвойственную им в норме активность.

Предлагая эту тест-систему, мы считали (Гончаров, 1981), что ее можно использовать также для поиска заменителей гипофизов. Представлялось, что, сравнивая гонадотропную активность гипофизов своего и чужого вила, можно определить, какие относительные количества последнего могут быть использованы для индукции созрсвання половых продуктов /я г/г*). Однако полученные недавно и описанные выше данные о влиянии состава среды культивирования на соотношение активности с-ГТГ и к-ГГГ (\Villiot, ОопсЬагоу, 1998), показывают, что определенное ¡а п7/'о соотношение активности двух гонадотропных препаратов не обязательно отражает соотношение их активности, которое будет проявляться при действий in vivo (см. раздел "Сравнение свойств гонадотропинов севрюги и карпа").

Разработка критерия отбора самок осетровых рыб, пригодных для искусственного размножения. В практике осетроводства уже очень давно возникла необходимость проведения отбора производителей, пригодных для искусственного размножения. Было предложено немало критериев для отбора самок осетровых рыб. Предлагалось использовать такие характеристики, как отношение длины тела к весу, уровень общего белка, липидов и холестерина в крови (Баденко и др., 1981, Дорошева, 1983) и уровень вителлогенина в крови (Fujii et al., 1991). Другие авторы предлагали критерии, отражающие морфометрические или физиологические характеристики ооцитов или фолликулов, такие как индекс поляризации ооиита (Трусов, 1964, Казанский и др., 1978) и/или компетенция созревания, определяемая по способности ооцитов или фолликулов отвечать in vitro созреванием на действие прогестинов или гонадотропных препаратов (Детлаф, Давыдова, 1979; Lutes el al., 1987; Williot et al., 1991). Предложено было также, ориентируясь на нарушения пигментации ооцита, выбраковывать самок с начальными признаками атрезии (Фалеева, 1979). Практика показала, что ни один из этих критериев не позволяет безошибочно рассортировать самок, а эффективность их применения существенно варьирует в разных условиях или на разных видах и популяциях

Мы попытались найти более эффективный и дающий воспроизводимые результаты критерий, основываясь на результатах изучения закономерностей становления компетенции и механизма гормональной регуляции созревания ооцитов осетровых рыб. Работая в основном с волжской популяцией севрюги, дающей наименее стабильные результаты при искусственном размножении, мы выяснили прежде всего, по каким характеристикам различаются фолликулы только что отловленных самок. Из 60 самок, обследованных в мае-июне в низовье Волги, у двух - ооциты оказались неспособными созревать под влиянием прогестерона и у пяти - под влиянием гонадотропных препаратов. Время созревания 5()'г ооцитов пол влиянием прогестерона (Т50) колебалось от 9,5 до 22t„ , ГЗП - от 3,5 iu> 12t,„

Д50 для ЭГ - от 0,39 до 2,5 мкг/.мл. а для с-ГТГ - от 0,03 до 0,5 мкг/мл (Гончаров, 1976). Несмотря на то, что и чувствительность фолликулов к гонадогропинам, и ГЗП несомненно могут служить индикаторами изменения их состояния, из-за отсутствия возможности стандартизации гонадотропной активности, разработка методов отбора производителей, основанных на использовании этих критериев, не представлялась возможной. Напротив, обнаруженный нами широкий диапазон колебаний такого показателя как Т50, внушал определенные надежды, поскольку прогестерон, используемый для определения этой характеристики, является стандартным препаратом. Кроме того, было показано, что Т50 не зависит от дозы гормона в очень широком диапазоне и мало зависит от состава среды культивирования (Гончаров и др., 1997). Еще большая надежда появилась, когда мы обнаружили довольно сильную корреляцию между Т50 и продолжительностью ГЗП (рис. I). Сопоставление качества икры, полученной после гормональной стимуляции, и Т50 позволило установить, что самки севрюги, для которых Т50>18то, либо не реагируют на гормональную инъекцию созреванием и овуляцией оопитов, либо дают икру низкого рыбоводного качества Этот факт свидетельствует о том, что компетенция созревания появляется раньше, чем компетенция развития. К такому же выводу недавно пришли исследователи, работающие на млекопитающих (0(о1 е! а!., 1997).

На основании полученных результатов было предложено использовать Т50 в качестве критерия для отбора самок севрюги (Гончаров, 1979, СопсИагоу, 1993). Это метод, однако, не гарантирует полного успеха, поскольку среди отобранных по этому критерию (Т50<18то) самок, встречаются такие, которые не дают икру высокого качества. Это связано, вероятно, с тем, что повреждение ооцита, которое сказывается на качестве икры, не всегда влияет на его реакцию на прогестерон. В связи с этим эффективность применения данного метода отбора самок будет тем выше, чем меньше в данной партии производителей будет самок со скрытыми дегенеративными изменениями ооцитов.

Действительно, работая с производителями сибирского осетра, выращенными из яйца до половозрелого состояния и находящимися в контролируемых условиях, удалось найти более тесную связь между Т50 и качеством икры (Гончаров и др., 1999). Оказалось, что во всем диапазоне значений Т50, который оказался достаточно широким (от 7,3 до 27 ч при 18°С). эта характеристика ооцита коррелировала с процентом нормальных зародышей, полученных от этих самок после гормональной стимуляции. Помимо Т50 мы определяли еще целый ряд морфометричсских и физиологических характеристик фолликулов, таких как диаметр, индекс-поляризации ооцита и характер пигментации ооцита. а также способность ооцитов созревать и овулировать in vitro пол влиянием 17а,20(!-ДГП, с-ГТГ, эГ карпа и среды культивирования. Ориентируясь на эти характеристики (за исключением диаметра ооцита и индекса поляризации ооцита), оказалось возможным разделять самок на две группы, п которых соотношение "хороших" (дающих больше 50% нормальных зародышей) и "плохих" (соответственно, меньше 50%) самок достоверно различалось, тогда как в исходной популяции оно было близко к 1:1. Следует отметить, что самки, с которыми мы работали, были предварительно отобраны по диаметру ооцита. и поэтому самок с недоросшими ооцитами среди них практически не было и, соответственно, ни диаметр ооцита, ни индекс поляризации ооцита не могли выступать в качестве дискриминирующих признаков. Тем не менее, средний процент нормальных зародышей был довольно низок. Для 79 самок, инъецированных в восьми партиях с декабря по апрель, он составлял 45,5%.

Для того,* чтобы выяснить, какая из изученных характеристик и при каком значении наилучшим образом позволяет рассортировать самок на "хороших" и "плохих", был использован оригинальный подход, позволяющий оценить эффективность отбора с помощью описанного ниже индекса эффективности.

Индекс эффективности отбора самок. Для оценки эффективности отбора пригодных для размножения самок была предложена следующая формула: le = [I (Ps) + £(100 - Рг)]/п, где Ре и Рг процент нормально развивающихся зародышей, полученных от самок, которые согласно определенному критерию могли бы быть отобраны для размножения (Ре) и отбракованы (Рг). [£ (Ре)] представляет собой выраженное в процентах общее число зародышей, которое могло бы быть получено при использовании данного критерия при отборе самок, а 151(100 - Рг)] - то число яиц, не способных в данный момент развиться в нормальных зародышей, которое могло бы быть сохранено, если бы эти самки были отбракованы и использованы или с другой целью, или в другое время, или в других условиях. Чтобы узнать, какую часть (в процентах) правильно отобранная и правильно отбракованная икра составляет от общего числа яйцеклеток, которое в процентах выражается числом 100п, где п - число изученных самок, производится соответствующее математическое действие и формула приобретает свой окончательный вид. Другими словами, эта формула показывает, какая часть икры в среднем на самку могла бы быть не потеряна, если бы отбор самок был проведен по данному критерию.

Эту формулу можно использовать для сравнения эффективности отбора самок по различным критериям, но только внутри одной популяции, поскольку величина 1е зависит не только от эффективности рассортировки самок по какому-либо критерию, а и еще от двух характеристик исследуемой популяции. Первая из них -это репродуктивный потенциал данной группы самок. Он равняется эффективности размножения всех самок (без отбора), в этом случае 1е = [£ (Р)]/п, то есть среднему проценту нормально развивающихся зародышей. Второй показатель популяции -это вариабельность, индивидуальных репродуктивных потенциалов самок. Две группы самок могут иметь одинаковый средний репродуктивный потенциал (например, 50%), но в одной - все самки имеют икру сходного качества, а в другой - у половины самок либо икра не овулирует, либо не оплодотворяется, зато остальные дают икру стопроцентного качества. Очевидно, что в первом случае, какой бы высокоэффективный критерий не применялся, эффективность отбора будет низкой, так как выбирать не-из. чего. Напротив, 1е будет очень высок, если во второй популяции удастся разделить всех самок с высоким и низким репродуктивным потенциалом.

Если сравнивать 1е какого-либо изучаемого критерия отбора с 1е для данной группы самок в случае отсутствия отбора (обозначим его как 1е(%в) и 1е той же группы, который мог бы быть при проведении «идеального» отбора (1е(|*в)), можно оценивать эффективность отбора с помощью относительного индекса эффективности (1е(ге1)), не зависящего от двух описанных выше характеристик популяции. Это делает возможным сравнение результатов, полученных на разных популяциях. 1е(ге1) рассчитывается по формуле:

1е(ге1) = [1е - 1е(|«;)1 х 100/[ Ге(1й) - 1е(\«)

Проведенное нами сравнение одиннадцати характеристик фолликулов выявило, что наибольшей прогностической ценностью обладает Т50, далее следуют овуляция, индуцированная гонадотропными препаратами, созревание в среде, не содержащей гормонов, овуляция, индуцированная 17а,20(5-ДГП и, наконец, характер пигментации ооцята. В табл. 3 приведены расчеты, показывающие, какие результаты могли бы быть получены при использовании оптимального (дающего наибольший 1е) значения всех изученных характеристик. Можно видеть, что, отобрав для размножения самок, для которых Т50<13 ч, можно на 20% увеличить эффективность использования икры, относительный же индекс эффективности (1е(ге1)) для этого критерия равен 57%. Как уже говорилось выше, причины неполной рассортировки "хороших" и "плохих" самок заключаются в том, что способность ооцитов обеспечивать нормальное развитие при повреждающих воздействиях исчезает раньше, чем повреждаются механизмы, обеспечивающие созревание ооцита. В данной работе нам также удалось установить, что и Т50, и эффективность размножения коррелируют с перепадом температур, составлявшим от 1 до 8°С, которому самки подвергались в ходе манипулирования. Следовательно, чрезмерный перепад температур и может являться таким повреждающим воздействием. Этот вывод хорошо согласуется с данными М.С. Чебанока и

Таблица 3. Сравнение эффективности применения различных критериев отбора самок сибирского осетра для искусственного размножения

Самки, отобранные для размножения Отбраковании е самки

Пороговое нормальные нормальные

Характеристика фолликула, значение 1е* всего «хорошие» «плохие» зародыши всего «хорошие» «плохие» зародыши р*** используемая для отбора самок характе- <%> (шт) (шт) (шт) (%) (шт) (шт) (шт) (%) ристики

Без отбора - - 79 39 40 45,5 -

Гипотетическая характеристика. гипотеобеспечивающая «идеальный» отбор тическое 81.1 39 39 0 77,0 40 0 40 13,

Время созревания 50% ооцитов под влиянием 17а,20(5-ДГП (ч) <13 65,5 36 25 11 62,1 43 14 29 31.7 0,

Ооциты, овулировавшие под влиянием ЭГк (%) >10 64,2 35 24 П 61 44 15 29 33.3 0,

Ооциты, овулировавшие под влиянием сГТГ <%) >10 62,7 39 24 15 56,7 40 15 25 34,6 0,

Ооциты, созревшие под влиянием среды культивирования (%) >40 61,7 22 15 7 63,0 57 23 34 38,8 0,

Ооциты, овулировавшие под влиянием 17а,20р-ДГП(%) >10 59,9 37 23 14 55,8 42 16 26 36,5 0,

Характер пигментации ооцита »* 59,9 24 17 7 59,0 55 22 33 39,7 0,

Ооциты. созревшие под влиянием

ЭГк (%) >80 59,9 53 31 22 54,0 26 8 18 28.2 0,

Ооциты, овулировавшие под влиянием среды культивирования (%) >0 58,2 18 12 58,1 61 27 34 41,8 0.

Диаметр ооцита (мм) >3 57,2 10 7 3 60,8 69 32 37 43.3 0,

Индекс поляризации ооцита (%) <3 56,7 8 5 3 61,1 71 34 37 43,8 0,

•Индекс эффективности отбора: ** Сравниваются самки со «слабо поврежденными» оошпами с самками с «нормальными» и «сильно поврежденными» ооцитами; *** Значимость различий в соотношении «хороших» и «плохих» среди (побранных и отбракованных для размножения самок

Э.А.Савельевой (1993), которые свидетельствуют о важности режима температурной акклимации для успешного размножения севрюги.

Изучение физиологических характеристик фолликулов оказалось плодотворным для выяснения и других факторов, которые могут влиять на качество икры.

Влияние стресса на физиологическое состояние фолликулов и эффективность размножения севрюги. При изучении физиологического состояния фолликулов только что отловленных самок и самок, доставленных на рыбоводный завод, наблюдалось некоторое расхождение показателей (рис. 1). Это могло быть связано либо с тем, что опыты проводились с разными по состоянию гонад самками, либо с тем, что за время от отлова до инъекции самок, доставленных на рыбоводный завод, происходило изменение состояния фолликулов. Для выяснения этого вопроса были поставлены опыты, в которых состояние фолликулов одних и тех же самок регистрировалось сразу после отлова и перед гормональной стимуляцией. Результат оказался достаточно неожиданным (рис. 10 ).

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Т50, т0 (прогестерон, 5 мкг/мл)

Рис. 10. Изменение состояния фолликулов севрюги (стрелки) от момента отлова до инъекции гипофизарного препарата и качество полученной икры (столбики).

Вопреки распространенному мнению о том, чго стрессовые воздействия, которым самки подвергаются в момент отлова, в ходе транспортировки и при пересадках из одной емкости в другую, а также благодаря нахождению в ограниченном пространстве, ухудшают их состояние и неблагоприятным образом сказываются на результатах искусственного размножения, мы получили прямо противоположный результат У самок, чьи фолликулы характеризовались коротким временем созревания ооиитов под влиянием прогестерона и высоким процентом созревания ооцитов под влиянием гормонов гипофиза, существенных изменений не произошло, а у самок, чьи фолликулы были на менее продвинутой стадии, произошло улучшение состояния фолликулов (сокращение Т50 и увеличение процента ооцитов, созревающих пол влиянием гормонов гипофиза). Средний процент нормальных зародышей, полученных от этих самок, был достаточно высоким (66). Время от отлова до инъекции в этом опыте составило двое суток. Во в юрой подобной опыт (рис. II) природа внесла неожиданные изменения.

Т50, т0 (прогестерон, 5 мкг/мл)

Рис. 11. Изменение состояния фолликулов севрюги (стрелки) от момента отлова до инъекции гипофизарного препарата и качество полученной икры (столбики).

Из десяти запланированных самок в первый день было отловлено только шеегь, на следующий день штормило, и рыбаки смогли отловить еще четыре самки только через сутки. У этих четырех самок мы наблюдали ту же картину, что и в предыдущем опыте. Состояние их фолликулов либо не изменилось, либо улучшилось. У самок же, которые во время шторма находились в прорези, гоже произошло уменьшение Т50, но существенно ухудшилась или не улучшилась реакция на гормоны гипофиза. Ни у одной из этих самок процент нормальных зародышей не превысил 50, а средний процент для всей партии составил 26. Из этих опытов следует, что различное по силе стрессовое воздействие приводи г к различному эффекту - от улучшения до ухудшения, причем при передозировке стрессового воздействия прежде всего нарушается реакция фолликула на гормоны гипофиза, а Т50 либо не изменяется, либо даже сокращается. Вероятно, это и является причиной того, что по величине Т50 нельзя безошибочно отбирать самок для размножения. Величина ошибки будет тем выше, чем больше самок до инъекции подвергалось неблагоприятным воздействиям. Снижение или исчезновение реакции на гормоны гипофиза наблюдалось и при помещении самок , озерной лягушки в условия пониженной температуры (Гончаров, 1971 в) и после холодовой обработки или резервации самок севрюги при нерестовой температуре (Деглаф, Давыдова, 1974).

Для того, чтобы выяснить, насколько такие нарушения носят необратимый характер, был поставлен опыт на самках тех же сроков заготовки, то есть, отловленных до шторма и после него, но не обследованных на исходное состояние фолликулов и не помеченных (рис. 12). Состояние фолликулов самок было определено перед инъекцией небольшой дозы препарата ацетонированных гипофизов (3 мг/самку) и через 12 ч. Отмечалось, что двукратное введение препарата гипофиза (градуальные инъекции) оказывается более эффективным на самках осетровых рыбах с менее развитыми гонадами или ослабленных неблагоприятными воздействиями (Баранникова, Буренин, 1971). В нашем опыте у всех самок через 12 ч после инъекции произошло сокращение Т50, реакция на гормоны гипофиза не изменилась в тех с лучаях, коиы она была либо близка к созревшие ооиитм, % (ЭГ, 10 мкг/мл) нормальные зародыши. %

9 самок - 34 %

12 часов ->

Т50, т„ (прогестерон, 5 мкг/мл)

Рис. 12. Изменение состояния фолликулов севрюги (стрелки) после инъекции 3 мг препарата гипофизов и качество икры (столбики), полученной после разрешающей инъекции. максимальной, либо, наоборот, полностью подавлена. Если же у самок реагировала только часть фолликулов, то происходило улучшение реакции. В результате самки, имевшие высокую чувствительность к гормонам гипофиза или восстановившие ее. после разрешающей инъекции дали икру относительно высокого качества (в среднем 68% нормальных зародышей).

Восстановление чувствительности фолликулов к гормонам гипофиза после инъекции небольших доз может быть связано либо с действием ГТГ, либо каких-то иных компонентов гипофиза, например, тиреотропного гормона, тем более, что утерянная в результате выдерживания самок в течение нескольких дней при нерестовых температурах или их резкого охлаждения способность созревать под действием гормонов гипофиза восстанавливается после инъекции трийодотиронина (Детлаф, Давыдова, 1974). В следующем опыте (рис.13) мы проверили, можег ли с-ГТГ воспроизвести эффект ЭГ. Для этого самок выдерживали в течение трех суток в прорези, вблизи места лова, а затем инъецировали им 0,3 мг с-ГТГ. За время выдерживания происходило снижение реакции на гормоны гипофиза, хотя и не гак

Рис. 13. Изменение состояния фолликулов севрюги (стрелки), происходящие за трое суток после отлова и через сутки после инъекции 0,3 мг с-ГТГ. резко, как в предыдущих опытах, но через сутки после инъекции гормона реакция их фолликулов на гормоны гипофиза практически полностью восстанавливалась.

Как показали наши дальнейшие опыты, такое улучшенное небольшой тозой препарата гипофиза состояние фолликулов не сохраняется в течение длительного времени. Уже через 36 и, особенно, через 60 ч реакция на гормоны гипофиза снижается до исходного уровня, но только у самок с продвинутым состоянием компетенции ооцитов (с небольшим Т50). У самок же с менее продвинутыми ооцитами Т50 продолжает сокращаться и нарастает реакция на гонадотропины.

Таким образом, на основании проведенных опытов можно говорить о двояком действии стресса. В зависимости от силы воздействия он может либо улучшать состояние фолликулов (сокращается Т50 и, главное, улучшается реакция на гонадотропины), либо ухудшать (реакция на гонадотропины падает). Кроме того, реакция может различаться в зависимости от состояния фолликулов и, возможно, от состояния организма самки. Так, неблагоприятное воздействие стресса более всего сказывается на самках, у которых фолликулы находятся в наиболее продвинутом состоянии. Ухудшение состояния фолликулов может быть обратимо. Поскольку реакция фолликулов восстанавливается иол действием небольших доз очищенного ПТ, можно думать, что ухудшение реакции на гормоны может быть связано с нарушением секреции этого гормона. Инюресно, что даже на фоне потери реакции на ГТГ у некоторых самок происходит сокращение Т50. Возможны два объяснения этого явления. Во-первых, уменьшение Т50 может быть связано с кратковременным повышением концентрации ГТГ в крови, после чего их секреция падает, и в результате это ведет к падению чувствительности к ПТ клеток стенки фолликула. Другое возможное объяснение заключается в том, что уменьшение Т50 на фоне ухудшения реакции на ГТГ вызывается действием других гормонов, например, гормонов сгрсееа • кортнкостсроидов. В наших опытах лсзоксикортикоосрон вызывал in vitro созревание ооЦитов осетровых рыб. Регистрируемое отсутствие реакции на гормоны гипофиза in vitro вовсе не означает полной потери чувствительности к ним, поскольку после инъекции таким самкам препарата гипофизов происходит созревание и овуляция их оошпои, однако, качество га кои икры оказывается неудовлетворительным.

В пелом подход, основанный на определении физиологического состояния фолликулов, может быть эффективным для изучения влияния различных гормональных и экологических факторов и для разработки новых методов управления развитием или корректировки состояния репродуктивной системы самок осетровых рыб (Goncharov, Williot, 1993; Goncharov, Pohipan, 1997).

Применение синтетических аналогов гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) для индукции созревания половых продуктов у низших позвоночных. Многие виды рыб и амфибий не размножаются в неволе. Это может быть связано с тем, что процессы размножения заблокированы благодаря воздействию стресса, либо, что наиболее вероятно, с отсутствием тех сигнальных природных факторов, которые обеспечивают регуляцию гаметогенеза, а на заключительном этапе индуцируют софеваиис половых продуктов. Поскольку действие таких факторов обычно приводит к подъему уровня ПТ в крови, ТО ДЛЯ MliolllX ВИДОВ ИСПОИ,лют нньекцию либо неочищенного црепарам гипофиш. либо более или менее очищенных препаратов ГТГ как своего вида, так и видов, иногда таксономически очень отдаленных. Основным недостатком препаратов гипофизов является невозможность стандартизации их гонадотропной активности. Отсюда риск введения либо недостаточной, либо избыточной дозы. Кроме того, вместе с ГТГ в организм животного вводится весь спектр содержащихся в гипофизе гормонов, которые могу т, действуя на эндокринные органы мишени неким непредсказуемым образом, менять гормональный баланс организма, что, в свою очередь, может приводить к нарушениям процесса созревания половых продуктов. Нельзя забывать также, что для получения гипофизов используются биологические ресурсы. Применение стандартных гонадотропных препаратов (например, хорионического гонадотропина) ограничено видами, чувствительными к нему, и не лишено некоторых недостатков. Уже очень давно (Гербильский, 1947) был поставлен вопрос о необходимости замены гипофизов более совершенным и более выгодным с экономической точки зрения препаратом.

После раскрытия механизма участия гормонов гипоталамуса в секреции ГТГ появилась надежда на появление универсального стимулятора, тем более что после выделения, очистки и выяснения первичной структуры ГнРГ, который оказался небольшим олигопептидом, состоящим всего из десяти аминокислотных остатков, были синтезированы его суперактивные аналоги, во много раз превосходящие по активности нативный гормон. Несмотря на казалось бы блестящие предпосылки, первые опыты с ГнРГ млекопитающих, проведенные на рыбах оказались разочаровывающими (Hirose, Ishida, 1974; Lam et al., 1975, 1976). Гормон действительно индуцировал созревание половых продуктов у ряда костистых рыб, но только в таких огромных дозах, что его практическое применение теряло всякий смысл по экономическим соображениям. В результате на некоторое время интерес к возможности применения этих препаратов с практическими целями был утерян. Мы обратились к этим препаратам с целью выяснить, какие изоформы с-ГТГ секретируются в ответ на действие ГнРГ. Поскольку in vitro отчетливой стимуляции секреции ГТГ не было получено, мы решили проверить активность этого препарата in vivo. Для этого мы проинъецировали трех самок севрюги аналогом ГнРГ (аГнРГ) и относительно небольшой дозе (50-70 мкг/кг), небольшой по сравнению с дозами, эффективными для исследованных к тому времени костистых рыб. От двух из этих самок была получена зрелая икра (Гончаров, 1984а,б). Имея в виду практическую значимость полученного эффекта, мы продолжили эту работу на осетровых рыбах.

Осетровые рыбы. Для проведения дальнейших опытов мы выбрали севрюгу, заходящую на нерест в реку Урал, из-за лучших результатов, получаемых при ее искусственном размножении, по сравнению с волжской севрюгой. Инъекции аГнРГ в приведенных выше дозах были эффективны, однако созревание половых продуктов проходило позднее, чем созревание, индуцированное препаратом шпофиза. Поскольку такое замедленное созревание могло быть признаком применения лоз, близких к пороговым, мы несколько повысили дозу препарата. В то же время мы начали искать подходы для снижения эффективной дозы. В случае гона.чотропных препаратов одним из таких подходов является введение его в несколько приемов. Желая отработать оптимальную схему многократного введения препарата, мы решили проследить, как будет изменяться физиологическое состояние фолликулов при инъекции небольших доз. Результат оказался неожиданным. Самки отреагировали созреванием на эти небольшие дозы (4-12 мкг/кг). В дальнейшем наша работа была перенесена на волжские рыбоводные заводы, с тем чтобы проверить действие аГнРГ на основных популяциях, используемых для пополнения стада осетровых рыб в Каспийском море. На нижневолжской севрюге и русском осетре испытанные на уральской севрюге дозы оказались также эффективными. Тогда мы попытались определить нижнюю пороговую дозу для аГнРГ. Она оказалась равной 0,15-0,2 мкг/кг (Гончаров, 1985). С голь высокая чувствительность осетровых рыб к аГнРГ и отсутствие эффекта передозировки (напомним, что мы начинали с доз, которые в 250-450 раз превышали минимальные) позволяли провести производственные испытания и рекомендовать (Гончаров, 1990) рентабельные, стандартные для всех производителей лозы, что позволяло исключить из рыбоводного процесса взвешивание производителей и иметь достаточный запас прочности, минимализирующий последствия технических погрешностей (например, потери части препарата при инъекции).

Одним из основных был вопрос, не снизит ли применение нового препарата эффективность осетроводства. Данные, полученные в ходе экспериментальных работ, а затем и в ходе производственных испытаний на трех наиболее массово разводимых видах - севрюге, русском осетре и белуге (Гончаров 19846, 1985, Гончаров и др., 1991а; СопсЬагоу е! а1., 1991), показали, что по всем принятым показателям эффективность аГнРГ не ниже, чем препарата ацетонированных гипофизов осетровых рыб. Интересно, что работы, 'Проводившиеся на Краснодарском осетровом рыбоводном заводе, показали более высокую эффективность аГнРГ по сравнению с гипофизами осетровых рыб (Гончаров и др. 1991а). Напротив, когда мы перешли к четвертому разводимому виду осетровых -стерляди (Гончаров и др., 1991а; ОопсЬагоу е! а!. 1991), то обнаружили, что на инъекцию высокоэффективной для других видов осетровых дозы аГнРГ (1-3 мкг/кг) отвечает существенно более низкий процент самок, по сравнению с обычной лозой препарата гипофиза. Процент отреагировавших самок увеличивался с увеличением дозы аГнРГ. Таким образом, для этого вида был обнаружен довольно большой разброс в чувствительности самок. Не исключено, что это связано с особенностями биологии этого вида, поскольку стерлядь, в отличие от трех других изученных видов, является туводной формой и не осуществляет длительных нерестовых миграций, которые, вероятно, оказывают синхронизирующее действие на нейроэндокринную систему. Подобный результат был получен и при работе с самками сибирского осетра, выращенными в неволе. На стерляди мы попробовали применить двукратные инъекции аГнРГ. Одна и та же доза, введенная в два приема с интервалом в 13 ч, всегда оказывалась более эффективной, чем при однократном введении.

На русском осетре и севрюге мы проверили также эффективность применения аГнРГ для индукции спсрмиации у самцов. Никаких различий по сравнению с Iипофизарными инъекциями обнаружено не было. И процент самцов, ответивших на оба гормональных препарата, и активность получаемой спермы не различались.

Обычно самны более чувствительны к гоналотропным препаратам и им инъецируют дозы в два раза меньшие чем самкам. Интересно, что самцы стерляди оказались не более чувствительными к аГнРГ, чем самки - на дозу 5 мкг/кг реагировало только 50 % особей.

Для того чтобы выяснить, с чем связана такая высокая чувствительность осетровых рыб к аГнРГ - со структурными особенностями аналога или с особенностями их реагирующей системы, мы решили проверить действие используемых нами аналогов на представителях костистых рыб.

Костистые рыбы. Первая попытка использовать вьюна (Misgumus fossilis) для изучения проблем регуляции созревания половых продуктов с помощью ГнРГ, не увенчалась успехом, так как самки лого вида не реагировали даже на очень высокие дозы аГнРГ млекопитающих (до 300 мкг/кг), вводимые единовременно или в несколько приемов (Гончаров, 19846). Напротив, исследователи, работавшие с родственным видом - китайским вьюном (Paramisguriws dabryanus), обнаружили его достаточно высокую чувствительность к аГнРГ млекопитающих и, особенно, лососевых рыб (Lin et al., 1988, 1991), что, как полагают авторы, может быть связано со слабо выраженным негативным контролем секреции ГТГ дофамином. Возобновив работу с вьюном (Попонов, Гончаров, 1995), мы убедились в том, что этот вид действительно очень мало чувствителен к аГнРГ. Даже при инъекции наибольшей дозы (400 мкг/кг) овуляция наблюдалась не у всех самок.

Существует несколько возможных объяснений низкой чувствительности многих видов рыб к аГнРГ млекопитающих. Во-первых, это может быть связано с тем, что используется аналог гормона, который структурно и функционально отличается от собственного. Действительно, ГнРГ лососевых рыб отличается or ГнРГ млекопитающих двумя аминокислотными остатками (Sherwood, 1987). Аналог, синтезированный на основе его первичной структуры, па рыбах оказывается существенно более активным, чем аГнРГ млекопитающих (Lin et al., I9SS, 1991). Нами также было показано, что инъекция нерке (Oncorhynchiis nerka) аГ'нРГ, представляющего собой как бы средний вариант между аГнРГ млекопитающих и аГнРГ лососевых рыб (в гормоне млекопитающих был заменена одна аминокислота), ускорял овуляцию эффективнее, чем «ГнРГ млекопитающих (Гончаров, 1991). В этой связи интересно отметить, что структура основного ГнРГ осетровых рыб оказалась идентичной структуре ГнРГ млекопитающих (Sherwood et al., 1991), и это тоже может быть причиной высокой чувствительности осетровых рыб к аналогу этого гормона.

Другое объяснение связано с механизмом двойственной регуляции секреции ГТГ у рыб, согласно которому ГнРГ оказывает стимулирующий эффект, а дофамин - подавляющий (Peter et al., 1986). Предполагается, что у видов, малочувствительных к ГнРГ, более эффективно действует подавляющая система (Lin et al., 1988, 1991). Это подтверждается работами, в которых применение антагонистов дофамина значительно увеличивало эффективность аГнРГ (Peter et al., 1986; Поиопов и др., 1990). В случае вьюна также удалось путем совместного введения аГ'нРГ и антагониста дофамина (сульпирида или пимозида) па порядок снизить эффективную дозу аГнРГ и получить результат, сопоставимый и по проценту отреагировавших самок, и по качеству икры с результатом, получаемым с помощью хориопического гонадотропина (Попонов, Гончаров, 1995).

Работая с вьюном в разные годы и сезоны, мы обнаружили существенный разброс в чувствительности самок из разных партий к аГнРГ, причем его нельзя было увязать с сезонностью. Мы склонны объяснять это влиянием стресса, всегда трудно учитываемого фактора. Другое объяснение было предложено С.Б.Подушкой (1992), который связывает ра шум чувствительность самок вьюна с возле и с ищем неблагоприятных температур. Еще с большей вариабельностью чувствительности к аГнРГ мы столкнулись при работе с амфибиями.

Амфибии. Относительно недавно развитие сравнительного направления исследований гормональной регуляции получило новый импульс, так как существенно расширился круг видов, которые стало необходимо размножать в неволе для их сохранения. Участвуя в этих работах, нам удалось, применяя разработанные для других видов осетровых рыб подходы, впервые полушть потомство от амударьинского лопатоноса (Pseudoscaphirhynchus kaufmanni) - вида, включенного в Красные книги СССР и Международного союза охраны природы

Шубравый и др., 1989; Гончаров и др., 19916; ОопсЬагоу е! а1., 1994). Благодаря этой работе впервые было описано раннее развитие этого вида (Шмальгаузен, 1991). Это тем более важно, что из двух других представителей того же рода один -сырдарьинский лопатонос (Р. /еЖисИепко!) - считается исчезнувшим, а второй -малый амударьинский лопатонос (Р. Непший) - встречается крайне редко В еще более опасном положении оказались амфибии. В Красную книгу СССР (1984) были внесены девять видов.

В 1982 г. была создана Рабочая группа по разведению в неволе редких, исчезающих и "проблемных" видов амфибий при Герпетологическом комитете СССР. Перед нами была поставлена задача разработать универсальный метод стимуляции процессов размножения амфибий. Работа проводилась с тремя группами видов: модельные виды, виды, находящиеся под угрозой исчезновения, и экзотические виды. Упор был сделан на применение гормональной стимуляции, хотя для ряда видов дополнительно были Использованы и методы экологической стимуляции, например, помещение тритонов рода ТгИигии в условия зимовки и "дождевание" тропических амфибий.

Использование аГнРГ показало его эффективность практически для всех исследованных видов (СопсИагоу еч а!., 1989; Гончаров и др., 1990; СоШзЬагоу ^ а1., 1991) . Тем не менее эффективные дозы и режимы инъецирования препарата существенно различались и зависели от вида животного, сезона, применения дополнительных воздействий экологическими факторами и, видимо, стрессовых воздействий. Для многих видов предпочтительными и даже единственно возможными оказались многократные инъекции аГнРГ. На модельном виде -травяной лягушке - мы столкнулись с существенными различиями в чувствительности самок из разных партий, достигающими двух порядков.

Сложность задачи но сравнению с рыбами, при размножении которых использовалось искусственное осеменение, заключалась в том, чтобы получить не только качественные зрелые половые продукты, а и весь комплекс процессов размножения, заканчивающийся появлением потомства. Для получения оплодотворенной икры необходима синхронизация созревания половых продуктов и брачного поведения самок и самцов. Чтобы достичь этого у ряда видов гормональную стимуляцию начинали с самцов, и лишь после регистрации брачного поведения (амплексус или откладка сперматофора) инъецировали самок.

В результате проведенных работ потомство было получено от 33 видов бесхвостых и 15 видов хвостатых амфибий, в том числе и от 10 видов, включенных в Красные книги РСФСР и СССР (Goncharov et al., 1989; Гончаров и др., 1990). Были разработаны методы инкубации икры, выращивания головастиков, личинок и молоди и проведены работы по созданию новых природных популяций редких и исчезающих видов (сирийская чесночница (Pelobates syriaeus) и малоазиатский тритон (Triturus vittatus)) за счет полученных и выращенных в неволе животных (Serbinova et al., 1988; Сербинова и др., 1990а,б).

Заключение диссертации по теме «Эмбриология, гистология и цитология», Гончаров, Борис Федорович

ВЫВОДЫ

1. На основании комплексного исследования сформулированы и обоснованы представления о гормональной регуляции перехода ооцитов ог витсллогенсза к созреванию у низших позвоночных животных, согласно которым в период становления компетенции созревания гонадотропин(ы) играют двойную роль -стимулируют продвижение фолликула к преднерестовому состоянию и, в то же время, удерживают его от преждевременного созревания.

2. Показано, что в период перехода ооцитов амфибий и осетровых рыб от вителлогенеза к созреванию способность ооцитов созревать под влиянием прогестерона появляется раньше, чем способность фолликула реагировать созреванием ооцига на действие гонадотропинов. В ходе становления компетенции обнаружено такое состояние фолликулов, при котором экстракт гипофизов оказывает in vitro подавляющее или тормозящее действие на индуцируемое прогестероном созревание ооцитов.

3. В результате изучения подавляющего (тормозящего) действия экстракта гипофизов на созревание ооцигов осетровых рыб и амфибий выяснено, что это действие: а) зависит от дозы; б) ослабевает по мере приближения фолликулов к преднерестовому состоянию; в) обязано присутствующему в гипофизе гонадотропину; г) осуществляется при посредничестве клеток стенки фолликула; в) вероятно осуществляется через цАМФ и д) имеет точкой приложения процесс, значительно отстоящий во времени от начала действия прогестерона.

4. Впервые получен в высокоочищенном виде гонадотропный гормон i ипофиза севрюги и изучены его физико-химические свойства. Показано, что он имеет ряд общих свойств с гонадотропинами других позвоночных животных - это гликопротеин с молекулярной массой около 30 кД, состоящий из двух неравноценных субъединиц, однако отличающийся от известных гонадотропинов но аминокислотному составу, электрофорстической подвижности и р1. Обнаружен полиморфизм гоиадотропного гормона гипофиза севрюги по заряду молекулы. Показано, что этот полиморфизм: а) не связан с повреждением молекул при проведении очистки гормона; б) не связан с генетическим полиморфизмом популяции севрюги; в) не связан с существованием полоспецифичных форм гормона. Выявлены качественные различия в действии изоформ гонадотропного гормона, различающиеся по р1. Получены способные к реассоциации частично очищенные субъединицы гонадотропина. Показано, что в действии гонадотропных гормонов севрюги и карпа имеются качественные различия.

5. Предложены новые методические приемы, в частности, были разработаны: а) среда культивирования фолликулов осетровых рыб, позволяющая получать созревание ооцитов под влиянием гонадотропинов; б) высокочувствительный и высокоточный метод сравнительного количественного определения гошщотропной активности гипофизов низших позвоночных, основанный на использовании реакции созревания ооцитов т \ч!го\ в) метод определения продолжительности гормонозависимого периода созревания ооцитов осетровых рыб, основанный на прекращении действия гонадотропинов при переносе фолликулов в среду, не обеспечивающую их действия, но не препятствующую действию прогестерона.

6. Обнаружена существенная разнородность нерестовой популяции севрюги по физиологическому состоянию фолликулов старшей генерации. Установлена корреляция в показателях реакции фолликулов севрюги на гонадотропины и прогестерон, что свидетельствует в пользу синхронного развития компетенции клеток стенки фолликула и ооцита.

7. Показано разнонаправленное изменение физиологического состояния фолликулов осетровых рыб (от улучшения до ухудшения) при различных стрессовых воздействиях.

8. На основе проведенных исследований предложены новые методы, позволяющие усовершенствовать биотехнику размножения осетровых рыб и амфибий, в частности, разработаны а) метод отбора самок осетровых рыб, основанный на определении продолжительности созревания ооцитов <п \чт> пол влиянием прогестерона, позволяющий повысить эффективность их использования в рыбоводстве; б) высокоэффективный и рентабельны!! способ получения зрелых половых продуктов от производителей осетровых рыб, основанный на применении синтетического аналога гонадотропин-рилизинг гормона. На большом числе видов показана возможность использования синтетических аналогов гонадотропин-рилизинг гормона для стимуляции процессов размножения у амфибий, и получено потомство от ряда видов, находящихся под угрозой исчезновения.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Гончаров Б.Ф. 1969а. Подавляющее действие гипофиза на вызываемое прогестероном созревание ооцитов лягушек и осетра. В сб.: "Демонстрации на IX Международной эмбриологической конференции", M , Наука, с.27.

Гончаров Б.Ф. 19696. К вопросу о закономерностях возникновения чувствительности гонад к гонадотропным гормонам гипофиза. В сб.: "Современное состояние метода гипофизарных инъекций", Астрахань, ЦНИОРХ, с.39-44.

Гончаров Б.Ф. 1971а. Зависимость величины гормонозависимого периода созревания фолликулов травяной лягушки от разведения суспензии гипофизов. Новый метод тестирования гипофизов. Онтогенез, т.2, с.64-70.

Гончаров Б.Ф. 19716. Новый метод сравнительного определения гонадотропной активности гипофизов осетровых рыб. В сб.: "Материалы к объединенной научной сессии ЦНИОРХ и АзНИИРХ", Астрахань, с.ЗО.

Гончаров Б.Ф. 1971 в. Изучение закономерностей перехода ооцитов амфибий и осетровых рыб от роста к созреванию. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд.биол.наук., Москва, 27 с.

Гончаров Б.Ф. 1972. Опыт определения гонадотропной активности гипофиза осетровых рыб по реакции созревания ооцитов in vitro. В сб.: "Осетровые н проблемы осетрового хозяйства", М., Пищевая промышленность, с.257-262.

Goncharov В.F. 1972. A study of the inhibitory effect of pituitary on the progesterone-induced oocyte maturation in Rana temporaria. Gen. Comp. Endocrinol., v.IS, p.593.

Burzawa-Gerard E., Goncharov В F., Fontaine Y.A. 1975a. L'hormone gonadotrope hypophysäre d'un Poisson Chondrosteen, l'Esturgeon (Acipenser steUams Pall.). I. Purification. Gen. Comp. Endocrinol , v.27, p.289-295.

Bnrzawa-Gcrard F. Goncharov B.F., Fontaine Y.A. 1975b. L'hormone gonadotrope hypophysäre d'un Poisson Chondrosteen, l'Esturgeon (Acipenser steUatus Pall.). 11. Propriétés biochimiques. Gen. Comp. Endocrinol., v.27. p.296-304.

Гончаров Б.Ф., Бурзава-Жсрар Е., Фонтен И.А. 1976. Сравнительное изучение биологического действия очищенных гонадотропиноп карпа и севрюги. Онтогенез, т.7, с.85-89.

Гончаров Б.Ф. 1976. Физиологическое состояние фолликулов старшей генерации у севрюги во время нерестовой миграции. В сб.:"Эколо| ичсская физиология рыб", Киев, Наукова думка, с.139-140.

Burzawa-Gerard Е., Goncharov B.F. Dumas A., Fontaine Y.A. 1976. Further biochemical studies on carp gonadotropin (c-GTH); biochemical and biological comparison of c-GTH and a gonadotropin from Acipenser stellatus Pall. (Chondrostei). Gen. Сотр. Endocrinol. v.29, p.498-505.

Гончаров Б.Ф. 1977. Гормональная регуляция вителлогенеза и созревания у рыб и амфибий. Веб.: "Современные проблемы оогенеза". М., Наука, с. 173-199.

Гончаров Б.Ф. 1978. Влияние состава среды культивирования на способность фолликулов осетровых рыб реагировать созреванием на действие гонадотрогжых гормонов. В сб.: "Вопросы раннего онтогенеза рыб", Киев, Наукова думка, с.77-78.

Гончаров Б.Ф. 1979. Использование временных параметров реакции фолликулов на гормоны для оценки рыбоводных качеств производителей осетровых рыб. В сб. "Осетровое хозяйство внутренних водоемов СССР", Астрахань, с. 60.

Burzawa-Gerard Е., Goncharov B.F. 1980. Les sous-unites dc I'hormone gonadotropc d un chondrosteen, 1'esturgeon (Acipenser stellatus): Separation partielle et molecules hybrides. Gen. Сотр. Endocrinol., v.40, p.338.

Гончаров Б.Ф., Кузнецов A.A., Бурзава-Жерар Э. 1980. Анализ гетерогенности гонадотропного гормона гипофиза севрюги. Биохимия, т.45, с.455-462.

Goncharov B.F. 1980. The inhibitory cflFect of pituitary gonadotropic hormone on the progesterone-induced maturation of amphibian and sturgeon oocytes. In: "Communications of the XIV International Embryoiogical Conference, Patras, Greece, 1980", p. 68.

Гончаров Б.Ф. 1981. Использование метода гипофизарных инъекций в рыбоводстве. Некоторые итоги и перспективы. В сб.: "Исследования размножения и развития рыб", М., Наука, с. 16-48.

Гончаров Б.Ф., Кузнецов А.А. 1981. Различие в биологическом действии изоформ гонадотропного гормона севрюги (Acipenser stellatus Pall.) и идентичность их спектра в гипофизах самцов и самок. Докл. АН СССР, т.258, с.243-246.

Kuznetzov А.А., Goncharov B.F., Burzawa-Gerard Е. 1983. Pituitary gonadotropic hormone from a chondrostean fish, starred sturgeon (Acipenser stellatus Pall ). III. Polymorphism. Gen. Сотр. Endocrinol., v.49, p.364-374.

Goncharov B.F., Kuznetzov A.A., Burzawa-Gerard E. 1983. Pituitary gonadotropic hormone from a chondrostean fish, starred sturgeon (Acipenser stellatus Pall.). IV. Differences in biological action of isoforms and absence of sex-specific forms . Gen Сотр. Endocrinol., v.49, p.375-382.

Гончаров Б.Ф. 1984а. Опыт применения синтетических аналогов люлиберина для индукции созревания половых продуктов у осетровых рыб. В сб.: "Осетровое хозяйство водоемов СССР", Астрахань, с.94-95.

Гончаров Б.Ф. 19846. Синтетический аналог люлиберина - новый перспективный стимулятор созревания половых продуктов осетровых рыб. Докл. АН СССР, т.276, с. 1002-1006.

Гончаров Б.Ф. 1985. Перспективы использования синтетических аналогов люлиберина при получении зрелых половых продуктов от производителей осетровых рыб. В сб.: "Экологическая физиология и биохимия рыб", Вильнюс, с.384-385.

Serbinova I.A., Shubravy 0.1., Uteshev V.K., Agasjan A.L., Herrmann H.-J., Gonjsharov В.F. 1988. Haltimg, Vermehrung und Rcintroduction von Petobates syriaais Boettgei 1889. ln:"Haltung und Vermehrung von Amphibien in Labor und Terrarium." Ed. H.-J. Herrmann., Tagungsmaterial Amphibien, s.41-46.

Гончаров Б.Ф., Сербинова H.A., Утешев B.K., Шубравый О.И. 1989. Разработка методов гормональной стимуляции процессов размножения у амфибий. В сб.: "Проблемы доместикации животных" М., с.197-201.

Goncharov В.F., Shubravy О.Г, Serbinova I.A., Uteshev V.K. 1989. The USSR programme for breeding amphibians, including rare and endangered species. Int. Zoo ib., v.28, p.22

31.

Гончаров Б.Ф. 1990. Новый способ получения зрелых половых продуктов от производителей осетровых рыб. В сб.: "Фундаментальные науки - народному хозяйству", М., Наука, с.297-300.

Гончаров Б.Ф., Сербинова H.A., Шубравый О.И., Утешев В.К., Полупан И.С. 1990. Влияние синтетических аналогов гонадотропин-рилизинг гормонов на размножение у амфибий. В сб.: "Зоокультура амфибий", Москва, с.51-74.

С ербинова H.A., Туниев Б.С., Утешев В.К., Шубравый О.И., Гончаров Б Ф., 1990а. Создание поддерживаемой в искусственных условиях популяции малоазиатского тритона (Trituras vittatus nphriticiix, 1846). В сб.: "Зоокультура амфибий", Москва, с.75-81.

Сербинова И.А., Шубравый О.И., Утешев В.К., Агасян А.Л., Гончаров Б.Ф. 19906. Содержание, разведение в неволе и создание новых природных популяций сирийской чесночницы (Pelobates syriacus Boettger). В сб.: "Зоокультура амфибий", Москва, с.82-89.

Попоноз С Ю., Веселовзоров С.И., Мотлох H.H., Гончаров Б.Ф. 1990. Дофаминовая регуляция овуляции и спермиации у рыб. В сб.: "Эколого-физиологические и токсикологические аспекты рыбохозяйственных исследований", М., ВНИРО, с.102-117.

Гончаров Б.Ф., Игумнова J1.В. Полупан И.С., Савельева Э.А. 1991. Использование синтетических аналогов люлиберина для стимуляции созревания половых продуктов у производителей осетровых рыб. Онтогенез, т.22, с.514-524.

Гончаров Б.Ф., Шубравый О.И., Утешсв В.К. 1991. Размножение и раннее развитие большою амударьинского лопатоноса в искусственных условиях. Онтогенез, т.22, с.485-492.

Гончаров Б.Ф. 1991. Ускорение овуляции у нерки под влиянием синтетических аналогов гонадотропин-рилизинг гормона. В сб.: "Репродуктивная физиология рыб", Минск, с.25.

Goncharov B.F., Igumnova L.V., Polupan I.S., Savelieva E.A. 1991. Induced oocytc maturation, ovulation and spermiation in sturgeons (Acipenseridae) using synthetic analogue of gonadotropin-releasing hormone. In: "Acipenser", P.Williot (ed). CEMAGREFF Pubi., Bordeaux, p.35I-364.

Ciontsharov B.F., Serbinova I.A. Uteshov V.K., Shubravy O.I. 1991. Benut/ting eines synthetischen Analogous des Gonadotropin-Releasing-Homions fur die Stimulation des Reifens dcr Geschlechtsprodukte und des Laicliens bei Amphibien. In: "Amphibienforschung und Vivarium". H.-J.Herrmann (cel.), s.57-59.

Goncharov B.F. 1993. Appendix B: Duration of oocyte maturation time in vitro as a criterion for selecting sturgeon spawners for breeding. In: T.A.DettlafT, A S Ginsburg, O.I.Schmalhausen. Sturgeon Fishes. Developmental Biology and Aquaculuire. Berlin; Springer-Verlag, p.218-219.

Goncharov B.F., Williot P. 1993. Estimation and monitoring of the physiological state of full-grown follicles in Acipenseridae. In: "Abstract Bulletin. International Symposium on Sturgeons. September 6-11, 1993. Moscow-Kostroma-Moscow". Moscow, VN1RO, p.16.

Goncharov B.F., Shubravyi O.I., Uteshev V.K. 1994. Captivity breeding of the big Anui-dar shovelnose Pseudoscaphirynchus kaufmanni Bogdanow. In: "Summaries of Oral Presentations of the International Conference on Sturgeon Biodiversity and Conservation. The American Museum of Natural History. July 28-30, 1994, New York", 13 pp.

Попонов С.Ю., Гончаров Б.Ф. 1995. Влияние синтетическою аналога гонадотропин-рилизинг гормона и антагонистов дофамина на созревание и качество яйцеклеток вьюна. Онтогенез, т. 26, с.453-459.

Goncharov B.F. 1996. Possible dual role for gonadotropin(s) in the regulation of meiotic oocyte maturation in lower vertebrates. Annales d'Endocrinologie, vol. 57, suppl, no.4, p.55.

Гончаров Б.Ф., Полупан И.С., Вийо П., Ле Менн Ф. 1997. Влияние состава среды культивирования на созревание ооцитов осетровых рыб, индуцируемое гонадотропными гормонами и прогестероном. Онтогенез, т. 28, с. 55-64.

Goncharov B.F., Polupan I S. 1997. Stress affects the physiological state of" sturgeon ovarian follicles and female reproductive potential. In: "Abstracts of the 3-rd International Symposium on Sturgeon" Piacenza, Italy, July 8-11/1997.

Williot P., Goncharov B.F. 1998. Spawning induction in farmed Siberian sturgeon, Acipenser baeri Brandt: in vivo and in vitro comparison of effects of carp and sturgeon pituitary homogenates. Aquaculture (in press).

Гончаров Б.Ф., Вийо П., Ле Менн Ф. 1999. Сезонные изменения морфологических и физиологических характеристик овариальных фолликулов сибирского осетра, Acipenser baeri Brandt и их ценность для прогнозировании успеха искусственною размножения. Онтогенез, т. 30, N I, (в печати).

Список сокращений, использованных в диссертации:

ГЗП - гормонозавиеимый период созревания ооцитов

Т50 - продолжительность созревания 50% ооцитов под влиянием прогестерона

МИС - мейоз индуцирующий стероид

17а,20р-ДГП - 17а,20р-дигидрокси-4-прегнсн-3-он

ЭГ - экстракт гипофиза

ЭГс - экстракт гипофиза севрюги

ЭГк- экстракт гипофиза карпа

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ГТГ - гонадотропный гормон с-ГТГ гонадотропный гормон гипофиза севрюги к-ГТГ гонадотропный гормон гипофиза карпа

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг гормон аГнРГ - аналог гонадотропин-рилизинг гормона цАМФ - циклический аденозинмонофосфат дбцАМФ - дибутирил циклический аденозинмонофосфат

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

ОЭП - относительная электрофоретическая подвижность